CN111540404B

CN111540404B - 一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法

Info

Publication number: CN111540404B
Application number: CN202010300809.1A
Authority: CN
Inventors: 李晓琳; 韩艳芳; 张鲁嘉; 张增辉; 丛亚龙; 马明哲; 方波欢
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-04-16
Also published as: CN111540404A

Abstract

本发明改造脯氨酰内肽酶以提升其催化效率的理性设计方法主要是通过同源建模获得嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophiles)脯氨酰内肽酶，分子对接获得酶‑底物复合物结构，MD模拟使结构稳定，对底物附近的酶残基进行虚拟饱和突变，约束性MD模拟使酶处于完美催化的“近进攻态”构象，利用MM/GBSA方法计算结合自由能从而虚拟筛选出潜在催化效率提升的突变体酶。通过大肠杆菌表达系统进行酶的表达，镍柱纯化，使用HPLC测定重组酶对于九肽底物的酶活及动力学参数。结果表明，本发明分子改造设计方法可以快速有效提升脯氨酰内肽酶的催化活性，说明本发明的酶改造方法可靠。

Description

一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种根据脯氨酰内肽酶的催化机制，利用一系列计算机理性计算开发一种基于催化完美构象的理性设计方法，从而定向改造提升酶的催化效率。

背景技术

蛋白质是主要营养物质之一，也是食品中的重要成分，其代谢产物在人体中具有许多必不可少的生理活性。目前，通常将外源性蛋白酶添加到蛋白质中以获得各种类型的生物活性肽，在深入了解营养、健康机制以及精确、高质量的加工技术前提下，向功能食品中添加蛋白酶的方法已得到广泛研究。但是，酶在工业生产中的应用仍然存在一些局限性，主要问题之一是蛋白酶的特异性不高，尚不能足够有效利用蛋白质原料。因此，脯氨酰内肽酶(PEPs)因为其具有对底物脯氨酸羧基端的肽键裂解具有很高的特异性而富有价值。到目前为止，已发现许多活性肽具有在C末端是脯氨酸的特征。此外，乳糜泻病患者通常不耐受具有免疫毒性的富含脯氨酸的肽，而消化道蛋白酶(胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)通常不偏好水解P1位是脯氨酸的肽。因此，脯氨酰内肽酶又可以弥补消化道蛋白酶水解的缺陷，从而最大化蛋白质食品的价值。综上，选取酶学性质优良的脯氨酰内肽酶，并在此基础上对其进行进一步理性设计改造，从而提高其催化效率，对于食品加工及医学治疗都是具有重大意义的。

脯氨酰内肽酶属于丝氨酸蛋白酶的一种，分子量大多在65-85kDa之间。脯氨酰内肽酶的结构在1998年第一次被解析出来，随后粘球菌Myxococcus xanthus(MX)和氯酚鞘氨醇单胞菌Sphingomonas capsulata(SC)两种细菌来源的脯氨酰内肽酶结构也被解析出来，其整个结构呈圆柱形，它们由两个主要结构域组成，分别为α/β水解酶折叠的催化结构域和螺旋桨结构域。催化结构域中含有包括由色氨酸、组氨酸、天冬氨酸三个氨基酸组成的催化三联体Ser-His-Asp，且催化三联体位于两个结构域界面处的大空腔中。脯氨酰内肽酶的催化机理与其他丝氨酸蛋白酶基本相同，与底物发生催化作用的主要是结合口袋中的催化三联体Ser-His-Asp，催化三联体的排布使丝氨酸处于特别活泼的状态，组氨酸可以起到碱催化色氨酸的作用，而天冬氨酸起到维持组氨酸空间构象的作用。其中脯氨酰内肽酶催化残基色氨酸上的氧原子亲核进攻底物脯氨酸上的碳原子，这一步骤是催化的重要一步。

针对蛋白质尤其是对酶的改造设计的一系列蛋白质工程学领域引起了科学家们的关注，计算机理性设计方法因为其效率高，实验筛选工作量小，可以快速获得更优突变体，而受到广泛应用。目前对于酶的计算设计主要从改造酶结合口袋的大小及其微环境(极性和电荷)出发，很少从催化机理入手。目前对于脯氨酰内肽酶的改造研究较少，且大多脯氨酰内肽酶由于催化效率、温度和pH稳定性差等因素而不适用于食品工业加工。

