JPH0466090A - 異種遺伝子高発現ベクター - Google Patents
異種遺伝子高発現ベクターInfo
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は異種遺伝子高発現ベクターに関する。
さらに詳しくは、キシロースイソメラーゼ遺伝子を含有
するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ）属菌用の高
発現ベクターに関する。
するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ）属菌用の高
発現ベクターに関する。
〔従来の技術及び発明が解決すべき課題〕ザイモモナス
属菌〔特にザイモモナス・モビリス（２，ｍｏｂｉｌｉ
ｓ） ］は酵母と同程度のエタノール生成能を有する唯
一の細菌である。しかし発酵性糖はシュクロース、グル
コース、及びフラクトースに限られ、しかもフラクトー
ス発酵速度がグルコース発酵速度に比べて遅い等の欠点
を有している。これらの欠点を克服するための手段とし
て遺伝子操作技術が考えられる。しかしながら遺伝子操
作に必要なザイモモナス属菌のためのベクターは、ダラ
ム陰性細菌の広宿主域プラスミドＲＰ４などの巨大プラ
スミドであるため宿主の形質転換頻度、宿主内での安定
性、導入異種遺伝子の大きさと遺伝子の数などに制限が
ある。また異種遺伝子をザイモモナス属菌内で高発現さ
せるためにはザイモモナス属菌由来の高発現遺伝子のプ
ロモーター等の発現機構が必要である。ザイモモナス属
菌の酵素遺伝子のＤＮＡ塩基配列についてはアルコール
デヒドロゲナーゼ（Ｔ、Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ、
Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：ｖｏ
１１６９．ｎｏ６．ｐ２５９１−２５９７（１９８７）
、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｌａｎ Ｄ、Ｎｅ
ａｌｅ ｅｔａｌ、 Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ： ｖｏｌ １５．ｎｏ４．ｐ１７５３
（１９８７）などが報告されている。しかし、これらの
遺伝子のプロモーターを用いた満足すべき異種遺伝子高
発現用の有用な発現ベクターは今まで作製されておらず
、当該分野においてはその作製が望まれていた。
属菌〔特にザイモモナス・モビリス（２，ｍｏｂｉｌｉ
ｓ） ］は酵母と同程度のエタノール生成能を有する唯
一の細菌である。しかし発酵性糖はシュクロース、グル
コース、及びフラクトースに限られ、しかもフラクトー
ス発酵速度がグルコース発酵速度に比べて遅い等の欠点
を有している。これらの欠点を克服するための手段とし
て遺伝子操作技術が考えられる。しかしながら遺伝子操
作に必要なザイモモナス属菌のためのベクターは、ダラ
ム陰性細菌の広宿主域プラスミドＲＰ４などの巨大プラ
スミドであるため宿主の形質転換頻度、宿主内での安定
性、導入異種遺伝子の大きさと遺伝子の数などに制限が
ある。また異種遺伝子をザイモモナス属菌内で高発現さ
せるためにはザイモモナス属菌由来の高発現遺伝子のプ
ロモーター等の発現機構が必要である。ザイモモナス属
菌の酵素遺伝子のＤＮＡ塩基配列についてはアルコール
デヒドロゲナーゼ（Ｔ、Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ、
Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：ｖｏ
１１６９．ｎｏ６．ｐ２５９１−２５９７（１９８７）
、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ａｌａｎ Ｄ、Ｎｅ
ａｌｅ ｅｔａｌ、 Ｎｕｃｌｅｌｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ： ｖｏｌ １５．ｎｏ４．ｐ１７５３
（１９８７）などが報告されている。しかし、これらの
遺伝子のプロモーターを用いた満足すべき異種遺伝子高
発現用の有用な発現ベクターは今まで作製されておらず
、当該分野においてはその作製が望まれていた。
本発明者らは、上記の課題を解決すべくザイモモナス属
菌によるペントース（キシロース）からのアルコール発
酵を目的として鋭意研究した結果、以下の過程を経て所
望の異種遺伝子高発現ベクターを作製することに成功し
、本発明を完成した。
菌によるペントース（キシロース）からのアルコール発
酵を目的として鋭意研究した結果、以下の過程を経て所
望の異種遺伝子高発現ベクターを作製することに成功し
、本発明を完成した。
従って、本発明は、ザイモモナス（２ｙｍｏｍｏｎａｓ
）属細菌の細胞中で複製することができ且つ第３図に
示す制限酵素地図により特定される構造又はこれと実質
的に同じ構造を有するプラスミドを提供する。
）属細菌の細胞中で複製することができ且つ第３図に
示す制限酵素地図により特定される構造又はこれと実質
的に同じ構造を有するプラスミドを提供する。
本発明はさらに、前記のプラスミド及びザイモモナス属
細菌の細胞中で機能する追加のプロモーターを含有し、
該追加のプロモーターの下流に異種遺伝子を挿入した場
合に該異種遺伝子をザイモモナス属細菌の細胞中で発現
させることができる発現用ベクターを提供する。
細菌の細胞中で機能する追加のプロモーターを含有し、
該追加のプロモーターの下流に異種遺伝子を挿入した場
合に該異種遺伝子をザイモモナス属細菌の細胞中で発現
させることができる発現用ベクターを提供する。
本発明はさらに、前記発現用ベクターの前記追加のプロ
モーターの下流に大腸菌由来のキシロースイソメラーゼ
遺伝子が挿入されているキシロースイソメラーゼ発現ベ
クターを提供する。
モーターの下流に大腸菌由来のキシロースイソメラーゼ
遺伝子が挿入されているキシロースイソメラーゼ発現ベ
クターを提供する。
本発明はさらに、前記発現ベクターにより形質転換され
ておりそしてキシロースイソメラーゼ活性を発現するこ
とができるザイモモナス属細菌を提供する。
ておりそしてキシロースイソメラーゼ活性を発現するこ
とができるザイモモナス属細菌を提供する。
本発明はさらに、前記形質転換体をグルコース、フラク
トース、及び／又はシュクロースを含有する培地中で培
養し、培養液からエタノールを採取することを特徴とす
るエタノールの製造方法を提供する。
トース、及び／又はシュクロースを含有する培地中で培
養し、培養液からエタノールを採取することを特徴とす
るエタノールの製造方法を提供する。
次に、順次さらに具体的に説明する。
（１）ザイモモナス属細菌と該属以外の微生物の宿主細
胞（特に大腸菌）の両宿主において安定に保持される低
分子量のシャトルベクターを作製し、ザイモモナス属細
菌の遺伝子操作による育種を行う。
