CN116042590A - 一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法 - Google Patents

一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116042590A
CN116042590A CN202211377122.3A CN202211377122A CN116042590A CN 116042590 A CN116042590 A CN 116042590A CN 202211377122 A CN202211377122 A CN 202211377122A CN 116042590 A CN116042590 A CN 116042590A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
protein glutaminase
signal peptide
recombinant
bacillus subtilis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211377122.3A
Other languages
English (en)
Inventor
张国强
堵国成
殷鑫鑫
周景文
陈坚
李江华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Original Assignee
Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Sunhy Biological Co ltd filed Critical Wuhan Sunhy Biological Co ltd
Priority to CN202211377122.3A priority Critical patent/CN116042590A/zh
Publication of CN116042590A publication Critical patent/CN116042590A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01044—Protein-glutamine glutaminase (3.5.1.44)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本分案申请公开了一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。在本发明中通过改造信号肽，实现了蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效的胞外表达，解决了蛋白质谷氨酰胺酶胞外分泌不足的问题。本发明通过改造信号肽，使蛋白质谷氨酰胺酶的分泌酶活由440U/L提高到910U/L，酶活提高2.67倍，应用本发明中的信号肽明显提高了蛋白质谷氨酰胺酶的胞外分泌，降低了工业上生产蛋白质谷氨酰胺酶的成本，同时也为枯草芽孢杆菌外源分泌蛋白表达量的提高奠定了基础。

Description

一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法
本申请是专利号为“202110132935.5”，申请日为“2021年2月1日”，名称为“一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法”的发明专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
蛋白质谷氨酰胺酶(protein-glutaminase，EC3.5.1.44，简称PG)是一类特异性谷氨酰胺脱酰胺水解酶。蛋白质谷氨酰胺酶主要应用于食品工业，大量研究验证该酶能显著改善小麦谷蛋白、米谷蛋白等植物蛋白的溶解度、乳化性和起泡性等功能，蛋白质谷氨酰胺酶的脱酰胺作用不需要提前对蛋白质进行预处理且特异性强，只作用于蛋白质的侧链的谷氨酰胺，对天冬酰胺无脱酰胺作用，且不会对蛋白质的结构造成不良变化。但是目前蛋白质谷氨酰胺酶的应用受到制约，其中蛋白分泌表达量低是其中一个重要因素。
与产蛋白质谷氨酰胺酶的野生解朊金黄杆菌相比，枯草芽孢杆菌作为传统的工业生产菌，具有极强的蛋白质分泌能力，是蛋白质谷氨酰胺酶表达和分泌的良好系统。目前研究表明枯草芽孢杆菌的启动子与信号肽等表达元件的选择与优化对外源蛋白表达有重要影响。其中，信号肽最主要功能就是引导分泌蛋白或膜蛋白，在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确定位，可提高外源蛋白质的可溶性，避免因包涵体复性带来的产物纯化等困难。然而信号肽对蛋白的表达分泌往往具有特异性，同一种蛋白质在不同信号肽的作用下，表达分泌效率往往相差甚远，缺乏普适应的规律。
因此，获得高效、特异性的信号肽序列，改善蛋白质谷氨酰胺酶蛋白分泌途径，提高蛋白质谷氨酰胺酶表达效率，是很有难度的事情，但具有重要的应用价值。
发明内容
本发明提供一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，所述方法包括：以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示，编码所述蛋白质谷氨酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.1所示信号肽的核苷酸序列如SEQID NO.22所示。编码SEQ ID NO.2所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。编码SEQID NO.3所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。编码SEQ ID NO.4所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。编码SEQ ID NO.5所示信号肽的核苷酸序列如SEQ IDNO.26所示。编码SEQ ID NO.6所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。编码SEQ IDNO.7所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。编码SEQ ID NO.8所示信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。