本发明开发了一种基于催化完美构象的脯氨酰内肽酶的分子改造理性设计方法，根据脯氨酰内肽酶的催化机制，使用催化位点Ser的O原子与底物Pro的C原子之间的距离作为标准，基于“近进攻态”构象原理，利用同源建模、分子对接、分子动力学模拟、MM/GBSA等方法虚拟筛选获得潜在催化活性提高的突变体。通过实验验证筛选突变体的酶活及动力学参数，最终获得具有更高催化活性的突变脯氨酰内肽酶。这将在食品加工和医学治疗等方面具有极其重要的价值。

发明内容

本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一个快速改造提升脯氨酰内肽酶的催化效率的理性设计方法。主要从计算机理论计算快速虚拟筛选突变体，然后使用实验验证酶催化结果两方面进行。选取具有高温活性、稳定性，广泛pH稳定性和高脯氨酸特异性的嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophiles)来源脯氨酰内肽酶进行一系列理性计算，筛选出潜在催化效率提升的突变体；利用大肠杆菌表达系统进行异源表达，利用纯化后的重组脯氨酰内肽酶测定酶学参数及酶促反应动力学参数。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供了一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，包括以下步骤：

1)整理并比较不同物种的脯氨酰内肽酶的酶学性质，选择嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophiles)来源的脯氨酰内肽酶作为改造对象；

查找蛋白质数据库(PDB)中已解析脯氨酰内肽酶晶体结构的氨基酸序列，使用NCBI数据库的BLAST(局部序列排比检索基本工具)对上述脯氨酰内肽酶的氨基酸序列进行序列比对，选择与嗜热球杆菌脯氨酰内肽酶同源性最高的黄色粘球菌(Myxococcusxanthus)脯氨酰内肽酶作为模版，进行同源建模，获得同源建模结构；

使用AMBER18软件进一步对上述同源建模结构进行20ns MD模拟，取模拟过程中势能最低的结构，作为稳定的脯氨酰内肽酶结构；

2)将步骤1)得到的脯氨酰内肽酶的最低势能结构和九肽底物通过

的Glide模块对接以生成酶-底物复合物，并对其对接结构进行20ns MD模拟，将模拟过程中势能最低的酶-底物复合物对接结构，作为稳定的酶-底物复合物的对接结构；其中，所述九肽底物的氨基酸序列为：SEKTTMPLW。

3)对步骤2)中获得的稳定的酶-底物复合物的对接结构，通过AMBER18的leap模块对底物序列中P(Pro，脯氨酸)周围

范围内的脯氨酰内肽酶的残基进行虚拟饱和突变，产生了若干个虚拟单点突变体，对于上述所有虚拟单点突变体进行虚拟筛选，选取具有较强结合自由能的虚拟单点突变体；

4)对步骤3)中筛选出的虚拟单点突变体，进行重组表达并纯化获得改造的脯氨酰内肽酶，采用所述九肽底物对改造的脯氨酰内肽酶进行酶催化效率的测定，挑选得到酶催化效率最高的突变体。

上述提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其中，步骤3)中所述虚拟筛选包括以下步骤：

对所有突变体进行约束动力学模拟以优化其结构，即使底物序列中Pro的C原子和所述脯氨酰内肽酶序列中Ser537的O原子之间的距离保持在在

谐波力常数为

用来表征“近进攻态”构象，再使用MM/GBSA方法计算所有结构优化后的虚拟单点突变体的酶与底物的结合自由能，将结合自由能从低到高排序，尽量选择不同的原始残基并选择结合自由能较低的至少前8个突变体，留待下一步实验验证。

上述提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其中，步骤4)中所述酶催化效率的测定包括酶活的测定和酶促反应动力学参数的测定。

本发明基于脯氨酰内肽酶的催化机制，选取酶学性质优良的嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophiles)来源的脯氨酰内肽酶，从“近进攻态”完美构象原理出发，开发了一个新型计算机理性设计策略，经过同源建模、分子对接、分子动力学模拟、MM/GBSA计算结合能等一系列理论计算虚拟筛选出潜在催化效率提升的突变体；测定酶对九肽底物SEKTTMPLW的酶活与动力学参数。验证结果显示该理性设计方法可以快速有效提升脯氨酰内肽酶的催化活性。

