CN113444763B

CN113444763B - 树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法

Info

Publication number: CN113444763B
Application number: CN202110934837.3A
Authority: CN
Inventors: 谭芙蓉; 孙玲玲; 何明雄; 吴波; 王彦伟; 祝其丽
Original assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Current assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Priority date: 2021-08-16
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-08-16
Also published as: CN113444763A

Abstract

本发明公开了一种树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，属于微生物发酵技术领域，优选Scheffersomyces stipitisCICC1960与Zymomonas mobilis 8b以1:3的比例同时接种到含葡萄糖和木糖的培养基中进行摇床发酵，碳代谢抑制的现象得到了很大的缓解，即葡萄糖和木糖可以同时被消耗；混菌发酵的最终木糖利用量和乙醇发酵浓度比S.stipitisCICC1960单菌发酵分别提升了188.99％、48.37％，比Z.mobilis 8b单菌发酵分别提升了5.52％、6.52％；发酵过程操作简单，乙醇发酵效率高。

Description

树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法。

背景技术

木质纤维素生物质是由植物的光合作用合成，每年的年产量高达1×10¹⁰吨，是地球上储量最丰富的可再生资源。将木质纤维素生物质转化成燃料乙醇等可再生清洁能源，以部分代替石油、天然气等传统的化石能源，不仅可以实现废弃物(秸秆、木屑等)的资源化利用，而且有助于缓解当前的全球气候变暖进程。

用木质纤维素生物质生产乙醇，即二代燃料乙醇，虽然技术上可行，但生产成本高昂，这成为限制二代燃料乙醇大规模生产的主要原因，这其中的一个表现正为葡萄糖和木糖的共利用问题。经过预处理和酶解后，木质纤维素生物质主要转变为葡萄糖和木糖，但无论是自然界中本身能发酵木糖的菌株，如S.stipitis，还是通过基因工程引入木糖代谢途径的重组菌株，如Saccharomyces cerevisiae和Z.mobilis，往往都存在着碳代谢抑制现象(即，在葡萄糖与其他糖共存的情况下，微生物往往优先利用葡萄糖，待葡萄糖消耗殆尽时，微生物才开始利用其他糖类)。由于碳代谢抑制的分子机理十分复杂：不同菌株的碳代谢抑制机理不尽相同；即使是同一种菌，如Escherichia coli，其具体的作用途径也较多(参见：Kim SR,Ha S,Wei N,Oh EJ,Jin Y.Simultaneous co-fermentation of mixed sugars:apromising strategy for producing cellulosic ethanol.Trends Biotechnol.2012；30(5):274-82)，目前很难找到合适的靶点去完全解决这个问题。目前虽然有些研究通过菌株的适应性进化等方法缓解了碳代谢抑制现象，但是发酵菌株对葡萄糖和木糖的共利用效率依然较低(参见：Sarkar P,Mukherjee M,Goswami G,Das D.Adaptive laboratoryevolution induced novel mutations in Zymomonas mobilis ATCC ZW658:a potentialplatform for co-utilization of glucose and xylose.J Ind MicrobiolBiotechnol.2020；47(3):329-41.)。

目前已有文献报道了树干毕赤酵母(S.stipitis)发酵木糖产乙醇，并且葡萄糖的适量加入可以在一定程度上提高木糖的代谢速率缩短发酵时间，葡萄糖含量越高，乙醇产率越大；但是，葡萄糖加入过多反而会加重碳代谢抑制，甚至使得树干毕赤酵母无法利用木糖；此外，也报道了运动发酵单胞菌(Z.mobilis)与葡萄糖和木糖共发酵；

为了解决上述问题，越来越多的学者把目光转向了混菌发酵，即将两种或两种以上的菌同时接种或顺序接种来进行发酵。

S.stipitis天然具备葡萄糖和木糖的利用能力，其木糖利用能力是目前公认的自然界中能力最强的菌株之一；Z.mobilis利用ED途径代谢葡萄糖，乙醇发酵与细胞生长部分偶联，因而与S.cerevisia相比，Z.mobilis可以将糖更大限度地转化为乙醇(参见：Xia J,Yang Y,Liu C-G,Yang S,Bai F-W.Engineering Zymomonas mobilis for RobustCellulosic Ethanol Production.Trends Biotechnol.2019；37(9):960-72.)。