在本发明的一种实施方式中，所述分泌表达是通过构建重组菌实现。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以细菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的出发菌株为枯草芽孢杆菌WB600。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，将SEQ ID NO.9所示基因编码的蛋白质谷氨酰胺酶基因N端融合核苷酸序列为SEQID NO.22～29所示的信号肽形成的重组基因进行表达。
本发明的第二个目的是提供一种重组菌，所述重组菌以含有SEQ ID NO.1～8任一所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，在编码蛋白质谷氨酰胺酶基因的N端融合SEQ ID NO.1～8任一所示的信号肽，得到重组基因，并将该重组基因与表达质粒pP43NMK连接所构成的重组质粒转化到大肠杆菌JM109中，抽提质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中。
在本发明的一种实施方式中，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示；编码蛋白质谷氨酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO.9所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组基因是采用基因合成和一步克隆法得到的含有改造信号肽和蛋白质谷氨酰胺酶基因序列的重组基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法如下：合成SEQID NO.22～29任一所示的信号肽，分别通过一步克隆的方法将每条信号肽的DNA片段与插入到目的载体的RBS之后，RBS序列如SEQ ID NO.21所示，得到重组质粒，转入E.coli JM109中，经质粒的抽提后导入宿主菌细胞中，得到重组枯草芽孢杆菌。
本发明另外提供了一种生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法，是使用上述的重组菌进行发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶。可选地，所述重组菌为重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌于37℃培养36h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述接种是按体积接种4％的种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液是将所述重组菌接种于LB培养基中，于37℃，220rpm培养8～12h，获得种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是先进行种子培养，再进行发酵；所述种子培养是将所构建好的重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中，现用现转。从平板上挑取枯草芽孢杆菌单菌落，接种至装液量为25mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，220r/min培养8～12h，所述摇瓶发酵是将培养10h的种子液以4％(V/V)的接种量接入含50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，装液量为25mL/250mL，37℃，220r/min培养36h。
本发明还要求保护所述重组菌在食品、生物领域的应用。
本发明还要求保护SEQ ID NO.5所述的信号肽(YfkN)在提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达效果或在蛋白质谷氨酰胺酶生产方面的应用。
有益效果：
在本发明中通过改造YfkN信号肽，实现了蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效的胞外表达，解决了蛋白质谷氨酰胺酶胞外分泌不足的问题。本发明通过改造信号肽，使蛋白质谷氨酰胺酶的分泌酶活由440U/L提高到910U/L，酶活提高2.67倍，应用本发明中的信号肽明显提高了蛋白质谷氨酰胺酶的胞外分泌，降低了工业上生产蛋白质谷氨酰胺酶的成本，同时也为枯草芽孢杆菌外源分泌蛋白表达量的提高奠定了基础。
附图说明
图1为构建重组质粒的流程图；
图2为电泳图；其中GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ为含有SecA启动子且分别含有GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ信号肽的重组质粒转化到枯草芽孢杆菌WB 600感受态得到的重组菌株；
图3为重组菌株发酵酶活。
具体实施方式
信号肽GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ的氨基酸序列依次如SEQID NO.1～8所示，编码上述信号肽的基因的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.22～29所示。
编码蛋白质谷氨酰胺酶的基因PG的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
LB/种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。发酵培养基(g/L)：酵母膏24、胰蛋白胨12、甘油10、K 2HPO 4 16.43、KH 2PO 4 2.32。
蛋白质谷氨酰胺酶的酶活测定方法：蛋白质谷氨酰胺酶能特异性地水解蛋白质中谷氨酰胺残基上的氨酰基，释放出游离的氨，氨在硝普钠的催化作用下，以次氯酸钠为氧化剂，与苯酚生成蓝绿色的靛酚蓝染料，对波长为630nm的光谱具有特异的吸收作用，通过测定OD 630即可反映PG酶的相对活力。
