CN108410845B

CN108410845B - 一种催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体及其制备方法

Info

Publication number: CN108410845B
Application number: CN201810311758.5A
Authority: CN
Inventors: 许菲; 杨海泉; 陈媛; 卢潇; 王浩坤; 王拂祥; 代瑶
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2018-04-09
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2038-04-09
Also published as: CN108410845A

Abstract

本发明公开了一种催化效率提高的D,D‑羧肽酶DacA突变体及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明公开了由大肠杆菌(Escherichia coli)BL21来源的D,D‑羧肽酶DacA为母本，基于酶结构解析确定关键位点及突变方式，经分子生物学技术进行定点突变而获得催化效率提高的DacA突变体。在此改造条件下，E.coli D,D‑羧肽酶DacA的突变体K113G催化效率常数k_cat值提高最多，由6543.4s^‑1提高至9428.1s^‑1。利用此策略可以显著提高D,D‑羧肽酶DacA的催化效率，为其在代谢改造E.coli提高其胞外分泌水平等方面的应用提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。

Description

一种催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体及其制备方法，属于酶工程领域。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)是最广泛使用的用于重组蛋白质生产的细菌种类之一，它具有诸多优点(如翻译后修饰-二硫键形成等)。但在大肠杆菌中，大多数蛋白质被转运到细胞的周质空间而不能直接到达胞外，这容易带来诸多问题(如蛋白质生产不连续等)。肽聚糖作为细胞壁的主要成分，有助于维持细胞结构的鲁棒性。通过破坏细胞周围的肽聚糖结构可增强大分子的细胞外生产水平。D,D-羧肽酶DacA可从肽聚糖侧链切除末端D-丙氨酸残基，其对于合成肽聚糖网络及维持其结构稳定具有重要作用。

具有高催化效率的D,D-羧肽酶DacA可高效调控肽聚糖网络合成，可应用于代谢改造E.coli提高其蛋白胞外分泌水平等方面。定点突变和定向进化是提高酶催化效率的两种主要手段。定向进化虽然不需要准确的酶分子结构信息，但是需要建立一种能够从大量的突变株中快速简便的筛选到优势菌株的方法。而定点突变，与定向进化相比，是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶催化效率的方法。

发明内容

本发明基于已得到的D,D-羧肽酶DacA在E.coli中的表达平台，利用定点突变技术，对D,D-羧肽酶DacA进行分子改造，以得到更适合代谢改造E.coli提高其蛋白胞外分泌水平等方面应用的催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体。

本发明提供了一种催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体，是通过定点突变方法在D,D-羧肽酶DacA酶催化结构域内(口袋区域)进行氨基酸替换，获得了催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体。

所述D,D-羧肽酶DacA突变体是以SEQ ID NO.1为出发序列，在第113位氨基酸位置处做如下替换：赖氨酸替换成精氨酸、甘氨酸或组氨酸。

本发明还提供一种制备所述催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体的方法，具体步骤如下：

1)将编码大肠杆菌D,D-羧肽酶DacA的基因(SEQ ID NO.2)，通过PCR方法克隆到质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒pET28a-dacA(图1)；

2)设计突变引物，对D,D-羧肽酶DacA基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有编码突变D,D-羧肽酶DacA的基因序列的重组载体；

3)将突变后重组载体转化E.coli BL21，诱导表达，获得D,D-羧肽酶DacA突变体。

本发明提供的D,D-羧肽酶酶突变体催化效率显著提高，由原始菌株的6543.4s^-1提高至9428.1s^-1。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。所得D,D-羧肽酶DacA突变体可用于催化Park核苷酸生成D-丙氨酸、代谢改造微生物以提高其胞外蛋白分泌表达水平。

附图说明

图1：重组质粒pET28a-dacA的图谱。

图2：D,D-羧肽酶DacA的三级(3D)结构示意图。

图3：D,D-羧肽酶DacA及其突变体的比酶活力。

具体实施方式

实施例1：D,D-羧肽酶DacA催化效率定点突变分析与方法

通过Swiss-model软件对源自大肠杆菌(Escherichia coli)的D,D-羧肽酶DacA(SEQ ID NO.1)进行模拟，以获得的D,D-羧肽酶DacA 3D结构模型。选取位于“活性口袋”的关键氨基酸残基——赖氨酸，将其替换成精氨酸、甘氨酸或组氨酸。

根据E.coli D,D-羧肽酶DacA序列，以E.coli BL21基因组为模板采用PCR方法克隆到质粒pET-28a(+)的酶切位点XhoⅠ、EcoRⅠ之间，构建重组质粒pET28a-dacA。

针对定点突变方式，设计相对应的定点突变引物(表1)。利用定点突变引物及重组质粒pET28a-dacA，对D,D-羧肽酶DacA进行定点突变。采用PCR酶，利用突变引物对重组质粒pET28a-dacA进行扩增。将扩增后片段利用胶回收试剂盒进行回收纯化。将获得的纯化后片段，采用磷酸化试剂盒对片段两端进行磷酸化。将磷酸化后的片段，利用连接酶进行连接，获得单点突变后的重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，在LB培养基中37℃培养8h，然后按1％(v/v)的接种量接种到TB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8，加入终浓度为1mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃诱导表达，进行蛋白纯化后获得单点突变后的重组D,D-羧肽酶DacA。

表1D,D-羧肽酶DacA突变引物序列

实施例2：D,D-羧肽酶DacA酶活力测定及分析方法

(1)D-丙氨酸标准曲线的制作：配制0-60mM不同浓度的D-丙氨酸溶液。加5μL邻联茴香胺溶液，70μL酶和辅酶(39:19:10:2)的混合物，37℃反应5min。立即加入400μL甲醇/水(1:1)混合物，37℃反应2min，测定460nm下的吸光光度值。以D-丙氨酸的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。

(2)反应体系包括：15μL底物Park核苷酸类似物(Na,Ne-Diacetyl-Lys-D-Ala-D-Ala)、3μL Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和12μL酶溶液。混匀，37℃反应10min。加5μL邻联茴香胺，70μL酶和辅酶的混合物，37℃反应5min。立即加入400μL甲醇/水混合物，37℃反应2min，测定460nm下的吸光光度值。

(3)D,D-羧肽酶DacA的催化效率测定

配制不同浓度的底物，采用(2)的方法，测定D,D-羧肽酶酶活。绘制酶活与底物浓度的线性关系，根据的斜率和截距得到该酶的催化效率k_cat值。

(4)酶活力单位定义：在pH 7.5，37℃条件下，1min催化底物产生1μmol D-丙氨酸所需的酶量，为1个酶活力单位(U)。

实施例3：D,D-羧肽酶DacA及其突变体催化效率的测定分析

通过对D,D-羧肽酶DacA及其突变体的催化效率进行测定发现，突变体K113R和K113G的催化效率(表2)均有提高，但突变体K113H的催化效率有所下降。突变体K113R和K113G的催化效率常数k_cat值分别由野生酶的6543.42s^-1提高至8541.56s^-1、9428.13s^-1。其中突变体K113G的效果最显著，催化效率常数k_cat值提高至原来的1.4倍。同时，突变体K113G的K_m值由野生酶的0.85mmol/L降低为0.66mmol/L，说明突变后酶与底物的结合能力增强。

表2 D,D-羧肽酶DacA突变体的动力学参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体及其制备方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 1

Met Asn Thr Ile Phe Ser Ala Arg Ile Met Lys Arg Leu Ala Leu Thr

1 5 10 15

Thr Ala Leu Cys Thr Ala Phe Ile Ser Ala Ala His Ala Asp Asp Leu

20 25 30

Asn Ile Lys Thr Met Ile Pro Gly Val Pro Gln Ile Asp Ala Glu Ser

35 40 45

Tyr Ile Leu Ile Asp Tyr Asn Ser Gly Lys Val Leu Ala Glu Gln Asn

50 55 60

Ala Asp Val Arg Arg Asp Pro Ala Ser Leu Thr Lys Met Met Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Val Ile Gly Gln Ala Met Lys Ala Gly Lys Phe Lys Glu Thr Asp

85 90 95

Leu Val Thr Ile Gly Asn Asp Ala Trp Ala Thr Gly Asn Pro Val Phe

100 105 110

Lys Gly Ser Ser Leu Met Phe Leu Lys Pro Gly Met Gln Val Pro Val

115 120 125

Ser Gln Leu Ile Arg Gly Ile Asn Leu Gln Ser Gly Asn Asp Ala Cys

130 135 140

Val Ala Met Ala Asp Phe Ala Ala Gly Ser Gln Asp Ala Phe Val Gly

145 150 155 160

Leu Met Asn Ser Tyr Val Asn Ala Leu Gly Leu Lys Asn Thr His Phe

165 170 175

Gln Thr Val His Gly Leu Asp Ala Asp Gly Gln Tyr Ser Ser Ala Arg

180 185 190

Asp Met Ala Leu Ile Gly Gln Ala Leu Ile Arg Asp Val Pro Asn Glu

195 200 205

Tyr Ser Ile Tyr Lys Glu Lys Glu Phe Thr Phe Asn Gly Ile Arg Gln

210 215 220

Leu Asn Arg Asn Gly Leu Leu Trp Asp Asn Ser Leu Asn Val Asp Gly

225 230 235 240

Ile Lys Thr Gly His Thr Asp Lys Ala Gly Tyr Asn Leu Val Ala Ser

245 250 255

Ala Thr Glu Gly Gln Met Arg Leu Ile Ser Ala Val Met Gly Gly Arg

260 265 270

Thr Phe Lys Gly Arg Glu Ala Glu Ser Lys Lys Leu Leu Thr Trp Gly

275 280 285

Phe Arg Phe Phe Glu Thr Val Asn Pro Leu Lys Val Gly Lys Glu Phe

290 295 300

Ala Ser Glu Pro Val Trp Phe Gly Asp Ser Asp Arg Ala Ser Leu Gly

305 310 315 320

Val Asp Lys Asp Val Tyr Leu Thr Ile Pro Arg Gly Arg Met Lys Asp

325 330 335

Leu Lys Ala Ser Tyr Val Leu Asn Ser Ser Glu Leu His Ala Pro Leu

340 345 350

Gln Lys Asn Gln Val Val Gly Thr Ile Asn Phe Gln Leu Asp Gly Lys

355 360 365

Thr Ile Glu Gln Arg Pro Leu Val Val Leu Gln Glu Ile Pro Glu Gly

370 375 380

Asn Phe Phe Gly Lys Ile Ile Asp Tyr Ile Lys Leu Met Phe His His

385 390 395 400

Trp Phe Gly

<210> 2

<211> 1212

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 2

atgaatacca ttttttccgc tcgtatcatg aagcgcctgg cgctcaccac ggctctttgc 60

acagccttta tctctgctgc acatgccgat gacctgaata tcaaaactat gatcccgggt 120

gtaccgcaga tcgatgcgga gtcctacatc ctgattgact ataactccgg caaagtgctc 180

gccgaacaga acgcagatgt ccgccgcgat cctgccagcc tgaccaaaat gatgaccagt 240

tacgttatcg gccaggcaat gaaagccggt aaatttaaag aaactgattt agtcactatc 300

ggcaacgacg catgggccac cggtaacccg gtgtttaaag gttcttcgct gatgttcctc 360

aaaccgggca tgcaggttcc ggtttctcag ctgatccgcg gtattaacct gcaatcgggt 420

aacgatgctt gtgtcgccat ggctgatttt gccgctggta gccaggacgc ttttgttggc 480

ttgatgaaca gctacgttaa cgccctgggc ctgaaaaaca cccacttcca gacggtacat 540

ggtctggatg ctgatggtca gtacagctcc gcgcgcgata tggcgctgat cggccaggcg 600

ttgatccgtg acgtaccgaa tgaatactcg atctataaag aaaaagaatt tacgtttaac 660

ggtattcgcc agctgaaccg taacggcctg ttatgggata acagcctgaa tgtcgacggc 720

atcaaaaccg gacacactga caaagcaggt tacaaccttg ttgcttctgc gactgaaggc 780

cagatgcgct tgatctctgc ggtgatgggc ggacgtactt ttaaaggccg tgaagccgaa 840

agtaaaaaac tgctgacctg gggcttccgt ttcttcgaaa ccgttaaccc actgaaagta 900

ggtaaagagt tcgcctctga accggtttgg tttggtgatt ctgatcgcgc ttcgttaggg 960

gttgataaag acgtgtacct gaccattccg cgtggccgca tgaaagatct gaaagccagc 1020

tatgtgctga acagcagtga attgcatgcg ccgctgcaaa agaatcaggt cgtcggtact 1080

atcaacttcc agcttgatgg caaaacgatc gaacaacgcc cgttggttgt actgcaagaa 1140

atcccggaag gtaacttctt cggcaaaatc attgattaca ttaaattaat gttccatcac 1200

tggtttggtt aa 1212

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaattccat atgatgaata ccattttttc cgctc 35

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt taaccaaacc agtgatggaa ca 32

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgtttcgt ggttcttcgc t 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggttaccgg tggcccat 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtgtttggc ggttcttcg 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggttaccgg tggcccat 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccggtgtttc atggttcttc g 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttaccggtg gcccatgc 18

Claims

1.一种D,D-羧肽酶DacA突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为出发序列，将第113位赖氨酸残基替换为精氨酸或甘氨酸。

2.编码权利要求1所述D,D-羧肽酶DacA突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.携带权利要求2所述基因或表达权利要求1所述D,D-羧肽酶DacA突变体的基因工程菌或转基因细胞系。

5.制备权利要求1所述D,D-羧肽酶突变体的方法，其特征在于，以大肠杆菌(Escherichia coli)为表达宿主，通过定点突变在D,D-羧肽酶DacA催化结构域内关键氨基酸进行氨基酸替换，获得了催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)根据SEQ ID NO.2所示的E.coli D,D-羧肽酶的基因序列，以E.coli BL21基因组为模板采用PCR方法将编码D,D-羧肽酶的基因克隆到质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒pET28a-dacA；

2)设计突变引物，对编码D,D-羧肽酶DacA的基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有编码突变D,D-羧肽酶DacA的基因序列的重组载体；

5)将突变后重组载体转化E.coli BL21，诱导表达，获得D,D-羧肽酶DacA突变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达是：将重组E.coli BL21在LB培养基中37℃培养8h，然后按1％(v/v)的接种量接种到TB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8，加入终浓度为1mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，25℃诱导表达。

8.权利要求1所述D,D-羧肽酶DacA突变体在催化Na,Ne-Diacetyl-Lys-D-Ala-D-Ala生成D-丙氨酸中的应用。