TWI516599B - 丁酸之製備方法 - Google Patents

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Description

丁酸之製備方法
本發明係有關於一種丁酸之製備方法，特別是有關於一種使用乳酸或選擇性地使用乳酸及至少一醣類作為原料之丁酸之製備方法。
丙酮-丁醇-乙醇發酵(acetone-butanol-ethanol fermentation,ABE fermentation)為一種利用細菌發酵以自醣類產生丙酮、丁醇及乙醇的厭氧(anaerobic)製程。該製程亦經常利用來自梭菌綱(Clostridia Class)的菌株。丙酮-丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)是最為知名的菌株，而拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)亦經常被使用。在丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發酵過程中，先產生丁酸及醋酸，之後，培養基經代謝轉換(metabolic shift)再產生例如丁醇、丙酮及乙醇的溶劑。該製程依3：6：1的比例(3份丙酮、6份丁醇及1份乙醇)產生上述溶劑。發酵的實際機制可能相當複雜且難以控制，導致丁醇產率低，且上述溶劑的生產進一步為嚴重的產物抑制(product inhibition)所限制。該方法曾廣泛應用於工業發酵製程。惟自1950年以來，與上述溶劑自石油的生產相較，由於某些缺點使其獲利較低，致工業丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發酵已逐漸為石油化學方法(petroleum chemical methods)所取代。
一般來說，發酵製程受限於低產率、低生產力及低產物濃度。低產率歸因於發酵過程中生成二氧化碳所造成基 質與產物的低轉換率(conversion rate)。發酵過程所產生的揮發性有機化合物包括乙醇或丁醇。此外，由於產生大量(一般為40~50%)二氧化碳，致該等溶劑被稱為半燃燒燃料(half-burn fuel)。
隨著石油價格波動，自再生資源(renewable resources)生產生質燃料(biofuels)已日趨獲重視。研究人員尋求各種改善發酵製程的方法，以提升醣類轉換為丁酸或丁醇的產率。然，產率並未顯著改善。
例如，美國專利US 7,455,997描述一兩步驟發酵製程，其使用包括兩多醣類的植物性原料，第一個較易水解，第二個則較難水解。在該製程中，先後以酸及酵素對該兩多醣類進行水解以產生一發酵產物混合物，例如乙醇、甘油、丙酮、正丁醇、丁二醇、異丙醇、丁酸、甲烷、檸檬酸(citric acid)、反丁烯二酸(fumaric acid)、乳酸、丙酸等。美國專利US 5,132,217教示使用選自果糖、葡萄糖、甘油及蔗糖的營養物質作為主要碳源，於梭菌(Clostridium)存在下進行發酵以產生丁酸。根據此例，34%的碳產率來自葡萄糖，而33%的碳產率來自蔗糖。另一製程描述於美國專利US 2008/0248540，其提供一高達48%(g/g)的產率，為葡萄糖轉換為丁酸的理論轉換率。此專利亦揭露將葡萄糖轉換為丁醇的一兩步驟製程。
當使用傳統葡萄糖發酵製程並尋求改善之道時，對於生產生質燃料可行性的因素為二氧化碳的生成。在製程中，至少三分之一的碳會因二氧化碳生成而損失。
此處，揭露一種新穎製備丁酸(butyric acid)、丁醇(butanol)及丁酸酯(butyrate ester)的方法。該方法使用乳酸或選擇性地使用乳酸及至少一醣類作為原料進行發酵以產生丁酸及丁醇，其較傳統僅使用醣類作為碳源的發酵方法具有較高碳產率。
與傳統醣類發酵過程相較，本揭露提供具有較佳碳轉換(carbon conversion)及碳產率(carbon yield)的丁酸及丁醇製備方法。
本揭露亦提出一種新穎製備丁酸(butyric acid)的方法，其利用一產丁酸菌(butyric acid-producing bacterium)對一原料進行發酵，其中該原料包括乳酸或選擇性地包括乳酸及至少一醣類。
本揭露係有關於製備丁酸的方法，其包括以至少一產丁酸菌(butyric acid-producing bacterium)對一原料進行發酵以產生丁酸，其中該原料包括乳酸或選擇性地包括乳酸及至少一醣類。例如，該至少一產丁酸菌包括至少一梭菌株(Clostridium strain)。
在部分實施例中，該至少一梭菌株(Clostridium strain)選自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)。在另一實施例中，該至少一梭菌株(Clostridium strain)為酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)。
在部分實施例中，該至少一醣類選自單醣、雙醣、多醣及其混合物。在部分實施例中，該至少一醣類選自單醣及雙醣，例如，該單醣為葡萄糖(glucose)、木糖(xylose)、 半乳糖(galactose)或其混合物，例如，該雙醣為乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、纖維二糖(cellobiose)或其混合物。在部分實施例中，該多醣選自澱粉(starch)、肝糖(glycogen)、纖維素(cellulose)及其混合物。在部分實施例中，該至少一醣類包括至少一可溶性醣類，以一酵素糖化製程(enzymatic saccharification process)處理生質物(biomass)而獲得。
當該原料包括乳酸(lactic acid)及至少一醣類(carbohydrate)時，在本揭露方法的部分實施例中，於該原料中，乳酸與該至少一醣類之重量比介於0.1~10，介於0.3~3，或介於0.5~1.5。
在部分實施例中，該至少一梭菌株(Clostridium strain)為酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)，而該原料包括乳酸及葡萄糖。
在本揭露的部分實施例中，該發酵方法所達到的丁酸碳產率(butyric carbon yield)，高於傳統使用醣類作為單一基質的發酵過程的丁酸碳產率，例如，該方法提供一丁酸碳產率(butyric carbon yield)，約高於66%，例如，高於69%的丁酸碳產率。
與傳統使用醣類作為單一基質的發酵過程相較，本揭露方法產生較少二氧化碳。在部分實施例中，原料中的乳酸轉換為丁酸，並不產生二氧化碳。例如，於丁酸的轉換中，未產生可偵測量的二氧化碳。