基于此，很多研究者尝试利用S.stipitis与Z.mobilis混菌发酵生产乙醇。

目前的发酵方法为：

1)基于S.stipitis碳代谢抑制的考虑：研究者先接种Z.mobilis以消耗培养基中的葡萄糖，然后将发酵液连续流入另一个接种有S.stipitis的发酵罐以发酵木糖(参见：Chaudhary G,Ghosh S.Two-reactor,continuous culture fermentation for fuelethanol production from lignocellulosic acid hydrolysate using Zymomonasmobilis and Scheffersomyces stipitis.RSC Adv.2014；4(69):36412-8.以及：WirawanF,Cheng C-L,Lo Y-C,Chen C-Y,Chang J-S,Leu S-Y,et al.Continuous cellulosicbioethanol co-fermentation by immobilized Zymomonas mobilis and suspendedPichia stipitis in a two-stage process.Appl Energy.2020；266:114871)；或者通过无机溶剂分步萃取和蒸汽爆破相结合的方法将木质纤维素中的葡萄糖和木糖分开，然后在发酵罐内先接种S.stipitis以发酵木糖，然后将葡萄糖部分和Z.mobilis加入同一个发酵罐内以实现葡萄糖向乙醇的转化(两步法发酵，参见：Singh LK,Majumder CB,GhoshS.Development of sequential-co-culture system(Pichia stipitis and Zymomonasmobilis)for bioethanol production from Kans grass biomass.Biochem Eng J.2014；82:150-7)；

2)基于发酵菌株低密度接种时，悬浮状态下的Z.mobilis会对S.stipitis的木糖利用性能造成负面影响，研究者将S.stipitis与Z.mobilis一方或双方都固定，然后将混合在一起进行发酵(参见：Fu N,Peiris P,Markham J,Bavor J.A novel co-cultureprocess with Zymomonas mobilis and Pichia stipitis for efficient ethanolproduction on glucose/xylose mixtures.Enzyme Microb Technol.2009；45(3):210-7以及：Nguyen DTT,Praveen P,Loh K-C.Co-culture of Zymomonas mobilis andScheffersomyces stipitis immobilized in polymeric membranes for fermentationof glucose and xylose to ethanol.Biochem Eng J.2019；145:145-52)。

目前的上述发酵方法通常操作繁琐，且葡萄糖和木糖的共利用效率不高，如文献：

“Co-culture of Zymomonas mobilis and Scheffersomyces stipitisimmobilized in T polymeric membranes for fermentation of glucose and xyloseto ethanol”所报道的，葡萄糖和木糖的总转化率低至67.6％，木糖的转化率低至2.8％，得到的乙醇浓度为28g/L，产率0.34g/g，乙醇产生速率0.40g/L/h。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，将树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌按照体积比(1:3)～(3:1)的比例同时接种到含有葡萄糖和木糖的培养基中。

作为优选的技术方案：所述树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌按照体积比为1:3接种。采用该比例，在其他条件相同的情况下，木糖利用率和乙醇发酵浓度均更高。

作为优选的技术方案：所述培养基中，葡萄糖与木糖的质量比为2：1。适宜的葡萄糖与木糖比例，可以使共利用发酵进展更顺利。

作为优选的技术方案：发酵时采用摇床。

作为进一步优选的技术方案：摇床转速为100～200rpm。

作为更进一步优选的技术方案：摇床转速为150rpm。适宜的摇床转速，可以使发酵效率和共利用效率提高。

作为优选的技术方案：所述树干毕赤酵母为S.stipitis CICC1960，该菌株为工业菌株，具有工业菌株所具有的所有特点和优势。

作为优选的技术方案：所述运动发酵单胞菌为Z.mobilis 8b。

运动发酵单胞菌Z.mobilis虽然本身具有很强的葡萄糖代谢能力，但是其对于秸秆水解液中的第二大糖类—木糖却无能为力，除非其基因组内已含有外源的木糖代谢途径，如Z.mobilis 8b。

S.stipitis本身具有优良的木糖代谢能力，但是当环境中葡萄糖与木糖共存时，S.stipitis总是优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后，再经过一段较长的延滞期，S.stipitis才开始利用木糖，这严重阻碍了工业化乙醇生产的效率。

由于本申请是将S.stipitis与Z.mobilis同时接种，而并非传统模式(即采用两步法发酵，或将菌株固定后再进行发酵)。因而，与传统模式相比，本研究采用的发酵方式较为简单，这有利于简化纤维素乙醇生产工艺流程，提高发酵效率。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本申请将树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌按照一定比例同时接种，达到了葡萄糖和木糖共利用提升产乙醇效率的效果；两株菌同时接种，无需固化，简化了发酵流程，操作更方便，操作效率更高。

附图说明

图1为实施例中S.stipitis CICC1960单菌发酵、Z.mobilis 8b单菌发酵、S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b以1:3的接种比(v/v)混菌发酵时的葡萄糖消耗情况；

图2为实施例中S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b以3:1～1:2的接种比(v/v)混菌发酵时的葡萄糖消耗情况；