附图说明

图1：不同物种的脯氨酰内肽酶序列同源性比较图；

图2：Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶同源结构模型；

图3：Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶结构模型的拉式图；

图4：Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶建模结构与Myxococcusxanthus脯氨酰内肽酶晶体结构的结构叠合比对；

图5：MD模拟过程中脯氨酰内肽酶的势能和RMSD值；

图6：脯氨酰内肽酶与SEKTTMPLW的对接结果；

图7：MD过程中脯氨酰内肽酶和底物的势能和RMSD值；

图8：Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶目的基因PCR鉴定图；

图9：Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶的表达纯化图；1、上清液，2、穿出液，3、30mM咪唑洗脱液，4、100mM咪唑洗脱液，5、250mM咪唑洗脱液；框出的是目的蛋白；

图10：脯氨酰内肽酶野生型与突变体纯化后的SDS-PAGE蛋白胶图；

图11：HPLC测定标准品与酶切底物峰图；

图12：脯氨酰内肽酶野生型和突变体的相对酶活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。下述实施例中所述试剂原料除非注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作。

实施例1：Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶的同源建模与分子对接

1、整理并比较不同物种的脯氨酰内肽酶的酶学性质，选择嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophiles)来源的脯氨酰内肽酶作为改造对象，该脯氨酰内肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、查找蛋白质数据库(PDB数据库)中已解析脯氨酰内肽酶晶体结构的氨基酸序列，使用NCBI数据库的BLAST(局部序列排比检索基本工具)对这些脯氨酰内肽酶的氨基酸序列进行序列比对，结果如图1所示。

3、选择与Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶相似度高的Myxococcusxanthus脯氨酰内肽酶(43.84％序列同一性)的X射线晶体结构(PDB ID：2BKL)作为模板，使用Modeller 9.18软件对Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶的同源结构进行建模，建模结果如图2所示，使用拉式图判断建模合理性，结果如图3所示。使用VMD软件将同源建模所得虚拟结构与模版结构进行蛋白叠合比对，结果如图4所示。使用AMBER18软件进一步对同源建模结构进行20ns MD模拟以获得稳定结果，取模拟过程中势能最低的结构，作为稳定的脯氨酰内肽酶结构，模拟过程中的脯氨酰内肽酶的势能和RMSD值如图5所示。MD模拟的步骤如下：

采用leap模块完成缺失原子的补全，ff14SB力场进行蛋白质模拟获得必要的参数，体系被放置在充满TIP3P水分子的水盒子里，设置

的缓冲距离，添加抗衡离子以维持体系的电中性。接下来，分别使用最速下降法和共轭梯度法分两步进行能量最小化。第一步，通过以

的力常数保持脯氨酰内肽酶来优化溶剂水分子；第二步，脯氨酰内肽酶和溶剂水分子将在没有任何限制的条件下全部能量最小化。然后整个系统在

弱约束下从0K加热到300K，持续300ps，应用SHAKE算法来约束所有涉及氢原子的化学键，非键相互作用的截止距离设置为

最后，在NPT集合中进行20ns的MD模拟。Langevin动力学用于维持温度，Berendsen恒压器用于将压力控制在1.0atm。

4、脯氨酰内肽酶的最低势能结构和九肽底物通过

的Glide模式对接以生成酶-底物复合物，如图6所示。在对接过程中，在Protein Preparation Wizard中制备蛋白质，在OPLS2005力场中优化了氢键网络，以减轻潜在的空间冲突，通过LigPrep panel制备九肽底物，低能量3D结构是通过互变异构体、立体异构体和环构象产生的。为了预测结合模式，将蛋白质中的催化三联体定义为网格框的中心，使用在RRD(受体刚性对接)协议中具有默认参数的超精度(XP)模式进行对接。随后，为获得稳定的复合物结构，对酶-底物复合物对接结构再次进行20ns的MD模拟，具体步骤与上述相同，将模拟过程中势能最低的酶-底物复合物对接结构，作为稳定的酶-底物复合物的对接结构，模拟过程中的脯氨酰内肽酶的势能和RMSD值如图7所示。