如本揭露部分實施例所提供，該發酵步驟持續進行與 否取決於當大部分原料已被消耗時，或當觀察到丁酸已無顯著增加時。例如，該發酵步驟持續進行約10~80小時，例如持續進行約30~75小時。
於該發酵步驟(fermenting step)開始之前或之後，可將乳酸或選擇性地將乳酸及至少一醣類以任意順序分次地加至該原料中。
該發酵方法更包括以化學或生化製程對丁酸進行氫化以產生丁醇。例如，該氫化步驟可以化學氫化進行，例如催化氫化(catalytic hydrogenation)或轉移氫化(transfer hydrogenation)。在部分實施例中，該氫化步驟利用至少一產丁醇微生物(butanol-producing microorganism)。例如，該至少一產丁醇微生物的微生物為一梭菌株的醇酮化反應期(solventogenesis phase)，例如，丙酮-丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、金黃丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)及假破傷風梭菌(C.tetanomorphum)。該發酵方法更包括於一觸媒與一醇類存在下，對該丁酸進行酯化以產生一丁酸酯(butyrate ester)。在部分實施例中，該丁酸酯可進一步還原獲得丁醇(butanol)。
為讓本發明之上述目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉一較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
定義
此處，”酸”一詞，例如乳酸及丁酸，包含游離酸(free acid)及該些酸與過程中可存在於培養基的適當基質結合而形成的鹽類，舉例來說，乳酸可包含游離乳酸、乳酸鈉、乳酸銨、乳酸鋰、乳酸鈣、乳酸鉀、乳酸鎂及乳酸鋁。此外，根據環境pH值，”丁酸”與”丁酸鹽”一詞可相互替換，以描述該酸或其去質子化(deprotonated)型式。此一概念亦可應用於其他酸，例如乳酸/乳酸鹽、丙酸/丙酸鹽及醋酸/醋酸鹽。
除非另有限定，此處所述的化學名稱即指該化學名稱的所有異構物形式，例如鏡像異構物(enantiomers)、非鏡像異構物(diastereomers)及構形異構物(conformational isomers)。舉例來說，”乳酸”、”葡萄糖”、”木糖”、”半乳糖”一詞即同時包括D及L異構物。當該醣類可同時存在開環及環狀形式時，其椅形(chair form)的構形異構物及α、β異構物均包含在內。
除非文意另有所指，單數形式的”一”及”該”亦包括複數概念。
”大約”一詞表示與一提及的數字或數值幾乎相同。此處，”大約”一詞應理解為包括一特定數量(或數值)的±10%。此外，除非另有所指，在說明書與申請專利範圍中所有表示數量的數字，例如濃度、反應條件、時間、溫度及產率均以”大約”一詞加以修飾。此處，當給定一數字範圍時，該範圍兩端亦包含在內。
”實質地”一詞表示真實的價值或重要性或相當大的數值，舉例來說，實質地增加或減少表示大於前量測數值5%以上的改變。
此處，”發酵”一詞是指例如細菌、酵母菌及其他小有機體的微生物使一或多種物質代謝以產生能量及生存與繁殖所必須化學物質的過程。此化學反應過程將產生某些形式的副產物。當發酵終止時，微生物可產生一系列分子，舉例來說，二氧化碳與乙醇即是酵母菌釀造過程中所產生的副產物，而丙酮酸(pyruvate)於乳酸發酵過程中轉變為乳酸。發酵(fermentation)為一種產生ATP的過程，以有機化合物作為電子的供應者與接受者，且可發生於厭氧環境下(Berg,M.Jeremy et al.Biochemistry chap.16(2002))。此處，”傳統發酵”是指僅使用醣類(carbohydrate(s))作為基質的發酵。
此處，”原料”或”發酵培養基”一詞為發酵原料，其可為適合發酵的培養基，亦可進一步包括可發酵基質。該基質可包括，但不限定於，醣類及/或乳酸或其混合物。若有需要，於培養基中亦可存在其他物質，例如可添加氫氧化鈉、氫氧化銨(NH4OH)、磷酸二氫鈉(NaH2PO3)、磷酸氫二鈉(Na2HPO3)、檸檬酸(citric acid)、氯化氫、氯化銨(NH4Cl)以調整原料pH值至一預期數值，例如pH6，或調整其他物理、化學或生理性質。
此處，”微生物”一詞是指太小而使裸眼無法看見的生物體，包括細菌、真菌(fungi)、原生動物(protozoans)、藻 類(algae)及病毒。
此處，細菌株可為野生株或突變株。接種量(inoculum size(w/v))是指細胞(例如固定化細胞顆粒)重量相對於原料總體積的比例。
評估碳保留效率
此處，”碳產率”一詞是指在一化學或生物轉換中，保留於預期產物中的碳數(number of carbons)相對於基質中的碳數。
碳產率=預期產物中的碳數/基質中的碳數
為評估預期產物中碳保留的效率，於利用不同原料及細菌的發酵過程中進行”碳產率”的比較。舉例來說，在一利用葡萄糖作為基質以產生丁酸或丁醇的發酵過程，可能的化學轉換為：葡萄糖(C6H12O6) → 1丁酸(C4H8O2)+2二氧化碳(CO2)+2氫(H2)
葡萄糖(C6H12O6) → 1丁醇(C4H10O)+2二氧化碳(CO2)+水(H2O)
在傳統發酵過程中，1分子的葡萄糖(C6H12O6，6個碳)轉換產生1分子的丁酸(C4H8O2，4個碳)或1分子的丁醇 (C4H10O，4個碳)，因此，丁酸或丁醇碳產率為4/6=0.66。然，量測的碳產率往往低於理論碳產率。
當丁酸為發酵過程中的主要產物時，”丁酸碳產率(butyric carbon yield)”可作為碳保留效率的指標。舉例來說，在一利用葡萄糖及乳酸作為基質的發酵過程，丁酸碳產率可以如下表示：丁酸碳產率=丁酸中的碳數/原料(葡萄糖+乳酸)中的碳數
在發酵過程中，氣體產物-二氧化碳(CO2)通常非為預期產物，通常視為”碳損失(carbon loss)”。然，醋酸及丙酸(propionic acid)為發酵過程中常見的產物，且可視為”總碳產率”中的預期產物。對於一產生大量醋酸及/或丙酸的發酵過程來說，其更適合以”總碳產率”評估碳保留效率。舉例來說，一利用葡萄糖及乳酸作為基質的發酵過程的總碳產率如下表示：總碳產率=預期產物(丁酸+丙酸+醋酸)中的碳數/原料(乳酸+醣類)中的碳數
提升碳產率
此處提供一種新穎的產生丁酸及丁醇的方法，其可提升碳轉換(carbon conversion)及碳產率(carbon yield)，特別 是丁酸碳產率。
在部分實施例中，上述結果是藉由使用乳酸或選擇性地使用乳酸及至少一醣類作為發酵過程的基質而達成。藉由在發酵過程中使用上述兩者的結合作為原料，與傳統僅使用醣類作為基質的發酵過程相較，可達到較高碳產率，特別是丁酸碳產率。舉例來說，目前所揭露的方法中，丁酸碳產率約可超過66%(或0.49g/g)，其為傳統發酵過程(假設使用醣類進行於傳統發酵機制)的理論丁酸碳產率。不為特定理論所約束，乳酸發酵進行於未包含產生二氧化碳的不同生化路徑。此或許可解釋為何此處所揭露方法的總碳產率超過傳統丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol,ABE)路徑的理論碳產率。
