CN101861385B - 用于乙醇生产的可利用木糖的发酵单胞菌的木糖醇合成突变体 - Google Patents

用于乙醇生产的可利用木糖的发酵单胞菌的木糖醇合成突变体 Download PDF

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Abstract

通过对葡萄糖-果糖氧化还原酶基因进行遗传修饰以降低GFOR酶表达活性，从而构建了可利用木糖的发酵单胞菌。该工程菌表现为降低木糖代谢中有害副产物木糖醇的产量。它也可在处理相关的条件下，在混合糖发酵过程中消耗更多的木糖，产生更多的乙醇。

Description

用于乙醇生产的可利用木糖的发酵单胞菌的木糖醇合成突变体
本申请要求于2006年9月28日申请的美国临时申请No.60/847813的权益，其全部内容作为本申请的一部分并入本申请中，用于所有的目的。
政府权利声明
本发明是在美国政府支持下完成的，由能源部授予的合同号为04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146。政府在本发明中享有某些权利。
发明领域
本发明涉及微生物及基因工程领域。更具体地，开发了一株对葡萄糖-果糖氧化还原酶基因进行了遗传修饰的、可利用木糖的发酵单胞菌。该菌株在发酵及乙醇生产期间木糖代谢中的有害的副产物——木糖醇的产量降低了。
发明背景
通过微生物来生产乙醇可为化石燃料提供替代的能源来源，因而是目前研究中的一个重要领域。运动发酵单胞菌是一种可生长在葡萄糖、果糖、及蔗糖上、通过恩杜糖解途径将这些糖类代谢为CO2和乙醇的产乙醇细菌。尽管野生型菌株不能以木糖为碳源，但已构造了可生长在这种糖上的重组运动发酵单胞菌菌株(US 5514583，US5712133，WO 95/28476，Feldmann et al.(1992)Appl MicrobiolBiotechnol 38：354-361，Zhang et al.(1995)Science 267：240-243)。
木糖是可水解的木质纤维素原料中主要的戊糖，因此可在发酵中提供充足的、低廉的可用碳源。已对运动发酵单胞菌改造使其表达木糖代谢所需的四种酶：1)木糖异构酶，催化木糖向木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，将木酮糖磷酸化形成木酮糖5-磷酸；3)转酮醇酶及4)转醛醇酶(US 5514583，US 6566107；Zhang et al.(1995)Science267：240-243)。通过这四种酶的联合作用以及细胞正常的代谢机制，三分子的木糖被转化为二分子的葡萄糖6-磷酸及一分子的甘油醛3-磷酸，随后在葡萄糖一侧的途径中被转化为乙醇和CO2(参见图1)。
尽管已经成功构建了用于木糖代谢的运动发酵单胞菌菌株，但这些菌株不能如利用葡萄糖那样，利用木糖生长并产生乙醇。导致利用木糖生长不良的一个因素是产生了作为木糖代谢副产物的木糖醇(Feldmann et al.同上；Kim et al.(2000)Applied and EnvironmentalMicrobiology 66：186-193)。木糖醇通过木酮糖激酶被磷酸化，产生木糖醇5-磷酸，它在细胞中累积并抑制细菌生长。木糖醇的合成也降低了乙醇产量，因为可利用木糖的重组运动发酵单胞菌菌株不能将木糖醇转化为乙醇。此外，木糖醇也是木糖异构酶的潜在抑制剂(Smith etal.(1991)Biochem J.277：255-261)，该酶可催化工程菌木糖代谢途径中利用木糖的第一个步骤。参见图2表示木糖醇合成及作用的图表。
尚未确定在体内与木糖醇合成有关的生理途径及酶。不过，已表明来自野生型运动发酵单胞菌的无细胞提取物在添加了NADPH时可还原木糖生成木糖醇(Feldmann et al.，同上)，并且该反应是由NADPH依赖的醛糖还原酶来催化的。也表明了运动发酵单胞菌的无细胞提取物可在没有添加NADPH的情况下将少量的木糖转化为木糖醇，而且在这些条件下当还向反应混合物中加入了纯化的木糖异构酶时木糖醇产量增加了3-4倍(Danielson，2001，University of Colorado MastersThesis)。由于木糖异构酶能够将木糖转化为木酮糖，近来实验的合理推论是运动发酵单胞菌中的酶——葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)可以利用木糖作为电子供体、木酮糖作为电子接纳体来生成木糖醇，这些将在下文进行更为详尽的讨论。因此，基于体外实验，在运动发酵单胞菌中至少存在两条木糖醇产生途径，但是它们在生理条件下对木糖醇形成的贡献程度仍待确定。
为了高水平地生产乙醇，在可能导致渗透压休克的高浓度可发酵碳源中培养运动发酵单胞菌。当将野生型菌株转移到含＞200g/L葡萄糖和果糖或者＞360g/L蔗糖的液体培养基中时，在开始生长前的长时间的延迟期即为渗透压休克(Loos et al.(1994)J Bacteriol176：7688-7693)。此外，当将野生型菌株转移到高浓度的这些糖类中时，向培养基中添加山梨糖醇可减少延迟期(Wiegert et al.(1996)ArchMicrobiol 166：32-41，Loos et al同上)。
也表明了当在浓缩的葡萄糖与果糖混合物(Loos et al.同上)或者浓缩的蔗糖溶液(-，Weigert et al同上，Loos et al同上)中培养野生型运动发酵单胞菌时，周质酶——葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)在渗透压平衡中发挥重要作用。简而言之，GFOR与其紧密结合的辅助因子以如图表1中所示的典型的乒乓机制来催化葡萄糖到葡糖酸内酯的氧化以及后来的果糖到山梨糖醇的还原。在周质空间产生的山梨糖醇逆浓度梯度转运到细胞内，在那里它由于不发生进一步的代谢而累积到很高水平。细胞内高浓度的山梨糖醇会消除质膜内外的渗透压差异，恢复渗透压平衡。
当在低浓度蔗糖(＜150g/L)中进行培养时，一株不能产生山梨糖醇的野生型运动发酵单胞菌的自发突变株可比野生型细胞生产出更高水平的乙醇，但该菌株不能在高浓度蔗糖中生长(Kirk and Doelle(1993)Biotechnol.Letters 15：985-990)。后来发现该突变株缺少葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的表达，这使得它不能将任何蔗糖来源的果糖转化为多余的副产物山梨糖醇(Wiegert et al.同上)。也表明可通过向培养基中添加山梨糖醇的方式来恢复山梨糖醇缺陷的突变株在高浓度蔗糖中的生长(Wiegert et al.，同上)。因此，当在浓缩的葡萄糖与果糖混合物中或者浓缩的可被宿主细胞转化酶水解为葡萄糖与果糖的蔗糖中培养运动发酵单胞菌时，GFOR通过合成山梨糖醇在渗透压平衡中发挥着至关重要的作用。
Figure G200780036026XD00031
图表I
CN1600850(A)描述了一株具有失活的GFOR基因从而不能利用木糖的运动发酵单胞菌突变株，以及使用该菌株来进行乙醇生产。当葡萄糖、果糖和蔗糖用作碳源时，该菌株中没有山梨糖醇的产生会导致更高水平的乙醇。
在改造后的、利用木糖及葡萄糖混合物(没有添加蔗糖或果糖)生长的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株中降低或消除了葡萄糖-果糖氧化还原酶酶活的效应仍是未知的。
对于当在含木糖的培养基上进行培养时能够产生更多量乙醇的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株仍有需求。申请人已经通过确定体内木糖醇产生的主要途径、并利用基因失活消除了与其形成有关的酶的活性、进而生成了具有更高乙醇产量的运动发酵单胞菌菌株，从而解决了该问题。
发明概述
本发明涉及诸如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)这样的发酵单胞菌菌株，当在存在木糖的情况下进行培养时，其木糖醇产量降低了，而乙醇产量增高了。申请人已发现在可代谢木糖的运动发酵单胞菌中木糖醇产量主要是由葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)这个酶来介导的。构建了不表达GFOR的遗传改良菌株(譬如敲除GFOR的突变株)，发现当利用含有木糖的糖类混合物上培养，木糖醇的产量降低了。当利用存在山梨醇的高糖混合物培养时，GFOR敲除突变株还可以比表达GFOR的亲代菌株消耗更多的木糖并产生更高浓度的乙醇。此外，GFOR敲除突变株的乙醇产量(消耗每克糖产生的乙醇量)有了显著增高。
因此，本发明提供了能够通过在糖类培养基中发酵，利用木糖来生产乙醇的发酵单胞菌属的重组微生物，所述微生物含有至少一种可降低葡萄糖-果糖氧化还原酶酶活的遗传修饰。本发明包括能够利用木糖产生乙醇的发酵单胞菌菌株，它由于GFOR基因的遗传改造而表现出GFOR活性的降低。任何GFOR活性的降低均在本发明范畴内，包括完全失活针对GFOR活性的基因和/或完全敲除GFOR酶活的突变。
此外，本发明提供了生成GFOR活性有所降低的发酵单胞菌菌株的方法，其包括：
a)提供能够在适当条件下利用木糖产生乙醇的重组发酵单胞菌菌株；及
b)向(a)中的重组发酵单胞菌菌株引入至少一种遗传修饰，其中所述修饰可降低葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。
附图、生物保藏及序列描述的简要说明
可通过下述详细描述、附图及作为本发明一部分的附加的序列描述来更为充分地了解本发明。
图1所示的是用于改造运动发酵单胞菌以利用木糖的四种酶(框内)以及使用木糖进行乙醇生产的生化途径的示意图。
图2所示的是改造后木糖途径的前两个步骤(框内)、木糖醇合成、木糖醇5-磷酸形成(一种毒性削弱的中间物)及木糖醇对木糖异构酶的抑制的示意图。
图3所示的是对转酮醇酶(A)、转醛醇酶(B)、木糖异构酶(C)和木酮糖激酶(D)进行酶测定的策略。
图4所示的是pMODPgaptaltktCm的质粒图谱。
图5所示的是pMODPgapxylABCm的质粒图谱。
图6所示的是在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C和T5C谱系中木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性的图。
图7所示的是在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C和T5C谱系中转醛醇酶(TAL)和转酮醇酶(TKT)活性的图。
图8所示的是所选择的适于利用木糖的菌株菌落的％理论乙醇产量及％理论木糖利用图。
图9所示的是适应利用木糖的菌株在含5％葡萄糖的RM(RMG)中培养50代之前或之后于含5％木糖(RMX5％)的RM(丰富培养基)上培养70小时时的生长图。
图10所示的是所选择的菌株——ZW658与对照菌株——8b相比较，在RM+10％葡萄糖(RMG10％)(A、B)及RM+8％木糖(RMX8％)(C、D)中的生长、葡萄糖或木糖利用及乙醇与木糖醇产量图。
图11所示的是所选择的菌株——ZW658与对照菌株——8b相比较，在不含醋酸盐(A、B)或含有0.6％醋酸盐(C、D)的、RM+10％葡萄糖(RMG10％)及RM+8％木糖(RMX8％)中的生长、葡萄糖或木糖利用及乙醇与木糖醇产量图。
图12所示的是在为了对GFOR基因进行插入失活而构建自杀构建体时所制备的质粒、以及终产物GFORSp-9WW的图谱。
图13所示的是用来构建木糖异构酶表达质粒——pZB 188/Kan-XylA而制备的载体的图谱，以及用于该构建体的大肠杆菌木糖异构酶表达盒的图表(框内)
图14所示的是在存在或者没有木糖异构酶表达时，具有或者不具有GFOR基因失活的ZW1菌株的木糖醇与木酮糖产量图。
图15所示的是利用总计为97g/L木糖+葡萄糖培养没有(A)或者具有(B)GFOR基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时，其生长、葡萄糖或木糖利用及乙醇产量图。
图16所示的是利用总计为188g/L木糖+葡萄糖培养没有(A)或者具有(B)GFOR基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时，其生长、葡萄糖或木糖利用及乙醇产量图。
图17所示的是在存在不同浓度山梨糖醇时具有GFOR基因失活的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株的生长图。
图18所示的是在没有(A、B)或存在(C、D)醋酸盐、利用总计为174g/L木糖+葡萄糖培养没有(A、C)或者具有(B、D)GFOR基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时，其木糖利用、乙醇产量及木糖醇产量图。
图19所示的是在没有(A、B)或存在(C、D)醋酸盐、利用总计为203g/L木糖+葡萄糖培养没有(A、C)或者具有(B、D)GFOR基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时，其木糖利用、乙醇产量及木糖醇产量图。
图20所示的是在添加了用于增加缓冲能力的碳酸氢钾的、没有(A、B)或存在(C、D)醋酸盐、利用总计为203g/L木糖+葡萄糖培养没有(A、C)或者具有(B、D)GFOR基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时，其木糖利用、乙醇产量及木糖醇产量图。
图21所示的是在进行可控pH的发酵中，在存在醋酸盐、利用总计为189g/L木糖+葡萄糖培养具有GFOR基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时，其木糖与葡萄糖利用、乙醇产量及木糖醇产量图。
图22所示的是pZB 188/Kan以及可在运动发酵单胞菌中复制的Cre表达载体pZB 188/kan-Cre的质粒图谱。
图23A所示的是在可控pH条件下，在含有醋酸盐的高葡萄糖+木糖中ZW801-4与ZW800生长的比较。
图23B所示的是ZW801-4相对于ZW800的葡萄糖与木糖利用及乙醇产量图。
图24所示的是ZW801-4中翻译后的突变序列与野生型GFOP蛋白的比对。
可通过下述详细描述以及作为本申请一部分的附加序列描述来更为充分地理解本发明。
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含核苷酸序列和/或氨基酸序列事项的专利申请的要求-序列规则”)，并与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)、EPO及PCT的序列列表要求(规则5.2及49.5(a-bis)、以及行政指导208项与附录C)相一致。核苷酸及氨基酸序列数据中所用的符号和格式符合37C.F.R.§1.822中给出的规则。
在此用光盘来提供序列列表。因此根据37CFR 1.52(e)通过参考的方式将含有序列列表的光盘的内容并入本申请。光盘以一式两份的形式来提交，彼此间相互一致。光盘标记为“拷贝1-序列列表”和“拷贝2-序列列表”。光盘含有下列文件：CL3604seq list.ST25。
SEQ ID NOs：1和2是用于从pZB4中扩增含甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：3和4是用于从pZB4中扩增含tal编码区的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：5和6是用于从Pgap及tal片段中扩增含Pgaptal的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：7和8是用于从pZB186中扩增含loxP::Cm的DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是pMODPgaptaltktCm质粒的完整核苷酸序列。
SEQ ID NOs：10和11是用于在具有pMODPgaptaltktCm的转化子中扩增含tal及tkt编码区的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是pMODPgapxylABCm质粒的完整核苷酸序列。
SEQ ID NOs：13和14是用于从具有pMODPgapxylABCm的T2C、T3C、T4C及T5C整合子中扩增1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：15和16是用于从具有pMODPgapxylABCm的T2C、T3C、T4C及T5C整合子中扩增1.3kb xylB DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：17和18是用于从含pgm基因的3’末端部分、ldh基因及adhl基因的5’末端部分的运动发酵单胞菌W1基因组DNA中扩增2268bp DNA片段的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：19和20是用于从pACYC184中扩增四环素抗性盒的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：21和22是用于生成loxP位点的寡聚核苷酸序列。
SEQ ID NOs：23和24是用于生成loxP位点的寡聚核苷酸序列。
SEQ ID NOs：25和26是用于从pHP15578中扩增Specr盒的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：27和28是用于从ZW1基因组DNA中扩增3′GFOR侧翼DNA的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：29和30是用于从ZW1基因组DNA中扩增5′GFOR侧翼DNA的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：31是pGFORSp-9WW质粒的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：32和33是用于从pET-24a中扩增Kanr-盒的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：34是来源于pZB4的大肠杆菌xylA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NOs：35和36是用于扩增Cre-表达盒的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：37是ZW801-4中被破坏的GFOR编码区的完整的核苷酸序列(从起始密码子到原有的终止密码子)。
EQ ID NO：38是野生型GFOR编码区的完整的核苷酸序列(从原有的起始密码子到原有的终止密码子)。
申请人根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约将下述生物学保藏物保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209：
Figure G200780036026XD00081
发明详述
本发明描述了通过修饰内源葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)基因进行了改造的可利用木糖的重组发酵单胞菌菌株，以及制备GFOR被修饰的发酵单胞菌菌株的方法。本文所述的方法包括任何可消除或减少GFOR酶活性的遗传修饰，它可在木糖代谢期间导致木糖醇产量的降低并增加乙醇产量。经遗传修饰后的、GFOR酶活性降低的、可利用木糖的发酵单胞菌可用于通过发酵来生产乙醇的方法。通过全新的发酵单胞菌菌株所生产的乙醇可用作化石燃料的替代能源。
下述缩写及定义将用于阐明本发明及权利要求。
″葡萄糖-果糖氧化还原酶″缩写为GFOR。
RM是丰富培养基。
RMG5％是RM+5％葡萄糖。
RMG10％是RM+10％葡萄糖。
RMX8％是RM+8％木糖。
RMX2％是RM+2％木糖。
RMX5％是RM+5％木糖。
RMGX10％8％是RM+10％葡萄糖和8％木糖。
RMGX5％8％是RM+5％葡萄糖和8％木糖。
“基因”是指包括编码序列之前(5’非编码序列)或之后(3’非编码序列)的调控序列在内的可表达特定蛋白的核酸片段。“天然基因”或“野生型基因”是指与其自身调控序列以天然状态存在的基因。“嵌合基因”是指任何非天然基因的基因，含有不会同时以天然状态存在的调控序列及编码序列。因此，嵌合基因可含有来自不同来源的调控序列及编码序列，或者来自相同来源的调控序列与编码序列以与天然状态不同的方式排列在一起。“内源基因”是指在生物基因组中位于其天然位置的天然基因。“外源”基因是指在宿主生物中通常不存在的基因，但是通过转基因方式导入到宿主生物中。外源基因可包括插入到非天然生物体内的天然基因，或者嵌合基因。
术语“基因构建体”是指编码用于表达一种或多种特定蛋白的核酸片段。在基因构建体中，基因在性质上可以是天然的、嵌合的或者外源的。典型地，基因构建体会含有“编码序列”。“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
“启动子”或“起始控制区”是指能够控制编码序列表达的DNA序列或者有功能的RNA。通常，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可以全部来自天然基因，或者由来自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或者还可以含有合成的DNA片段。本领域的技术人员知道在不同的组织或者细胞类群中、或在不同的发育阶段、或为了对不同的环境条件做出应答，可使用不同的启动子来指导基因表达。在绝大多数细胞类群中可在大部分时间使基因进行表达的启动子通常称之为“组成型启动子”。
本申请中所用术语“表达”是指来源于某个基因的正义(mRNA)或反义RNA的转录及稳定累积。表达也可以指将mRNA翻译为多肽。“反义抑制”是指产生的反义RNA转录物能够抑制靶蛋白的表达。“过表达”是指在转基因生物中基因产物的产量超过了正常的或非转化生物中的产量水平。“共抑制”是指正义RNA转录物或片段的产生能够抑制相同的或者基本上相似的外源或内源基因的表达(U.S.5,231,020)。
本申请中所用术语“信使RNA(mRNA)”是指没有内含子并可由细胞翻译为蛋白的RNA。
本申请中所用术语“非功能基因”是指不表达所编码蛋白的基因——该基因在野生型菌株中通常是内源的。可在任何水平上——譬如转录、RNA加工或翻译水平上破坏非功能基因的表达。典型地，非功能基因极少或者不表达所编码的蛋白。然而，它仍可编码比野生型蛋白具有更低酶活性的修饰蛋白。
本申请中所用术语“转化”是指将核酸片段转入到宿主生物中，并可稳定遗传。转入的核酸可以是可在宿主细胞中维持的质粒的形式，或者某些转入的核酸也可以整合到宿主细胞的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或者“转化”生物。
本申请中所用术语“质粒”及“载体”是指通常携带不参与细胞核心代谢的基因的额外的染色体元件，一般以环状双链DNA分子的形式存在。这些元件可以是来自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状、单链或双链DNA或RNA，其中一些核苷酸序列连接起来或者重构成为独特的构建体，它可将启动子片段、产生所需基因产物的DNA序列以及合适的3’非翻译序列转入到细胞中。
术语“可操作连接到”是指将核酸序列连接到单个核酸片段上，从而使其中某个的功能受到另一个的影响。例如，启动子当能够影响编码序列的表达时，它可操作连接到编码序列上(即，编码序列处于启动子的转录控制下)。编码序列可以正义方向或反义方向可操作连接到调控序列上。
术语“选择标记”是指某种鉴定因子，通常是能够根据标记基因的效果——例如对抗生素的抗性来进行选择的抗生素或化学抗性基因，其中上述效果用于追踪目标核酸的遗传和/或鉴定继承了目标核酸的细胞或生物。
术语“基本上消除了”木糖醇产生及“基本上没有”副产物木糖醇是指使用典型的实验室分析所检测木糖醇的量接近或者近似为0的情形。
术语“高浓度的混合糖类”是指在培养基中的总糖浓度能使可利用木糖的运动发酵单胞菌的GFOR突变株的生长受到抑制。尽管确切浓度会随培养基中的其它组分有很大变化，典型地，它高于约100g/L。
术语“可发酵的糖”是指在发酵过程中可用作微生物的碳源的寡糖与单糖。
术语“木质纤维”是指同时含有木质素及纤维素的组分。木质纤维原料也可含有半纤维素。
术语“纤维质”是指含有纤维素及包括半纤维素在内的其它成分的组分。
术语“糖化作用”是指从多糖中产生可发酵的糖类。
术语“预处理的生物量”是指在糖化作用前进行过预处理的生物量。
“生物量”是指任意的纤维质或木质纤维原料，并包括含有纤维素、优选地进一步含有半纤维素、木质素、淀粉、多糖和/或单糖的原料。生物量也可以含有其它组分，譬如蛋白和/或脂类。生物量可以是单一来源，或者生物量可包括来自一种来源以上的混合物；例如，生物量可以包括玉米棒子及玉米干草的混合物，或者草及叶子的混合物。生物量包括单不限定于，生物能源作物、农作物剩余物、城市生活垃圾、工业固体废物、来自造纸厂的淤泥、庭园垃圾、木材及林业垃圾。生物量的实施例，包括但不限定于，玉米粒、玉米棒子、诸如玉米壳这样的作物剩余物、玉米秸秆、草、小麦、小麦杆、大麦、大麦杆、秸秆、水稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高梁、大豆、从磨碎的谷子、树木、枝条、根、叶片、木片、锯屑、灌木和矮树中获得的组分、蔬菜、水果、花及动物肥料。
“生物量水解产物”是指由生物量糖化作用获得的产物。生物量也可以在糖化作用前进行预处理。
本文所用的标准重组DNA及分子克隆技术在本领域是周知的，在
Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.；Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，New York，1989(在下文为“Maniatis”)；and bySilhavy，T.J.，Bennan，M.L.and Enquist，L.W.Experiments withGene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，New York，1984；and by Ausubel，F.M.et al.，In Current Protocolsin Molecular Biology，published by Greene Publishing and Wiley-Interscience，1987，中有描述。
本发明涉及增加乙醇生产的、可利用木糖的发酵单胞菌的改造菌株。通过可利用木糖的运动发酵单胞菌来提高乙醇产量的挑战在于减少或消除木糖醇的合成，这(a)意味着不会对碳吸(carbon sink)收造成增值；(b)抑制木糖利用的第一个步骤；及(c)可被磷酸化成抑制细菌生长的毒性削弱的中间物。申请人已发现内源GFOR酶主要负责体内木糖醇的合成，通过减少或消除GFOR酶活，可提高从木糖到乙醇的生产(速度、产量及滴度)。
可利用木糖的发酵单胞菌宿主菌株
任何能够利用木糖作为碳源的发酵单胞菌菌株均可用作制备本发明菌株的宿主。发酵单胞菌菌株，譬如已经对木糖发酵成乙醇进行了改造的运动发酵单胞菌是更为有用的。内源基因可提供部分代谢途径，或可通过任意已知的遗传操作技术来进行改变以提供对木糖代谢有用的具有酶活性的蛋白。例如，内源转酮醇酶可与其它导入的酶活性相互补产生木糖利用途径。典型地，如通过参考整合到本申请中的US 5514583所述，将4个基因导入到运动发酵单胞菌中用来表达参与木糖代谢的4个酶(图1)。它们包括编码催化木糖转化为木酮糖的木糖异构酶、及将木酮糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸的木酮糖激酶的基因。此外，戊糖磷酸化途径中的两个酶——转酮醇酶和转醛醇酶，能将木酮糖5-磷酸转化为可将戊糖代谢与糖酵解中恩杜糖解途径相关联的中间物，可使木糖代谢为乙醇。编码这些酶的DNA序列可从诸如肠道细菌及某些酵母与真菌这样的能代谢木糖的众多微生物中的任一一种来获得。编码区的来源包括黄单胞菌(Xanthomonas)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella)、埃希氏菌(Escherichia)、红细菌(Rhodobacter)、黄杆菌(Flavobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、土壤杆菌(Agrobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonads)及发酵单胞菌(Zymomonas)。特别有用的是大肠杆菌的编码区。
编码DNA序列可操作地连接到诸如运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP启动子)，及运动发酵单胞菌烯醇化酶启动子(ENO启动子)这样的、可在运动发酵单胞菌细胞中表达的启动子上。编码区可单独通过启动子来表达，或者两个或多个编码区连接成一个用同一个启动子进行表达的操纵子。得到的嵌合基因可导入到发酵单胞菌中并维持在质粒上，或使用譬如同源重组、定点整合或随机整合的方式整合到基因组中。具体所用的可利用木糖的菌株包括CP4(pZB5)(US 5514583)、ATCC31821/pZB5(US 6566107)、8b(US20030162271；Mohagheghi et al.，(2004)Biotechnol.Left.25；321-325)及ZW658(在本文中进行描述；保藏，ATTCC#PTA-7858)。
也可在本发明过程中使用进行了其它改造以利用不属于天然底物的、与木糖类似的其它糖类的发酵单胞菌菌株。在US 5843760中描述了改造后可利用阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株的实施例，通过参考的方式并入到本申请中。
发现由GFOR进行的木糖醇合成
由可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株合成的有害副产物——木糖醇，会降低乙醇的产量并导致可抑制细菌生长的毒性组分——木糖醇-5-磷酸的形成(参见图2)。此外，木糖醇是在改造后木糖利用途径中的第一个酶——木糖异构酶的有效抑制物，它的合成会降低细胞代谢木糖的能力。尽管体外实验已表明在运动发酵单胞菌中至少有两个木糖醇形成的途径(Feldmann et al.同上，Danielson et al.同上)，申请人发现生理产生的大部分木糖醇是GFOR酶活的结果。如本文所述，现在已发现由在含有木糖的培养基上培养的可利用木糖(或野生型运动发酵单胞菌的木酮糖合成的衍生物)的运动发酵单胞菌菌株合成的木糖醇的量在缺少GFOR酶活时明显降低了。申请人已发现木糖到木酮糖的转化是体内GFOR介导的木糖醇产生的先决条件，该反应仅发生在可表达木糖异构酶的运动发酵单胞菌菌株中。因此，认为改造后可利用木糖生长的运动发酵单胞菌菌株中木糖醇的主要生理性来源是由GFOR通过图表II和III中描述的其中一个或两个反应来合成的。
图表II
Figure G200780036026XD00142
图表III
需注意在两个图表中，木酮糖作为GFOR专性的电子接纳体，并且该化合物被还原成木糖醇，作为对比，在已知利用果糖的反应中会产生山梨糖醇(图表I)。尽管GFOR对葡萄糖和果糖十分具有特异性，但已表明它也可以使用其它糖类作为电子供体和电子接纳体，虽然相当稀少(Zachariou and Scopes(1986)Journal of Bacteriology167：863-869)。因此，当将木糖和果糖与纯化后的蛋白一起温育时，可观察到山梨糖醇的产生，但同使用葡萄糖的对照反应相比，GFOR酶活约降低了12倍。在同一篇论文中，表明了木酮糖可以替代果糖作为电子接纳体，该反应生成了如图表III中所述的木糖醇。然而，使用该底物组合，GFOR的酶活性降低了约14倍。除了这些观察资料外，还表明当向提供木酮糖来源的反应混合物中加入纯化的木糖异构酶时，从野生型运动发酵单胞菌制备的无细胞提取物能够从木糖生成木糖醇(Danielson同上)，因此表明了GFOR也能够催化图表II所述的反应。不过，无论在活细胞中是否发生了这些GFOR介导的反应、如果发生了它们对体内木糖醇的形成又有多大程度的影响，在申请人的发现之前仍有待确定。同样不确定的还有也存在于野生型运动发酵单胞菌无细胞提取物中的能够直接将木糖转化为木糖醇的NADPH依赖的醛糖还原酶活性(Feldmann et al.同上)。实际上，没有一个利用无细胞提取物的实验关注过上述关于GFOR与NADPH依赖的醛糖还原酶对体外木糖醇形成的相对贡献，更不用说在经过相关条件下的体内实验了。因此，申请人关于在改造后可利用木糖生长的运动发酵单胞菌，于生理条件下，在含木糖培养基中主要是由GFOR来负责木糖醇的产生的这个发现是令人震惊的，不能通过以前的技术进行预测。
改变GFOR基因表达
对本发明中可利用木糖的发酵单胞菌进行改造，使其GFOR编码基因的表达降低或者不表达，从而减少木糖醇的合成。本领域技术人员所知的、任何可减少有功能的酶的遗传修饰方法均可用来改变GFOR的表达。方法包括但不限制于，删除编码GFOR的基因的整个基因或其一部分、将一段DNA片段插入到GFOR基因(在启动子或者编码区内)中从而不表达蛋白或者在更低水平进行表达、向GFOR编码区引入可增加终止密码子或移码的突变从而不表达有功能的蛋白、以及向GFOR编码区引入一个或多个突变以改变氨基酸从而表达的是无功能的或者只有较低酶活性的蛋白。此外，可通过表达反义RNA或干扰RNA来封闭GFOR的表达，可引入能够产生共抑制的构建体。本领域技术人员利用编码GFOR酶的已知序列(SEQ ID NO：3)可以很容易地实现所有这些方法。在某些修饰过程中，GFOR编码序列周围的DNA序列也是有用的，其可由运动发酵单胞菌完整基因组序列(GenBank Accession#AE008692)中获得。
如本申请实施例3和5中所示，一种特别合适的用来产生遗传修饰的GFOR菌株的方法是，使用通过结合有壮观霉素抗性基因或者其它选择标记的GFOR侧翼DNA序列介导的同源重组，将选择标记插入到GFOR编码区从而不会表达有功能的GFOR酶。此外，选择标记也可以有位点特异性的重组位点，通过接下来表达相应的位点特异性的重组酶，可在不回复GFOR基因活性的情况下将抗性基因从GFOR基因上切除。位点特异性重组会留下一个重组位点，它会破坏GFOR酶的表达。如本领域技术人员所周知，可构建同源重组载体，在切除选择标记后同样可在GFOR基因中产生缺失。