酶活定义：100μL酶液每分钟水解二肽Cbz-Gln-Gly释放1μmol氨为1个酶活力单位(U/ml)。方法：取1mL二肽Cbz-Cln-Gly溶液(称取0.337g二肽Cbz-Gln-Gly，溶于0.176mol/LPBS缓冲液(pH6.5)中，并定容至100mL)，滴加100μL待测样品(100μL无活性的酶液作为空白对照)，混匀后置于37℃恒温箱中孵育30min，滴加1mL 0.4mol/L三氯乙酸溶液，混匀并终止反应。取60μL反应液与240μL蒸馏水、300μL显色试剂A(称取2.023g苯酚和7.5mg亚硝基铁氰化钠，溶于双蒸水并定容至50mL)、150μL显色试剂B(称取2.5g KOH溶于双蒸水并定容至50mL)和300μL显色试剂C(称取10.2g无水K 2CO 3溶于双蒸水，滴加417μL NaClO溶液，加水定容至50mL)充分混匀，置于37℃恒温箱中孵育20min，冷却，测量体系在630nm处的光吸收值。
实施例1：出发菌株重组质粒的构建
将序列如SEQ ID NO.31所示的6×His组氨酸标签加入蛋白质谷氨酰胺酶(GenBank：AB046594.1)的C端，合成全长共981bp的核苷酸序列(由生工完成)，设计两对引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14经过一步PCR分别得到序列为SEQ ID NO.9的目的片段和SEQ ID NO.10的具有粘性末端的pP43NMK载体片段，用一步克隆法37℃连接30min，将连接产物通过化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化液涂在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上，转化子的测序由上海生工完成，测序无误后得到出发菌株的重组质粒。
实施例2：枯草芽孢杆菌感受态的制备
将出发菌株的重组质粒，柱回收后转化待用，转化枯草芽孢杆菌WB600，具体操作如下：
(1)从甘油管中挑取一环枯草芽孢杆菌WB600菌液，在LB平板上划线，37℃恒温过夜培养；
(2)从平板上挑取枯草芽孢杆菌WB600单菌落，接种至含有2mL SPI的14mL摇菌管中，37℃，220r/min培养过夜；
(3)取200μL步骤2过夜培养物接种至含有2mL SPII的14mL摇菌管中，37℃、220r/min培养1.5～2h；
(4)步骤3分装前10min加入20μL EGTA。
(5)将步骤3培养物分装500μL于1.5mL EP管中，即得到枯草芽孢杆菌WB600感受态。
实施例3：含有启动子SecA重组质粒的构建
设计引物，序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，以实施例1构建的重组质粒为模板进行一步PCR得到具有粘性末端的pP43NMK片段，同时设计引物SEQ ID NO.17和SEQID NO.18，从枯草芽孢杆菌基因组上一步PCR得到启动子SecA片段，将上述PCR得到的两个片段进行一步克隆，将连接产物通过化学法转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化液涂在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板上，转化子的测序由上海生工完成，测序无误最终将启动子P43更换成启动子SecA。
实施例4：含有不同信号肽重组枯草芽孢杆菌的构建
设计上下游引物，上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，下游序列如SEQ ID NO.20所示，以实施例3的重组质粒为模板进行PCR扩增，得到的片段序列如SEQ ID NO.30所示，作为后续一步克隆的载体片段；合成编码SEQ ID NO.1～8所示信号肽的基因并在每条信号肽上游加入如SEQ ID NO.32所示的同源片段gtaagagaggaatgtacac，下游加入如SEQ IDNO.33所示的同源片段GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATG，分别命名为GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ(核苷酸序列分别为SEQ ID NO.22～29所示)作为一步克隆的插入片段插入到目的载体RBS之后，RBS序列如SEQ ID NO.21所示，用一步克隆法连接后转化、测序得到信号肽改造后的重组质粒。将5～10μL重组质粒转入到实施例2制备的枯草芽孢杆菌WB600感受态中，37℃、220r/min培养2h后，8000rpm离心2min，弃去400μL上清后混匀，涂布到含有卡那霉素(50mg/L)的LB平板上，37℃恒温过夜培养得到转化子；挑取LB平板上转化子进行菌落PCR，通过核酸电泳得到大小正确的条带(图2)，说明得到重组枯草芽孢杆菌。
实施例5：构建重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵培养
将实施例4的信号肽GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB、YdeJ用到重组枯草芽孢杆菌中为生产菌株，同时实施例4构建的GlmU重组枯草芽孢杆菌为对照，挑取实施例4中的8种重组枯草芽孢杆菌单菌落，接种至装液量为25mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，220r/min培养8～12h，然后按照4％的接种量再次转接至装液量为25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，37℃，220r/min培养36h后测发酵液上清酶活。
结果如图3所示，重组枯草芽孢杆菌GlmU、LipA、YmzC、NprE、YfkN、SpoIIIJ、NprB和YdeJ的发酵酶活分别为440U/L、480U/L、20U/L、570U/L、910U/L、540U/L、2020U/L和3260U/L。其中菌株YfkN酶活达910U/L，与菌株GlmU(对照)相比，酶活提高2.67倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQ ID NO.1
MDRRDNGGQYMDKRFAVVLAAGQGTRMKSKLYKVLHP
SEQ ID NO.2
MKFVKRRIIALVTILMLSVTSLFALQPSAKA
SEQ ID NO.3
MFESEAELRRIRIALVWIAVFLLFGACG
SEQ ID NO.4
MGLGKKLSVAVAASFMSLSISLPGVQA
SEQ ID NO.5
MRIQKRRTHVENILRILLPPIMILSLILPTPPIHA
SEQ ID NO.6
MLLKRRIGLLLSMVGVFMLLAGCS
SEQ ID NO.7
MRNLTKTSLLLAGLCTAAQMVFVTHASA