图3为实施例中S.stipitis CICC1960单菌发酵、Z.mobilis 8b单菌发酵、S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b以1:3的接种比(v/v)混菌发酵时的木糖消耗情况；

图4为实施例中S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b以3:1～1:2的接种比(v/v)混菌发酵时的木糖消耗情况；

图5为实施例中S.stipitis CICC1960单菌发酵、Z.mobilis 8b单菌发酵、S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b以1:3的接种比(v/v)混菌发酵时的乙醇产生情况；

图6为实施例中S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b以3:1～1:2的接种比(v/v)混菌发酵时的乙醇产生情况。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

下述实施例所使用的培养基：

RM培养基：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L KH₂PO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，2g/LMgSO₄；

80G40XRM培养基：80g/L葡萄糖，40g/L木糖，10g/L酵母提取物，2g/L KH₂PO₄，1g/L(NH₄)₂SO₄，2g/L MgSO₄；

YPD培养基：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨；

YP120X培养基：120g/L木糖，10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨；

固体培养基(平板)需另加15g/L琼脂。

实施例：

一种树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，包括如下步骤：

(1)菌株的活化

Z.mobilis的活化：将Z.mobilis 8b在RM平板上划线，30℃培养2天；从平板上挑取单菌落于5mL 80G40XRM培养基中，30℃静止培养至液体浑浊。将5mL的菌液全部倒入100mL新鲜的80G40XRM培养基中，30℃静止培养约22h，此时的OD₆₀₀约为1.8～1.9(本发明中OD₆₀₀由Beckman Coulter生产的紫外分光光度计测定，仪器型号为UV795S)。

S.stipitis的活化：将S.stipitis CICC1960在YPD平板上划线，30℃培养1天；从平板上挑取单菌落于5mL YP120X培养基中，30℃150rpm培养至液体浑浊，将5mL的菌液全部倒入100mL新鲜的YP120X培养基中，30℃150rpm培养约22h，此时的OD₆₀₀约为1.8～1.9。

(2)混菌发酵的接种方式

将100mL的菌液用同一个50mL的离心管离心(4000g，4℃离心5min)，分别倒去上清液后，加入50mL无菌ddH₂O重悬，4000g，4℃离心5min，然后用4mL新鲜的80G40XRM培养基重悬；

在100mL的无菌锥形瓶中事先装入48mL的80G40XRM液体培养基，然后向其中接入不同比例的S.stipitis CICC1960和Z.mobilis 8b的种子液(具体接种方式见表1)，每个发酵瓶中的总接种体积为2mL；发酵条件为30℃150rpm。

表1混菌发酵接种方式

(3)发酵液中葡萄糖、木糖和乙醇浓度的测定

在发酵的不同时间点分别取样500μL，13000g离心2min，并立即置于-20℃冰箱中保存。测样时将样品从冰箱中取出，溶解，涡旋均匀后，再次13000g离心2min；分别吸取20μL的上清液用980μL灭过菌的ddH₂O稀释，涡旋均匀；最后用0.22μm的滤膜过滤至HPLC专用测样瓶，用HPLC测量各个稀释样品中的葡萄糖、木糖和乙醇的浓度。

HPLC的测样参数：进样量20.0μL，温度35℃，流速0.600mL/min，流动相为5mMH₂SO₄，色谱柱为HPX-87P(Biorad)。

样品中各物质的实际浓度为HPLC测出的各物质浓度乘以稀释倍数(50)，结果见表2。

乙醇产生速率：乙醇浓度(g/L)/时间(h)；

乙醇产率：乙醇浓度(g/L)/消耗的葡萄糖和木糖浓度之和(g/L)；

乙醇的理论产率为0.51g/g。

显著性检验：利用IBM SPSS Statistics(version 22)进行数据显著性分析。若实验数据满足方差齐性(P>0.05)，则采用One-way ANOVA的方法进行显著性分析，事后检验方法为Turkey法；若不满足方差齐性，则采用Kruskal-Wallis H进行非参数检验。显著性分析结果P<0.05，则表明此两组数据差异具有显著性；显著性分析结果P<0.01，则表明此两组数据差异具有极显著性。

表2 S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b在80G40XRM中混菌发酵的乙醇转化效率^a

^a本实验均采用4个平行，表中的数据为平均值±标准差。

^*代表混菌发酵数据与Z.mobilis 8b单菌发酵数据相比具有显著性差异(没有显著差异，P>0.05；^**,P<0.01)。

不同发酵方式的葡萄糖消耗情况对比如图1、2所示，木糖消耗情况对比如图3、4所示，乙醇发酵情况对比如图5、6所示；

从图中可以看出：

对于S.stipitis CICC1960单菌发酵，葡萄糖在前6h内利用速度较慢(从初始的76.29g/L下降到68.56g/L)，随后进入葡萄糖的快速利用阶段，大约在27h时耗尽；而木糖的消耗是在葡萄糖耗尽后才开始进行(图1，3)，这说明S.stipitis CICC1960在发酵葡萄糖和木糖时出现了明显的碳代谢抑制现象。