优选地，应彻底消除GFOR的表达，不过，GFOR表达的显著降低也是本发明的体现。在此情况下，无功能的GFOR基因是指不以正常方式发挥功能，从而低于GFOR酶的正常水平。某些基因失活的方法可导致仍有某些残留的低水平表达，譬如共抑制。本文中，修饰的GFOR菌株是指具有较少或者没有GFOR酶活性的遗传修饰菌株。GFOR修饰菌株的生长和乙醇生成
在缺少或者存在其它糖类(“混合糖类”)的情况下，于含木糖的培养基中培养本发明中GFOR修饰的、可利用木糖的发酵单胞菌。混合糖类含有至少一种除木糖之外的其它糖类。任何可为发酵单胞菌细胞代谢提供能量来源的糖类、或者任何存在于含有木糖的混合物中的糖类均可包括在内。希望能够利用由生物量糖化作用(biomasssaccharification)产生的糖类培养GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌细胞。典型地，例如专利申请WO2004/081185以及共有且共同未决的美国专利申请60/670437中所述那样，生物量是经过预处理的，然后如Lynd，L.R.，et al.(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66：506-577)所综述用糖化作用的酶进行处理。生物量糖化作用产生的糖类，典型地含有木糖与葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和/或阿拉伯糖的混合物。优选地，混合糖类组分中含有木糖与葡萄糖，其中也可以有其它糖类。
混合物中不同糖类的比例可以有很大差异，典型地，木糖至少为总糖量的约10％。优选地，木糖为约40％至约60％之间。在糖类中存在由某些生物量譬如甘蔗渣的糖化作用所产生的果糖，可替代一部分木糖或者葡萄糖，这样木糖至少占糖类混合物的约10％。此外，阿拉伯糖来源于半纤维素，并且是来源于含半纤维素的糖化生物量的混合糖类中的典型成分。
在不属于GFOR修饰菌株的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株不会产生木糖醇的发酵条件下，本发明中GFOR修饰的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株可生长并产生与非GFOR修饰菌株等量的乙醇。例如，在譬如约100g/L的混合糖类、其中葡萄糖与木糖的比为5∶4的低糖培养基中，GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌细胞表现得与非GFOR修饰菌株很相似。
为了在发酵时获得最大的乙醇产量及效率，希望可在含包括木糖在内的高水平糖类的培养基中培养可利用木糖的产乙醇生物。为了培养本发明的运动发酵单胞菌菌株，可在培养基中使用高浓度的混合糖类。这样可以直接使用生物量糖化作用的糖类，或者略加稀释后使用，从而减少发酵物体积——这在商业规模的乙醇生产中是很受欢迎的。使用高糖浓度可产生更高浓度的乙醇。在发酵培养基中混合糖类的浓度典型地为至少约120g/L直至约300g/L。特别有用的是浓度在约150g/L到约235g/L之间的高浓度混合糖类。
在期望生产乙醇的高浓度混合糖类条件下，GFOR修饰的可利用木糖的运动发酵单胞菌所用的发酵培养基中含有山梨糖醇。申请人惊奇地发现向高混合糖类培养基中添加山梨糖醇可使GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌生长很好，而未加入山梨糖醇的、GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌极少生长或不生长。这与可产生GFOR的菌株明显相反，后者在延迟期12-36小时后不添加山梨糖醇的情况下能够适应浓缩的糖类混合物。在缺少果糖或蔗糖(作为果糖来源)的培养基中，认为GFOR不会合成山梨糖醇或者在渗透适应中发挥作用。当生长培养基中没有果糖时，如图表I所示的GFOR在山梨糖醇合成中的已知反应无法继续。具有正常GFOR酶活性的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株能够在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中生长的能力——尽管有一个长的延迟期，表明了通过GFOR进行的山梨糖醇合成对于渗透适应不是必需的，因为没有果糖，GFOR不会合成山梨糖醇。因而在缺少果糖的生长培养基中，消除GFOR酶活性不会对山梨糖醇产生水平有什么影响，在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中，GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株生长对山梨糖醇的需求是完全未料到的。
在培养基中可含有浓度在约2mM到200mM之间的山梨糖醇(D-山梨糖醇和/或L-山梨糖醇)。在培养基中更为适合的终浓度为浓度在约2mM到100mM之间，浓度在5mM到20mM之间是优选的。在培养基中也可使用甘露醇来替代山梨糖醇，或与山梨糖醇一起使用。在通过参考并入本申请的共有且共同未决的美国申请#60/847997中，发现甘露醇具有与山梨糖醇相似的效应。此外，发现半乳糖醇和/或核糖醇可用来替代山梨糖醇或甘露醇或者与其一起使用。山梨糖醇、甘露醇、半乳糖醇、核糖醇或其组合均可以以同关于山梨糖醇的描述中相同的浓度来应用。
在不属于GFOR修饰菌株的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株能够产生木糖醇的发酵条件下，譬如在存在或缺少诸如乙酸盐这样的抑制物的高糖培养基中，本发明的GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株表现得要优于GFOR未修饰的菌株。申请人发现所消耗的木糖总量与最终乙醇滴度在GFOR修饰菌株中均大于未修饰的菌株。此外，在相应处理条件下，GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌在发酵中没有产生木糖醇，尽管在本文实施例6中所示的特定环境中通过非GFOR机制可能会有少量合成。
木糖利用及乙醇生产中的改进在不同的发酵条件下会有所变化。在GFOR未被修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株可产生高水平木糖醇的条件下，缺少木糖醇合成对GFOR突变体会产生更大影响。例如，当在培养基中存在诸如乙酸盐这样的抑制物时，GFOR未修饰的菌株产生了更多量的木糖醇。这种木糖醇的产生可通过GFOR突变来彻底消除，该突变会使得木糖利用及乙醇产生比在不使用GFOR突变体来产生少量木糖醇的条件下有更大增加。由于在处理后的纤维质生物量中特别存在乙酸盐，希望利用来源于处理后的纤维质生物量的碳源生长的、产乙醇生物对乙酸盐具有更低的敏感性。因此，当在发酵中使用生物量水解物时，利用GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株进行的发酵会特别有益。
生产乙醇的发酵
对于乙醇生产，将重组的GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌接种到含包括木糖在内的混合糖类的培养基上。当混合糖类的浓度高到可抑制生长时，培养基含有山梨糖醇、甘露醇或其混合物。半乳糖醇或核糖醇可以替代山梨糖醇或甘露糖醇，或与它们组合使用。在可进行发酵并产生乙醇的培养基上培养运动发酵单胞菌。发酵在无需补充空气、氧气或其它气体的条件下进行(它包括诸如厌氧、微需氧或者微好氧发酵这样的条件)至少约24小时，也可进行30小时或以上。到达最大乙醇产量的时间是不同的，依赖于发酵条件。典型地，如果在培养基中存在抑制物，则需要有更长的发酵周期。发酵可以在约30℃到约37℃之间的温度下于约4.5到约7.5的pH值下进行。
在实验室规模的发酵中，以及在可产生商品化用量的乙醇的规模放大的发酵中，可在含包括木糖在内的混合糖类的培养基中培养GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌，当希望获得商品化产量的乙醇时，可应用不同的培养方法。例如，可通过批式培养及持续培养方法从GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌进行大规模产物的生产。典型的批式培养法是一个封闭的体系，其中在培养开始时设定好培养基的组分，在培养过程中不进行人为改变。这样，在培养过程开始时，将培养基与期望的生物一起温育，不需向体系中加入什么即可进行生长并有代谢活性。不过典型地，“批式”培养根据加入的碳源来分批，通常尝试去控制诸如pH及氧浓度这样的因素。在批式体系中，系统的代谢物及生物量组分持续改变直至培养结束。在批式培养中细胞平和地通过静态延迟期到高速生长的对数期，最终到达生长速率降低或终止的稳定期。如果不经处理，稳定期的细胞终将死亡。在某些体系中，终产物或中间产物产量中的大多数通常是由对数期的细胞产生的。在其它体系中可获得稳定期或者对数后期的产量。
标准批式体系的一个变型是补料批式体系。对于GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌，补料批式培养过程也是适用的，它包括一个典型的批式体系，只是在培养过程中将底物以增量形式加入。当分解代谢抑制会抑制细胞的代谢并且希望培养基中只有有限量的底物时可使用补料批式体系。在补料批式体系中测定实际底物浓度是困难的，因此可基于诸如pH以及废气例如CO2分压这样的可测定因素的改变来进行估算。批式及补料批式培养方法在本领域中是常见的并且是周知的，可在Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Crueger，Crueger，and Brock，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，or Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)中找到示例，此处通过参考的方式并入本申请。
商品化的乙醇生产也可通过持续培养来完成。持续培养是开放体系，其中向生物反应器中持续加入给定的培养基，并同时移走等量的条件培养基。持续培养通常使细胞维持在一个恒定的高液相密度，其中细胞主要处于对数期生长之中。或者，可通过固定细胞来实现持续培养，其中持续加入碳源和营养物，并从细胞团中持续移走有价值的产物、副产物或废物。可使用许多由本领域技术人员已知的天然和/或合成材料组成的固相支持物来进行细胞固定。
持续或半持续培养允许调节可影响细胞生长或终产物浓度的某个因素或多个因素。例如，某个方法可以以固定速率来维持，诸如碳源或氮源水平这样的限制性养分，同时调整所有其它参数。在其它体系中，当通过培养基浊度来测定的细胞浓度保持恒定时，可持续改变许多影响生长的因素。持续体系试图维持稳定状态的生长条件，从而由于移走培养基造成的细胞损失与培养基中细胞生长速率是相平衡的。在持续培养过程中调节养分及生长因素从而使产物形成速率最大化的方法以及技术在工业微生物领域是周知的，Brock，同上，详细描述了多种方法。
特别适合乙醇生产的发酵形式如下所述。在摇瓶的半复合培养基中，于约30℃到约37℃以约150rpm的速度在定轨摇床中培养所需的GFOR修饰的、可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株，然后转移到含有相似培养基的10L种子发酵罐中。在种子发酵罐中无氧培养种子培养物直至OD600在3到6之间，此时将其转移到产物发酵罐，在这里对发酵参数进行优化以生产乙醇。从种子罐中转入到的产物罐中典型的接种物体积范围从约2％到约20％v/v。典型的发酵培养基含有诸如磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合氮源，例如酵母提取物或大豆碱性产物(0-10g/l)这样的基本培养基组分。在培养基中存在终浓度为约5mM的山梨糖醇或甘露醇。将提供碳源的包括木糖及至少一种其它糖类，譬如葡萄糖(或蔗糖)在内的混合糖类，持续加入到培养罐中弥补最初批次碳源(50-200g/l)的损耗以最大化乙醇产率及滴度。可动态调节碳源补给速率，以确保培养物不会过量累积葡萄糖，这会导致诸如乙酸这样的有毒副产物的增加。为了从所利用的底物来实现乙醇产量的最大化，生物量生长受批式起始时或发酵过程中加入的磷酸盐的量的控制。使用苛性溶液(譬如氢氧化铵、氢氧化钾或氢氧化钠)及硫酸或磷酸将pH值控制在5.0-6.0。将发酵温度控制在30℃-35℃。为了使泡沫最小化，如有需要则向罐中加入防沫剂(任何种类——基于硅树脂、基于有机物等)。可选择性地使用诸如卡那霉素这样的抗生素——菌株中存在该种抗生素的抗性基因，以使污染最小化。
任何上述条件及本领域技术人员已知的这些条件的其它改变，均是由可利用木糖的重组发酵单胞菌菌株来生产乙醇的合适条件。
实施例
本发明通过以下实施例进行进一步详细说明。应理解这些描述本发明的优选实施方案的实施例仅起示例性作用。通过以上讨论及这些实施例，本领域的技术人员可了解本发明的基本特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改以使其满足不同用途和情形。
常规方法
此处所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域已知的，在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1989)(在下文中为“Maniatis”)；and by Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.and Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；and by Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in MolecularBiology，published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)中有描述。
缩写的含义如下：”kb”是指千碱基，“bp”是指碱基对，“nt”是指核苷酸，”hr”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“L”是指升，“ml”是指毫升，“μL”是指微升，“μg”是指微克，“ng”是指纳克，“mM”是指毫摩尔，“μM”是指微摩尔，“nm”是指纳米，″μmol”是指微摩尔，“pmol”是指皮摩尔，“Cm”是指氯霉素，“Cmr“是指氯霉素抗性，“Cms”是指氯霉素敏感，“Spr“是指壮观霉素抗性，“Sps”是指壮观霉素敏感，“XI”是木糖异构酶，“XK”是木酮糖激酶，“TAL”是转醛醇酶，“TKT”是转酮醇酶，“EFT”是指经过的发酵时间，“RM”是指含10g/L酵母提取物及2g/L KH2PO4的丰富培养基，“MM”是指含10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH4)2SO4和0.2g/L KH2PO4的接合培养基(mating medium)。
制备用于酶活测定的发酵单胞菌的无细胞提取物
将细胞在50ml RM+2％葡萄糖中，30℃培养过夜至OD600为1.0-1.2。于4500rpm，4℃离心10分钟收获细胞。除去上清，并用25ml冰冷的超声缓冲液(10mM Tris，pH 7.6，10mM MgCl2)洗涤细胞沉淀，然后在4500rpm离心10分钟。将细胞沉淀重悬在2.0-2.5ml补加1mM二硫苏糖醇的超声缓冲液中。以每份500μl的量在Eppendorf离心机中于4℃离心1分钟。除去大部分上清液，剩余约10-20μl以防止沉淀干燥。将细胞冷冻并储存在-80℃，以备检测。在检测前，将细胞融化，并用500μl补加1mM二硫苏糖醇的超声缓冲液重悬。将混合物用Branson超声仪450在62％占空比(duty cycle)，输出控制为2的条件下超声2次，每次45秒，在两次超声之间保持样品冷冻3-5分钟。将样品用Beckman离心机，于14,000rpm，4℃离心60分钟。将上清转移到新管中，并保持在4℃。使用Pierce BCA检测法测定蛋白浓度。
通常首先进行转酮醇酶(TKT)检测，因为该酶比其它酶更不稳定。TKT检测的图如图3A所示。
在微孔板检测中，于30℃下，将20μl无细胞提取物加入到各孔中、包含下述组分的反应混合物中，所述反应混合物包括以下终浓度的组分：0.37mM NADP、50mM TrisHCl pH 7.5、8.4mM Mg Cl2、0.1mM TPP(焦磷酸硫胺素氯化物)、0.6mM E4P(赤藓糖-4-磷酸)、4mM BHP(β羟基丙酮酸)、4U/ml PGI(磷酸葡萄糖异构酶)、及4U/ml G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。在微孔板读数仪上读取A3403-5分钟。TKT活性计算如下：
1单位相当于在30℃下形成1μmol D-果糖-6-磷酸/分钟。
U(微摩尔/分钟)＝斜率(dA340/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADP→NADPH的摩尔数是在1cm比色皿中每摩尔每L 6220A340)。
(微孔板中每孔200μl光程长(pathlength)＝0.55cm)
比活性(μmole/min-mg)＝μmole/min/蛋白浓度(mg)
转醛醇酶(TAL)检测的基础如图3B所示。在微孔板检测中，在30℃下，将20μl无细胞提取物加入到各孔中、包含下述组分的反应混合物中，所述反应混合物包括以下终浓度的组分：0.38mMNADH、87mM三乙醇胺、17mM EDTA、33mM F6P(果糖-6-磷酸)、1.2mM E4P(赤藓糖-4-磷酸)、2.0U/ml GDH(甘油-3-磷酸脱氢酶)和20U/ml TPI(丙糖磷酸异构酶)。将板温育5分钟。然后读取A3403-5分钟。TAL活性计算如下：1单位相当于在30℃下每分钟形成1μmol D-甘油醛。
U(微摩尔/分钟)＝斜率(dA340/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADH→NAD的摩尔数是在1cm比色皿中每摩尔每L 6220A340)。
(微孔板中每孔200μl光程长＝0.55cm)
比活性(μmole/min-mg)＝μmole/min/蛋白
木糖异构酶(XI)检测的基础如图3C所示。在微孔板检测中，在30℃下，将20μl无细胞提取物加入到各孔中、包含下述组分的反应混合物中，所述反应混合物包括以下终浓度的组分：0.256mMNADH、50mM木糖、10mM MgSO4、10mM三乙醇胺和1U/ml SDH(山梨糖醇脱氢酶)。在微孔板读数仪上读取A3403-5分钟。XI活性计算如下：1单位相当于在30℃下每分钟形成1μmol D-木酮糖。U(微摩尔/分钟)＝斜率(dA340/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADHP→NAD的摩尔数是在1cm比色皿中每摩尔每L 6220A340)。
(微孔板中每孔200μl光程长＝0.55cm)
比活性(μmole/min-mg)＝μmole/min/蛋白浓度(mg)
木酮糖激酶(XK)检测的基础如图3D所示。在微孔板检测中，在30℃下，将20μl无细胞提取物加入到各孔中、包含下述组分的反应混合物中，所述反应混合物包括以下终浓度的组分：0.2mM NADH、50mM Tris HCl pH 7.5、2.0mm MgCl2-6H2O、2.0M ATP 0.2M PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)、8.5mM D-木酮糖、5U/ml PK(丙酮酸激酶)和5U/ml LDH(乳酸脱氢酶)。在微孔板读数仪上读取A3403-5分钟。XI活性计算如下：
1单位相当于在30℃下每分钟1μmol D-木酮糖转变为D-木酮糖-5-磷酸。
U(微摩尔/分钟)＝斜率(dA340/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm
(NADH→NAD的摩尔数是在1cm比色皿中每摩尔每L 6220A340)。
(微孔板中每孔200μl光程长＝0.55cm)
比活性(μmole/min-mg)＝μmole/min/蛋白浓度(mg)HPLC方法
用Agilent 1100系列HPLC和Agilent ChemStation软件进行LC3D分析。柱子用的是带有BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125-0129)的BioRad Aminex HPX-87H(HPLC有机分析柱125-0140)。操作条件如下：
流速   0.6mL/min
溶剂   0.01N H2SO4
停止时间  25min
注射体积  5μL
自动进样  温度控制10℃或4℃
柱温    55℃
检测器  折射系数(40℃)
使用外部标准校准曲线
实施例1
构建可发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株ZW658
通过一系列转座事件将两个包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的四个木糖利用基因的操纵子PgapxylAB和Pgaptaltkt整合到ZW1(ATCC#31821)基因组中，然后在含木糖的选择培养基上适应而构建ZW658。如美国专利申请20030162271所述，以前已通过向运动发酵单胞菌5C的基因组进行同源重组及转座方法而整合了两个操纵子PgapxylAxylB和Penotaltkt及选择性抗生素标记，然后通过适应和NTG突变构建了命名为8b的、可发酵木糖的运动发酵单胞菌。在制备ZW658时，使用了转座(Epicentre′s EZ::Tn体外转座系统)，因为该方法相对于位点特异的同源重组的优势在于，整合位点具有多种选择，而且插入频率相对较高。将编码木糖利用的酶的四个基因排列并克隆在两个独立的操纵子PgapxylAB和Pyaptaltkt中以用于整合。将抗生素抗性标记——旁侧为两个P1噬菌体Cre重组酶识别序列(loxP)的氯霉素抗性(Cmr)基因克隆到每个操纵子中用于整合子的筛选。两个操纵子的整合通过Pgaptaltkt，然后是PyapxylAB的两步连续方式完成。在两个整合事件中均使用Cm抗性选择，因为它可通过质粒上的Cre重组酶的表达，然后在每次整合后通过消除质粒而除去。该过程可允许用相同的抗生素标记进行多次筛选。更重要的是，它允许去除引入的用于筛选整合的操纵子的抗生素标记。该过程消除了抗生素抗性基因对商用发酵菌株的负面影响。
构建用于转座的pMODPgaptaltkfCm
如美国专利申请20030162271(本文实施例9)所述，从pUCtaltkt(美国专利申请20030162271)中通过BgIII/Xbal消化分离出2.2kb含大肠杆菌转酮醇酶(tkt)编码区的DNA片段，并克隆到用BamHl/Xbal消化的pMOD(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)载体中，得到pMODtkt。通过将运动发酵单胞菌gap基因的启动子区(Pgap；甘油醛-3-磷酸脱氢酶)与大肠杆菌转醛醇酶编码区(tal)进行如下融合而得到命名为Pgaptal的PCR片段。用描述在US 5514583(实施例3)中的构建体pZB4通过引物SEQ ID NOs：1和2扩增Pgap片段。pZB4含有Pgap-xylA/xylB操纵子和PENO-tal/tkt操纵子。tal编码区片段用引物SEQ ID NOs：3和4从pZB4扩增。以Pgap和tal片段为模板，通过引物SEQ ID NOs：5和6扩增Pgaptal片段。该片段用Xbal消化并克隆到质粒pMODtkt的tkt编码区上游。用Cmlox(F，sfi)和Cmlox(R，sfi)引物(SEQ ID NOs：7和8)，以pZB186为模板，通过PCR产生loxP::Cm片段。pZB186是运动发酵单胞菌天然质粒和pACYC184的组合，如US514583(实施例3)和Zhang et al.((1995)Science 267：240-243)所述。最后，将loxP::Cm PCR片段插入到含Pgaptaltkt的质粒的Sfil位点，形成整合型质粒pMODPgaptaltktCm(图4)。在该质粒中，PgaptaltktloxP::Cm片段插入到pMOD载体的两个嵌合末端(转座酶结合位点)。pMODPgaptaltktCm质粒的完整核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
pMODPgaptaltktCm在ZW1中的转座和转化
由于质粒pMOD是基于pUC的载体，因此在发酵单胞菌中是非复制型载体。将质粒pMODPgaptaltktCm用转座酶在存在Mg2+时，室温下处理1小时，并通过电穿孔转化ZW1细胞(使用BioRad GenePulser，设置为200ohms，25μF和16kV/cm)。将电穿孔的细胞在含10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH4)2SO4、0.2g/LK2HPO4)，并补加50g/L葡萄糖和1mM MgSO4的结合培养基(MM)中，30℃温育6小时。将转化混合物涂布在补加50g/L葡萄糖和120μg/mL氯霉素，并含15g/L Bacto琼脂的MM琼脂平板上，在30℃厌氧培养。约2天后可见转化子。转化/转座频率约为3x101/μg DNA。
共获得39个Cmr转化子克隆。挑取21个克隆，并进一步通过PCR和酶活性检测法进行分析。用引物SEQ ID NOs：10和11通过PCR验证在转化子中确实存在含tal和tkt编码区的3kb DNA片段。用来自21个整合子克隆的质粒DNA进行回复转化，没有在大肠杆菌中产生回复转化子，这表明tal和tkt整合到ZW1的基因组中。用修改的微孔板方法对这些整合子检测其转醛醇酶和转酮醇酶活性(一般方法)。用Pierce BCA蛋白检测法测定蛋白浓度。将转化子在含2％(w/v)葡萄糖，并补加120μg/ml氯霉素的RM培养基，在50ml锥形离心管中30℃培养。对照菌株8b与ZW1进行同样培养(ZW1用补加2％葡萄糖的RM)用于酶活性检测。当OD600达到1.0时收获细胞。将细胞洗涤1次并重悬在超声缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.6和10mM MgCl2)中。酶活性检测如美国专利申请20030162271所述。单位定义为mole/min-mg。除1株外，所有样品均具有转醛醇酶和转酮醇酶活性。
用tkt探针对用Pstl消化的、选择的整合子基因组和质粒DNA进行Southern杂交。ZW1 DNA不与tkt探针杂交。在所有整合子基因组DNA样品中可见1条共同的1.5kb带，它是tkt的Pst1位点和tal的Pst1位点之间预期的DNA片段。第二个可见的高分子量(6kb或更大)的带是独立株系T2、T3、T4和T5特有的，表明在每个株系中具有独立的基因组整合位点。有趣的是，T5的质粒和基因组DNA均与tkt探针杂交，表明在T5的天然质粒中也整合了Pgaptaltkt。选择这4个菌株(T2、T3、T4和T5)进行进一步的Cre处理，以除去Cmr标记。Cre处理以从taltkt整合子中除去Cmr标记
为了从染色体中除去Cmr，用pZB 188/Spec-Cre转化T2、T3、T4和T5。该质粒是发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭载体pZB188[Zhang et al.(1995)Science 267：240-243；US 5514583]的衍生物，其包含Cre重组酶表达盒。除了用壮观霉素抗性基因代替卡那霉素抗性基因，pZB188/Spec-Cre与实施例10中描述的Cre表达载体(pZB188/Kan-Cre)相同。在含2％葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的MM琼脂培养基上筛选转化子。将Spr抗性克隆挑取到补加2％葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的RM琼脂平板上，RM琼脂平板补加2％葡萄糖和120μg/mL Cm。挑取的克隆100％是Cms，这表明通过Cre高效去除Cmr。将SprCms转化子培养在补加2％葡萄糖的RM中，37℃进行2到5次转移，以去除pZB188aadACreF。在每次转移中，将细胞稀释并铺在补加2％葡萄糖的RM琼脂平板上，以挑取到有或无200μg/ml Sp的相同培养基的其它平板上。通过PCR分析Sps克隆，以确定pZB188aadACreF丢失。消除质粒的整合子后代命名为T2C、T3C、T4C和T5C。为了检测这些转座整合子是否是稳定的，将这4个菌株培养在补加2％葡萄糖的RM中，然后转移到10ml相同培养基中，37℃平行培养2个检测管。将细胞每天进行转移，共进行10天，或约100代。在第1次和第10次转移后将克隆稀释并铺在RMG平板上进行克隆分离。共12个来自每个菌株每次转移的克隆通过5′Pgap和3′tkt引物(SEQ ID NOs 1和11)进行的检测Pgaptaltkt存在的克隆PCR检测为阳性。也检测了第1次和第10次转移后的分离株的转醛醇酶和转酮醇酶活性(如一般方法所述)。所有这4个整合子在非选择性培养基中转移100代后均具有相似的TAL和TKT活性水平，这表明这些整合子是遗传稳定的。
构建用于转座的pMODPgapxylABCm
下一步是进一步将PgapxylABloxP::Cm操纵子整合到ZW1::Pgaptaltkt整合子(T2C、T3C、T4C和T5C)中。基于质粒pMODPgaptaltktCm(图4)构建整合型质粒pMODPgapxylABCm(图5)。通过Sacl/Sfil消化除去PgaptaltktDNA片段。通过连接引入含Sacl、Notl和Sfil限制性位点的接头片段。然后将从pZB4(US 5514583)分离的PgapxylAB的Notl片段克隆到接头的Notl位点。木糖异构酶(XI)由xylA编码，木酮糖激酶(XK)由xylB编码。pMODPgapxylABCm质粒的完整序列如SEQ ID NO：12所示。
pMODPgapxylABCm在T2C、T3C、T4C和T5C中的转座和转化
通过与PgaptaltktCm整合相似的方法，用转座酶处理的pMODPgapxylABCm(如上所述)转化/转座T2C、T3C、T4C和T5C。在2次转化/转座实验中通过Cm筛选后获得6个整合子(T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1、T5CCmX2)。所有整合子均通过PCR用两组引物：SEQ ID NOs：13和14及SEQ IDNOs：15和16验证xylAB的存在，除了T2CcmX1和T2CcmX6用引物SEQ ID NOs：13和14没有检测到PCR片段。
对包括2个PCR阴性的株系在内的整合子均检测XI、XK、TAL和TKT活性(一般方法)。如图6和7所示的结果表明，6个xylAB整合子T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1和T5CCmX2均具有XI、XK、TAL和TKT活性。与阴性亲本对照(图6)相比较，XI和XK活性是新获得的。TAL和TKT活性维持在亲本对照水平。所有这些结果表明产生了蛋白并具有功能。酶活性水平具有差异，TI和XK活性与用相同质粒转化/转座的ZW1的整合子的活性相似。XI、XK、TAL和TKT的活性水平比菌株8b的活性低。
通过Southern杂交验证xylAB操纵子的整合。将6个株系的基因组和质粒DNA用Sphl消化，并与地高辛标记的xylB探针杂交。在所有基因组DNA样品中均存在一条约3kb的共同条带，它是由xylB的Sphl位点和pMOD载体临近克隆位点的另一个Sphl位点产生的，另外，基因组DNA样品中更高分子量的杂交带表明PgapxylAB操纵子在染色体上有4个整合位点。T3CCmX1和T3CCmX2具有相同的整合位点，T3CCmX3和T4CCmX1可能具有相同的整合位点，T5CCmX1和T5CCmX2每个具有单独的整合位点。用PstI消化相同的DNA，然后用tkt探针进行Southern杂交，表明每个整合子均具有与其各自亲本相同的杂交模式。
ZW1::PgaptaltktPgapxylAB Cm整合子在木糖培养基上的适应
尽管存在所有四种木糖利用的酶活性，但以前的观察(美国专利申请20030162271)表明整合子可能不立即在木糖上生长。在木糖上的生长可通过在木糖培养基(或者在试管中，或者在平板上)上延长培养而发生，这个过程称为适应。
将菌株进行如下适应。将ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm整合子菌株接种到含RMX(含10g/l酵母提取物、2g/l KH2PO4、20g/l或2％(w/v)木糖)及RMGX(含有0.025％(w/v)葡萄糖和4％(w/v)木糖的)的试管或平板上。低水平的葡萄糖用于支持最初的生长，以增加在适应中的突变机会。在至少5次培养基和平板的木糖适应试验中有1次是成功的。在30℃厌氧培养10天后，用T3CCmX1和T3CCmX2细胞铺板的MMGX上分别可见17和19个克隆。克隆在平板上较小，而且看起来不健康(透明)。将12个克隆(4个来自T3CCmX1平板：T3CCmX11、T3CCmX12、T3CCmX13和T3CCmX110；8个来自T3CCmX2平板：T3CCmX24、T3CCmX25、T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、T3CCmX29、T3CCmX211和T3CCmX212)接种到RMGCm120中，并转移到3ml RMX中进行进一步适应，以获得能在木糖上快速生长的株系。
在含3ml RMX的试管中的整合子的适应在30℃进行。不断用Spectronic 601分光光度计监测OD600。当达到中期生长阶段(mid-logphase)时，将培养物转移到新鲜RMX试管中。该过程进行7次转移。在转移后生长速度和最终ODs(非线性读数)均有提高。
在第6次转移时，将培养物在RMX平板上划线以分离单克隆。有3个整合子：T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27在RMX划线平板上长的比其它更快，它们在表中和以下讨论中被称为X13、X26和X27。为了筛选最好的木糖生长株，分别将TX13、X26和X27的4个大(L1-4)和4个小(S1-4)克隆在RMX试管中筛选和培养，对其生长、糖利用和乙醇的产生进行监测。将克隆在30℃培养过夜，然后接种OD600＝0.05到2个3ml RMX试管中。X27在RMG中比其它培养物生长更慢，因此在6.5小时后再次接种。69小时(对X27为62.5小时)后，对样品进行HPLC分析(一般方法)。图8列出培养物在69小时(对所有X27培养物为62.5小时)后培养物的平均乙醇产量(理论产量的％)和木糖利用(％)。大克隆和小克隆之间没有显著差异。虽然X27在木糖上的性能比X26好，但它在葡萄糖上生长更慢。因此，选择最好的株系X13(X13L3)和X26(X26L1)的大克隆在pH控制的发酵中进行进一步评估。在37℃，在RMG(6％葡萄糖)、RMX(6％木糖)和RMGX(8％∶4％；葡萄糖∶木糖)中对菌株X13L3和X26L1及对照菌株8b进行发酵。生长在RMG(6％)和RMGX(8％∶4％)中的X13L3和X26L1对葡萄糖的发酵进行的较快。X13L3和X26L1在RMGX(8％∶4％)中对木糖的发酵均比菌株8b更慢。另外，在37℃，在RMX(6％)中，X13L3和X26L1的生长均发生长时间延迟。在RMX(6％)发酵中有几个分离株X13b、X13c和X13FL发生回复。对这些分离株和原始菌株X13a(X13L3的分离株)如本实施例前述进行Cre处理，以从ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm菌株中除去Cmr标记。得到的Cre处理的无Cmr的整合子命名为：X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC和X26C。整合子通过在RMX(5％)中，37℃的系列转移而在木糖培养基中的适应
如前所述，最初ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm菌株在RMX中，在30℃的适应极大提高了菌株在这些条件下的生长。但适应的菌株在RMX(6％)中，在37℃生长和发酵时有长时间延迟。为了进一步提高整合子在包括更高糖浓度和温度的优选过程条件下的木糖发酵，在RMX(5％)中，在37℃继续进行演化或适应过程。进行系列转移并筛选生长株。在本过程中所用的整合子包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C和X13FLC。这5个菌株在转移到RMX(5％)中，在37℃进行另外5到16次转移前，在RMX中30℃培养并进行6次转移。在所有转移中和转移后，将培养物在RMX平板上划线，并在37℃培养以分离单克隆。将大克隆在RMX平板上进一步划线3到4次，并在37℃培养，以纯化克隆。最后将大克隆在RMX(5％)，37℃培养进行筛选。
对来自RMX(5％)培养基，37℃适应的菌株的评估
最初将系列转移后适应的18个分离克隆在RMX(5％)试管中，在37℃进行检测。选择12个菌株进行第二次试管评估。在所有评估中均包括菌株8b进行比较。将18个克隆在RMG中，37℃培养过夜，离心，并将细胞接种到4ml RMX(5％)中，37℃，在试管中静置培养以进行第一次评估。基于生长((OD600，非线性)和终点HPLC结果(低残留木糖和高产量乙醇)，筛选12个菌株进行第二次评估。
第二次评估的目标之一是检测这些菌株在木糖上生长和木糖利用能力的稳定性。所有这12个菌株均进行稳定性研究，以检测适应的菌株是否在非选择培养基上在37℃系列转移50代后是稳定的。将RMG(5％)转移前后的培养物接种到RMX(5％)试管中，37℃培养进行评估。通过在Spectronic 601分光光度计直接读取试管来监测非线性ODs。在RMG培养50代前和后在RMX(5％)中第70个小时生长的ODs描绘在图9中。结果表明多数菌株在RMG中37℃培养50代后仍是稳定的。也通过HPLC分析终点(静止期)上清的木糖和乙醇浓度。在这些培养物中的低残留木糖和高乙醇浓度支持菌株在木糖上很好生长和发酵的事实。
基于以上试管评估结果(低残留木糖，高乙醇浓度和更高OD)和以下通过高浓度葡萄糖和/或木糖(大于20％)及葡萄糖和木糖与乙酸盐的混合物的微滴定板生长筛选在高糖和有乙酸盐时生长更好的菌株，例如命名为ZW658的菌株#26，它具有最好的综合性能。
实施例2
在37℃对木糖利用提高最多的菌株的发酵评估
以下实施例描述木糖利用提高的发酵单胞菌菌株ZW658在模拟预期的生物量水解产物的糖浓度和乙酸盐水平的发酵条件下的发酵性能。将菌株ZW658接种到含分别补加10％葡萄糖(RMG10％)、8％木糖(RMX8％)、10％葡萄糖+8％木糖(RMGX10％8％)和10％葡萄糖+8％木糖+0.6％乙酸盐(RMGXAc10％8％0.6％)的RM培养基的发酵罐中。所有的发酵在含300ml培养基的Sixfors中，150rpm，pH5.5，37℃进行。对发酵罐中的培养基过夜排除氮气，并在接种前停止。在发酵时不排除氮气。用于发酵的接种物是通过将工作储液在RMG5％中复苏后，用RMGX(10％，4％)，在烧瓶中(150rpm)37℃培养而制备的。菌株8b在相同条件下作为对照。如图10所示，ZW658与8b相比较，在RMG10％中长的更慢(A和B)，在RMX8％中与8b生长的速率相同(C和D)。尽管生长速度较慢，但图10表明ZW658的乙醇产量(93％)与8b在葡萄糖培养基的终点发酵时相同。在RMX8％培养基中，ZW658的乙醇产量(0.46g乙醇/g糖)高于8b(0.44g乙醇/g糖)。在RMX8％中，ZW658比8b多产生4g/l乙醇。有趣的是，在RMX8％的发酵终点，ZW658不产生任何木糖醇，而8b产生低水平木糖醇(0.7g/l)。如图11的数据表明ZW658比8b在发酵含(C、D)和不含(A、B)乙酸盐(acetate)的10％葡萄糖+8％木糖中发酵的更好，具有更多的葡萄糖和木糖消耗、更少的木糖醇产量和更多的乙醇产量。对两个菌株在RMG10％X8％中，37℃，pH5.5时，在发酵终点大部分葡萄糖均被利用，而大部分木糖仍残留，尽管ZW658比8b多利用了约8g/l木糖。在RMG10％X8％中，37℃，pH5.5发酵，在发酵终点ZW658的木糖醇产量(4.9g/l)显著低于8b(8.2g/l)。在存在乙酸盐(6g/l)时，两个菌株的细胞生长均显著降低，从而在葡萄糖和木糖中均表现出较差的发酵性能，虽然ZW658在更多的葡萄糖和木糖消耗、更少的木糖醇产量和更多的乙醇产量上表现出略好的发酵性能。不象在RMX8％中一样，两个菌株在有或无乙酸盐的RMG10％X8％中均产生副产物木糖醇，虽然与8b相比较，ZW658产生更少的木糖醇。两个菌株的发酵性能总结在表1中。总的来说，ZW658比8b在纯的糖发酵中表现更好。如实施例1所述，ZW658没有抗生素选择标记，这对商业应用的发酵微生物是一个有价值的特性。
表1.ZW658和8b乙醇产生的发酵性能总结.
Figure G200780036026XD00331
CPI是细胞产率系数：g乙醇/g细胞干重
实施例3
制备自杀型构建体用于在ZW1和ZW658中进行葡萄糖-果糖氧化还原 酶(GFOR)基因的插入失活
用于在ZW1和ZW658中敲除编码葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的自杀型构建体(″GFORSp-9WW″)来源于另一个以前通过宿主介导的双交换同源重组，并以壮观霉素抗性为选择性标记对运动发酵单胞菌D-乳酸脱氢酶基因插入失活的自杀型构建体(″pLDHSp-9WW″)。pLDHSp-9WW也来源于多种以前产生的构建体。下面对所有这些构建体的最初前体是质粒载体pNEB193(NEB#N3051S；New EnglandBiolabs)。选择该质粒是因为它可在大肠杆菌中复制，但不能在运动发酵单胞菌中复制。所有参与产生GFOR敲除构建体的步骤和中间体从质粒pNEB193开始按时间顺序进行描述。
pLDH193的构建
将pNEB 193用Sbfl和Ascl双消化，用于插入到如下所述的DNA片段中。这两个限制性位点是唯一的，位于质粒的多克隆区。用Qiagen′s QIAQuick纯化试剂盒(货号#28104)根据说明书纯化Sbfl/Ascl-线性化的pNEB193质粒DNA片段。克隆到pNEB193中的DNA片段是从用Qiagen′s Blood & Cell Culture Maxi试剂盒(货号#13362)分离的菌株ZW1的运动发酵单胞菌基因组DNA通过PCR扩增获得的长2268bp的片段。用于该片段PCR扩增的合成寡核苷酸是引物1和2：
引物1(SEQ ID NO：17)
CTACTCATTTcctgcaggTGGTAACTCATTGCGCGCTC
引物2(SEQ ID NO：18)
CATCTTACTggcgcgccAAAAATCTGCGGCTGACATAC
引物1(正向引物)的下划线碱基与GenBank登录号AE008692的核苷酸1262739-1262720在编码磷酸甘油酸变位酶(pgm)的开放阅读框的3’末端杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Sbfl位点。引物2(反向引物)的下划线碱基与GenBank登录号AE008692的核苷酸1260490-1260472杂交，其正处于编码乙醇脱氢酶(adhl)的开放阅读框的上游，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Ascl位点。因此，作为PCR扩增靶的2268bp DNA片段由以下元件组成，起始于Sbfl位点，终止于Ascl位点：(a)pgm基因3’末端；(b)编码D-乳酸脱氢酶的完整的ldh基因，和(c)adhl基因的5’非编码区。用Sbfl和Ascl切割PCR产物，将得到的DNA片段连接到前述Sbfl/Ascl-线性化的pNEB 193载体中。用连接反应混合物转化大肠杆菌JM 110，并将转化的细胞涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上。最初用重悬克隆和引物1和2通过PCR(“克隆PCR”)来鉴定含具有正确大小插入的质粒的氨苄青霉素抗性转化子。然后用Sbfl和Ascl限制性消化分析来验证阳性克隆，并对用氨苄青霉素抗性转化子进行克隆PCR产生的2268bp片段进行DNA序列分析。选择进行进一步操作的质粒以下命名为pLDH193。
pLDHTc139#7的构建
质粒pLDH193具有唯一的Ncol位点，临近于ldh开放阅读框的中部。该位点用于插入赋予四环素抗性的DNA片段。本操作所用的四环素抗性盒(Tcr-盒)以质粒pACYC184(GenBank登录号X06403)为DNA模板，引物3和4为PCR引物，通过PCR产生。
引物3(SEQ ID NO：19)
ACTCATTTccatggCGATCGCACTATgcggccgcAATGTAGCACCTGAAGT CAGCC
引物4(SEQ ID NO：20)
ATCTCACTccatggCCGGCCAACTAttaattaaGAATTGATTGGCTCCAATTC TTG
引物3(正向引物)的粗体下划线碱基与四环素抗性基因上游杂交。引物3的5’末端也具有3个限制性位点(Ncol、AsiSl和Notl)。Ncol位点是小写字母。AsiSl位点是细下划线。Notl位点是斜体小写字母。引物4(反向引物)的粗体下划线碱基与四环素抗性基因终止密码子下游杂交，该引物也具有添加到其5’末端的3个限制性位点(Ncol、Fsel和Pacl)。与上面标记相同，Ncol位点是小写字母，Fsel位点是细下划线，Pacl位点是斜体小写字母。用Ncol切割通过引物3和4产生的1448bp的Tcr-盒，并通过制备型凝胶电泳进行纯化。然后将得到的DNA片段连接到质粒pLDH193的ldh开放阅读框的唯一的Ncol位点中。为了使没有插入片段的载体的自环化可能性最小，在连接前将Ncol-消化的pNEB193用小牛肠碱性磷酸酶进行去磷酸化。将连接反应混合物引入到大肠杆菌JM110中，并将转化的细胞涂布含20μg/ml四环素的LB平板。用Ncol、AsiSl、Notl、Fsel和Pacl限制性消化分析来鉴定含具有正确大小插入的质粒的四环素抗性转化子，并用合适的引物通过PCR分析来验证Tcr-盒的方向。筛选进行进一步操作的质粒(pLDHTc 139#7)的环状图谱如图12所示。在此处未描述的实验中，该自杀型构建体用于在ZW1中通过宿主介导的、双交换同源重组，并在四环素上生长作为筛选而进行D-乳酸脱氢酶基因的插入失活(即“破坏”或“敲除”)。
pLDHTc139#7-9WW的构建
已证明pLDHTc139#7可在ZW1中用于“敲除”D-乳酸脱氢酶基因，因此下一步是修饰该构建体，使其可在基因破坏后，通过Cre重组酶从染色体中除去筛选标记。为了达到该目标，利用Tcr-盒旁侧的4个限制性位点，即5’末端的AsiSl和Notl和3’末端的Pacl和Fsel将两个野生型loxP位点(Lee and Saito，1998)添加到pLDHTc139#7中。在用两个酶切割构建体并纯化得到的大DNA片段后，第一个loxP位点插入到质粒pLDHTc139#7的AsiSl和Notl位点之间。插入到该位置的loxP位点用两个合成的、5’末端磷酸化的寡核苷酸5和6(SEQID NOs：21和22)产生。
寡核苷酸5(SEQ ID NO：21)；
cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc
寡核苷酸6(SEQ ID NO：22)：
ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat
这些寡核苷酸相互补，退火后形成全长双链野生型loxP位点，在两端有单链突出，从而使DNA片段连接到pLDHTc139#7的AsiSl和Notl位点。寡核苷酸的大写字母对应于全长野生型loxP位点，而小写字母表示用于连接双链DNA片段到pLDHTc139#7的AsiSl和Notl位点的核苷酸。
用连接反应混合物转化大肠杆菌DH10B，并在含20μg/ml四环素的LB平板上涂布转化细胞。通过限制性消化分析、克隆PCR和相关区域的DNA序列分析来鉴定含具有正确插入到pLDHTc139#7的AsiSl和Notl位点的loxP位点的质粒的四环素抗性转化子。选择进行进一步操作的质粒以下命名为pLDHTc139#7-9W。
然后在用酶切割质粒并纯化得到的大载体片段后，将第二个野生型loxP位点插入到pLDHTc139#7-9W的Tcr-盒另一端的Pacl和Fsel位点之间。插入到该位置的loxP位点用两个合成的、5’末端磷酸化的寡核苷酸7和8(SEQ ID NOs：23和24)产生。
寡核苷酸7(SEQ ID NO：23)：
taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg
寡核苷酸8(SEQ ID NO：24)：
ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat
寡核苷酸7和8相互互补，退火后形成全长双链野生型loxP位点，在两端有单链突出，从而使DNA片段连接到pLDHTc139#7-9W的Pacl和Fsel位点。寡核苷酸的大写字母对应于全长野生型loxP位点，而小写字母表示用于连接双链DNA片段到pLDHTc139#7-9W的Pacl和Fsel位点的核苷酸。
用连接反应混合物转化大肠杆菌DH10B，并在含20μg/ml四环素的LB平板上涂布转化细胞。通过限制性消化分析、克隆PCR和相关区域的DNA序列分析来鉴定含具有正确插入到pLDHTc139#7-9W的Pacl和Fsel位点的loxP位点的质粒的四环素抗性转化子。选择进行进一步操作的质粒以下命名为pLDHTc139#7-9WW。该构建体的环状图谱如图12所示。
pLDHSp-9WW的构建
pLDHSp-9WW与pLDHTc139#7-9WW相同，但后一个构建体的四环素抗性盒被赋予壮观霉素抗性的DNA片段(即Spec-盒)代替。后者以质粒pHP15578(Cahoon et al，2003)为模板，用引物9和10通过PCR产生。pHP15578含Specr-盒及其启动子的完整核苷酸序列，它基于转座子Tn7编码3′(9)-O-核苷酸转移酶的aadA基因的公开序列(GenBank登录号X03403)。
引物9(SEQ ID NO：25)
ATAAAAgcggccgcAGCACAGGATGA
引物10(SEQ ID NO：26)
GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG
引物9(正向引物)的下划线碱基与Specr-盒启动子上游(GenBank登录号X03043 nts6-17)杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Notl位点。引物10(反向引物)的下划线碱基与Specr-盒终止密码子下游约130碱基处(GenBank登录号X03043 nts1006-1019)杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Pacl位点。将1040bp PCR-产生的Specr-盒用Notl和Pacl双消化，通过琼脂糖凝胶电泳纯化DNA片段。将质粒pLDHTc139#7-9WW也用相同的两个限制性酶切割以除去Tcr-盒，并将得到的大载体片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将两个目的DNA片段连接在一起，并将转化反应混合物通过电穿孔引入大肠杆菌DH10B中。将转化子涂布在含壮观霉素(200μg/ml)的LB培养基上，并在37℃培养。通过Notl和Pacl的限制性消化分析鉴定含具有正确大小插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化子，选择进一步操作的质粒以下命名为pLDHSp-9WW；该构建体的环状图谱如图12所示。在此处未描述的实验中，在ZW1中用pLDHSp-9WW通过对壮观霉素抗性为选择标记敲除D-乳酸脱氢酶基因。用自杀型构建体进行的基因失活通过宿主介导的双交换同源重组发生(WO 01/83784A2)，这使得旁侧为两个野生型loxP位点的ldh开放阅读框中部插入选择性标记(Specr-盒)。双交换事件通过pLDHSp-9WW中Specr-盒旁侧的两个DNA片段定位于ldh基因。这些片段其中之一(以下指5’ldh旁侧DNA)在Specr-盒上游，位于Sbfl和AsiSl位点之间。这一约1100bp的DNA片段的核苷酸序列与编码pgm基因3’末端及ldh开放阅读框约前一半的ZW1染色体DNA相同。另一DNA片段(以下指3′ldh旁侧DNA)位于Fsel和Ascl位点之间的Specr-盒的反向末端。3′ldh旁侧DNA的核苷酸序列(也为约1100bp)与编码ldh基因另一半和部分adhl基因5′非翻译区的染色体DNA相同。当5′和3′ldh旁侧DNA片段与其染色体互补部分相互作用并进行同源重组时发生双交换事件。该现象基本不可逆，完全由宿主酶系统介导，可通过在开放阅读框中间插入Specr-盒而使染色体ldh基因失活。由于构建体不能在运动发酵单胞菌中复制，使其成为自杀型构建体，因此用pLDHSp-9WW产生稳定的壮观霉素抗性克隆的唯一方法是通过同源重组发生的双交换事件(除了在极低频率发生的自发药物抗性突变体)。需要注意的是通过双交换事件插入到染色体中的Specr-盒仍然夹在存在于自杀型构建体中的两个野生型loxP位点之间。由于这种安排易于通过实施例10所述的Cre表达载体从D-乳酸脱氢酶基因中除去选择标记，但不重新激活该基因。
pGFORSp-9WW的构建
将pLDHSp-9WW在如下所述的2步流程中转变为用于运动发酵单胞菌葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)基因失活的自杀型构建体。第一步是除去3′ldh旁侧DNA，并用将质粒定位到编码GFOR的染色体基因的类似DNA片段代替。后一个DNA片段(以下称为3′GFOR旁侧DNA)以ZW1基因组DNA为模板，用引物11和12为PCR引物通过PCR产生。
引物11(SEQ ID NO：27)
CTACTCATggccggccTCAGAACGATCCTGCACAGC
引物12(SEQ ID NO：28)
CATCTTACTggcgcgccGGACGAGGTTCATCATCAGG
引物11(正向引物)的下划线碱基与对应于GFOR开放阅读框中部的GenBank登录号为AE008692的核苷酸684324-684305杂交，而小写字母对应于添加于引物5’末端的Fsel位点。引物12(反向引物)的下划线碱基与对应于GFOR终止密码子下游约625bp的GenBank登录号为AE008692的核苷酸683124-683143杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Ascl位点。用Fsel和Ascl切割1234bp PCR片段。也用相同的限制性酶切割pLDHSp-9WW，以除去3′ldh旁侧DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化该操作中获得的大载体片段。然后将PCR-产生的3′GFOR旁侧DNA连接在上述凝胶纯化的大载体片段的Fsel和Ascl位点，并将一份连接反应混合物通过电穿孔转化到大肠杆菌DH10B中。将转化的细胞涂布在含200μg/ml壮观霉素的LB培养基上，并将平板在37℃培养。通过克隆PCR和Fsel和Ascl的限制性消化分析鉴定含具有正确大小插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化子，选择进一步操作的质粒以下命名为pLDH/GFORSp-9WW。
下一步是从pLDH/GFORSp-9WW中除去5′ldh旁侧DNA，并用5′GFOR旁侧DNA替代，从而在选择破坏GFOR开放阅读框的染色体靶处发生双交换事件。以ZW1基因组DNA为模板，引物13和14为PCR引物，通过PCR产生5′GFOR旁侧DNA片段。
引物13(SEQ ID NO：29)：
CTACTCATatgcatGTCCAGAAAAGACAGCATTCC
引物14(SEQ ID NO：30)：
CATCTTACTgcgatcgcTGCACGGTTCATTGGAT
引物13(正向引物)的下划线碱基与对应于GFOR起始密码子上游约520bp的GenBank登录号为AE008692的核苷酸685584-685564杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Nsil位点。引物14(反向引物)的下划线碱基与对应于临近GFOR开放阅读框中部及引物11结合位点上游的、GenBank登录号为AE008692的核苷酸684396-684415杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的AsiSl位点。用Nsil和AsiSl切割1217bp PCR产物，也用Sbfl和AsiSl双消化pLDH/GFORSp-9WW，以除去5′ldh旁侧DNA；并通过琼脂糖凝胶电泳纯化该操作中获得的大载体片段。然后将PCR产生的5′GFOR旁侧DNA连接在上述凝胶纯化的大载体片段的Sbfl和AsiSl位点间，并将一份连接反应混合物通过电穿孔转化到大肠杆菌SCS110(它是dcm-和dam-)中，以获得非甲基化的质粒DNA进行ZW1和ZW658的后续转化，在以下实施例5和7中详细描述。值得注意的是将非甲基化质粒DNA用于来源于ZW4的运动发酵单胞菌的转化对成功非常关键，因为从野生型大肠杆菌菌株，例如DH10B中分离的甲基化质粒DNA易于被宿主的限制/修饰系统破坏(如US 6566107B1所述)。另外值得注意的是Nsil和Sbfl具有互补的粘性末端，但当它们连接后，则两个位点均被破坏。将转化子涂布在含100μg/ml壮观霉素的LB培养基上，并将平板在37℃培养。通过克隆PCR和限制性消化分析鉴定含具有正确大小插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化子。得到的用于在ZW1和ZW658中敲除GFOR基因的自杀型构建体以下命名为pGFORSp-9WW。该质粒的环状图谱如图12所示，其完整核苷酸序列如SEQ ID NO：31中所示。需要注意的是该自杀型构建体和运动发酵单胞菌染色体GROR基因之间的双交换事件会导致插入两个野生型loxP位点旁侧的Specr-盒，与上述pLDH-Spec-9WW的情况类似。
实施例4
生成针对运动发酵单胞菌的大肠杆菌木糖异构酶表达载体
如下所述，以大肠杆菌/运动发酵单胞菌穿梭载体(pZB188)为起始材料构建在运动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶的质粒构建体(pZB188/Kan-XylA)(图13)。参与构建pZB188的步骤描述在US 5,514,583中。简言之，该7008bp质粒可在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制，因为它具有两个不同的复制原点，分别针对每个细菌种类。pZB188也包含赋予四环素抗性的DNA片段(即Tcr-盒)。构建pZB188/Kan-XylA的第一步是从pZB 188中除去Tcr-盒，并用赋予卡那霉素抗性的DNA片段(即Kanr-盒)代替。为了从pZB188中除去Tcr-盒，将质粒用Xbal和BssHll切割，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化得到的大载体片段。以质粒pET-24a(Novagen)为模板，通过引物15和16进行PCR扩增以产生Kanr-盒。pET-24a含有Kanr基因的完整开放阅读框及其相关启动子。
引物15(SEQ ID NO：32)：GCtctagaGCAGCAGATTACGCGC
引物16(SEQ ID NO：33)：ACATTGgcgcgcTTAGAAAAACTCATC
引物15(正向引物)的下划线碱基与对应于pET-24a的Kanr基因起始密码子上游约160bp处杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Xbal位点。引物16(反向引物)的下划线碱基与对应于Kanr基因包括终止密码子的开放阅读框另一端杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的BssHll位点。用Xbal和Bsshll切割991bp PCR产生的Kanr-盒，并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
然后通过标准连接反应将得到的DNA片段插入到上述pZB188DNA片段的Xbal和BssHll位点。通过电穿孔将转化反应混合物引入大肠杆菌DH10B中，将细胞涂布在含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上；并在37℃培养。从卡那霉素抗性转化子中分离质粒DNA，并将得到的构建体以下命名为pZB188/Kan；该穿梭载体的环状图谱如图13所示。
在下一步中，将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入到用Ncol和Acll双酶切的质粒pZB188/Kan的Ncol和Acll位点之间，通过琼脂糖凝胶电泳纯化的大载体片段。作为大肠杆菌木糖异构酶表达盒的约2KbpDNA片段来源于用Ncol和Clal切割并通过琼脂糖凝胶电泳纯化相关DNA片段的质粒pZB4。质粒pZB4在US 5514583中有详细描述，大肠杆菌表达盒PgapxylA(SEQ ID NO：34)的示意图如图13框出的图谱所示。
Ncol和Clal位点分别位于大肠杆菌木糖异构酶表达盒的5′和3′末端。如US 5514583所述，该片段包含强的组成型运动发酵单胞菌甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子，它是恰好与编码木糖异构酶的大肠杆菌xylA基因的完整开放阅读框融合在一起的。它在紧邻木糖异构酶终止密码子处也包含小的茎环区。通过标准连接反应将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入到pZB188/Kan的Ncol和Acll位点之间。需要注意的是Clal和Acll产生互补的“粘性末端”，但它们连接后则两个位点均被破坏。然后将连接反应混合物通过电穿孔转化到大肠杆菌SSC110(dGm-，dam-)中，以获得非甲基化质粒DNA进行以下实施例6所述的运动发酵单胞菌的转化，并将转化的细胞涂布在含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上，37℃培养。通过限制性消化分析和克隆PCR鉴定含具有正确大小插入片段的质粒的卡那霉素抗性转化子。用于在运动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶的质粒以下命名为“pZB188/Kan-XylA”，该构建体的环状图谱如图13所示。
实施例5
产生ZW1GFOR敲除突变体
为了在ZW1(衍生ZW658的野生型菌株)中除去GFOR酶活性，使用了在实施例3中详细描述的自杀型构建体pGFORSp-9WW。将非复制型质粒DNA通过电穿孔引入到细菌宿主中，基本如US 5514583所述。简言之，DNA转化反应包括50μl含约1010细胞/ml的10％(v/v)甘油和约0.9ug如实施例3所述从大肠杆菌SSC110分离的非甲基化质粒DNA。对照反应进行相同处理，只是不加入任何质粒DNA。电穿孔仪设置为16kv/cm、200Ω、25μF，电转杯的缺口宽度为0.1cm。电穿孔后，将转化反应物用1.0ml MMG培养基(50g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH4)2SO4、0.2g/L K2HPO4和1mM MgSO4)稀释，并将细胞在30℃复苏约5小时。然后在无菌1.5-ml离心管中通过室温下离心(13,000X g，5min)收获细胞，并小心除去上清。将细胞沉淀重悬在150μl液体MMG培养基中，用50和100μl细胞悬浮液涂布含1.5％琼脂和200μg/ml壮观霉素的MMG培养基上。将平板在厌氧培养箱30℃培养，在2到3天后在实验平板上出现50到150个克隆。这时在对照平板上没有壮观霉素抗性克隆，虽然在另外48小时培养时间后会出现少许克隆。选择从转化中得到的2个具有GFOR敲除构建体的壮观霉素抗性克隆用于以下进一步的操作。
以前用运动发酵单胞菌和与pGFORSp-9WW类似的自杀型构建体进行的实验表明，最初染色体和质粒DNA的整合是在两个靶位点之一的单交换事件，单交换事件最后发展为双交换事件。双交换事件的转变通常在含针对自杀型构建体的选择性试剂的液体培养基中进行一系列转移后很快发生。为了利于两个选择的ZW1转化子发生由GFOR敲除构建体介导的双交换事件，将细胞接种到10ml含100g/L葡萄糖和200μg/ml壮观霉素的RM培养基(10g/L酵母提取物和2g/LKH2PO4)中。在30℃培养24小时后，两个培养物均达到静止期。然后，用10μl第一代培养物接种10ml相同的生长培养基，在30℃培养24小时后，两个培养物也均达到静止期。最后，用10μl第二代培养物接种10ml相同的生长培养基，并在30℃再培养24小时。在液体培养基中进行最后一次转移后，将第三代培养物稀释并涂布在含壮观霉素(200μg/ml)的MMG培养基上以获得单克隆，平板在30℃厌氧条件下培养48小时。
用3对不同的引物通过克隆PCR实验验证双交换事件确实发生。第一对PCR引物仅扩增自杀型构建体的5′GFOR旁侧DNA与其染色体互补区进行单交换事件而产生正确大小的DNA片段。同样，第二对PCR引物仅扩增自杀型构建体的3′GFOR旁侧DNA与其染色体互补区进行单交换事件而产生正确大小的DNA片段。最后，第三对PCR引物仅扩增发生双交换事件，并排除单和双交换事件混合群体而产生正确大小的DNA片段。用于本分析中的两个壮观霉素抗性克隆来源于两个不同的具有自杀型构建体的ZW1电穿孔反应的原始转化子，在液体培养基中转移3次，涂布以获得上述单克隆，本实验的对照是亲本菌株ZW1。由于两个转化子用3对不同的引物对均产生阳性结果，因此只选择其中一个进行以下分析。该菌株(ZW1GFOR敲除突变体)以下命名为ZW1-ΔGFOR。
实施例6
在生理条件下葡萄糖-果糖氧化还原酶是木糖醇形成的主要贡献者
用ZW1GFOR敲除突变体(ZW1-ΔGFOR)检测假说：在利用木糖的运动发酵单胞菌重组菌株中木糖醇的形成至少部分由周质空间的酶GFOR，或其也具有酶活性的更大分子量的胞质前体介导(Loos etal.，同上)。如实施例2(图11)所示，木糖醇是利用木糖的菌株8b和ZW658的主要副产物，但它仅在生长培养基中存在木糖时形成。虽然野生型运动发酵单胞菌菌株，例如CP4具有可直接还原木糖为木糖醇的NADPH依赖的醛糖还原酶(Feldmann et al，同上)，但可能在生长培养基中含有木糖或葡萄糖和木糖混合物时，GFOR也在体内参与木糖醇的形成，如图表II和III所示。但对这些发生的任何一个反应，酶都需要接近木酮糖，因为该化合物是GFOR介导的木糖醇产生的专性(obligatory)电子接纳体，如体外GFOR酶性状检测(Zachariou and Scopes，同上)和用粗无细胞提取物进行的实验(Danielson同上)所示。在构建的利用木糖生长的运动发酵单胞菌中，木糖醇合成必需的木酮糖可通过催化木糖代谢(图1)第一个步骤的木糖异构酶产生，该酶在野生型菌株，例如ZW1中不存在。
为了检测在生长培养基中存在木糖和葡萄糖时GFOR产生木糖醇的可能性，将如实施例4所述的大肠杆菌木糖异构酶表达载体(pZB188/Kan-XylA)导入ZWl和ZWl-ΔGFOR中。其策略是在不能利用这些糖生长的两个菌株中提供从木糖转变为木酮糖的途径，并测定GFOR是否可产生木糖醇。用于转化的电穿孔流程基本如实施例5所述，但在复苏阶段后将转化的细胞涂布在含300μg/ml卡那霉素的MMG培养基上。将ZW1和ZW1-ΔGFOR也用与pZB188/Kan-XylA相同但不含大肠杆菌木糖异构酶表达盒的pZB188/Kan(图13)转化，作为本实验的对照。通过克隆PCR鉴定含pZB188/Kan-XylA或对照质粒的卡那霉素抗性克隆，并随机选择每个转化反应的代表性克隆进行如图14所示的实验。这4个含质粒的菌株以下命名为ZW1(pZB188/Kan)、ZW1(pZB188/Kan-XylA)、ZW1-ΔGFOR(pZB188/Kan)和ZW1-ΔGFOR(pZB 188/Kan-XylA)。
将在30℃下，过夜培养物培养在含5ml 60g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH2PO4、2g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO2(7H2O)和300μg/ml卡那霉素的15ml带盖试管中。然后用每份过夜培养物接种含相同生长培养基，存在或不存在20g/L木糖的20ml培养物(在50-ml带盖试管中)中。在30℃轻轻振荡培养，最初OD600值为～0.1。培养0、24、48和120小时后除去1.0ml培养物，用具有折光率检测器(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)的HP 1100进行HPLC分析，以检测发酵液中存在的木糖、木酮糖和木糖醇浓度。在进行HPLC分析前，通过离心除去细胞，并将上清通过0.22μm醋酸纤维素Spin-X离心管过滤器(Costar，catalog number 8160)以除去小颗粒。在AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)上，在55℃，无梯度条件下以流速0.6ml/min，0.01N H2SO4为流动相分离化合物。用已知浓度的标准品定量目标峰，所有结果表示为g/L。
结果表明，当具有“空”载体的对照菌株ZW1(pZB188/Kan)在存在葡萄糖和木糖的条件下进行培养时，在120小时培养时间后，生长培养基中仅有小量木糖醇积累(图14A)。该菌株木糖醇的最大量为＜0.5g/L。相反，当ZW1(pZB188/Kan)生长在相同浓度的葡萄糖但没有木糖的条件下，则没有木糖醇产生，对其它3个菌株也是这样。因此，只有在存在葡萄糖和木糖时进行的实验如图14所示。显然，大肠杆菌木糖异构酶在ZW1中的表达极大增加了发酵液中木糖醇的量，到120小时，ZW1(pZB188/Kan-XylA)比ZW1(pZB188/Kan)多产生5倍的该化合物(图14B)。如预期一样，木糖异构酶在ZW1中的表达也导致木酮糖的产生，因为木糖异构酶催化木糖到木酮糖的异构化。需注意的是在本实验中，加到生长培养基中约16％的总木糖转变为木酮糖或木糖醇。另外值得注意的是在这两个化合物之间存在明显的前体/产物的关系(木酮糖降低，则木糖醇增加)，这与在培养基中存在葡萄糖和木糖时，GFOR在生理条件下可将木酮糖转变为木糖醇的假说相一致。
与ZW1相似，ZW1-ΔGFOR在没有木糖异构酶表达载体时产生极少的木糖醇(图14C)。在这些条件下形成的小量木糖醇可能来自NADPH依赖的醛糖还原酶，如Feldmann et al.(1992同上)所述。令人惊讶的是，与用ZW1(pZB188/Kan-XylA)获得的结果相比较，当木糖异构酶在ZW1GFOR敲除突变体中表达时，没有额外的木糖醇产生(图14D)。ZW1-ΔGFOR(pZB 188/Kan-XylA)确实产生了大量木酮糖，形成的该化合物的量与由相应ZW1菌株(即ZW1(pZB188/Kan-XylA)产生的木酮糖和木糖醇的总量一样。这些实验清楚表明，当酶接近木酮糖时，GFOR在体内参与木糖醇的形成，这种情况在葡萄糖和木糖混合物中培养的、利用木糖的运动发酵单胞菌重组菌株中确实发生。这些结果进一步表明当运动发酵单胞菌重组菌株在含木糖的培养基生长时，NADPH-依赖的醛糖还原酶对木糖醇的产生不具有重要作用，这与文献(Feldmann et al，同上；Kim et al，同上)的预期相矛盾。
实施例7
ZW658GFOR敲除突变体的产生及该菌株不产生功能性GFOR酶的验 证
在ZW658中，在存在葡萄糖和木糖醇时，在生理条件下，编码如实施例6所述的、参与运动发酵单胞菌中木糖醇形成的GFOR基因通过自杀型构建体pGFORSp-9WW(如实施例3所述)进行插入失活。该流程中的所有步骤与实施例5中所述的ZW1GFOR敲除突变体相同，包括用3组PCR引物验证双交换事件。选择进行进一步所述实验的ZW658敲除突变体以下命名为ZW800。
为了验证ZW800不产生在生理反应中由GFOR催化的、从葡萄糖和果糖产生山梨糖醇的酶，进行了以下实验。将1.5毫升ZW800和亲本ZW658培养物在30℃，在10ml带盖试管中的含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4和1g/L MgSO4的液体培养基中培养到早期静止期。当培养物达到OD600约5.5时，通过离心收获细胞，仔细除去上清并抛弃。然后将细胞沉淀重悬在5ml含以下组分的新鲜生长培养基中：110g/L葡萄糖、110g/L果糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4和4g/L KHCO3。以上所有步骤在无菌条件下进行，生长培养基的最初pH在细胞重悬前用浓磷酸调整到5.8。然后将得到的培养物在30℃培养，并轻轻振荡(150rpm)，在如表2所示的时间点除去样品，并用如实施例6所述的相同流程进行发酵液的HPLC分析。本实验的目标峰是葡萄糖、果糖、山梨糖醇和乙醇，用已知量的标准品计算离心除去细胞后它们在发酵液中的浓度；表2的所有浓度表示为g/L。
表2ZW658和ZW800中山梨糖醇的产生——体外测定
  菌株   小时   葡萄糖   果糖   山梨糖醇   乙醇
  ZW658   0   110   110   0   0
  ZW658   23   5.99   61.43   45.99   49.36
  ZW658   47   1.55   21.98   45.89   69.04
  ZW800   0   110   110   0   0
  ZW800   23   0   60.44   0   73.85
  ZW800   47   0   6.79   10.21   96.21
如表2所示，ZW658培养物在23小时后消耗了几乎所有葡萄糖和约一半的果糖，并产生相当量的山梨糖醇和乙醇为主要产物；后两个化合物的值在第一个时间点分别为45.99g/L和49.36g/L。因此，在ZW658培养物中，最初的果糖有40％以上通过GFOR转变为山梨糖醇。显著不同的是，在23小时培养后，在ZW800培养物的发酵液中没有检测到山梨糖醇，而葡萄糖和果糖几乎定量转变为乙醇，这与消耗每克糖产生0.51克乙醇的理论值相近。值得注意的是在另外24小时培养后，ZW658培养物中的山梨糖醇的量没有进一步增加。这与预期相符，因为几乎所有的葡萄糖已在早期被消耗，而用果糖进行GFOR反应没有电子供体。有趣的是，在47小时的时间点，ZW800培养物的发酵液中有小量山梨糖醇(10.21g/L)，这可能是由NADPH依赖的醛糖还原酶(Feldmann et al.，同上)或其它仍未阐明的酶产生。但上述结果表明插入到ZW800中的GFOR开放阅读框中部的Specr-盒即使不完全，也极大地破坏了GFOR酶活性。
该结论的进一步支持来自用ZW1、ZW658和ZW800制备的无细胞提取物的体外实验。其目标是确定是否ZW658可在没有添加其它的底物或辅因子的情况下将木糖转变为木糖醇，并研究是否ZW800由于GFOR失活而丧失进行该反应的能力。用运动发酵单胞菌无细胞提取物中GFOR介导的木糖醇产生有3个条件：1)可还原GFOR紧密结合辅因子的糖电子供体，例如葡萄糖或木糖，2)木酮糖作为电子接纳体，因为它是酶实际将其还原为木糖醇的化合物，及3)功能性GFOR酶。如果不向反应混合物中加入木酮糖，则无细胞提取物也必需含有木糖异构酶将木糖转变为木酮糖。
用100ml在33℃，培养在含10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4和50g/L葡萄糖的250ml锥形瓶中的培养物制备无细胞提取物。在OD600为2-3时通过离心收获细胞，并用冰50mM Tris-HCl(pH 7.0)，1.0mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇洗涤2次。将最终沉淀重悬在1.0ml相同缓冲液中，并通过超声破碎细胞。通过4℃离心(16,000x g，60min)除去细胞碎片，并立即用无细胞提取物进行如下所述的木糖醇产生的检测。在聚丙烯微离心管中进行500μl反应，管中含具有以下终浓度的组分：50mM Tris-HCl(pH 7.0)，1.0mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，66mM木糖和0.32-0.35mg无细胞提取物蛋白；通过BCA蛋白检测法(Pierce)测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准。在40℃温育15小时后，用终浓度为30mM新戊酸终止反应，并取一份用SH1011柱(Showdex)进行HPLC分析，以0.01N硫酸为流动相。柱温维持在50℃，流速为1.0ml/min。本实验对照不加入无细胞提取物，但其它处理相同。
如表3所示，当将ZW1无细胞提取物加入到反应混合物中，在15小时的温育时间内木糖不能转变为木酮糖或木糖醇。如已提及的，该结果与预期相符，因为与ZW658和ZW800相比较而言，ZW1是野生型菌株，不表达大肠杆菌木糖异构酶。相反，当使用ZW658无细胞提取物时则产生大量木酮糖和木糖醇，因为它含有这两种化合物形成所必需的酶。在这种情况下，约8％最初的66mM木糖用于木糖醇的产生，因为当加入到反应混合物中的木糖为GFOR的唯一底物时，每产生1个分子木糖醇需消耗两分子木糖。最后，最重要的是，ZW800无细胞提取物仅能将木糖转变为木酮糖，因为虽然它含有木糖异构酶活性，但它缺失GFOR酶活性。这些结果进一步表明，ZW800不产生功能性GFOR酶，而且进一步证明该蛋白以木糖为电子供体，将木酮糖还原为木糖醇，如以前用加入了纯化的木糖异构酶的野生型无细胞提取物所示的结果一样(Danielson同上)。
表3.GFOR介导的、由木糖生成木糖醇也需要木酮糖——体外测定
  无细胞提取物   木酮糖(mM)   木糖醇(mM)
  none   0   0
  ZW1   0   0
  ZW658   9.45   2.6
  ZW800   10.63   0
实施例8
在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中山梨糖醇是ZW800生长所必需的
检测ZW800在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中产生乙醇的发酵性能。该实验在pH-控制的发酵罐中进行，使用总糖为97g/L或188g/L，葡萄糖和木糖的固定比例为～5∶4。
将ZW658和ZW800的种子培养物在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH2PO4、2g/L(NH4)2SO4和1g/LMgSO4的液体培养基的摇瓶中，37℃下培养；最初pH用4N KOH调整为5.5。当OD600达到～5.0时，用50ml种子培养物接种含450ml生长培养基的1升发酵罐(B-DCU system，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)。最终500ml培养物含5g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、2g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4及低浓度糖(54g/L 43g/L木糖)或高浓度糖(104g/L葡萄糖、84g/L木糖)。在33℃培养，通过自动加入4N KOH维持pH5.5。混合速度设置为150rpm。在多个时间点，取出1份发酵液用与实施例6所述相同流程和条件进行HPLC分析。本实验的目标化合物是葡萄糖、木糖和乙醇，用已知浓度的标准品定量色谱峰。也用设定光密度为600nm的分光光度计通过以下浊度变化监测细胞生长，并将得到的OD600做图。
如图15所示，当发酵罐含低浓度糖(54g/L葡萄糖、43g/L木糖)时，GFOR失活对生长、糖消耗或乙醇滴度没有影响。但如图16所示，当总糖浓度增加约2倍时，则发酵性能有很大差异。ZW658的延迟期约30小时，这对利用木糖的运动发酵单胞菌重组菌株从葡萄糖和木糖稀释混合物转移到总糖超过180g/L的相同糖的浓缩混合物时是典型现象。在延迟期后，细胞开始生长并消耗培养物中的所有葡萄糖和约75％木糖，因此得到最终乙醇滴度为～73g/L(图16A)。相比之下，ZW800培养物甚至在130小时培养时间后不从延迟期复苏(图16B)，该结果在两个独立的情况下获得。
如图15所示，由于ZW800在葡萄糖和木糖稀释混合物中生长很好，因此该菌株不能在高糖混合物中复苏可能与渗透压力相关。当野生型运动发酵单胞菌转移到葡萄糖和果糖混合物，或通过转化酶可产生葡萄糖和果糖的高浓度蔗糖中时，GFOR确实通过产生山梨糖醇而在维持渗透平衡方面具有重要作用(Loos et al.，同上)。由GFOR在周质空间产生的山梨糖醇逆浓度梯度进入细胞内，由于不进行进一步代谢而高水平积累。从而消除跨质膜的渗透压差异，并保持渗透平衡(Wiegert et al.，同上)。但GFOR介导的山梨糖醇产生的前提是同时存在葡萄糖和果糖，在缺少果糖的培养基中不发生该反应。由于山梨糖醇是GFOR的生理性重要的产物，但该酶在ZW800中失活，因此在以下实验中检测了向浓缩的葡萄糖和木糖混合物中增加山梨糖醇的效果。
在高浓度混合物中培养～70小时后(时间点由图16的垂直箭头指定)，从发酵罐中除去5份4.5ml延迟的(stalled)ZW800培养物并转移到15ml带盖的试管中。然后向4个试管补加0-20mM山梨糖醇(终浓度)，而且在所有情况下，将培养物的总体积用去离子水调整为5.0ml；本实验所用的山梨糖醇储液也由水配制。当向10％稀释的生长培养基中加入水和山梨糖醇时，对第五个培养物不做任何添加，作为对照。然后将所有培养物在33℃轻轻振荡(200rpm)培养，并用分光光度计监测生长。如图17所示，当向生长培养基中加入山梨糖醇后，细胞几乎立即开始生长，甚至在最低检测浓度时(5mM)也是如此。而且发现不加入山梨糖醇，但用水将培养物稀释10％，将总糖浓度从188g/L降低到169g/L时也刺激生长。但山梨糖醇对生长的刺激作用大大强于稀释的作用。
通过山梨糖醇得到的ZW800生长的拯救(rescue)完全在意料之外，因为ZW658在葡萄糖和果糖混合物，而没有已知来源的果糖中从延迟期复苏，并生长很好。由于后一化合物是GFOR介导的山梨糖醇产生的专性电子接纳体，GFOR在含高浓度葡萄糖和木糖的培养基中能合成山梨糖醇或在渗透平衡方面起重要作用并不明显。因此不能表明山梨糖醇是ZW658或ZW800在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中的生长的重要因子。
实施例9
GFOR失活可在处理相关条件(process relevant conditions)下提高从 木糖到乙醇的产量
对ZW658和ZW800在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中的发酵性能在处理相关条件下以并行方式进行比较，以测定GFOR失活是否是有利的或有害的代谢工程策略。由于在这些实验中使用高浓度葡萄糖和木糖，因此向培养基中加入山梨糖醇以使ZW800生长。在此处未描述的实验中，也发现山梨糖醇消除了ZW658的延迟期。因此，对生长培养基补充山梨糖醇可提供理想的在处理相关条件下来比较这两个菌株的方式。
用两种总糖浓度，存在和不存在乙酸盐下，将ZW658和ZW800在6个不同条件下进行比较，对更浓缩的糖混合物，检测了两种不同的缓冲能力。这些实验用20ml培养物在30℃，在50ml试管中轻轻振荡(150rpm)培养进行。不控制pH，但最初生长培养基中的pH用浓磷酸在用种子培养物接种前调整到5.8。基本生长培养基含10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4、5mM山梨糖醇和或者4g/L(图18和19)或者8g/L(图20)KHCO3。所有以上和以下的值是加入种子培养物后的终浓度。用KHCO3增加生长培养基的缓冲能力，以使在细菌生长时通常发生的pH降低最小。所有这些实验的碳源是两种不同总糖浓度的葡萄糖和木糖混合物，其与预处理的玉米秸水解物中的这两种糖的比例相似。葡萄糖和木糖的最初浓度分别为或者92g/L和82g/L(图18)或者107g/L和96g/L(图19和20)。其中也存在6g/L of乙酸盐(预处理玉米秸水解物中存在的抑制剂)。将种子培养物在30℃，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4的液体培养基中培养到OD600为～5.0，并用1/10体积接种实验培养物。在不同时间点，除去1份发酵液如前实施例6所述进行HPLC分析。本实验的目标化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，所有的值以g/L计。由于实际上所有的葡萄糖在第一个采样时间点均被消耗，因此该糖的值不在图中画出。
从如图18-20所示的实验表明，ZW800在所有检测的条件下均优于ZW658，根据两个不同的标准进行判定：(a)在实验过程中消耗的木糖的总量，及(b)达到的最大乙醇滴度。而且从该数据也表明，当遇到最胁迫的条件(即所有的葡萄糖被消耗完，而且乙醇浓度开始达到毒性水平)时，GFOR失活起到极大的有利作用。事实上，当生长培养基中存在将产生额外的胁迫的、抑制浓度的乙酸盐时观察到两个菌株最大的差异。在三组实验条件下，ZW800在存在乙酸盐时的乙醇滴度平均增加量是10.2％，其值在4.4％到13.7％。ZW800在三个实验中，在没有乙酸盐时产生的乙醇也比ZW658多，在这种情况下的平均增加量是3.2％。与预期一样，ZW658将木糖转变为大量的不期望的副产物木糖醇，当条件最胁迫(即在发酵最后阶段，当生长培养基中存在乙酸盐时)时，该化合物达到最高水平。例如，在如图18-20所示的有乙酸盐的实验中，ZW658将消耗的总木糖的8.1％、8.3％和9.9％转变为木糖醇。相反，ZW800培养物在任何检测条件下都没有木糖醇的产生。这些结果清楚地表明，GFOR失活利于在处理相关条件下代谢木糖产生乙醇，特别是在存在抑制浓度的乙酸盐时。如图18和19所示的试管实验进行了两次，确实获得相同的结果。
另一个用ZW800和ZW658在pH控制的发酵罐中，在含乙酸盐的浓缩葡萄糖和木糖混合物中进行了并行实验。由运动发酵单胞菌产生的代谢副产物例如有机酸和二氧化碳降低生长培养基的pH，这可增加乙酸和乙酸盐的比例，而已知质子化物质是实际上抑制细菌生长的化合物(Kim et al，(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology，84-86：357-370)。因此，在大规模发酵中，pH是非常重要的，因为pH从5.8降低到5.0将使乙酸的浓度增加5倍。
将ZW800和ZW658种子培养物在摇瓶中，37℃，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、10g/L KH2PO4、2g/L(NH4)2SO4和1g/L MgSO4的液体培养基中培养；起始pH用4N KOH调整为5.5。当OD600达到～5.0时，用50ml种子培养物接种到含450ml生长培养基的1升发酵罐(BIOSTATO B-DCU system，Sartorius BBISystem Inc.，Bethlehem，Pennsylvania，USA)中。最终500ml培养物含92g/L葡萄糖、97g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、10mM山梨糖醇和7.2g/L乙酸盐。在33℃培养，通过自动加入4N KOH维持pH在5.5，混合速度为150rpm。在不同时间点，取出1份发酵液用实施例6所述相同流程对其进行HPLC分析。本实验的目标化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，也对细胞生长(OD600)进行监测。图21所示的是用ZW800培养物的整个时间段的发酵罐运行的参数，表4总结了两个菌株木糖、乙醇和木糖醇的终点值。
表4.ZW800和ZW658在pH控制的发酵罐中的木糖、乙醇和木糖醇的终点值
  ZW658   ZW800
  乙醇(g/L)   65.95   72.31
  消耗的木糖(g/L)   60.71   69.14
  木糖醇(g/L)   3.92   0
  乙醇产量(g乙醇/g糖)   0.43   0.45
与有乙酸盐的试管结果(图18-20)相同，ZW800比ZW658在pH-控制的发酵罐中多消耗14％的木糖，而且多产生9.6％的乙醇(图21)。由于ZW800不产生任何可检测到的木糖醇，因此该菌株乙醇的产量高约5％。相比之下，木糖醇在ZW658发酵液中的终浓度为3.92g/L，代表在实验过程中消耗的总木糖的约6.5％。这些实验对GFOR失活可通过去除木糖醇形成而提高由木糖产生的乙醇产量提供了另外的证据。如已知的，不期望的副产物木糖醇以至少两个不同的方式干扰木糖代谢并抑制细菌生长，其导致低水平的ATP。因此，当GFOR产生木糖醇时，它降低了运动发酵单胞菌应对所有其它通常在从木质纤维素贮存物发酵产生乙醇的过程中遇到的能量消耗胁迫的能力。与ZW658相比，由于ZW800不需要与木糖醇相关的胁迫相竞争，因此它可在发酵后期阶段产生最高水平胁迫时消耗更多的木糖，产生更多的ATP和更多的乙醇。
实施例10
从ZW800中去除选择性标记及获得的菌株ZW801-4的特征 Cre表达构建体pZB188-Kan/Cre的产生
如实施例3所述，插入到ZW800的GFOR开放阅读框中的Specr盒夹在两个野生型loxP位点之间。这种排列易于从染色体中通过Cre重组酶(Sternberg and Hamilton(1981)J.Mol.Biol.150：467-486；Leeand Saito  同上，Trinh et al(2000)Journal of Immunological Methods244(2)：185-193)除去选择性标记。但为了达到该目的，首先需要产生可在运动发酵单胞菌中复制的Cre表达载体(图22)。Cre表达载体的前体是如实施例4详细描述的pZB188/Kan。简言之，pZB188/Kan是可在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制的穿梭载体，因为它具有两个细菌种的复制原点。它也含有赋予卡那霉素抗性的DNA片段(即Kanr盒)。用Ncol和Notl对pZB 188/Kan进行双消化，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化大载体片段。下一步是通过PCR用引物17和18产生Cre表达盒。扩增Cre表达盒所用的DNA模板是含噬菌体P1Cre重组酶整个基因及其启动子的质粒(Sternberg et al(1986)J.Mol.Biol.187(2)：197-212)。
引物17(SEQ ID NO：35)
CTACTCATccatggCATCTTGAGCTTGAGAAAAACC
引物18(SEQ ID NO：36)
CATCTTACTgcggccgcTTAATGGCTAATCGCCATCTTC
引物17(正向引物)的下划线碱基与对应于Cre起始密码子上游200bp处GenBank登录号为X03453的序列的nt 286-307杂交，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Ncol位点。引物18(反向引物)的下划线碱基与Cre开放阅读框另一端GenBank登录号为X03453的序列的nt 1523-1503结合，而小写字母对应于添加到引物5’末端的Notl位点。用Ncol和Notl双消化1238bp PCR产物，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化得到的含Cre重组酶完整开放阅读框及其推测的启动子的DNA片段(Sternberg et al，1986同上)。然后通过标准连接反应将Cre-表达盒插入到上述pZB188/Kan DNA片段的Ncol和Notl位点。将连接反应混合物电转入大肠杆菌DH10B，并将转化的细胞涂布在含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基上；37℃培养。从卡那霉素抗性转化子中分离质粒DNA，然后将该制备物导入大肠杆菌JM110(dcm-，dam-)以获得非甲基化的质粒DNA进行后续的运动发酵单胞菌转化(参见以下描述)。Cre表达载体pZB188/Kan-Cre的质粒图谱如图22所示。
Cre处理以从ZW800染色体中除去选择性标记并消除Cre表达载体
噬菌体P1的Cre重组酶(Cre)可识别特异的34bp的DNA序列——“loxP位点”，该位点在8bp的非对称核心旁侧含有两个13bp反向重复(Sternberg and Hamilton，1981，同上；Lee and Saito，同上；Trinh et al，同上)。Cre也可以切割任何位于两个相同的loxP位点之间的干扰DNA片段，而且切割反应非常快。为了从GFOR开放阅读框中除去Specr盒，将Cre表达载体(pZB188/Kan-Cre)导入ZW800中。
转化流程基本如实施例5所述，但在复苏阶段后，将细胞涂布在含350μg/ml作为Cre表达载体选择试剂的卡那霉素MMG培养基上。从该过程复苏的原代转化子对壮观霉素不再有抗性，因为通过Cre从染色体除去的Specr盒是在运动发酵单胞菌中不能复制的环状DNA片段。在30℃，在厌氧条件下培养48小时后，将两个Kanr/Specs原代转化子进行Cre质粒消除过程。虽然pZB188/Kan-Cre可在运动发酵单胞菌中复制，但在不合卡那霉素的培养基上培养细胞很容易使该质粒丢失。为了在本发明中消除Cre表达载体，将细胞在升高的温度(37℃)下，在不含卡那霉素的液体培养基中培养；每隔24-36小时将细胞转移到含相同组分的新鲜生长培养基中。在进行至少50代后，在MMG平板上分离单克隆，并从两个原始的原代转化子中随机选择5个克隆进行进一步分析。与预期一致，这些克隆都不能在含卡那霉素(350μg/ml)或壮观霉素(200μg/ml)的MMG平板上生长。虽然不能在卡那霉素上生长是质粒消除过程成功的很好提示，但该结论也用与Cre表达盒杂交的引物通过克隆PCR进行验证。基于这些实验，选择3个Cre处理的、质粒消除的ZW800衍生物进行进一步分析，这些菌株以下命名为ZW801-4、ZW801-5和ZW801-6。
为了研究这些菌株在葡萄糖和木糖浓缩混合物中，在存在抑制浓度的乙酸盐时表现如何，进行了摇瓶实验。在本分析中也包括ZW658和ZW800。将种子培养物在30℃，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4的液体培养基中培养至OD600～3.0，用10％接种物作为15ml的实验培养物。将后者在50ml试管中，在30℃振荡(150rpm)培养。生长培养基含10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4、5mM山梨糖醇、40mMKHCO3、95g/L葡萄糖、90g/L木糖和7.7g/L乙酸盐；最初pH用浓磷酸调整为5.8。在不同时间点，除去1份培养物进行如前实施例6所述的发酵液HPLC分析。本实验的目标化合物是葡萄糖、木糖、乙醇和木糖醇，所有值以g/L计。
如表5所示，ZW658产生66.35g/L乙醇，并留下40.6g/L残余的木糖。ZW658由于具有功能性GFOR酶，因此也产生3.19g/L不期望的副产物木糖醇。与以前其它并行实验所观察到的一样，ZW800比ZW658多消耗17％的木糖，多产生6.2％的乙醇，而且不产生任何可检测的木糖醇。虽然用ZW801-4和ZW801-6获得的结果略好一些，但这些差异可能在实验误差范围内，不是统计学显著的。本实验中观察到的ZW801-5相对较差的性能难以理解，不再进一步研究。基于这些结果，选择菌株ZW801-4进行进一步分析。
表5.ZW658、ZW800、ZW801-4、ZW801-4和ZW801-5在高糖醋酸下的摇瓶实验
  菌株   小时   葡萄糖   木糖   木糖醇   乙醇
  ZW658   0   95.7   89.3   0   3.2
  ZW658   15.5   27.75   80.93   0   37.39
  ZW658   38   0   42.71   1.85   66.53
  ZW658   62   0   40.6   3.19   66.35
  ZW800   0   95.7   89.3   0   3.2
  ZW800   15.5   30.64   81.36   0   36.05
  ZW800   38   0   37.29   0   69.82
  ZW800   62   0   32.34   0   70.47
  ZW801-4   0   95.7   89.3   0   3.2
  ZW801-4   15.5   28.04   80.82   0   37.75
  ZW801-4   38   0   36.13   0   70.54
  ZW801-4   62   0   30.28   0   71.25
  ZW801-5   0   95.7   89.3   0   3.2
  ZW801-5   15.5   55.61   85.62   0   21.86
  ZW801-5   38   0   46.83   0   64.92
  ZW801-5   62   0   39.54   0   66.19
  ZW801-6   0   95.7   89.3   0   3.2
  ZW801-6   15.5   32.34   82.02   0   34.89
  ZW801-6   38   0   36.39   0   70.64
  ZW801-6   62   0   29.55   0   71.74
为了验证摇瓶实验表明ZW 801-4至少与ZW800表现一样的结果，将这两个菌株在pH控制的条件下进行比较。将种子培养物在30℃，在含75g/L葡萄糖、25g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/L KH2PO4、1g/L MgSO4的培养基中培养。当OD600达到～4.6时，用17ml种子培养物接种含153ml生长培养基的pH控制的生物反应器中。最终170ml培养物中含105g/L葡萄糖、100g/L木糖、10g/L酵母提取物、2g/LKH2PO4、1g/L MgSO4、5mM山梨糖醇和7.2g/L乙酸盐。在33℃培养，通过自动加入4N KOH将pH维持在5.5；搅拌速度为～150rpm。在不同时间点，从生物反应器中取出1份培养物进行如上所述的发酵液HPLC分析，并对OD600进行监测。在这些实验条件下，ZW800和ZW 801-4的生长曲线几乎重叠(图23A)。葡萄糖和木糖消耗的时间段也基本上一样，而且两个菌株产生具有相同动力学的相同量的乙醇(图23B)。另外，这两个菌株均不产生任何可检测的木糖醇。基于这些结果，我们认为从GFOR开放阅读框中除去Specr-盒不能使GFOR酶活性恢复或部分恢复，而且该操作对发酵性能没有坏的影响。虽然ZW800和ZW801-4都比具有功能性GFOR酶的亲本菌株(ZW658)表现好，但优选的用于商业用途的菌株是ZW801-4，因为它不含有对抗生素赋予抗性的外源基因。
来自ZW801-4的基因组DNA的序列分析提供了确实发生正确的Cre切除事件的明确证据。ZW801-4中被破坏的GFOR开放阅读框的完整核苷酸序列(从原始起始密码子到原始终止密码子)如SEQ IDNO：37所示，图24所示的是翻译的突变序列与野生型GFOR蛋白的比对；后者由GenBank登录号AE008692的核苷酸683751-685052的反向互补序列编码。与预期一样，Specr盒的Cre切割在GFOR开放阅读框中间留下1个野生型loxP位点，该插入事件产生成熟前截短蛋白的同框终止密码子；“lox瘢痕”由灰色高亮残基表示。作为自杀型构建体设计的结果，突变的核苷酸序列也在相同位置缺失～72bp的原始野生型GFOR核苷酸序列。
Figure IYZ000005181668000011
Figure IYZ000005181668000021
Figure IYZ000005181668000031
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Figure IYZ000005181668000071
Figure IYZ000005181668000081
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Figure IYZ000005181668000111
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Figure IYZ000005181668000161
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Figure IYZ000005181668000221
Figure IYZ000005181668000231
Figure IYZ000005181668000241

Claims (7)

1.能够利用木糖产生乙醇的重组发酵单胞菌(Zymomonas)菌株，其包含对SEQ ID NO：38所示的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的至少一种可降低葡萄糖-果糖氧化还原酶活性的遗传修饰，其中，与没有通过遗传修饰降低葡萄糖-果糖氧化还原酶活性的菌株相比，所述菌株产生更少量的木糖醇。
2.权利要求1所述的重组发酵单胞菌菌株，其中，降低葡萄糖-果糖氧化还原酶活性的遗传修饰选自插入、缺失、突变、共抑制和反义RNA表达。
3.权利要求1所述的重组发酵单胞菌菌株，其中降低葡萄糖-果糖氧化还原酶活性的遗传修饰是通过同源重组引入到所述菌株的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因中的插入。
4.权利要求1所述的发酵单胞菌菌株，其中所述菌株是ATCC#PTA-7858，其包含编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因中的破坏。
5.生产能够利用木糖来产生乙醇、且具有降低的GFOR活性的发酵单胞菌菌株的方法，包括：
a)提供能够在合适条件下利用木糖产生乙醇的重组发酵单胞菌菌株；及
b)向(a)中的、能够利用木糖产生乙醇的重组发酵单胞菌菌株中引入至少一种遗传修饰，所述修饰可降低葡萄糖-果糖氧化还原酶活性。
6.权利要求5所述的方法，其中，(a)中的、能够利用木糖产生乙醇的重组发酵单胞菌菌株选自ATCC31821/pZB5、运动发酵单胞菌(Z.mobilis)8b、ATCC#PTA-7858、ZM4(pZB5)和运动发酵单胞菌CP4:pZB5。
7.权利要求6所述的方法，其中，所述的遗传修饰选自插入、缺失、突变、共抑制和反义RNA表达。
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