SEQ ID NO.8
MKKRRKICYCNTALLLMILLAGCT
SEQ ID NO.9
ATGAAAAACCTTTTTCTGAGCATGATGGCGTTTGTTACAGTTCTGACCTTTAATAGCTGCGCTGATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATGGCAAAGAAAAACTTTCCGTTAATGATTCAAAACTGAAAGATTTTGGCAAAACGGTTCCGGTTGGCATTGATGAAGAAAATGGCATGATTAAAGTCTCTTTTATGCTGACAGCACAATTTTATGAGATTAAACCTACAAAAGAAAATGAACAATATATTGGTATGCTTAGACAAGCAGTTAAAAATGAATCACCGGTCCATATTTTTCTTAAACCGAATAGCAATGAAATTGGCAAAGTTGAATCAGCGAGCCCTGAAGATGTTAGATACTTTAAAACAATTCTCACGAAGGAAGTGAAAGGCCAGACGAATAAACTGGCCAGCGTCATTCCGGACGTGGCGACGCTGAATAGCCTTTTTAACCAAATCAAGAATCAAAGTTGTGGAACATCAACAGCATCAAGCCCGTGCATTACATTTAGATATCCGGTTGATGGCTGCTATGCGAGAGCACATAAAATGAGACAGATTCTTATGAATAATGGCTATGATTGCGAAAAACAATTTGTCTATGGCAATCTGAAAGCAAGCACAGGCACATGCTGCGTCGCATGGAGCTATCATGTGGCAATTCTGGTTTCATATAAAAATGCGTCAGGCGTAACAGAAAAACGCATTATTGATCCGTCATTATTTTCATCAGGCCCGGTGACAGATACGGCATGGAGAAATGCGTGCGTGAATACAAGCTGCGGCTCAGCAAGCGTTAGCAGCTATGCAAATACAGCGGGAAATGTTTATTATCGTTCACCGTCAAATAGCTATCTTTATGATAATAATCTGATTAATACAAATTGCGTTCTGACAAAATTTAGCCTTCTGAGCGGCTGTAGCCCGAGCCCGGCACCGGATGTTTCATCATGCGGCTTTcatcatcatcatcatcatTAA
SEQ ID NO.10
catcatcatTAAtgatgaaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattccttaaggaacgtacagacggcttaaaagcctttaaaaacgtttttaaggggtttgtagacaaggtaaaggataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatggcgcattaacggaataaagggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataagaaaaaggattaattatgagcgaattgaattaataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcgtgagaatgttacagtctatcccggcattgccagtcggggatattaaaaagagtataggtttttattgggataaagtaggtttcactttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaatgtgtaatgaggttcggattcatctatgggaggcaagtgatgaaggctggcgcctcgtagtaatgattcaccggtttgtacaggtgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgccgcattgaagtagagggaattgatgaattatatcaacatattaagcctttgggcattttgcaccccaatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccgacaacaatttgattagcttttttcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatctgttcagcaatcgggcgcgattgctgaataaaagatacgagagacctctcttgtatcttttttattttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattcttgctgagtctggctttcggtaagctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaaaggtggagattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgcgcctcgcagagcacacactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgccggaaagagcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgatttacatatgagttatgcagtttgtagaatgcaaaaagtgaaatcagctggactaaaaggcatgcaatttcataatcaaagagagcgaaaaagtagaacgaatgatgatattgaccatgagcgaacacgtgaaaattatgatttgaaaaatgataaaaatattgattacaacgaacgtgtcaaagaaattattgaatcacaaaaaacaggtacaagaaaaacgaggaaagatgctgttcttgtaaatgagttgctagtaacatctgaccgagatttttttgagcaactggatcctgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatttaataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgtaatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacacATGAAAAACCTTTTTC
SEQ ID NO.11
ATGAAAAACCTTTTTCTGAGCATGATGGCGTTTG