实施例2：脯氨酰内肽酶底物周围残基的虚拟饱和突变

基于实施例1中获得的稳定的酶-底物复合物结构，对底物周围进行饱和突变。通过AMBER18的leap模块对底物序列中P(Pro，脯氨酸)周围

范围内的脯氨酰内肽酶的25个残基进行虚拟饱和突变，产生了575个虚拟单点突变体，对于上述所有虚拟单点突变体进行虚拟筛选，选取具有较强结合自由能的9个虚拟单点突变体。虚拟筛选的步骤如下：

谐波力常数为

再使用MM/GBSA方法计算所有结构优化后的虚拟单点突变体的酶与底物的结合自由能，将结合自由能从低到高排序，尽量选择不同的原始残基并选择结合自由能较低的前九个突变体，留待下一步实验验证。

其中，Ser537的O和Pro的C之间的距离被限制在

谐波力常数为

被用来表征“近进攻态”构象。

MM/GBSA方法的具体计算公式如下所示：

ΔG_bind＝ΔG_gas+ΔG_solv

ΔG_gas表示气相自由能；ΔG_solv表示溶剂化自由能。其中，ΔG_gas由静电相互作用和范德华力(vdW)相互作用组成，如下所示：

ΔG_gas＝ΔE_ele+ΔE_vdW

ΔG_solv包含极性和非极性溶剂化自由能两部分，如下所示：

ΔG_solv＝ΔG_gb+ΔG_np

极性溶剂化自由能根据GB模块进行计算，非极性溶剂化自由能根据以下计算：

ΔG_np＝γ×SASA+β

SASA表示溶剂可及的表面积，由MSMS程序计算。γ和β分别设定为

和0.00kcal·mol^-1。

最终，筛选得到的潜在的催化效率提升的9个虚拟单点突变体及其结合自由能(ΔG_bind)具体如下表所示：

实施例3：重组脯氨酰内肽酶和定点突变体的分子构建与表达

本实施例中用到的引物片段名称及序列如下表所示：

重组脯氨酰内肽酶的分子构建与表达

1、Sphaerobacter thermophiles菌株在10mL LB液体培养基中37℃培养过夜。使用细菌基因组DNA提取试剂盒对Sphaerobacter thermophiles菌株进行基因组抽提，以此为模板，使用P1、P2引物通过PCR扩增获得脯氨酰内肽酶目的基因片段(UniProtKB:D1C7Y4)，目的基因C端含有His-tag，与pET-28a(+)质粒分别进行EcoRI、NcoI限制性内切酶酶切，通过T4连接酶于16℃金属浴反应15h获得重组DNA。脯氨酰内肽酶目的基因PCR鉴定结果如图8所示。

2、通过热激法将连接产物导入至感受态E.coli DH5α菌株，37℃摇床培养50min，使用涂布棒将少量菌液均匀涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB固态平板上；置于37℃培养箱内，先正置20min，再倒置过夜。

3、从过夜平板上挑单菌落至1mL含50μg/mL卡那霉素抗性的LB液态培养基中，37℃摇床培养6h，使用pET-28a(+)通用引物进行PCR验证；菌落PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，挑选条带大小正确的单菌落进行测序。

4、对测序成功的菌液进行质粒抽提，然后转化进E.coli BL21(DE3)表达宿主，菌落PCR及测序对其进行验证。

5、将表达菌株接种于5-10mL含50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养8-9h。按2％转接100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，以温度37℃、搅拌速度220rpm的条件培养2-4h至OD 0.8-1.0，加入终浓度为0.1mM的IPTG，以温度20℃、搅拌速度220rpm的条件诱导过夜。

6、将发酵液按照6000×g，离心5min的条件收集菌体，按每1g菌体加入10mL缓冲液重悬菌体，按照超声5s-暂停5s、400W功率条件超声破碎，每20mL超声30min，破碎的菌液于4℃、17900×g的条件离心20min除去细胞碎片，收集上清液。

7、将破碎上清过0.22μm的无机水膜，通过镍柱进行纯化，咪唑洗脱液梯度为30-100-250-500mM，收集100mM洗脱液，进行10％SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白表达纯化情况。

8、100mL发酵液约获得30mg脯氨酰内肽酶，纯化后纯度高于95％。

Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶的表达纯化过程如图9所示。

脯氨酰内肽酶定点突变体的分子构建与表达

使用PCR和无缝克隆试剂盒进行脯氨酰内肽酶的定点突变，具体引物设计见上述引物表。将PCR获得的两个目的基因片段与线性化载体进行连接反应，然后用该混合物转化E.coli DH5α克隆宿主筛选阳性克隆，最终转化进E.coli BL21(DE3)表达宿主，通过基因测序进行验证。

对表达菌株进行表达纯化，具体步骤与野生型重组脯氨酰内肽酶的表达纯化相同。

脯氨酰内肽酶野生型与突变体纯化后的SDS-PAGE蛋白胶图如图10所示。

实施例4：重组脯氨酰内肽酶和突变体的酶活测定

1、使用反相高效液相色谱首先测定底物及产物标准品，确定检测波长、色谱柱及洗脱条件等，结果如图11所示。将合成的九肽底物SEKTTMPLW溶解在0.1M PBS缓冲液(pH7.0)中。在63℃下，使用5.7mM九肽底物在0.1M PBS(pH 7.0)中进行脯氨酰内肽酶和9个突变体的活性测量。反应混合物包含190μL底物溶液和10μL纯化的酶。

2、酶反应用浓HCl终止，反应体系以20000×g离心20分钟，然后通过0.22μm水系微孔滤膜过滤，预处理后在214nm的波长处检测肽峰，用C18反相柱分离样品。溶剂A是在乙腈(ACN)中含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)，溶剂B是在水中含有0.1％(v/v)TFA。梯度洗脱程序如下：(i)0分钟，10％A；(ii)0–2.5分钟，10％A；(iii)2.5-11分钟，55％A；(iv)11–15分钟，55％A；(v)15-15.01分钟，10％A；(vi)15.01–25min，10％A。进样量为10μL，流速为1mL/min。脯氨酰内肽酶活性的一个单位(U)定义为在指定的测定条件下每分钟消耗1μmolSEKTTMPLW底物所需的量。所有反应均重复三次。

结果如图12所示，与野生型脯氨酰内肽酶相比，G536H、N538R和G539H三个突变体的酶活性分别降低为44.2％、58.7％和72.6％，G536F和V561Q两个突变体导致酶活性几乎完全丧失，G536F和V561Q突变体分别仅剩余11.2％和6.2％的相对活性。实验未检测到V561I和V623T两个突变体的活性，可能是因为这些突变体破坏了脯氨酰内肽酶活性位点的结构，导致酶活性下降或显着降低。相反，另外两个突变(I462W和Q560Y)的酶活性分别提高了119.8％和18.3％。这些数据表明I462W和Q560Y突变体具有相对较高的酶活性，并证明了对九肽底物具有较高催化效率。

实施例5：重组脯氨酰内肽酶和突变体酶促反应动力学参数的测定

选取实施例4中酶活提升的两个突变体I462W和Q560Y，并将野生型重组脯氨酰内肽酶作为对照组，进行酶促反应动力学参数的测定。

动力学参数的测定方法与实施例4的酶活测定方法相似。使用SEKTTMPLW在最佳条件下测定纯化的脯氨酰内肽酶的V_max,K_M,k_cat和k_cat/K_M，底物终浓度在71.25μM和28.5mM之间。通过将初始数据与Michaelis-Menten方程非线性回归拟合，得到k_cat和K_M值。多次重复实验以获得准确值。

脯氨酰内肽酶野生型和突变体的动力学参数测定结果如下表所示：

上表中的测定结果显示：I462W和Q560Y突变体的K_M值分别为17.36mM和17.59mM，高于野生型的K_M值(7.48mM)，I462W和Q560Y突变体的k_cat值分别为506.97min^-1和411.36min^-1，高于野生型的k_cat值(164.47min^-1)。I462W突变体的k_cat值增加了2.08倍，而Q560Y突变体的k_cat值增加了1.50倍。此外，与野生型脯氨酰内肽酶相比，I462W和Q560Y两个突变体的k_cat/K_M值分别增加了32.7％和6.3％。结果表明，两种突变体脯氨酰内肽酶对九肽底物均具有较高的催化效率，这与酶活的结果一致。突变体催化效率的提高主要归因于k_cat值的增加。

本发明改造脯氨酰内肽酶以提升其催化效率的理性设计方法主要是通过同源建模获得Sphaerobacter thermophiles脯氨酰内肽酶，分子对接获得酶-底物复合物结构，MD模拟使结构稳定，对底物附近的酶残基进行虚拟饱和突变，约束性MD模拟使酶处于完美催化的“近进攻态”构象，利用MM/GBSA方法计算结合自由能从而虚拟筛选出潜在催化效率提升的突变体酶。通过大肠杆菌表达系统进行酶的表达，镍柱纯化，使用HPLC测定重组酶对于九肽底物SEKTTMPLW的酶活及动力学参数。结果表明，本发明分子改造设计方法可以快速有效提升脯氨酰内肽酶的催化活性，说明本发明的酶改造方法可靠。

以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求所限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 684

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Glu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Ala Thr Arg Val Glu Pro Val

1 5 10 15

Thr Glu Val Leu His Gly His Thr Ile Val Asp Pro Tyr Arg Trp Leu

20 25 30

Glu Asp Asp Glu Ser Pro Glu Thr Arg Ala Trp Val Asp Ala Gln Asn

35 40 45

Ala Tyr Thr Arg Arg Val Leu Asp Ala Ser Pro Ser His Ala Arg Ile

50 55 60

Arg Ala Arg Leu Glu Thr Leu Leu Ser Ile Gly Asp Ile Ser Ala Pro

65 70 75 80

Val Met Arg Gly Glu Arg Ala Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gly Tyr Glu

85 90 95

Asn Gln Pro Lys Leu Tyr Leu Arg Glu Gly Asp Ser Glu Arg Val Leu

100 105 110

Leu Asp Pro Asn Gln Glu Ser Ala Glu Gly Thr Thr Ala Leu Asp Trp

115 120 125

Trp Tyr Pro Ser Pro Asp Gly Thr Leu Val Ala Phe Gly Tyr Ser Gln

130 135 140

Asp Gly Asp Glu Glu Ser Val Leu Gln Val Leu Asp Val Ala Arg Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Ala Glu Arg Ile Asp Arg Thr Arg Phe Cys Ser Leu Ala

165 170 175

Trp Leu Pro Asp Ala Ser Gly Phe Tyr Tyr Thr Arg Tyr Pro Gln Pro

180 185 190

Gly Glu Val Pro Pro Gly Glu Glu Arg Tyr His Arg Lys Val Phe Phe

195 200 205

His Arg Leu Gly Asp Asp Pro Ala Ala Asp Pro Leu Val Phe Gly Asp

210 215 220

Gly Leu Pro Ala Glu Ala Gln Pro His Val Arg Leu Ser Arg Asp Gly

225 230 235 240

Arg Trp Leu Ile Val Thr Val Ser His Gly Trp Ala Arg Ala Asp Leu

245 250 255

Tyr Leu His Asp Arg Thr Arg Pro Glu Ala Gly Phe Ile Pro Val Phe

260 265 270

Val Glu Glu Glu Ala Leu Val Glu Gly Phe Val His Arg Gly Gln Leu

275 280 285

Tyr Leu Leu Thr Asn Leu Asp Ala Pro Arg Tyr Arg Leu Leu Ala Val

290 295 300

Asp Pro Glu Arg Pro Glu Arg Gln His Trp Arg Glu Ile Ile Ala Glu

305 310 315 320

Pro Glu Glu Ala Arg Ile Glu Gln Val Val Pro Val Gly Asp Arg Leu

325 330 335

Val Val Gln Thr Leu Val Arg Ala Thr Ser Arg Leu Thr Leu His Asp

340 345 350

Leu Asp Gly Arg Pro Val Ser Thr Leu Asp Leu Pro Gly Leu Gly Thr

355 360 365

Val Ser Gly Leu Asn Ala Glu Ser Glu Gly Asp Arg Ala Phe Phe Arg

370 375 380

Phe Glu Ser Phe Thr Val Pro Pro Thr Val Phe Gln Cys Asp Thr Ala

385 390 395 400

Ser Gly Arg Ile Thr Glu Trp Ala Ala Val Glu Ala Pro Ile Asp Pro

405 410 415

Ala Ala Tyr Thr Thr Glu Gln Val Trp Tyr Arg Ser Ala Asp Gly Thr

420 425 430

Leu Val Ser Met Phe Ile Val Ala Arg Ala Gly Thr Pro Arg Asp Gly

435 440 445

Ser Ala Pro Ala Leu Leu Thr Gly Tyr Gly Gly Phe Asn Ile Ser Arg

450 455 460

Thr Pro Leu Phe Asp Arg Arg Met Phe Phe Trp Leu Glu Gln Gly Gly

465 470 475 480

Val Tyr Ala Leu Pro Asn Leu Arg Gly Gly Gly Glu Tyr Gly Glu Glu

485 490 495

Trp His Arg Ala Gly Met Arg Glu Arg Lys Gln Asn Val Phe Asp Asp

500 505 510

Phe Ile Ala Ala Ala Glu Tyr Leu Ile Ala Glu Gly Tyr Thr Arg Pro

515 520 525

Glu Arg Leu Ala Ile Leu Gly Gly Ser Asn Gly Gly Leu Leu Val Gly

530 535 540

Ala Ala Met Thr Gln Arg Pro Asp Leu Phe Arg Ala Val Val Cys Gln

545 550 555 560

Val Pro Leu Leu Asp Met Leu Arg Tyr His Arg Phe Leu Ile Ala Arg

565 570 575

Leu Trp Ile Pro Glu Tyr Gly Ser Ala Asp Asp Pro Glu Gln Phe Ala

580 585 590

Tyr Leu Tyr Ala Tyr Ser Pro Tyr His Arg Val Glu Asp Gly Thr Pro

595 600 605

Tyr Pro Ala Val Leu Leu Thr Thr Ala Thr Ser Asp Thr Arg Val Ala

610 615 620

Pro Leu His Ala Arg Lys Met Ala Ala Arg Leu Gln Ala Ala Thr Gly

625 630 635 640

Ser Asp Leu Pro Val Leu Leu Arg Val Glu Thr Ala Ala Gly His Gly

645 650 655

Ala Gly Lys Pro Leu Gly Lys Gln Ile Ala Glu Gln Thr Asp Ile Trp

660 665 670

Thr Phe Val Cys Asp Gln Leu Gly Val Thr Val Ala

675 680

<210> 2

<211> 2052

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgcaactgtt accccgagct ggtcgcagac gaaggtccag atgtcggtct gctcggcgat 60