進行一比較性發酵過程研究，其使用乳糖(lactose)作為單一基質及使用酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)。此發酵過程可包含不同生合成路徑。雖於48小時後可定量碳產率，然，與其他發酵過程相較，此發酵過程產生大量(約50%)醋酸及丙酸(propionic acid)，因此，丁酸碳產率相對較低(約50%)。
乳酸或選擇性結合乳酸及至少一醣類的發酵過程
此處揭露產生丁酸的方法，其包括以至少一產丁酸菌(butyric acid-producing bacterium)對原料進行發酵以產生丁酸，其中該原料包括乳酸或選擇性地包括乳酸及至少一醣類。
此揭露的方法可藉由對包括乳酸或選擇性地包括乳酸及至少一醣類的原料進行發酵而增加丁酸的碳產率。假設丁酸為唯一發酵產物(fermentation product)，該轉換的化學式如下：1乳酸(C3H6O3)+3H++3e- → 0.75丁酸(C4H8O2)+1.5H2O
理論轉換率(theoretical conversion rate)為0.73g/g，碳產率為100%。
此外，上述方法以至少一產丁酸菌(butyric acid-producing bacterium)對包括乳酸或選擇性地包括乳酸及至少一醣類的原料進行發酵以產生丁酸。上述產丁酸菌例如為一梭菌株(Clostridium strain)，該梭菌株包括，但不限定於酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、嗜熱丁酸梭菌(C.thermobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)、波氏梭菌(C.populeti)、屍體梭菌(C.cadaveros)、產纖維二糖梭菌(C.cellobioparum)、匙形梭菌(C.cochlearium)、巴氏梭菌(C.pasteurianum)、薔薇色梭菌(C.roseum)、深紅梭菌(C.rubrum)及產孢梭菌(C.sporogenes)；例如酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)。
適合於此丁酸產生方法的醣類包括，但不限定於可發酵單醣、雙醣、多醣及其混合物。上述單醣可為五碳醣或六碳醣。五碳醣包括，但不限定於阿拉伯糖(arabinose)、來 蘇糖(lyxose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)及其混合物；例如木糖(xylose)。六碳醣包括，但不限定於阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、半乳糖(galactose)、塔羅糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、果糖(fructose)、山梨糖(sorbose)、塔格糖(tagatose)及其混合物；例如葡萄糖及果糖；例如葡萄糖。上述雙醣包括，但不限定於蔗糖(sucrose)、乳酮糖(lactulose)、乳糖(lactose)、麥芽糖(maltose)、海藻糖(trehalose)、纖維二糖(cellobiose)及其混合物；例如乳糖、蔗糖及纖維二糖；例如乳糖。上述多醣包括，但不限定於環糊精(cyclodextrin)、澱粉(starches)、肝糖(glycogen)、阿拉伯聚糖(arabinoxylans)、纖維素(cellulose)、關華豆膠(guar gum)、阿拉伯膠(gum arabic)、幾丁質(chitin)及果膠(pectins)。上述醣類可為可溶性醣類，以一酵素糖化製程(enzymatic saccharification process)處理生質物(biomass)而得到。適合的生質物原料來源包括例如玉米穗軸(corn stovers)、玉米芯(corn cobs)與稻草(rice straw)的農業廢棄物及例如玉米纖維的加工廢棄物。適合用於糖化製程的微生物包括，但不限定於細菌、酵母菌及絲狀真菌(filamentous fungi)。
當原料包括乳酸及至少一醣類時，於此原料中，乳酸與該至少一醣類的重量比可介於0.1~10，例如介於0.3~3，或介於0.5~1.5。
除非另有限定，”碳產率”是指”丁酸碳產率”或”總碳產率”，不論丁酸是否為主要產物，即作為一般碳保留效率(carbon retention efficiency)的指標。此處所揭露利用乳酸或選擇性地利用乳酸及至少一醣類作為原料的方法提供高的”丁酸碳產率”及”總碳產率”，其”丁酸碳產率”及”總碳產率”可高於45%，高於50%，高於55%，高於60%，高於66%，高於67%，高於68%，高於70%，高於72%，高於73%或高於82%，其”丁酸碳產率”及”總碳產率”可介於45%~100%，介於50%~100%，介於55%~95%，介於60%~90%，介於63%~90%，介於66%~90%，介於67%~85%或介於69%~85%。
丁酸碳產率(butyric carbon yield)及總碳產率(total carbon yield)會因多項原因而改變，例如細菌的科(family)及株(strains)、細菌是否固定化或為懸浮液、醣類、乳酸與醣類的濃度及比例、溫度、發酵槽的攪拌速度、發酵模式(批次、連續等)。在另一實施例中，於適當發酵條件下，此發酵過程可較傳統僅使用醣類作為基質的發酵過程提供較高的丁酸碳產率。較高的丁酸碳產率可藉由(1)抑制醋酸、丙酸及其他產物的生成，及/或(2)減少二氧化碳產生及最小化碳損失(carbon loss)而達成。丁酸碳產率可超過66%(理論(最大)丁酸碳產率)。舉例來說，丁酸碳產率可大於66%，大於67%，大於68%，大於70%，大於72%，大於73%，大於75%，大於82%，例如介於66%~90%，介於67%~88%，介於69%~85%。
舉例來說，原料中的乳酸(lactic acid)可轉換為丁酸(butyric acid)及其他少量產物，而發酵過程中僅產生少量或不產生二氧化碳(CO2)。在所揭露的發酵過程中，乳酸轉換為丁酸的效率可由以下評估：乳酸轉換為丁酸的碳產率=所產生丁酸中的碳數/乳酸中的碳數
在一利用結合乳酸與醣類作為基質的發酵試驗中，產自乳酸的丁酸是藉由對所產生的總丁酸減去醣類所產生的理論(最大)丁酸而計算得到。假設醣類(例如葡萄糖)以理論效率(約66%碳產率)進行轉換，與傳統僅使用醣類作為基質的發酵過程相較，此處，乳酸仍可產生高的碳產率。舉例來說，乳酸可產生高於45%，高於55%，高於60%，高於65%，高於70%，高於80%，高於90%及100%的高碳產率。
目前所揭露的發酵過程可較傳統發酵過程產生更低二氧化碳。原料中的乳酸可轉換為丁酸，並伴隨產生低於1莫耳當量的二氧化碳，例如低於0.5莫耳當量的二氧化碳。在其他實施例中，原料中的乳酸轉換為丁酸，並不產生二氧化碳。
此處，所揭露方法的發酵時間取決於多項因素，例如發酵時間(fermentation time)可取決於細菌株、基質濃度、操作模式等。乳酸可較醣類更快或更慢消耗，或兩者以相 同速度消耗。在許多情況下，於所有基質均消耗完畢後，仍會產生丁酸及其他產物，持續進行發酵，直至大部分基質已被消耗及/或觀察到丁酸已無顯著增加。舉例來說，由於產物抑制(product inhibition)，於一特定時間後，丁酸的量通常會停止增加甚或減少。發酵過程的時間可能持續10~80小時，例如持續20~80小時，持續30~75小時，持續35~70小時或持續40~55小時。
將基質及細菌添加至原料的順序可依任意順序添加並無限制。於發酵過程開始之前及期間，每一基質可添加多次。乳酸及醣類可依任意順序連續或分次添加至原料。舉例來說，於接種(inoculation)之前，可製備包含所有基質的原料。於接種後，可將一或多個基質重複地添加至原料。具體而言，又例如可以是在發酵步驟(fermenting step)開始之前，先將包含醣類之原料與細菌進行培養，於發酵開始後，再將乳酸或乳酸及至少一醣類添加至該原料中，持續進行發酵反應產生丁酸。在其他一些實施例中，原料可與細菌(例如固定化細胞顆粒(immobilized cell beads))分離並自發酵槽移除。之後，將新鮮原料添加至發酵槽中留下的細菌以啟動第二次發酵。上述操作可適當地重複多次。
在部分實施例中，原料(feedstock)包括乳酸(lactic acid)及至少一醣類(carbohydrate)，而乳酸與醣類的比例可作改變。舉例來說，乳酸與醣類的重量比可介於0.1~10，例如介於0.3~3，介於0.5~1.5。在另一實施例中，該比例可大約為1。
由發酵過程所產生的丁酸可進一步轉換為其他有機分子，例如丁醇。舉例來說，丁酸可經氫化產生丁醇。該氫化步驟可為一化學氫化，例如催化氫化(catalytic hydrogenation)或轉移氫化(transfer hydrogenation)，其在金屬觸媒存在下，藉由氫氣或氫供應者(hydrogen donor)對丁酸進行還原。可利用一產丁醇微生物(butanol-producing microorganism)進行上述氫化步驟。該產丁醇微生物例如為一細菌或一細菌的醇酮化反應期(solventogenesis phase)，例如一梭菌(Clostridium)。適合參與上述轉換的梭菌株包括，但不限定於丙酮-丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、拜氏梭菌(C.beijerinckii)、金黃丁酸梭菌(C.aurantibutyricum)及假破傷風梭菌(C.tetanomorphum)。由發酵過程所獲得的丁酸例如在觸媒與醇類存在下可進一步酯化產生丁酸酯(butyrate ester)，例如美國專利(U.S.Patent Application Publication No.2010/0124773)所載的方法。利用一胺類溶劑可自發酵原料萃取出丁酸。觸媒包括，但不限定於脂解酶(lipase)。醇類包括，但不限定於甲醇、乙醇、丙醇及丁醇。觸媒可為一酵素，例如脂解酶(lipase)。若醇類為丁醇，或具有一或多種例如己烷、丙酮、乙腈、環己烷、2-辛醇、阿拉明叔胺(Alamine)336的溶劑及其混合物，即可在無溶劑狀態下進行酯化。利用化學或生化方法可進一步將產生的丁酸酯還原為丁醇。
發酵裝置
發酵過程可依批次、饋料批次(fed-batch)或連續模式進行，以最適化產率或降低生產成本。適合本揭露發酵過程的裝置可為一懸浮液系統，如第1圖所示。該系統包括一原料26，具有一細胞懸浮液，置於一發酵槽10。發酵槽10配有一機械式攪拌器12、一溫度計14與一pH計16，均連接至一整合式控制台(integrated control station)30或由整合式控制台30控制之。整合式控制台30藉由添加一酸溶液32與一鹼溶液34通過管(70、72)至發酵槽10的一酸入口18與一鹼入口20以控制發酵過程的pH值，以及藉由一恆溫器36控制發酵溫度，以及控制攪拌速度38。可選擇性地將一氣體收集裝置(gas collecting device)50附於發酵槽10的任意位置，藉由位於發酵槽10頂部的一氣體出口22及管74收集發酵過程所產生例如二氧化碳及氫氣的氣體。產生的氣體可藉由氣相層析法(gas chromatography)進行分析。
在另一實施例中，本揭露方法包括先將細胞固定於例如聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)的顆粒(beads)中。舉例來說，可將細胞顆粒加至充滿原料的瓶中，而於密封瓶中進行發酵。
在另一實施例中，本揭露方法使用固定化細胞顆粒(immobilized cell beads)於一攪拌式反應槽系統，如第2圖所示。該系統包括固定化細胞顆粒24與一原料26，置於一發酵槽10。發酵槽10配有一機械式攪拌器12、一溫度計14與一pH計16，均連接至一整合式控制台(integrated control station)30或由整合式控制台30控制之。整合式控制台30藉由添加一酸溶液32與一鹼溶液34通過管(70、72)至發酵槽10的一酸入口18與一鹼入口20以控制發酵過程的pH值，以及藉由一恆溫器36控制發酵溫度，以及控制攪拌速度38。可選擇性地將一氣體收集裝置(gas collecting device)50附於發酵槽10的任意位置，藉由位於發酵槽10頂部的一氣體出口22及管74收集發酵過程所產生例如二氧化碳及氫氣的氣體。產生的氣體可藉由氣相層析法(gas chromatography)進行分析。
此外，固定化細胞顆粒可使用於包括一發酵槽與一填充床生物反應器(pack-bed bioreactor)的一再循環式填充床發酵系統(recirculating pack-bed fermentation system)，如第3圖所示。該系統包括一原料26，置於一發酵槽10。發酵槽10配有一機械式攪拌器12、一溫度計14與一pH計16，均連接至一整合式控制台(integrated control station)30或由整合式控制台30控制之。整合式控制台30藉由添加一酸溶液32與一鹼溶液34通過管至發酵槽10的一酸入口18與一鹼入口20以控制發酵過程的pH值，以及藉由一恆溫器36控制發酵溫度，以及控制攪拌速度38。該發酵系統亦包括一填充床生物反應器60。填充床生物反應器60包括固定化細胞顆粒62，其藉由再循環迴路64與攪拌式發酵槽10連接。整合式控制台30亦包括一幫浦40，以將原料26藉由再循環迴路64自發酵槽10頂部傳輸至填充床生物反應器60底部。發酵過程所產生的氣體藉由位於發酵 槽10頂部的一氣體出口22與位於填充床生物反應器60頂部的一氣體出口66以及管74釋放至選擇性設置的一氣體收集裝置50。收集的氣體可藉由氣相層析法(gas chromatography)進行分析。
【實施例】
除非另有所指，此處，將採用傳統細胞生物(cell biology)、細胞培養(cell culture)及發酵技術實施本揭露。上述技術將於文中作完整說明。
培養基
此處所使用的微生物包括酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)(ATCC 25755)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)(IAM 19001)及拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)(ATCC 8260)，皆購自生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)。將儲存培養基(stock culture)存放於血清瓶並置於4℃厭氧環境。使用前，取包含100ml強化梭狀芽孢菌培養基(Reinforced Clostridial Medium,RCM；Merck)的一血清瓶，對其儲存培養基進行厭氧預培養(pre-cultured)，於37℃攪拌48小時。
基礎培養基(basal medium)於每公升去離子水中包含以下成分：5g酵母菌萃取物(yeast extract)、5g蛋白棟(peptone)、3g硫酸銨(ammonium sulphate)、1.5g磷酸二氫 鉀(KH2PO4)、0.6g含水硫酸鎂(MgSO4．7H2O)及0.03g含水硫酸鐵(FeSO4．7H2O)(請參見Wu et al.,Biotechnology and Bioengineering 2003,82(1),93-102)。將適當基質(substrate)加入基礎培養基以製備原料(feedstock)。使用前，對所有培養基及原料進行121℃、15psig高壓滅菌消毒30分鐘。
細胞固定
為使細胞生長以便進行固定化(immobilization)，將約300ml於血清瓶中所製備的細胞懸浮液接種於5L發酵槽，該發酵槽充滿4L以葡萄糖及乳酸作為基質的基礎培養基。之後，允許細胞生長7天，直至細胞濃度約達光密度(OD600)=5。
根據Chen,K.所揭露方法(請參見“Immobilization of microorganism with phosphorylated polyvinyl alcohol(PVA)gel.”Enzyme Microbiob.Technol.1994,16,679-83)，將細胞固定於磷酸化聚乙烯醇凝膠顆粒(phosphorylated PVA-gel beads)。藉由離心(6,500rpm)(KUBOTA,model 7780)10分鐘收集細胞並將其懸浮於一聚乙烯醇(PVA)水溶液(約為9%(w/v)；即每公升聚乙烯醇(PVA)溶液具有20g濕細胞的比例)。將細胞與聚乙烯醇(PVA)溶液完全混合，之後，將聚乙烯醇-細胞(PVA-cell)混合物滴至飽和硼酸(boric acid)與磷酸鈉(sodium phosphate)溶液並輕微攪拌1~2小時，以形成球狀顆粒。將所形成直徑3~4mm顆粒以水進行清洗。
分析
以一分光光度計(OPTIZEN,model 2120UV plus)量測細胞懸浮液於波長600nm(OD600)的光密度以分析懸浮細胞密度(free cell density)。
以配有Aminex HPX-87H管柱(300 x 7.8 mm)、75℃管柱恆溫器(column oven)及折射率偵測器(refractive index detector)的高效液相層析儀(HPLC)(Agilent HP-1100)分析例如有機酸及醣類的液體產物。流動相為18mM硫酸(H2SO4)，其流速為6ml/min。根據標準校正曲線，決定醣類及有機酸的濃度。
以配有ShinCarbon ST 100/120mesh管柱(2 meter x 1mm ID micropacked)的氣相層析儀(GC)(YL6100 GC)分析例如二氧化碳及氫氣的氣體產物。將注射器及偵測器的溫度分別設定為100℃及200℃。載流氣體為氦，流速為10ml/min。將滯留時間與標準滯留時間作比較，以定義出二氧化碳峰。
【實施例1】
於懸浮細胞懸浮液系統中的批次發酵
進行酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)三梭菌株的批次發酵。於一懸浮液系統(如第1圖所示)中進行該試驗。該系統包括一2L發酵槽以及一pH計，連接至一整合式控制台。該整合式控制台藉由添加酸/鹼溶液至發酵槽以控制發 酵過程的pH值。
於1.0L以葡萄糖及L-乳酸作為基質(濃度請見表1)的原料中進行每一發酵過程。以氮氣曝氣培養基以達厭氧狀態(anaerobiosis)。於接種100ml如上所製備的細胞懸浮液之前，以2N氫氧化鈉調整原料pH值至6.0。於37℃進行每一試驗並利用2N氫氧化鈉溶液將pH值控制在大約6±0.1。持續進行發酵，直至由於產物抑制(product inhibition)停止產生可偵測的丁酸。對於酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)及丁酸梭菌(C.butyricum)，另進行僅使用葡萄糖作為基質的分離發酵，以比較碳產率及模擬傳統葡萄糖發酵。持續進行每一發酵過程，直至觀察無丁酸濃度的增加。發酵時間限定於表1。
重複每一批次發酵過程兩次，以進行發酵動力學研究。於固定間隔取樣，以分析懸浮細胞(free cell)、基質及產物濃度。濃度的時間歷程揭露於第4a~6圖。每一發酵過程的丁酸碳產率、產自乳酸的丁酸碳產率及發酵時間整理於下表1。第4a~6圖中的水平虛線代表產自葡萄糖的丁酸其理論的最大濃度。
表1 使用不同細菌的發酵過程其碳產率的比較