SEQ ID NO.12
TTAatgatgatgatgatgatgAAAGCCGCATGATG
SEQ ID NO.13
GAAAAAGGTTTTTCATgtgtacattcctctcttacctataatg
SEQ ID NO.14
catcatcatTAAtgatgaaagcttggcgtaatc
SEQ ID NO.15
GAGGTATACATGGACTAGgtaagagaggaatg
SEQ ID NO.16
CAAGCTCTCCTCggatccagttgctcaaaaaaatctcg
SEQ ID NO.17
GAGGAGAGCTTGGACATCGTC
SEQ ID NO.18
CTAGTCCATGTATACCTCTCATTATC
SEQ ID NO.19
GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATG
SEQ ID NO.20
Gtgtacattcctctcttac
SEQ ID NO.21
Gtaagagaggaatgtacac
SEQ ID NO.22
ATGGATAggAGGGATAATGGAGGCCAATACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTGTGTTAGCAGCTGGTCAAGGAACAAGAATGAAATCAAAGCTATATAAAGTTCTTCATCCT
SEQ ID NO.23
atgaaatttgtaaaaagaaggatcattgcacttgtaacaattttgatgctgtctgttacatcgctgtttgcgttgcagccgtcagcaaaagcc
SEQ ID NO.24
Atgtttgaaagtgaagcagaactgagacgaatcaggattgcacttgtatggatagctgtctttttactgttcggggcgtgcggg
SEQ ID NO.25
Atgggtttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgtttatgagtttatcaatcagcctgccaggtgttcaggct
SEQ ID NO.26
Atgagaatacagaaaagacgaacacacgtcgaaaacattctccgtattcttttgcccccaattatgatacttagcctaatcctcccaacaccacccattcatgca
SEQ ID NO.27
atgttgttgaaaaggagaatagggttgctattaagtatggttggcgtattcatgcttttggctggatgctcg
SEQ ID NO.28
Atgcgcaacttgaccaagacatctctattactggccggcttatgcacagcggcccaaatggtttttgtaacacatgcctcagct
SEQ ID NO.29
Atgaagaaacgcagaaagatatgttattgcaatactgccctgctgcttatgattttgcttgctggatgtacg
SEQ ID NO.30
GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATGGCAAAGAAAAACTTTCCGTTAATGATTCAAAACTGAAAGATTTTGGCAAAACGGTTCCGGTTGGCATTGATGAAGAAAATGGCATGATTAAAGTCTCTTTTATGCTGACAGCACAATTTTATGAGATTAAACCTACAAAAGAAAATGAACAATATATTGGTATGCTTAGACAAGCAGTTAAAAATGAATCACCGGTCCATATTTTTCTTAAACCGAATAGCAATGAAATTGGCAAAGTTGAATCAGCGAGCCCTGAAGATGTTAGATACTTTAAAACAATTCTCACGAAGGAAGTGAAAGGCCAGACGAATAAACTGGCCAGCGTCATTCCGGACGTGGCGACGCTGAATAGCCTTTTTAACCAAATCAAGAATCAAAGTTGTGGAACATCAACAGCATCAAGCCCGTGCATTACATTTAGATATCCGGTTGATGGCTGCTATGCGAGAGCACATAAAATGAGACAGATTCTTATGAATAATGGCTATGATTGCGAAAAACAATTTGTCTATGGCAATCTGAAAGCAAGCACAGGCACATGCTGCGTCGCATGGAGCTATCATGTGGCAATTCTGGTTTCATATAAAAATGCGTCAGGCGTAACAGAAAAACGCATTATTGATCCGTCATTATTTTCATCAGGCCCGGTGACAGATACGGCATGGAGAAATGCGTGCGTGAATACAAGCTGCGGCTCAGCAAGCGTTAGCAGCTATGCAAATACAGCGGGAAATGTTTATTATCGTTCACCGTCAAATAGCTATCTTTATGATAATAATCTGATTAATACAAATTGCGTTCTGACAAAATTTAGCCTTCTGAGCGGCTGTAGCCCGAGCCCGGCACCGGATGTTTCATCATGCGGCTTTcatcatcatcatcatcatTAAtgatgaaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattccttaaggaacgtacagacggcttaaaagcctttaaaaacgtttttaaggggtttgtagacaaggtaaaggataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatggcgcattaacggaataaagggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataagaaaaaggattaattatgagcgaattgaattaataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcgtgagaatgttacagtctatcccggcattgccagtcggggatattaaaaagagtataggtttttattgggataaagtaggtttcactttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaatgtgtaatgaggttcggattcatctatgggaggcaagtgatgaaggctggcgcctcgtagtaatgattcaccggtttgtacaggtgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgccgcattgaagtagagggaattgatgaattatatcaacatattaagcctttgggcattttgcaccccaatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccgacaacaatttgattagcttttttcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatctgttcagcaatcgggcgcgattgctgaataaaagatacgagagacctctcttgtatcttttttattttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattcttgctgagtctggctttcggtaagctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaaaggtggagattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgcgcctcgcagagcacacactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgccggaaagagcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgatttacatatgagttatgcagtttgtagaatgcaaaaagtgaaatcagctggactaaaaggcatgcaatttcataatcaaagagagcgaaaaagtagaacgaatgatgatattgaccatgagcgaacacgtgaaaattatgatttgaaaaatgataaaaatattgattacaacgaacgtgtcaaagaaattattgaatcacaaaaaacaggtacaagaaaaacgaggaaagatgctgttcttgtaaatgagttgctagtaacatctgaccgagatttttttgagcaactggatccGAGGAGAGCTTGGACATCGTCCGTCAGAAACGCTTTAATTTAAAGCCGATGGATAGTGAAGAAGCGATCTTGCAAATGAATATGCTCGGCCATAATTTCTTTGTTTTCACAAATGCGGAAACAAACCTTACAAATGTCGTGTACCGCAGAAATGACGGGAAATATGGCTTAATTGAACCGACTGAATAATGAAGAGAAGCCTTCCGTGATGTCCGCGGAAGGTTTTTGTTTTTCTTATTTGCAAATTCTTTGGAAATAACAAAAGGTATGATATGATAATGAGAGGTATACATGGACTAGgtaagagaggaatgtacac
SEQ ID NO.31
catcatcatcatcatcat
SEQ ID NO.32
Gtaagagaggaatgtacac
SEQ ID NO.33
GATTCAAATGGCAATCAAGAAATTAATG

Claims (10)

1.一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括：以含有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白质谷氨酰胺酶的氨基酸序列如GenBank登录号：AB046594.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分泌表达是通过构建重组菌实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组菌是以细菌为宿主。
5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌以含有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的信号肽引导蛋白质谷氨酰胺酶的分泌表达。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法是：在编码蛋白质谷氨酰胺酶基因的N端融合SEQ ID NO.5所示的信号肽，得到重组基因，并将该重组基因与表达质粒pP43NMK连接所构成的重组质粒转化到大肠杆菌JM109中，抽提质粒转化到枯草芽孢杆菌WB600中。
7.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以枯草芽孢杆菌WB600为出发菌株，将SEQ ID NO.9所示基因编码的蛋白质谷氨酰胺酶基因N端融合核苷酸序列为SEQID NO.26所示的信号肽形成的重组基因进行表达。
8.一种生产蛋白质谷氨酰胺酶的方法，其特征在于，是使用权利要求5-7任一所述的重组菌进行发酵生产蛋白质谷氨酰胺酶。
9.权利要求5-7任一所述的重组菌在食品、生物领域的应用。
10.SEQ ID NO.5所示的信号肽在提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达效果或在蛋白质谷氨酰胺酶生产方面的应用。
CN202211377122.3A 2021-02-01 2021-02-01 一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法 Pending CN116042590A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211377122.3A CN116042590A (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110132935.5A CN112680434B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法
CN202211377122.3A CN116042590A (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110132935.5A Division CN112680434B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116042590A true CN116042590A (zh) 2023-05-02

Family