胞（特に大腸菌）の両宿主において安定に保持される低
分子量のシャトルベクターを作製し、ザイモモナス属細
菌の遺伝子操作による育種を行う。
（２）さらにザイモモナス属細菌のピルビン酸デカルボ
キシラーゼ遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ塩基配列
を化学合成し、異種遺伝子とともに上記シャトルベクタ
ーに組込み、ザイモモナス属細菌用の異種遺伝子高発現
ベクターを作製する。
キシラーゼ遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ塩基配列
を化学合成し、異種遺伝子とともに上記シャトルベクタ
ーに組込み、ザイモモナス属細菌用の異種遺伝子高発現
ベクターを作製する。
（３）上記異種遺伝子としてはザイモモナス属菌以外の
キシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）を用い、ザ
イモモナス属細菌内での発現を図ることにより本発明に
おける異種遺伝子高発現ベクターを作製する。
キシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）を用い、ザ
イモモナス属細菌内での発現を図ることにより本発明に
おける異種遺伝子高発現ベクターを作製する。
以下に、本発明における異種遺伝子高発現ベクターの作
製について詳細に説明する。
製について詳細に説明する。
まずベクターの材料となる低分子量のプラスミドを得る
ためにザイモモナス属菌の例としてザイモモナス・モビ
リスＡＴＣＣ１０９８８株ヲ用いるこトカできる。該菌
株からプラスミドを調製した結果、約１．６ｋｂのプラ
スミド群（ｐＺＭＩＡ、 Ｂ、及びＣ）が存在していた
（第２図参照）。
ためにザイモモナス属菌の例としてザイモモナス・モビ
リスＡＴＣＣ１０９８８株ヲ用いるこトカできる。該菌
株からプラスミドを調製した結果、約１．６ｋｂのプラ
スミド群（ｐＺＭＩＡ、 Ｂ、及びＣ）が存在していた
（第２図参照）。
次に、それらのプラスミドのひとつであるｐＺＭＩＡの
ＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法により決定した。
ＤＮＡ塩基配列をジデオキシ法により決定した。
決定されたＤＮＡ塩基配列の解析の結果ｐ２Ｍ１＾は１
６８３塩基対からなるプラスミドでダイレクトリピート
、オーブンリーディングフレームなどの構造が確認され
た。ｐ２ＭＩＡの模式図と制限酵素地図を第３図に示す
。このプラスミドｐＺＭＩＡの塩基配列は、およそ、第
１図中の塩基配列の内第５４１４位の塩基が第７０９６
位の塩基までの配列に相当する。しかしながら、本発明
の、ザイモモナス属細菌の細胞中で複製可能なプラスミ
ドに第３図に示す制限酵素地図により特定されるものに
限定されない。
６８３塩基対からなるプラスミドでダイレクトリピート
、オーブンリーディングフレームなどの構造が確認され
た。ｐ２ＭＩＡの模式図と制限酵素地図を第３図に示す
。このプラスミドｐＺＭＩＡの塩基配列は、およそ、第
１図中の塩基配列の内第５４１４位の塩基が第７０９６
位の塩基までの配列に相当する。しかしながら、本発明
の、ザイモモナス属細菌の細胞中で複製可能なプラスミ
ドに第３図に示す制限酵素地図により特定されるものに
限定されない。
一般に、ＤＮＡの機能を実質的に変更することなく少数
個の塩基を置換、欠失、付加等により変化することがで
きることはよく知られており、この様な変化によって制
限酵素認識部位が破壊又は挿入されることもよく知られ
ている。従って本発明は少数の塩基が変更されているが
なおｐＺＭＩＡの機能が維持されているプラスミドをも
包含する。
個の塩基を置換、欠失、付加等により変化することがで
きることはよく知られており、この様な変化によって制
限酵素認識部位が破壊又は挿入されることもよく知られ
ている。従って本発明は少数の塩基が変更されているが
なおｐＺＭＩＡの機能が維持されているプラスミドをも
包含する。
ザイモモナス・モビリスはテトラサイクリン及びクロラ
ムフェニコールに対して感受性であるた６１両薬剤耐性
遺伝子を持ち、ＤＮＡ塩基配列が報告されている大腸菌
のベクター１］ＡＣＹＣ１８４（Ｒｏｎａｌｄε、Ｒｏ
ｓｅ ｅｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ： ｖｏｌ１６゜ｎｏｌ、 ｐ３５５
（１９８８）、＾ＴＣＣ３７０３３）とｐＺＭＩＡと
を組換えてザイモモナス・モビリスを形質転換した。そ
の結果、ｐＺＭＩＡ中のオーブンリーディングフレーム
内に存在する制限酵素３ｃｏＲＩ切断部位で組換えた場
合（第４図Ａ）は形質転換体は得られなかったが、ｐＺ
ＭＩＡ中のオープンリーディングフレーム及び複製開始
領域外の制限酵素Ｈａｅ ｍ切断部位で組換えた場合（
第４図Ｂ）は両薬剤耐性を有する形質転換体が得られた
。よって、ｐＺＭＩＡのオープンリーディングフレーム
がコードする蛋白質は複製に必須と考えられる。
ムフェニコールに対して感受性であるた６１両薬剤耐性
遺伝子を持ち、ＤＮＡ塩基配列が報告されている大腸菌
のベクター１］ＡＣＹＣ１８４（Ｒｏｎａｌｄε、Ｒｏ
ｓｅ ｅｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ： ｖｏｌ１６゜ｎｏｌ、 ｐ３５５
（１９８８）、＾ＴＣＣ３７０３３）とｐＺＭＩＡと
を組換えてザイモモナス・モビリスを形質転換した。そ
の結果、ｐＺＭＩＡ中のオーブンリーディングフレーム
内に存在する制限酵素３ｃｏＲＩ切断部位で組換えた場
合（第４図Ａ）は形質転換体は得られなかったが、ｐＺ
ＭＩＡ中のオープンリーディングフレーム及び複製開始
領域外の制限酵素Ｈａｅ ｍ切断部位で組換えた場合（
第４図Ｂ）は両薬剤耐性を有する形質転換体が得られた
。よって、ｐＺＭＩＡのオープンリーディングフレーム
がコードする蛋白質は複製に必須と考えられる。
次に、上記ｐＡｃＹｃ１８４、及びＤＮＡ塩基配列が報
告されている大腸菌のベクターｐＢＲ３２５［Ｐｉｅｒ
ｒｅＰｒｅｎｔｋｉ ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎｅ：ｖｏ１
１４．ｐ２８９−２９９（１９８１）、ベセスダ・リサ
ーチ社（日本ではコスモバイオ社）より購入可能〕並び
にザイモモナス・モビリスのプラスミドｐＺＭＩＡを用
いて、組換えテトラサイクリン耐性とクロラムフェニコ
ール耐性を宿主に与えるシャトルベクターｐＺＭ１７
（５４１４ｂｐ）を作製した（第５図、及び第６図参照
）。このシャトルベクターは、ザイモモナス属細菌の細
胞中で複製するために必要なすべての情報を有するプラ
スミドｐＺＭＩＡ部分、ザイモモナス属細菌及び大腸菌
の両者において選択マーカーとして機能するテトラサイ
クリン耐性遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子
、並びに大腸菌複製起点を含有している。
告されている大腸菌のベクターｐＢＲ３２５［Ｐｉｅｒ
ｒｅＰｒｅｎｔｋｉ ｅｔ ａｌ、 Ｇｅｎｅ：ｖｏ１
１４．ｐ２８９−２９９（１９８１）、ベセスダ・リサ
ーチ社（日本ではコスモバイオ社）より購入可能〕並び
にザイモモナス・モビリスのプラスミドｐＺＭＩＡを用
いて、組換えテトラサイクリン耐性とクロラムフェニコ
ール耐性を宿主に与えるシャトルベクターｐＺＭ１７
（５４１４ｂｐ）を作製した（第５図、及び第６図参照
）。このシャトルベクターは、ザイモモナス属細菌の細
胞中で複製するために必要なすべての情報を有するプラ
スミドｐＺＭＩＡ部分、ザイモモナス属細菌及び大腸菌
の両者において選択マーカーとして機能するテトラサイ
クリン耐性遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子
、並びに大腸菌複製起点を含有している。
ザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラー
ゼ遺伝子のプロモーター領域を、報告されティるＤＮＡ
塩基配列ＣＡ１ａｎ Ｄ、Ｎｅａｌｅ ｅｔ ａｌ。
ゼ遺伝子のプロモーター領域を、報告されティるＤＮＡ
塩基配列ＣＡ１ａｎ Ｄ、Ｎｅａｌｅ ｅｔ ａｌ。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ：ｖｏ
ｌ１５． ｎｏ４． ｐ１７５３（１９８７） ）に基
づき５′上流に制限酵素）ｆｉｎｄ■部位、３′下流に
制限酵素ＢａｍＨＩ部位を有する構造で化学合成した（
第７図参照）。化学合成した合成プロモーターをシャト
ルベクターｐＺＭ１７の旧ｎｄｌＪ 、 ＢａｍＨＩ切
断部位に挿入し発現用ベクターｐＺＭ１７ＥＸ （５１
３３ｂｐ）を作製した（第８図参照）。このベクターは
、デイモモナス細胞中で複製するために必要なすべての
情報を有するプラスミドｐＺＭＩＡ部分、ザイモモナス
属細菌及び大腸菌の両者にふいて選択マーカ−として機
能するテトラサイクリン耐性遺伝子及びクロラムフェニ
コール耐性遺伝子、大腸菌複製起点、並びにザイモモナ
ス細菌中で機能し得るプロモーターを含有し、このプロ
モーターの下流に異種構造遺伝子を挿入した場合にデイ
モモナス細胞中で異種遺伝子を発現せしめることができ
る。
ｌ１５． ｎｏ４． ｐ１７５３（１９８７） ）に基
づき５′上流に制限酵素）ｆｉｎｄ■部位、３′下流に
制限酵素ＢａｍＨＩ部位を有する構造で化学合成した（
第７図参照）。化学合成した合成プロモーターをシャト
ルベクターｐＺＭ１７の旧ｎｄｌＪ 、 ＢａｍＨＩ切
断部位に挿入し発現用ベクターｐＺＭ１７ＥＸ （５１
３３ｂｐ）を作製した（第８図参照）。このベクターは
、デイモモナス細胞中で複製するために必要なすべての
情報を有するプラスミドｐＺＭＩＡ部分、ザイモモナス
属細菌及び大腸菌の両者にふいて選択マーカ−として機
能するテトラサイクリン耐性遺伝子及びクロラムフェニ
コール耐性遺伝子、大腸菌複製起点、並びにザイモモナ
ス細菌中で機能し得るプロモーターを含有し、このプロ
モーターの下流に異種構造遺伝子を挿入した場合にデイ
モモナス細胞中で異種遺伝子を発現せしめることができ
る。
なお、前記プロモーターの側として、ザイモモナス・ピ
ルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター領域
を使用したが、デイモモナス細胞中で機能し得る任意の
プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、酸
性ホスファターゼ及びグリセルアルデヒド３リン酸デヒ
ドロゲナーゼ等を使用することもできる。
ルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター領域
を使用したが、デイモモナス細胞中で機能し得る任意の
プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、酸
性ホスファターゼ及びグリセルアルデヒド３リン酸デヒ
ドロゲナーゼ等を使用することもできる。
大腸菌のキシロースイソメラーゼ遺伝子（にｙｌＡ）を
大腸菌染色体ＤＮＡからベクターｐＡｃＹｃ１８４を用
いてクローニングした。このｘｙｌＡのプロモーターを
除去したＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ −Ｓｓｐ Ｉ ）（
第９図参照）を発現ベクターｐ２Ｍ１７ＥＸに挿入し、
組換えプラスミ）’ｐＸＩＰＸ（７８０１ｂｐ） ヲ作
ｔｃ）、ｔ： （第１図及び第１０図参照）。なお、挿
入する外来遺伝子としては、前記のキシロースイソメラ
ーゼ遺伝子のみならず、任意の外来遺伝子例えば、サル
モネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） 、ハシラス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）又は、ストレプトミ
セス・ビオラセオニジェ−（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅ
ｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）のキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子であることもできる。
大腸菌染色体ＤＮＡからベクターｐＡｃＹｃ１８４を用
いてクローニングした。このｘｙｌＡのプロモーターを
除去したＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ −Ｓｓｐ Ｉ ）（
第９図参照）を発現ベクターｐ２Ｍ１７ＥＸに挿入し、
組換えプラスミ）’ｐＸＩＰＸ（７８０１ｂｐ） ヲ作
ｔｃ）、ｔ： （第１図及び第１０図参照）。なお、挿
入する外来遺伝子としては、前記のキシロースイソメラ
ーゼ遺伝子のみならず、任意の外来遺伝子例えば、サル
モネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） 、ハシラス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）又は、ストレプトミ
セス・ビオラセオニジェ−（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅ
ｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ）のキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子であることもできる。
組換えプラスミドｐＸＩＰＸを保持する大腸菌及びザイ
モモナス・モビリスはキシロースイソメラーゼ活性を示
し、キシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）が発現
した（実施例９、及び第１表参照）。
モモナス・モビリスはキシロースイソメラーゼ活性を示
し、キシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）が発現
した（実施例９、及び第１表参照）。
以下、実施例で本発明の詳細な説明する。
ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ１０９８８株を、グル
コース１０．０％、酵母エキス１．０％、ＫＨ，ＰＯ４
０，２％を含む培地５００ｍ１で３０℃１日関静置培養
し、得られた菌体からアルカリ法（Ｈ８Ｃ０Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈニジｏ１７．ｐ１５１３（１９７８） ：ｌでプ
ラスミドを調製した。調製したプラスミドを０．８％ア
ガロースゲルを用いたゲル電気泳動法により分離し、１
，６ｋｂｐの分画プラスミドｐＺＭＩＡ、 Ｂ。
コース１０．０％、酵母エキス１．０％、ＫＨ，ＰＯ４
０，２％を含む培地５００ｍ１で３０℃１日関静置培養
し、得られた菌体からアルカリ法（Ｈ８Ｃ０Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｃｌｓ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈニジｏ１７．ｐ１５１３（１９７８） ：ｌでプ
ラスミドを調製した。調製したプラスミドを０．８％ア
ガロースゲルを用いたゲル電気泳動法により分離し、１
，６ｋｂｐの分画プラスミドｐＺＭＩＡ、 Ｂ。
及びＣをゲルから電気泳動溶出法により分離精製したく
第２図）。
第２図）。
ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ１０９８８株のプラス
ミドｐＺＭＩＡ １Ｎ及び大腸菌のベクターｐＡｃＹｃ
’１８４（４２４４ｂｐ） １Ｎを制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断後、ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌８８１
０１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテト
ラサイクリン耐性で且つクロラムフェニコール感受性の
形質転換体を得た。本形質転換体のプラスミドをアルカ
リ法で調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後アガロース
ゲル電気泳動により目的の組換えプラスミドであること
を確認した。
ミドｐＺＭＩＡ １Ｎ及び大腸菌のベクターｐＡｃＹｃ
’１８４（４２４４ｂｐ） １Ｎを制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断後、ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌８８１
０１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテト
ラサイクリン耐性で且つクロラムフェニコール感受性の
形質転換体を得た。本形質転換体のプラスミドをアルカ
リ法で調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後アガロース
ゲル電気泳動により目的の組換えプラスミドであること
を確認した。
の決定
ベクターｐＡｃＹｃ１８４に組込まれたザイモモナス・
モビリスＡＴＣＣ１０９８８株のプラスミドｐＺＭＩＡ
の制限酵素εｃｏＲＩ ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列
をジデオキシ法を用いて決定した。その結果ｐＺＭ１＾
は１６８３塩基対からなるプラスミドで、構造の特徴は
１２塩基を構成単位とした繰返し・配列で、連続して６
個、さらに１２０ｂｐ離れて７番目の繰返し配列が存在
していた。繰返し配列は大腸菌のプラスミドＲ６になど
の複製開始領域にも存在しており、ｐＺＭＩＡの場合も
この繰返し配列が複製開始領域であると考えられた。ま
た、オーブンリーディングフレームを検索した結果、約
ｌ ｋｂｐにわたる領域が存在し、そのコードする最長
の蛋白質は３３５個のアミノ酸からなる分子量的３９
ｋ ｄａｌｔｏｎの蛋白質であることが推定された（第
３図）。
モビリスＡＴＣＣ１０９８８株のプラスミドｐＺＭＩＡ
の制限酵素εｃｏＲＩ ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列
をジデオキシ法を用いて決定した。その結果ｐＺＭ１＾
は１６８３塩基対からなるプラスミドで、構造の特徴は
１２塩基を構成単位とした繰返し・配列で、連続して６
個、さらに１２０ｂｐ離れて７番目の繰返し配列が存在
していた。繰返し配列は大腸菌のプラスミドＲ６になど
の複製開始領域にも存在しており、ｐＺＭＩＡの場合も
この繰返し配列が複製開始領域であると考えられた。ま
た、オーブンリーディングフレームを検索した結果、約
ｌ ｋｂｐにわたる領域が存在し、そのコードする最長
の蛋白質は３３５個のアミノ酸からなる分子量的３９
ｋ ｄａｌｔｏｎの蛋白質であることが推定された（第
３図）。
転換
ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ１０９８８株のプラス
ミドｐ２Ｍ１＾１Ｎ及び大腸菌のベクターｐＡｃＹｃ１
８４１Ｋを制限酵素ＢｃｏＲＩにより、またはＨａｅ
Ｉ［［とＥＣＯＲＶとにより切断した後、ＤＮＡＩＪガ
ーゼにより連結し、大腸菌ｔｌＢ１０１株を形質転換し
、組換えプラスミドを保有するテトラサイクリン耐性で
且つクロラムフェニコール感受性の形質転換体（Ａ）及
びテトラサイクリン感受性で且つクロラムフェニコール
耐性形質転換体（Ｂ）をそれぞれ得た。
ミドｐ２Ｍ１＾１Ｎ及び大腸菌のベクターｐＡｃＹｃ１
８４１Ｋを制限酵素ＢｃｏＲＩにより、またはＨａｅ
Ｉ［［とＥＣＯＲＶとにより切断した後、ＤＮＡＩＪガ
ーゼにより連結し、大腸菌ｔｌＢ１０１株を形質転換し
、組換えプラスミドを保有するテトラサイクリン耐性で
且つクロラムフェニコール感受性の形質転換体（Ａ）及
びテトラサイクリン感受性で且つクロラムフェニコール
耐性形質転換体（Ｂ）をそれぞれ得た。
これら形質転換体のプラスミドをアルカリ法で調製し制
限酵素ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで切断後アガロース
ゲル電気泳動によりそれぞれ目的組換えプラスミド、９
２Ｍ１２ ’及び９２Ｍ１２であることを確認した。９
２Ｍ１２の作製過程を第５図に示す（なお、９２Ｍ１２
’の作製過程は図示されていない）。
限酵素ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで切断後アガロース
ゲル電気泳動によりそれぞれ目的組換えプラスミド、９
２Ｍ１２ ’及び９２Ｍ１２であることを確認した。９
２Ｍ１２の作製過程を第５図に示す（なお、９２Ｍ１２
’の作製過程は図示されていない）。
これら組換えプラスミドをヘルパープラスミドを利用し
た接合伝達法（Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１ｉｒｔｓｋｉ ｅｔ ａ
ｔ。
た接合伝達法（Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１ｉｒｔｓｋｉ ｅｔ ａ
ｔ。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、
＾： ｖｏ１７７、 ｐ７３４７ （１９８０） ）に
よりザイモモナス・モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３
株に導入した結果ｐＺＭＩＡの１（ａｅ ｍ切断部位と
ｐＡｃＹｃ１８４のεｃｏＲＶ切断部位で組換えた場合
（９２Ｍ１２）にのみ形質転換体が得られた（第４図Ｂ
）。
＾： ｖｏ１７７、 ｐ７３４７ （１９８０） ）に
よりザイモモナス・モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３
株に導入した結果ｐＺＭＩＡの１（ａｅ ｍ切断部位と
ｐＡｃＹｃ１８４のεｃｏＲＶ切断部位で組換えた場合
（９２Ｍ１２）にのみ形質転換体が得られた（第４図Ｂ
）。
実施例５． シャトルベクターＺＭ１７０作製大腸菌の
ベクターｐＢＲ３２５１ｚとｐＡｃＹｃ１８４１尾のそ
れぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＮｒｕＩとで切
断後、ＤＮＡ！Ｊガーゼにより連結し、大腸菌８８１０
１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテトラ
サイクリン耐性かつクロラムフェニコール耐性かつアン
ピシリン感受性の形ｉ転換体を得た。本形質転換体のプ
ラスミドをアルカリ法で調製し制限酵素ＥＣＯＲＩで切
断後アガロースゲル電気泳動により分子量を測定し、目
的組換えプラスミドｐＡｃＹｃ１８４−１であることを
確認した（第５図）。
ベクターｐＢＲ３２５１ｚとｐＡｃＹｃ１８４１尾のそ
れぞれを制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＮｒｕＩとで切
断後、ＤＮＡ！Ｊガーゼにより連結し、大腸菌８８１０
１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテトラ
サイクリン耐性かつクロラムフェニコール耐性かつアン
ピシリン感受性の形ｉ転換体を得た。本形質転換体のプ
ラスミドをアルカリ法で調製し制限酵素ＥＣＯＲＩで切
断後アガロースゲル電気泳動により分子量を測定し、目
的組換えプラスミドｐＡｃＹｃ１８４−１であることを
確認した（第５図）。
得られたｐＡｃＹｃ１８４−１を制限酵素Ｂｃｌ Ｉ
テ切断し、上記ｐＺＭ１２のｐＺＭＩＡを含むＢａｍＨ
Ｉ断片とＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌８８１０
１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテトラ
サイクリン耐性かつクロラムフェニコール耐性の形質転
換体を得た。本形質転換体のプラスミドをアルカリ法で
調製し制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気
泳動により分子量を測定し、シャトルベク？ −ｐＺＭ
１７（５４１４ｂｐ） テあルコトを確認した（第５図
及び第６図）。
テ切断し、上記ｐＺＭ１２のｐＺＭＩＡを含むＢａｍＨ
Ｉ断片とＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌８８１０
１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテトラ
サイクリン耐性かつクロラムフェニコール耐性の形質転
換体を得た。本形質転換体のプラスミドをアルカリ法で
調製し制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後アガロースゲル電気
泳動により分子量を測定し、シャトルベク？ −ｐＺＭ
１７（５４１４ｂｐ） テあルコトを確認した（第５図
及び第６図）。
ザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラー
ゼ遺伝子のプロモーター領域を報告されているＤＮＡ塩
基配列に基いて５′上流に制限酵素旧ｎｄｎＩ部位、３
′下流に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を有する構造で化学合
成した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＤ
ＮＡ合成装置を用い図に示す６５ｂの一本鎖ＤＮＡを各
々合成した後アニーリングにより目的の二重鎖ＤＮＡを
得た（第７図）。
ゼ遺伝子のプロモーター領域を報告されているＤＮＡ塩
基配列に基いて５′上流に制限酵素旧ｎｄｎＩ部位、３
′下流に制限酵素ＢａｍＨＩ部位を有する構造で化学合
成した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＤ
ＮＡ合成装置を用い図に示す６５ｂの一本鎖ＤＮＡを各
々合成した後アニーリングにより目的の二重鎖ＤＮＡを
得た（第７図）。
実施例７０発現ベクター１）２Ｍ１７８Ｘの作製シャト
ルベクターｐＺＭ１？ １ ｚを制限酵素ＨｉｎｄＩ
Ｉ［とＢａｍＨＩとで切断後、これと、前記の化学合成
した合成プロモーター０．１尾とをＤＮＡ！Ｊガーゼに
より連結し、大腸菌８８１０１株を形質転換し、組換え
プラスミドを保有するテトラサイクリン感受性かつクロ
ラムフェニコール感受性の形質転換体を得た。本形質転
換体からプラスミドをアルカリ法で調製し、制限酵素Ｈ
ｉｎｃｌｌとＢａｍＨＩとで切断後、アガロースゲル電
気泳動により目的組換えプラスミド発現ベクターｐｚＭ
１７Ｅｘ（５１３３ｂｐ）テアルコトヲ確認した（第８
図）。
ルベクターｐＺＭ１？ １ ｚを制限酵素ＨｉｎｄＩ
Ｉ［とＢａｍＨＩとで切断後、これと、前記の化学合成
した合成プロモーター０．１尾とをＤＮＡ！Ｊガーゼに
より連結し、大腸菌８８１０１株を形質転換し、組換え
プラスミドを保有するテトラサイクリン感受性かつクロ
ラムフェニコール感受性の形質転換体を得た。本形質転
換体からプラスミドをアルカリ法で調製し、制限酵素Ｈ
ｉｎｃｌｌとＢａｍＨＩとで切断後、アガロースゲル電
気泳動により目的組換えプラスミド発現ベクターｐｚＭ
１７Ｅｘ（５１３３ｂｐ）テアルコトヲ確認した（第８
図）。
大腸菌に１２株の染色体ＤＮＡ１０ｍｇ及び１０層のｐ
ＡｃＹｃ１８４を制限酵素旧ｎｄＩＩＩで切断後ＤＮＡ
リガーゼにより連結し、キシロースイソメラーゼ欠損変
異株である大腸菌８８１０１株を形質転換しＥＭＢキシ
ロース選択培地（ポリペプトン１．０％、Ｋ）１２ＰＯ
４０，２％、酵母エキス０．１％、キシロース１．０％
、Ｅｏｓｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗ Ｑ、０４％、Ｍｅｔｈ
ｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ Ｏ，００６５％、寒天２．０％
、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌ）に塗布し３７℃
２日間培養し、キシロース資化性を示す暗黒色の形質転
換体を得た。得られた形質転換体のプラスミドをアルカ
リ法で調製し制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後アガロー
スゲル電気泳動により分子量を測定し、報告されている
ＤＮＡ塩基配列情報（Ｖ、Ｂｒｙａｎ Ｌａｗｌｉｓら
、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｂｎｖｉｒｏｎ−ｍｅｎｔ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ｖｏ１４７．ｎｏｌ
、ｐ１５−２１（１９８４）に基きキシロースイソメラ
ーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）を含む制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［
ＤＮＡ断片（第９図参照）がクローニングされているこ
とを確認した。
ＡｃＹｃ１８４を制限酵素旧ｎｄＩＩＩで切断後ＤＮＡ
リガーゼにより連結し、キシロースイソメラーゼ欠損変
異株である大腸菌８８１０１株を形質転換しＥＭＢキシ
ロース選択培地（ポリペプトン１．０％、Ｋ）１２ＰＯ
４０，２％、酵母エキス０．１％、キシロース１．０％
、Ｅｏｓｉｎｅ ｙｅｌｌｏｗ Ｑ、０４％、Ｍｅｔｈ
ｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ Ｏ，００６５％、寒天２．０％
、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌ）に塗布し３７℃
２日間培養し、キシロース資化性を示す暗黒色の形質転
換体を得た。得られた形質転換体のプラスミドをアルカ
リ法で調製し制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後アガロー
スゲル電気泳動により分子量を測定し、報告されている
ＤＮＡ塩基配列情報（Ｖ、Ｂｒｙａｎ Ｌａｗｌｉｓら
、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｂｎｖｉｒｏｎ−ｍｅｎｔ
ａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ｖｏ１４７．ｎｏｌ
、ｐ１５−２１（１９８４）に基きキシロースイソメラ
ーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）を含む制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［
ＤＮＡ断片（第９図参照）がクローニングされているこ
とを確認した。
ｘｙｌＡのプロモーターと構造遺伝子の間にある制限酵
素５ａｃｌ Ｉ切断部位に制限酵素Ｂａｍｔ（Ｉ切断部
位を含むＤＮＡ切断である１３ａｍＨＩ ！Ｊンカーを
挿入し、ｘｙｌＡを含む制限酵素Ｂａｍ）Ｉ Ｉ −Ｓ
ｓｐ Ｉ ＤＮＡ断片を組換えプラスミドから調製し
た。このＤＮＡ断片ＩＫと、制限酵素Ｂａｍｆｌ Ｉ及
び旧ｎｃＩＩで切断した発現ベクターｐＺＭ１７ＥＸ
１ ｚとをＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌８８
１０１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテ
トラサイクリン感受性かつクロラムフェニコール耐性の
形質転換体を得た。本形質転換体のプラスミドをアルカ
リ法で調製し制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌ ＩＩで切断
後アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片の分子量を
測定し、目的組換えプラスミドｐＸＩＰＸ （７８０１
ｂｐ）であることを確認した（第１０図）。この組換え
プラスミドｐＸＩＰＸをヘルパープラスミドを利用した
接合伝達法によりザイモモナス・モビリスＮＲＲＬ Ｂ
−１４０２３株に導入し形質転換体が得られた。
素５ａｃｌ Ｉ切断部位に制限酵素Ｂａｍｔ（Ｉ切断部
位を含むＤＮＡ切断である１３ａｍＨＩ ！Ｊンカーを
挿入し、ｘｙｌＡを含む制限酵素Ｂａｍ）Ｉ Ｉ −Ｓ
ｓｐ Ｉ ＤＮＡ断片を組換えプラスミドから調製し
た。このＤＮＡ断片ＩＫと、制限酵素Ｂａｍｆｌ Ｉ及
び旧ｎｃＩＩで切断した発現ベクターｐＺＭ１７ＥＸ
１ ｚとをＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌８８
１０１株を形質転換し、組換えプラスミドを保有するテ
トラサイクリン感受性かつクロラムフェニコール耐性の
形質転換体を得た。本形質転換体のプラスミドをアルカ
リ法で調製し制限酵素ＢａｍＨＩとＢｇｌ ＩＩで切断
後アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片の分子量を
測定し、目的組換えプラスミドｐＸＩＰＸ （７８０１
ｂｐ）であることを確認した（第１０図）。この組換え
プラスミドｐＸＩＰＸをヘルパープラスミドを利用した
接合伝達法によりザイモモナス・モビリスＮＲＲＬ Ｂ
−１４０２３株に導入し形質転換体が得られた。
大腸菌ＪＭ１０３株、大腸菌８８１０１株、及びｐＸＩ
ＰＸで形質転換した大腸菌ＨＢＩ旧株、並びにザイモモ
ナス−％ ｌ：” ＩＪ 、２．ＮＲＲＬ Ｂ−１４０
２３株、及びｐＸＩＰＸで形質転換したザイモモナス・
モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３株のキシロースイソ
メラーゼ活性をＶ、 ＢｒｙａｎＬａｗｌｉｓらの方法
〔文献： Ｖ、 Ｂｒｙａｎ Ｌａｗｌｉｅｓ ら、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ：ｖｏ１４７． ｎｏｌ、
ｐ１５−２１ （１９８４） 〕を用いて測定した。
ＰＸで形質転換した大腸菌ＨＢＩ旧株、並びにザイモモ
ナス−％ ｌ：” ＩＪ 、２．ＮＲＲＬ Ｂ−１４０
２３株、及びｐＸＩＰＸで形質転換したザイモモナス・
モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３株のキシロースイソ
メラーゼ活性をＶ、 ＢｒｙａｎＬａｗｌｉｓらの方法
〔文献： Ｖ、 Ｂｒｙａｎ Ｌａｗｌｉｅｓ ら、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ：ｖｏ１４７． ｎｏｌ、
ｐ１５−２１ （１９８４） 〕を用いて測定した。
大腸菌はキシロースを含むＹＴ培地（グルコース０．８
％、キシロース０．２％、酵母エキス０．５％及びＮａ
Ｃ１０，５％）１００ｍｌで３７℃、１８時間培養し、
ザイモモナス・モビリスはグルコース１０．０％、酵母
エキス１．０％及びＫＨ２Ｐ０４０．２％を含む培地１
０〇−で３０℃１日間静置培養し、得られた菌体をＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，０）５０ｍＭ緩衝液で洗浄後
、超音波破砕器で細胞を破砕し遠心分離（１２，００Ｏ
ｒｐｍ 、 ４℃、１５分）後の上清を粗酵素液とした
。
％、キシロース０．２％、酵母エキス０．５％及びＮａ
Ｃ１０，５％）１００ｍｌで３７℃、１８時間培養し、
ザイモモナス・モビリスはグルコース１０．０％、酵母
エキス１．０％及びＫＨ２Ｐ０４０．２％を含む培地１
０〇−で３０℃１日間静置培養し、得られた菌体をＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，０）５０ｍＭ緩衝液で洗浄後
、超音波破砕器で細胞を破砕し遠心分離（１２，００Ｏ
ｒｐｍ 、 ４℃、１５分）後の上清を粗酵素液とした
。
結果を第１表に示す。
第１表
大腸菌及びザイモモナス・モビリス
のキシロースイソメラーゼ活性
即ち、大腸菌ＪＭ１０３株は野性株と同様のキシロース
オペロンを保持しているため２７．９（ユニット７ｍｇ
蛋白質）のキシロースイソメラーゼ活性を示した。大腸
菌１（８１０１株はキシロースイソメラーゼ欠損変異株
であるため、わずか１．７（ユニット／／ｍｇ蛋白質）
の活性を示すに過ぎなかった。ｐＸＩＰＩＸを保持する
大腸菌８８１０１株は大腸菌ＪＭ１０３株を上回る５２
．７（ユニッ）／ｍｇ蛋白質）の活性を示し、ザイモモ
ナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子
合成プロモーターが大腸菌８８１０１株中で機能するこ
とを示した。ザイモモナス・モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１
４０２３株はわずか０．４（ユニット７ｍｇ蛋白質）の
値を示すに過ぎずキシロースイソメラーゼ活性を実質的
に示さなかったが、ｐＸＩＰＸを保持するザイモモナス
・モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３株１ｔ１９．１（
ユニット７ｍｇ蛋白質）のキシロースイソメラーゼ活性
を示した。この結果から発現ベクターｐＺＭ１７ＥＸ（
５１３３ｂｐ） ハサイ％％ナス・％ ヒＩＪ 、ｒ、
ＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３株中で機能し大腸菌のキシロ
ースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）を発現させること
が確認された。
オペロンを保持しているため２７．９（ユニット７ｍｇ
蛋白質）のキシロースイソメラーゼ活性を示した。大腸
菌１（８１０１株はキシロースイソメラーゼ欠損変異株
であるため、わずか１．７（ユニット／／ｍｇ蛋白質）
の活性を示すに過ぎなかった。ｐＸＩＰＩＸを保持する
大腸菌８８１０１株は大腸菌ＪＭ１０３株を上回る５２
．７（ユニッ）／ｍｇ蛋白質）の活性を示し、ザイモモ
ナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子
合成プロモーターが大腸菌８８１０１株中で機能するこ
とを示した。ザイモモナス・モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１
４０２３株はわずか０．４（ユニット７ｍｇ蛋白質）の
値を示すに過ぎずキシロースイソメラーゼ活性を実質的
に示さなかったが、ｐＸＩＰＸを保持するザイモモナス
・モビリスＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３株１ｔ１９．１（
ユニット７ｍｇ蛋白質）のキシロースイソメラーゼ活性
を示した。この結果から発現ベクターｐＺＭ１７ＥＸ（
５１３３ｂｐ） ハサイ％％ナス・％ ヒＩＪ 、ｒ、
ＮＲＲＬ Ｂ−１４０２３株中で機能し大腸菌のキシロ
ースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）を発現させること
が確認された。
キシロースイソメラーゼはキシロースをキシルロースに
変換するとともにフラクトースをグルコースに変換する
。よって、ザイモモナス属菌内での・キシロースイソメ
ラーゼの発現はキシロース発酵の第１段階であるととも
にフラクトース発酵速度の増大に大いに寄与する。従っ
て、本発明における異種遺伝子高発現ベクター及び該ベ
クターにより形質転換された宿主細胞を用いれば、酵母
と同程度以上のアルコール産生能を有することが可能と
なった。
変換するとともにフラクトースをグルコースに変換する
。よって、ザイモモナス属菌内での・キシロースイソメ
ラーゼの発現はキシロース発酵の第１段階であるととも
にフラクトース発酵速度の増大に大いに寄与する。従っ
て、本発明における異種遺伝子高発現ベクター及び該ベ
クターにより形質転換された宿主細胞を用いれば、酵母
と同程度以上のアルコール産生能を有することが可能と
なった。
第１図は、ｐＸＩＰＸのＤＮＡ塩基配列及び該配列から
予想されるアミノ酸配列を示す。 第２図は、ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ１０９８８
株の低分子量プラスミドｐ２ＭＩＡ、 Ｂ及びＣの制限
酵素切断地図を示す。 第３図は、ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ１０９８８
株の低分子量プラスミドｐ２ＭＩＡの模式図と制限酵素
地図を示す。 第４図Ａ中、及びＢは、それぞれ、ｐＺＭＩＡとｐＡｃ
Ｙｃ１８４との組換えプラスミドｐＺＭ１２’及びｐ１
２Ｍ１２の模式図を示す。 第５図は、ｐ２Ｍ１２ 、ｐＡｃＹｃ１８４−１及びｐ
ＺＭ１７のプラスミド作製工程を示す。 第６図は、ｐ２Ｍ１７の模式図を示す。 第７図は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の合成
プロモーターのＤＮＡ塩基配列を示す。 第８図は、９２Ｍ１７ＥＫの模式図を示す。 第９図は、キシロースイソメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片の模式図を示す。 第１０図は、ｐＸＩＰＸの模式図を示す。
予想されるアミノ酸配列を示す。 第２図は、ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ１０９８８
株の低分子量プラスミドｐ２ＭＩＡ、 Ｂ及びＣの制限
酵素切断地図を示す。 第３図は、ザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ１０９８８
株の低分子量プラスミドｐ２ＭＩＡの模式図と制限酵素
地図を示す。 第４図Ａ中、及びＢは、それぞれ、ｐＺＭＩＡとｐＡｃ
Ｙｃ１８４との組換えプラスミドｐＺＭ１２’及びｐ１
２Ｍ１２の模式図を示す。 第５図は、ｐ２Ｍ１２ 、ｐＡｃＹｃ１８４−１及びｐ
ＺＭ１７のプラスミド作製工程を示す。 第６図は、ｐ２Ｍ１７の模式図を示す。 第７図は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の合成
プロモーターのＤＮＡ塩基配列を示す。 第８図は、９２Ｍ１７ＥＫの模式図を示す。 第９図は、キシロースイソメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片の模式図を示す。 第１０図は、ｐＸＩＰＸの模式図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ザイモモナス（￥Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ￥）属細菌の
細胞中で複製することができ且つ第３図に示す制限酵素
地図により特定される構造又はこれと実質的に同じ構造
を有するプラスミド。 ２、第１図に示す塩基配列中第５４１４位の塩基から第
７０９６位の塩基までの塩基配列又はこれと実質的に同
じ塩基配列を含む、請求項１に記載のプラスミド。 ３、請求項１又は２に記載のプラスミド及びザイモモナ
ス属細菌の細胞中で機能する追加のプロモーターを含有
し、該追加のプロモーターの下流に異種遺伝子を挿入し
た場合に該異種遺伝子をザイモモナス属細菌の細胞中で
発現させることができる発現用ベクター。 ４、大腸菌複製起点及び大腸菌選択マーカー遺伝子をさ
らに含有するシャトルベクターである請求項３に記載の
発現用ベクター。 ５、前記大腸菌選択マーカー遺伝子がテトラサイクリン
耐性遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子である
請求項４に記載の発現用ベクター。 ６、前記追加のプロモーターがザイモモナス・モビリス
（￥Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ￥￥ｍｏｂｉｌｉｓ￥）のピル
ビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターである
請求項３又は４に記載の発現用ベクター。 ７、（１）請求項１又は２に記載のプラスミド、（２）
ザイモモナス・モビリスのピルビン酸デカルボキシラー
ゼ遺伝子のプロモーター、（３）大腸菌複製起点、（４
）テトラサイクリン耐性遺伝子、及び（５）クロラムフ
ェニコール耐性遺伝子を含んで成り、前記プロモーター
の下流に異種遺伝子を挿入した場合にサブモモナス属細
菌の細胞中で該異種遺伝子を発現することができる発現
用ベクター。 ８、請求項３〜７のいずれか１項に記載の発現用ベクタ
ーの前記追加のプロモーターの下流に大腸菌由来のキシ
ロースイソメラーゼ遺伝子が挿入されているキシロース
イソメラーゼ発現ベクター。 ９、請求項８に記載の発現ベクターにより形質転換され
ておりそしてキシロースイソメラーゼ活性を発現するこ
とができるザイモモナス属細菌。 １０、請求項９に記載のザイモモナス属細菌をキシロー
ス及び／又はフラクトースを含有する培地中で培養し、
培養液からエタノールを採取することを特徴とするエタ
ノールの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2176420A JPH0466090A (ja) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | 異種遺伝子高発現ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2176420A JPH0466090A (ja) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | 異種遺伝子高発現ベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0466090A true JPH0466090A (ja) | 1992-03-02 |
Family
ID=16013388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2176420A Pending JPH0466090A (ja) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | 異種遺伝子高発現ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0466090A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010504756A (ja) * | 2006-09-28 | 2010-02-18 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生 |
| JP2010504757A (ja) * | 2006-09-28 | 2010-02-18 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 糖アルコールの存在下でキシロースを含有する混合糖類の発酵における改善されたエタノール産生 |
-
1990
- 1990-07-05 JP JP2176420A patent/JPH0466090A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010504756A (ja) * | 2006-09-28 | 2010-02-18 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のキシリトール合成変異体を使用するエタノール産生 |
| JP2010504757A (ja) * | 2006-09-28 | 2010-02-18 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 糖アルコールの存在下でキシロースを含有する混合糖類の発酵における改善されたエタノール産生 |
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