碳產率(carbon yield)隨使用在發酵過程中的梭菌株(Clostridium strain)而變化。酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)總的來說提供56%丁酸碳產率，而乳酸本身提供48%碳產率(假設葡萄糖轉換為丁酸的轉換率為其理論產率66%)，請參閱第4圖。當使用丁酸梭菌(C.butyricum)時，一部分乳酸為該菌株所使用，然，在整個發酵過程中，大量乳酸 殘留的現象並無改變(請參閱第5a圖)。此即表示，該特定菌株並未如酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)一般能有效地轉換乳酸，然，仍會消耗乳酸。此觀察與使用葡萄糖作為單一基質的發酵過程的結果(請參閱第5b圖)一致，其提供一可比較的碳產率(40%(有乳酸)，37%(無乳酸))。最後，使用拜氏梭菌(C.beijerinckii)的發酵過程在發酵過程的第一個20小時內消耗葡萄糖，然，該細菌卻以一相當慢的速度轉換乳酸。於發酵80小時後，約2/3的乳酸為該菌株所消耗，而約1/3未反應的乳酸留於發酵槽中(請參閱第6圖)。在此實施例中，酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)以幾乎相同的效率轉換葡萄糖及乳酸，且兩者於30小時後完全消耗。此反應總的來說提供56%丁酸碳產率，而乳酸本身提供48%碳產率(假設葡萄糖轉換為丁酸的轉換率為其理論產率(66%))。
【實施例2】
於密封瓶中的固定化細胞顆粒
在實施例2中，探討乳酸-醣類結合對於密封瓶中固定化酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)顆粒進行發酵所得碳產率的影響。在此實施例中，利用一改良基礎培養基(以磷酸鹽緩衝溶液(包含0.2M磷酸氫二鈉(Na2HPO4)與0.2M磷酸二氫鈉(NaH2PO4))取代蒸餾水)製備原料。第一次試驗的原料僅以3.3g/L葡萄糖作為基質。第二次試驗的原料以3.3g/L葡萄糖及5.9g/L L-乳酸作為基質。第三次試驗的原料僅以 5.7g/L L-乳酸作為基質。
於每次試驗，將100mL原料置於一168mL血清瓶，並使用一磷酸鹽緩衝溶液(包含0.2M磷酸氫二鈉(Na2HPO4)與0.2M磷酸二氫鈉(NaH2PO4))以維持整個試驗過程中培養基的pH值。以氮氣曝氣培養基以達厭氧狀態(anaerobiosis)。於接種5g聚乙烯醇固定化酪丁酸梭菌顆粒(PVA-immobilized C.tyrobutyricum beads)之前，將原料pH值調整至6.0。
於37℃，以150rpm攪拌速度進行每一試驗。持續進行發酵，直至偵測到無丁酸濃度的增加。重複每一批次發酵過程兩次，以進行發酵動力學研究。於固定間隔取樣，以分析懸浮細胞、基質及產物濃度。濃度的時間歷程揭露於第7~10d圖。基質起始濃度及碳產率整理於下表2。第10a~10d圖中的水平虛線代表產自葡萄糖的丁酸其理論的最大濃度。
當使用葡萄糖作為單一基質時，如第一次試驗，其總碳產率與丁酸碳產率之間的差異大於當使用葡萄糖與L-乳酸的結合，此因在發酵過程中產生較大量的醋酸及丙酸，請參閱第7圖。此外，該丁酸碳產率(61%)明顯高於懸浮細胞發酵過程的丁酸碳產率(請見表1，36%)，此因固定化細胞顆粒可長時間重複使用，致產生細胞適應(cell adaptation)承受較高丁酸濃度，而獲得較高丁酸碳產率。使用原料包含葡萄糖與L-乳酸的第二次試驗提供69%丁酸碳產率(高於理論產率)，其抑制醋酸及丙酸的產生(其總碳產率與丁酸碳產率之間的差異僅5%)，參閱第8圖。第三，當使用L-乳酸作為單一基質時，產生相當大量的丁酸，然，亦會產生醋酸及丙酸(其總碳產率與丁酸碳產率之間的差異為23%)，請參閱第9圖，其總碳產率為96%，已非常接近理論值100%。鑑於以上，在發酵過程中，將乳酸與醣類結合作為基質已超過傳統發酵過程使用葡萄糖作為單一基質所預期的結果，在部分情況下，可視為提升丁酸碳產率的協同作用。
【實施例3】
批次發酵-固定化攪拌式反應槽
在實施例3中，探討細菌對於利用一固定化攪拌式反應槽系統進行發酵所得碳產率的影響，請參閱第2圖。該系統包括一2L攪拌式發酵槽。該攪拌式發酵槽配有一機械式攪拌器以及一pH計，連接至一整合式控制台(integrated control station)。該整合式控制台藉由添加酸或鹼溶液至發酵槽以控制發酵過程的pH值。當固定化細胞顆粒加至發酵槽時，即開始進行發酵。發酵過程所產生的氣體藉由位於發酵槽頂部的出口進行收集並以氣相層析法(gas chromatography)分析之。
對於酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)及丁酸梭菌(C.butyricum)，於一攪拌式發酵槽進行批次發酵。於發酵槽充滿以葡萄糖及L-乳酸作為基質(濃度請見表3)的原料後，以氮氣曝氣培養基以達厭氧狀態(anaerobiosis)。於接種70g固定化聚乙烯醇細胞顆粒(PVA-immobilized cell beads)(包含酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)或丁酸梭菌(C.butyricum))之前，以2N氫氧化鈉調整培養基pH值至6.0。於37℃，以600rpm攪拌速度進行發酵，並維持pH值大約6±0.1。持續進行此反應，直至由於產物抑制(product inhibition)停止產生丁酸。
重複批次發酵過程兩次，以進行發酵動力學研究。於固定間隔取樣，以分析懸浮細胞、基質及產物濃度。收集發酵過程所產生的氣體(例如氫氣或二氧化碳)並以氣相層析儀(GC)分析之。濃度的時間歷程及二氧化碳體積揭露於第10a~10d圖。基質起始濃度及碳產率整理於下表3。第10a~10d圖中的水平虛線代表產自葡萄糖的丁酸其理論的最大濃度。
表3 使用不同細菌的固定化攪拌式反應槽其發酵過程的碳產率
在傳統發酵過程(無乳酸，含12.9g葡萄糖)中，自葡萄糖所產生的理論二氧化碳為：
監測發酵過程所產生的二氧化碳。如第10b與10d圖所示，整個過程中，所觀察二氧化碳的累積量低於1.0L(低於0.5莫耳當量)，遠低於傳統僅使用葡萄糖的發酵過程所預測的理論量。此表明其具有不同生合成路徑，於發酵過程中可降低二氧化碳生成。
【實施例4】
重複批次發酵
在實施例4中，探討藉由重複使用相同固定化細胞顆粒於一攪拌式反應槽系統所進行的重複批次發酵，如實施例3及第2圖所載。
於一2L攪拌式發酵槽進行酪丁酸梭菌(C. tyrobutyricum)的批次發酵。在第一發酵循環中，使用1.0L包含葡萄糖(13g/L)及L-乳酸(15g/L)的原料。以氮氣曝氣培養基以達厭氧狀態(anaerobiosis)。於接種70g固定化酪丁酸梭菌顆粒(immobilized C.tyrobutyricum beads)(接種量(inoculum size)約為5%(w/v))之前，以2N氫氧化鈉調整培養基pH值至6.0。於37℃，以600rpm攪拌速度進行試驗，並維持pH值大約6±0.1。於固定間隔取樣，以分析懸浮細胞、基質及產物濃度。濃度的時間歷程揭露於第11圖。基質起始濃度及碳產率整理於下表4。持續進行發酵，直至不再產生丁酸(約發酵開始後的70小時)。移除原料，將細胞顆粒留於發酵槽。丁酸碳產率為65%，而乳酸的丁酸碳產率為64%(假設葡萄糖以理論產率66%進行轉換)。第11圖中的水平虛線代表產自葡萄糖的丁酸其理論的最大濃度。
在第二批次中，於第80小時，將包含額外醋酸的新鮮 原料添加至發酵槽，即使醋酸濃度高，在反應過程中仍會產生丁酸。因人為添加醋酸可能引起的產物抑制似乎並未抑制丁酸生成。其基質與乳酸的丁酸碳產率(63%、60%)僅稍低於第一批次的丁酸碳產率(65%、64%)。於40小時後終止發酵並移除原料。在第三批次中，以相同固定化細胞顆粒對僅含L-乳酸的新鮮原料進行發酵。乳酸轉換為丁酸的碳產率為68%。此試驗證明即使在一高醋酸濃度下，於重複批次發酵(repeated batch fermentation)中藉由重複利用固定化細胞顆粒仍可達成再現碳產率(reproducible carbon yields)。其亦證明在固定化細胞顆粒存在下，每一基質可分次地加至原料(發酵液)中。
【實施例5】
在實施例5中，提供使用固定化酪丁酸梭菌顆粒(immobilized C.tyrobutyricum beads)的發酵過程，其程序及發酵系統大體與實施例3所描述者類似。
於一2L攪拌式發酵槽進行批次發酵。於發酵槽充滿包含葡萄糖(15g/L)及L-乳酸(15g/L)的原料後，以氮氣曝氣培養基以達厭氧狀態(anaerobiosis)。於接種70g包含酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)(接種量(inoculum size)約為5%(w/v))的固定化聚乙烯醇細胞顆粒(PVA-immobilized cell beads)之前，以2N氫氧化鈉調整培養基pH值至6.0。於37℃，以600rpm攪拌速度進行發酵，並藉由加入2N氫氧化鈉溶液以維持pH值大約6±0.1。持續進行此反應，直至由於產 物抑制(product inhibition)停止產生丁酸。濃度的時間歷程揭露於第12圖，其水平虛線代表產自葡萄糖的丁酸其理論的最大濃度。最終丁酸濃度為17.2g/L，而產物中的醋酸量極低。丁酸碳產率為83%，遠超過傳統發酵的理論產率66%(假設葡萄糖以理論碳產率進行轉換)。自乳酸至丁酸的轉換可予定量。也就是說，未因生成二氧化碳而發生碳損失(carbon loss)。本實施例中極高的碳產率表明自乳酸至丁酸的一替代生合成路徑，與未添加乳酸的發酵過程相較，其可降低二氧化碳生成並提高最大碳產率(maximum carbon yield)。
【實施例6】
結合乳酸與木糖於填充床發酵系統
在實施例6中，探討使用葡萄糖以外醣類的發酵過程。以下試驗所使用的填充床發酵系統揭示於第3圖。發酵系統包括一0.5L填充床生物反應器，其藉由一再循環迴路與一2L攪拌式發酵槽連接。該再循環迴路由整合式控制台中的幫浦給予動力。整合式控制台調整發酵槽內的pH值及溫度。整合式控制台中的幫浦將原料藉由再循環迴路自發酵槽頂閥傳輸至填充床生物反應器底部。過程所產生的氣體藉由填充床生物反應器及發酵槽頂部釋放至一氣體收集裝置。上述發酵過程於控制的pH值與溫度及良好混合條件下進行操作。
將約200g固定化聚乙烯醇酪丁酸梭菌細胞顆粒 (PVA-immobilized C.tyrobutyricum cell beads)填充於填充床生物反應器。發酵槽充滿1.5L包含木糖及L-乳酸的原料。以氮氣曝氣發酵槽原料以達厭氧狀態(anaerobiosis)。於開始進行發酵之前，以2N氫氧化鈉調整原料pH值至6.0。於37℃，幫浦速率10ml/min條件下，藉由填充床生物反應器對發酵槽中的培養基進行再循環以進行發酵。於第53小時，將第二批次原料加至發酵槽。於固定間隔取樣，以分析懸浮細胞、基質及產物濃度。基質及產物濃度的時間歷程揭露於第13a~13b圖。基質起始濃度及最終碳產率整理於下表5。
木糖碳產率為兩次進料的平均值。在使用五碳醣例如木糖的發酵過程中，可獲得極佳丁酸碳產率及總碳產率。本試驗證明在發酵過程中，將葡萄糖以外醣類與乳酸結合作為基質已超過傳統發酵過程使用葡萄糖作為單一基質所預期的結果，在部分情況下，可視為提升丁酸碳產率的協同作用。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
10‧‧‧(攪拌式)發酵槽
12‧‧‧機械式攪拌器
14‧‧‧溫度計
16‧‧‧pH計
18‧‧‧發酵槽的酸入口
20‧‧‧發酵槽的鹼入口
22‧‧‧發酵槽頂部的氣體出口
24、62‧‧‧固定化細胞顆粒
26‧‧‧原料
30‧‧‧整合式控制台
32‧‧‧酸溶液
34‧‧‧鹼溶液
36‧‧‧恆溫器
38‧‧‧攪拌速度
40‧‧‧幫浦
50‧‧‧氣體收集裝置
60‧‧‧填充床生物反應器
64‧‧‧再循環迴路
66‧‧‧填充床生物反應器頂部的氣體出口
70、72、74‧‧‧管
第1圖揭露一種用於發酵的懸浮液系統(free suspension system)；第2圖揭露一種用於發酵的攪拌式反應槽系統(stirred-tank reactor system)；第3圖揭露一種用於發酵的固定化填充床系統(immobilized pack-bed system)；第4a圖揭露使用葡萄糖及L-乳酸作為基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第4b圖揭露使用葡萄糖作為單一基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第5a圖揭露使用葡萄糖及L-乳酸作為基質以丁酸梭菌(C.butyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第5b圖揭露使用葡萄糖作為單一基質以丁酸梭菌(C.butyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第6圖揭露使用葡萄糖及L-乳酸作為基質以拜氏梭菌(C.beijerinckii)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第7圖揭露使用葡萄糖作為單一基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程； 第8圖揭露使用葡萄糖及L-乳酸作為基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第9圖揭露使用L-乳酸作為單一基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第10a圖揭露於一攪拌式反應槽系統中以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第10b圖揭露於一攪拌式反應槽系統中以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵所產生的二氧化碳體積；第10c圖揭露於一攪拌式反應槽系統中以丁酸梭菌(C.butyricum)進行發酵其細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第10d圖揭露於一攪拌式反應槽系統中以丁酸梭菌(C.butyricum)進行發酵所產生的二氧化碳體積；第11圖揭露於一攪拌式反應槽系統中以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行重複批次發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程，第一批次基質包括葡萄糖及L-乳酸，第二批次基質包括葡萄糖、L-乳酸及醋酸，第三批次基質僅包括L-乳酸；第12圖揭露於一攪拌式反應槽系統中使用葡萄糖及L-乳酸作為基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第13a圖揭露於一固定化填充床系統中使用木糖及L- 乳酸作為基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程；第13b圖揭露於一固定化填充床系統中使用木糖及L-乳酸作為基質以酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)進行發酵其懸浮細胞、基質及產物濃度的時間歷程。
10‧‧‧(攪拌式)發酵槽
12‧‧‧機械式攪拌器
14‧‧‧溫度計
16‧‧‧pH計
18‧‧‧發酵槽的酸入口
20‧‧‧發酵槽的鹼入口
22‧‧‧發酵槽頂部的氣體出口
24‧‧‧固定化細胞顆粒
26‧‧‧原料
30‧‧‧整合式控制台
32‧‧‧酸溶液
34‧‧‧鹼溶液
36‧‧‧恆溫器
38‧‧‧攪拌速度
50‧‧‧氣體收集裝置
70、72、74‧‧‧管

Claims (17)

  1. 一種丁酸之製備方法，包括：以至少一梭菌株(Clostridium strain)對一原料進行發酵以產生丁酸，其中該至少一梭菌株選自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)，其中該原料包括一基質，包括乳酸與至少一醣類，其中該至少一醣類選自醣或醣混合物所組成之族群，且該乳酸之用量大於或等於該基質中之總醣量。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之丁酸之製備方法，其中該至少一梭菌株(Clostridium strain)為酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之丁酸之製備方法，其中該至少一醣類選自單醣、雙醣、多醣及其混合物。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之丁酸之製備方法，其中該單醣選自葡萄糖(glucose)、木糖(xylose)、半乳糖(galactose)及其混合物。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之丁酸之製備方法，其中該雙醣選自乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、纖維二糖(cellobiose)及其混合物。
  6. 如申請專利範圍第3項所述之丁酸之製備方法，其中該多醣選自澱粉(starch)、肝糖(glycogen)、纖維素(cellulose)及其混合物。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之丁酸之製備方法，其中該至少一醣類包括至少一可溶性醣類，以一酵素糖化製 程(enzymatic saccharification process)處理生質物(biomass)而獲得。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之丁酸之製備方法，其中該至少一梭菌株(Clostridium strain)為酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)，而該至少一醣類為葡萄糖。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之丁酸之製備方法，其中該發酵步驟的持續時間為當大量該原料已被消耗時為止，或當觀察到該丁酸已無顯著增加時為止。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之丁酸之製備方法，其中該發酵步驟持續進行10~80小時。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之丁酸之製備方法，更包括於一觸媒存在下，對該丁酸進行氫化以產生丁醇。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之丁酸之製備方法，更包括於一觸媒與一醇類存在下，對該丁酸進行酯化以產生一丁酸酯。
  13. 一種丁酸之製備方法，包括：以至少一梭菌株(Clostridium strain)對一原料進行發酵以產生丁酸，其中該至少一梭菌株選自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)，其中該原料包括一基質，包括乳酸與至少一醣類，其中該至少一醣類選自醣或醣混合物所組成之族群，且該乳酸之用量大於或等於該基質中之總醣量，以及其中於該發酵步驟開始之前或之後，將該乳酸分次地 加至該原料中。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之丁酸之製備方法，其中於該發酵步驟開始之前或之後，將該乳酸與該至少一醣類以任意順序分次地加至該原料。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之丁酸之製備方法，其中該至少一醣類選自單醣、雙醣、多醣及其混合物。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之丁酸之製備方法，其中該至少一梭菌株(Clostridium strain)為酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)，而該原料包括乳酸及葡萄糖。
  17. 一種丁酸之製備方法，包括：以至少一梭菌株(Clostridium strain)對一原料進行發酵以產生丁酸，其中該至少一梭菌株選自酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、丁酸梭菌(C.butyricum)及拜氏梭菌(C.beijerinckii)，其中該原料包括乳酸及至少一醣類，且該乳酸之用量大於或等於該基質中之總醣量。
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