对于Z.mobilis 8b单菌发酵，葡萄糖的利用曲线一直呈现陡降趋势，在6h时葡萄糖已消耗殆尽(图1)。Z.mobilis 8b对木糖的利用与葡萄糖的利用同步，即未出现明显的碳代谢抑制现象，这可能与Z.mobilis 8b的高接种量有关(本实施例中Z.mobilis 8b发酵的初始OD₆₀₀约为1.8)。由于外源的木糖代谢基因xylA、xylB、tktA、talB是整合在Z.mobilis8b基因组内，因而，对于个体细胞而言，这些基因的表达量较低。所以，当之前研究者以低接种量(初始OD₆₀₀为0.2)进行接种时，Z.mobilis 8b对木糖的利用要滞后于葡萄糖的利用。相反，当本实施例以高接种量对Z.mobilis 8b进行接种，这些基因所编码酶的整体活性会得到有效地提升，因而促进了培养基中葡萄糖和木糖的共利用。在发酵终点(21h)时，木糖的残余量为6.16g/L(图3)，乙醇的产率为0.48g/g。

对于S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b的混菌发酵，从图1，2中可知，Z.mobilis 8b接种比例越高，葡萄糖的利用速率越快，但混菌发酵的葡萄糖利用速率都略微低于Z.mobilis 8b单菌发酵的葡萄糖利用速率；不同接种比例的混菌发酵均在9h内将葡萄糖全部消耗。对于木糖的利用而言，在混菌发酵的初始阶段，木糖就可以与葡萄糖的利用同步；Z.mobilis 8b接种量越高，木糖的利用速率也越快(当S.stipitis CICC1960:Z.mobilis 8b＝3:1时，木糖的利用速率为0.92g/L/h；当S.stipitis CICC1960:Z.mobilis8b＝1:3时，木糖的利用速率提升至2.38g/L/h)；不同接种比例的混菌发酵均在21h内将木糖消耗结束(图3，4)。当接种比例为1:1、1:2和1:3时，木糖总消耗量分别达到36.60g/L，37.06g/L和36.73g/L，均极显著(P<0.01)高于S.stipitis CICC1960单菌发酵(12.71g/L)和Z.mobilis 8b单菌发酵(34.81g/L)的木糖消耗量(表2)。

这些结果表明，S.stipitis CICC1960与Z.mobilis 8b的混菌发酵有助于提升培养基中木糖的消耗量，并最终提升乙醇发酵浓度。特别的是，当S.stipitis CICC1960:Z.mobilis 8b＝1:3时，培养基中产生的乙醇浓度达到了57.21g/L，高于其他发酵方式的乙醇产量(表2)；而且，此接种比例下混菌发酵的乙醇产率高达98％(乙醇产率的理论值为0.51g/g糖)(表2)，远高于Nguyen等探究的S.stipitis与Z.mobilis混菌发酵的最高乙醇产率(72.55％)。

因而，选用S.stipitis CICC1960:Z.mobilis 8b＝1:3的接种比例来进行混菌发酵为较佳比例。

另外，为了探究上述方案中混菌发酵(S.stipitis CICC1960:Z.mobilis 8b＝1:3)比S.stipitis CICC1960单菌发酵、Z.mobilis 8b单菌发酵木糖利用量和乙醇终浓度提升的原因，发明人采用RT-qPCR方法分析了两株菌在混菌发酵过程中木糖代谢相关基因表达量与单菌发酵时相应基因表达量的比值的变化，结果表明混菌发酵在木糖利用和乙醇产生方面的优势可能与混菌发酵中后期Z.mobilis 8b木糖代谢作用增强有关。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，其特征在于：将树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌按照体积比1:3～3:1的比例同时接种到含有葡萄糖和木糖的培养基中；

其中，所述树干毕赤酵母为Scheffersomyces stipitis CICC1960，所述运动发酵单胞菌为Zymomonas mobilis 8b。

2.根据权利要求1所述的树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，其特征在于：所述树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌按照体积比为1:3接种。

3.根据权利要求1所述的树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，其特征在于：所述培养基中，葡萄糖与木糖的质量比为2：1。

4.根据权利要求1所述的树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，其特征在于：发酵时采用摇床。

5.根据权利要求4所述的树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，其特征在于：摇床转速为100～200rpm。

6.根据权利要求5所述的树干毕赤酵母与运动发酵单胞菌混菌发酵葡萄糖和木糖产乙醇的方法，其特征在于：摇床转速为150 rpm。