ID=75459558

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211377122.3A Pending CN116042590A (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法
CN202211377085.6A Pending CN116042589A (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种利用NprB信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法
CN202110132935.5A Active CN112680434B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211377085.6A Pending CN116042589A (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种利用NprB信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法
CN202110132935.5A Active CN112680434B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (3) CN116042590A (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111018957A (zh) * 2019-12-03 2020-04-17 天津科技大学 一种介导PGase分泌表达的信号肽及其应用
CN113151135A (zh) * 2021-05-17 2021-07-23 江南大学 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用
CN113528495A (zh) * 2021-07-05 2021-10-22 江南大学 一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN114634966A (zh) * 2022-02-08 2022-06-17 武汉新华扬生物股份有限公司 一种蛋白质谷氨酰酶的酶活力检测方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3044320T (pt) * 2013-09-11 2020-04-13 Impossible Foods Inc Secreção de polipéptidos contendo heme
CN111018957A (zh) * 2019-12-03 2020-04-17 天津科技大学 一种介导PGase分泌表达的信号肽及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112680434A (zh) 2021-04-20
CN116042589A (zh) 2023-05-02
CN112680434B (zh) 2022-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116042590A (zh) 一种利用YfkN信号肽提高蛋白质谷氨酰胺酶分泌表达的方法
CN110607319B (zh) 一种适用于枯草芽孢杆菌分泌表达蛋白的表达载体及应用
CN103443278A (zh) 生产分泌型多肽的方法
KR20000011587A (ko) 사람성장호르몬의분비생산방법
CN112553134A (zh) 一种在枯草芽孢杆菌中表达α-淀粉酶的方法
CN112301012B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法
Deng et al. Improved inducible expression of Bacillus naganoensis pullulanase from recombinant Bacillus subtilis by enhancer regulation
CN112522173A (zh) 一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法
CN111670244A (zh) 突变的和遗传修饰的芽孢杆菌属细胞及其用于增加蛋白质产生的方法
CN117625581A (zh) 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用
CN108410845B (zh) 一种催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体及其制备方法
DK2340306T3 (en) EXPRESSION-AMPLIFIED NUCLEIC ACIDS
CN107541482B (zh) 一种构建大肠杆菌高效分泌表达转肽酶Sortase A的方法
CN109852650B (zh) 一种由茶碱调控的人工适体酶及应用
CN111850008A (zh) 促进蛋白胞外表达的信号肽
CN114058606B (zh) 缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用
CN112226422B (zh) 一种活性提高的EstWY酶突变体
CN111172143B (zh) D-木糖酸脱水酶及其应用
CN117143251A (zh) 一种提高芽孢杆菌表达外源蛋白水平的方法
CN112210544B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用
CN115851693B (zh) 葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用
CN114606172B (zh) 一种提高血红素产量的解淀粉芽胞杆菌工程菌及其构建方法
CN113957025B (zh) 一种过表达bshCBA基因的地衣芽孢杆菌及其应用
CN114657111B (zh) 顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示体系及构建和应用
CN116574157A (zh) 一种α-淀粉酶的嵌合信号肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination