CN1600850A - 运动发酵单胞菌工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及运动发酵单胞菌工程菌、其制备方法，以及其在发酵生产乙醇中的应用。该工程菌的制备方法是将四环素(TC)抗性基因插入到运动发酵单胞菌XW101的葡萄糖－果糖氧化还原酶基因中，用内切酶消化该重组质粒使其为线性质粒，经转化运动发酵单胞菌XW101后，筛选具有四环素抗性的突变菌株。本发明的运动发酵单胞菌工程菌在用碳源作为底物发酵生产乙醇的过程中能够减少副产物山梨糖醇的形成，提高乙醇的产率。
Description
技术领域
本发明涉及运动发酵单胞菌工程菌、其制备方法，以及其在发酵生产乙醇中的应用。
背景技术
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是迄今为止所发现的唯一一株通过脱氧酮糖酸(Entner-Doudoroff，E-D)途径利用葡萄糖、果糖和蔗糖发酵生产乙醇的厌氧细菌。
E-D代谢途径中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸生成6-磷酸葡萄糖内酯，同时，还原NAD生成NADH。催化活性很好的内酯酶迅速水解内酯，然后6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶将水解产物6-磷酸葡萄糖酸转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸。2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸是E-D途径中独特的中间产物。特异性醛缩酶再将这种化合物裂解为丙酮酸和甘油醛-3-磷酸，后来再经过一系列在糖酵解途径中常见的反应转化为第二个丙酮酸分子。接着丙酮酸通过一种不寻常的丙酮酸脱羧酶催化转变成乙醛和二氧化碳，最后两种乙醇脱氢酶(乙醇脱氢酶I和乙醇脱氢酶II)将乙醛还原为乙醇。
当运动发酵单胞菌采用蔗糖作为发酵碳源时，副产物山梨糖醇可导致乙醇产量降低。当葡萄糖和果糖同时添加到发酵基质中，和它们作为蔗糖水解产物出现在基质中时，运动发酵单胞菌可将11％的起始碳源转化为山梨糖醇。这种物质不能用作发酵碳源，只能积累在基质中。山梨糖醇是一种含量丰富的胞质酶(葡萄糖-果糖氧化还原酶)作用的产物，这种酶利用葡萄糖作为还原剂将果糖转化为山梨糖醇。该酶与NADP+(烟酰胺腺嘌呤磷酸酯，亦称辅酶II)紧密相连，不需要其它的辅因子。
因此，如何在发酵生产乙醇的过程中减少山梨糖醇的形成，以提高糖转化为乙醇的收率，是待解决的问题。
发明内容：
本发明的目的是制备一种新型运动发酵单胞菌工程菌，使其在用碳源作为底物发酵生产乙醇的过程中减少副产物山梨糖醇的形成，以提高乙醇的产率。
本发明制备的运动发酵单胞菌工程菌是在野生型菌株的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的432bp处插入1.95kb的四环素抗性基因的目标菌株。利用SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3作为引物进行PCR扩增，可获得3.4kb的产物。
所述运动发酵单胞菌工程菌具有四环素抗性，使葡萄糖-果糖氧化还原酶基因失活，不能将发酵底物蔗糖、葡萄糖和果糖转化为副产物山梨糖醇。在以15％的蔗糖为发酵底物时，在30摄氏度的发酵条件下，经过70小时的发酵，可以明显提高蔗糖转化为乙醇的效率。和野生型菌株相比，突变株将蔗糖转化为乙醇的产量是理论值的93％，比野生型提高了7个百分点。
本发明所述的运动发酵单胞菌工程菌的制备方法是：
将四环素(TC)抗性基因插入到运动发酵单胞菌XW101的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因中，用内切酶消化该重组质粒使其为线性质粒，经转化运动发酵单胞菌XW101后，筛选具有四环素抗性的突变菌株。该突变株即为将四环素抗性基因插入到合成山梨糖醇的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因中的目标菌株。
上述运动发酵单胞菌XW101的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因是通过PCR克隆得到的，在进行扩增运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因时该基因的PCR产物序列如SEQ ID NO：1所示，所用引物序列如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示。
上述插入四环素(TC)抗性基因的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因在用内切酶消化前连接到克隆载体pGEM-T easy载体上。
所述转化运动发酵单胞菌XW101可采用各种常规方法，如电击的方法。
本发明的优点是：
1.葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的突变减少了利用蔗糖或葡萄糖和果糖为底物时产生副产物山梨糖醇的量，提高了将底物转化为乙醇的效率。经测试突变株对底物的利用及乙醇的转化效率，发现获得的突变株可使底物的转化率提高7％。
2.本发明采取同源重组双交换的方法使运动发酵单胞菌XW101的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因突变失活，同时插入标记基因-四环素抗性基因，为突变后目标基因的筛选提供了方便。
具体实施方式
实施例1 运动发酵单胞菌工程菌的制备
A、运动发酵单胞菌的培养及DNA的提取
运动发酵单胞菌在培养基X(葡萄糖10％、酵母浸膏0.5％、硫酸铵0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、pH7.0)中30摄氏度培养48小时后，采用CTAB法提取总DNA用于以后的遗传操作。
B、运动发酵单胞菌XW101葡萄糖-果糖氧化还原酶基因部分片段的克隆
以SEQ ID NO：2(5’-AAAGCCGGCGAATCAGATAAC-3’)和SEQ ID NO：3(5’-TGGAAGAACCAATGACGCCT-3’)为引物，扩增运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因。得到XW101葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的PCR产物，其大小为1477bp，序列如SEQ ID NO：1所示，并克隆到pGEM-T easy载体上，该重组质粒命名为pGFO15，经测序分析后，与已报道的运动发酵单胞菌葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的同源性为98％。
PCR反应体系：
10×PCR buffer 2μl
2.5mMdNTP 2μl
10×BSA 2μl
50pM gfo1 2μl
50pM gfo2 2μl
模板DNA 5ng
5U/μl Taq酶 0.25μl
加无菌水至20μl
PCR反应条件：
1、94℃预变性 20s
2、94℃ 0s
54℃ 0s
72℃ 40s
(25个循环)
3、72℃ 5min
连接体系与连接反应：
2×buffer 5μl
pGEM-T easy 1μl
PCR产物 1μl
T4连接酶(3U/μl) 1μl
加水至10μl，4℃过夜连接。
C、将四环素抗性基因插入到所克隆的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因中。
通过分析，发现重组质粒pGFO15的插入片段中在432bp处有唯一的HindIII酶切位点，经酶切后，将大小位1.95kb的四环素抗性基因插入到该位点，构建成葡萄糖-果糖还原酶基因中插入有四环素抗性基因的重组质粒pGFT102。
D、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因突变菌株的构建
用SpeI完全酶切重组质粒pGFT102后，得到大小为3.4kb的线性化质粒，经电击(电容25μF、脉冲电压2000V、电阻400Ω)转化后，在含有10μg/ml的X培养基上筛选突变菌株。得到工程菌株XW1021。
E、四环素基因插入位点的验证
采用B中的引物，以工程菌株XW1021的总DNA为模板(反应条件和反应体系如B中所述)，可扩增到大小约为3.4kb的条带，说明四环素基因经过同源重组双交换，已成功的插入到目标基因葡萄糖-果糖氧化还原酶基因中间。
实施例2 工程菌株XW1021利用蔗糖发酵乙醇
1.培养条件
1.1 培养基成分
蔗糖15％、酵母浸膏0.5％、硫酸铵0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、pH7.0
1.2 培养条件
30摄氏度培养70小时
2.糖的测定
蔗糖是由两个还原糖通过一个糖苷键连接成的二糖，是非还原糖，其含量的测定则利用煮沸法测定还原糖，测定条件和方法如下：
2.1 葡萄糖标准曲线测定
2.1.1 葡萄糖标准溶液的配制：
准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖(预先105摄氏度干燥)，少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，定容到刻度，摇匀。浓度为1mg/ml。
取九支25×250mm试管，分别按表加入试剂：
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 葡萄糖标准液(ml) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 | 1.4 | 1.6 |
| 蒸馏水(ml) | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 |
| 3，5-二硝基水杨酸(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
2.1.2 将各管溶液混合均匀，沸水浴中加热5分钟，取出后立即冷却至室温，再向每管中加入21.5ml蒸馏水，摇匀，于520nm测A值。已葡萄糖mg数为横轴，A值为纵轴，做标准曲线。
2.2 还原糖的测定
2.2.1 还原糖的提取
取1ml培养基放入100ml烧杯中，加50-60ml水，沸水浴中加热半小时，取一到两滴置于白瓷盘上，加一滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全，完全水解不变蓝，在100ml容量瓶中定容至100ml。
2.2.2 糖含量的测定
取四支25×250mm试管，分别按表加入试剂：
| 编号 | 空白 | 1 | 2 | 3 |
| 样品溶液(ml) | 0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 蒸馏水(ml) | 2.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 3，5-二硝基水杨酸(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
加完试剂后，其余操作与做标准曲线时相同，测定后，取样品A值平均值在标准曲线上查出相应糖量。
3.乙醇的测定
3.1 色谱条件
3.1.1 色谱柱长2m，内径4mm。
3.1.2 固定相GDX-102，60-80目
3.1.3 温度气化室190度，检测器190度，柱温170度。
3.1.4 气体流速载气(N2)40ml/min。
3.2 进样量5.0ul。
3.3 定性以乙醇标准出峰时间定性。乙醇标准应用液和样品测定液各进样5.0ul，分别测定保留时间，样品与标准出峰时间对照而定性。
3.4 定量
3.4.1 样品测定液中乙醇含量测定 取样品测定液5.0ul进样，测出乙醇峰高或峰面积，依据工作曲线或回归方程计算测定液中乙醇含量(％)。
3.4.2 工作曲线制作取20±0.5度的乙醇标准应用液适量用20±0.5度纯水稀释成乙醇含量(V/V)分别为：0.20％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％的标准系列浓度。分别取上述乙醇标准系列浓度5.0ul进样，测得乙醇的峰高或峰面积。以乙醇的含量百分浓度为横坐标、相应的峰高或峰面积为纵坐标，制作工作曲线，或用最小二乘法计算其回归方程。
3.4.3 计算样品中乙醇含量
乙醇含量(C2H5OH，％，V/V)＝样品测定液中乙醇含量×f
f-稀释倍数(1，50或100)。
4.乙醇实际产量与理论产量的百分数的计算
5.试验数据(10ml培养基)
1、2、3为工程菌XW1021的三个重复，4、5、6为野生菌XW101的三个重复
| 编号 | 发酵前含糖量(g) | 发酵后含糖量(g) | 乙醇含量(ml) | 糖转化率(％) | 百分数(％) |
| 1 | 1.73 | 0.26 | 0.86 | 84.97％ | 91.57％ |
| 2 | 1.73 | 0.25 | 0.88 | 85.55％ | 93.07％ |
| 3 | 1.73 | 0.18 | 0.92 | 89.60％ | 92.90％ |
| 4 | 1.73 | 0.33 | 0.77 | 80.92％ | 86.09％ |
| 5 | 1.73 | 0.35 | 0.75 | 79.77％ | 85.07％ |
| 6 | 1.73 | 0.36 | 0.76 | 79.19％ | 86.83％ |
6.试验结果
以15％的蔗糖为发酵底物，在30摄氏度的发酵条件下，经过70小时测定发酵液中蔗糖和乙醇的量，发现野生菌XW101和突变菌株XW1021的糖转化率为80％和85％。XW102将蔗糖转化为乙醇的产量是理论值的86％，而突变菌株XW1021将蔗糖转化为乙醇的产量是理论值的93％。
运动发酵单胞菌工程菌及其应用序列表
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<120>运动发酵单胞菌工程菌及其应用
<130>03-01
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1477
<212>DNA
<213>运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)
<400>1
aaagccggcg aatcagataa cagttccgca caggtgagaa ccacgacgga tcttctctga 60
attgttggtt agttaagaaa gaaacaagga ttatgacgaa caaaatctcg tcttcagata 120
atctttccaa tgctgtttca gcaacggatg acaacgcttc ccgtacgcca aatctgaccc 180
gtcgcgctct cgttggtggt ggtgttggac tggccgcagc tggcgcctta gccagtggtc 240
ttcaggcagc gacgcttcct gctggtgcca gccaggttcc gaccacgcct gcaggtcgcc 300
cgatgcctta cgcgatccgc ccgatgccgg aagatcgtcg tttcggttat gctatcgtcg 360
gtctgggtaa atatgccctt aaccagattt taccgggttt tgccggatgc cagcattccc 420
gcatcgaagc tttggtcagc ggtaacgctg aaaaagctaa aatcgttgcc gctgaatatg 480
gcgtcgatcc ccgtaaaatt tatgattaca gcaacttcga caagatcgct aaagatccaa 540
aaatcgacgc tgtttacatc attttgccaa actctttgca tgctgaattt gctatccgtg 600
ctttcaaagc cggcaagcat gttatgtgtg aaaagccgat ggcaacctct gttgctgatt 660
gtcagcggat gatcgatgca gccaaggctg ctaataaaaa gctgatgatc ggttaccgtt 720
gccactatga tccaatgaac cgtgcagcgg taaaattgat ccgtgaaaac cagttgggta 780
aactgggcat ggttaccacc gacaactcag acgttatgga tcagaacgat cctgcacagc 840
agtggcgtct gcgtcgtgaa ctcgccggtg gcggttcttt gatggatatc ggtatttatg 900
gcttgaacgg tacccgttac ttgctgggtg aagaaccgat cgaagtccgt gcttacacct 960
acagcgatcc gaatgatgaa cgtttcgttg aagtcgaaga tcgtattatt tggcagatgc 1020
gcttcagaag cggtgctctg tctcatggtg catcttctta ttcgaccacg acgacttcac 1080
gtttctcggt gcagggcgac aaagctgttc tgttgatgga tccggctacc ggatattatc 1140
agaatttgat ttctgtccag accccaggcc atgctaacca gtcgatgatg ccacagttca 1200
tcatgccagc gaacaaccag ttctctgcac agttggatca tctggctgaa gccgtcatca 1260
ataacaaacc agttcgtagc ccgggtgaag aaggtatgca ggatgtgcgc ctgattcagg 1320
ccatttatga agcagctcgt accggtcgcc ccgtcaacac ggattggggt tatgtccgtc 1380
agggtggtta ttgattctga cttaacctat ttgggttaaa cagacttatt tttcctgttt 1440
taggaaaata gttaaaaagg cgtcattggt tcttcca 1477
<210> 2<211> 21<212> DNA<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis) <400>2
aaagccggcg aatcagataa c 21
<210> 3<211> 20<212> DNA<213> 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)
运动发酵单胞菌工程菌及其应用序列表
<400>3
tggaagaacc aatgacgcct 20
Claims (10)
1.运动发酵单胞菌工程菌，其特征是在野生型运动发酵单胞菌株的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的432bp处插入1.95kb的四环素抗性基因的目标菌株。
2.权利要求1所述的运动发酵单胞菌工程菌，其特征是利用SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3进行PCR扩增，可获得3.4kb的产物。
3.权利要求1或2所述的运动发酵单胞菌工程菌的制备方法是：将四环素(TC)抗性基因插入到运动发酵单胞菌XW101的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因中，用内切酶消化该重组质粒使其成为线性质粒，经转化运动发酵单胞菌XW101后，筛选具有四环素抗性的突变菌株。
4.权利要求3所述的制备方法，所述运动发酵单胞菌XW101的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因是通过PCR克隆得到的，该基因的PCR产物序列如SEQ ID NO：1所示。
5.权利要求4所述的制备方法，在进行扩增运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因时所用引物序列如SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示。
6.权利要求3所述的制备方法，所述插入四环素(TC)抗性基因的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因在用内切酶消化前连接到克隆载体pGEM-T easy载体上。
7.权利要求3所述的制备方法，所述转化运动发酵单胞菌XW101采用电击的方法。
8.权利要求1或2所述的运动发酵单胞菌工程菌利用碳源发酵生产乙醇的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中所述碳源是葡萄糖、果糖和蔗糖。
10.一种生产乙醇的方法，其特征是用权利要求1或2所述的运动发酵单胞菌工程菌利用碳源发酵。
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