ctgcttgccg agcggcttgc ctgcgccgtg gcccgcggcg gtctcgactc gcagcagcac 120

cgggagatcg gagccggtcg cagcctgcag gcgcgcggcc atcttgcgcg cgtgcagcgg 180

agcgacccgc gtgtccgagg tggctgtcgt caggagcacg gccgggtagg gcgtgccgtc 240

ctccacccgg tgatagggcg agtaggcgta caggtaggcg aactgctccg ggtcgtcggc 300

cgagccgtac tccgggatcc agaggcgggc gatcaggaac cggtggtagc gcagcatgtc 360

gagcagcggc acctggcaga cgacggcgcg gaagaggtcc ggccgctggg tcatggccgc 420

gccgaccagc agcccaccgt tgctgccgcc gaggatcgcc aggcgctcgg ggcgggtgta 480

accctcggcg atcaggtact ccgccgcagc gataaagtcg tcgaagacgt tctgcttgcg 540

ctcgcgcatc ccggcgcggt gccactcctc gccatactcg ccgccgccgc gcaggttggg 600

cagcgcgtag acgccgccct gctccagcca aaagaacatg cgacggtcga agagtggcgt 660

gcggctgatg ttgaaaccgc cgtagccggt gaggagcgcc ggggcgctgc cgtcgcgcgg 720

cgtccctgcc cgagccacga tgaacatgga aacgagggtg ccgtcggccg agcggtacca 780

gacctgctcg gtggtatacg cggccgggtc gatcggcgcc tcgaccgcgg cccactcggt 840

gatccgaccg ctggcagtgt cgcactggaa gaccgtgggt ggtaccgtga acgactcgaa 900

gcggaagaag gcgcgatcgc cctccgactc ggcattcagg ccggagacgg tccctaaccc 960

tggcaggtcg agggtgctca ccgggcggcc gtccaggtca tgcagcgtca ggcgagaggt 1020

cgcccgcacc agcgtctgca ccaccagccg gtcacctacc gggacgactt gctcgatgcg 1080

tgcttcctcc ggctcggcga tgatctcccg ccagtgctgg cgctccgggc gctccgggtc 1140

gaccgccagc agccggtagc gtggcgcatc gaggttcgtc agcaggtaga gctgcccgcg 1200

gtggacgaac ccctcgacca gcgcttcctc ctccacgaag acggggatga acccggcttc 1260

gggacgggtg cggtcgtgga ggtagaggtc ggcccgcgcc cagccgtggc tcacggtgac 1320

gatcagccag cgaccgtcgc gcgacaggcg gacgtgcggc tgggcttccg ccgggagccc 1380

gtcgccgaag acgagcggat cagccgccgg gtcgtctccg agccggtgga agaagacctt 1440

gcggtggtag cgctcctcac ccggtgggac ctcgccgggc tggggatagc gcgtgtagta 1500

gaagccggat gcgtcgggga gccaggcaag gctgcagaag cgggtccggt cgatgcgctc 1560

ggcgagcagc gtgtcccgcg cgacgtcgag gacctggagc acgctctcct cgtcgccgtc 1620

ctgggagtag ccgaacgcga cgagcgtgcc gtcgggcgag gggtaccacc agtcgagagc 1680

cgtcgtcccc tcggcgctct cctggttcgg gtcgagcaac acccgctcgc tgtccccctc 1740

gcgcaggtac agcttcggct ggttctcata tccctcccgg cggaggaaga aggcgcgctc 1800

gccccgcatt accggcgccg agatgtcacc gatcgagagc agcgtctcca gccgggcgcg 1860

gatgcgcgcg tgggaggggg aggcgtcgag tacgcggcgg gtgtacgcat tctgagcgtc 1920

gacccaggcg cgcgtctccg gtgactcgtc gtcctccagc cagcggtacg ggtctacgat 1980

ggtgtgcccg tgcagcacct cggttacggg ttcgactctc gtggcaggcg gcgacgtcaa 2040

ccgttcggtc at 2052

Claims

1.一种提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）整理并比较不同物种的脯氨酰内肽酶的酶学性质，选择嗜热球杆菌（Sphaerobacter thermophiles）来源的脯氨酰内肽酶作为改造对象；

查找蛋白质数据库PDB中已解析脯氨酰内肽酶晶体结构的氨基酸序列，使用NCBI数据库的局部序列排比检索基本工具BLAST对上述脯氨酰内肽酶的氨基酸序列进行序列比对，选择与嗜热球杆菌脯氨酰内肽酶同源性最高的黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）脯氨酰内肽酶作为模版，进行同源建模，获得同源建模结构；

使用AMBER18软件进一步对上述同源建模结构进行20 ns MD模拟，取模拟过程中势能最低的结构，作为稳定的脯氨酰内肽酶结构；

2）将步骤1）得到的脯氨酰内肽酶的最低势能结构和九肽底物通过Schrödinger的Glide模块对接以生成酶-底物复合物，并对其对接结构进行20 ns MD模拟，将模拟过程中势能最低的酶-底物复合物对接结构，作为稳定的酶-底物复合物的对接结构；其中，所述九肽底物的氨基酸序列为：SEKTTMPLW；

3）对步骤2）中获得的稳定的酶-底物复合物的对接结构，通过AMBER18的leap模块对底物序列中脯氨酸P周围8 Å范围内的脯氨酰内肽酶的残基进行虚拟饱和突变，产生了若干个虚拟单点突变体，对于上述所有虚拟单点突变体进行虚拟筛选，选取具有较强结合自由能的虚拟单点突变体；

4）对步骤3）中筛选出的虚拟单点突变体，进行重组表达并纯化获得改造的脯氨酰内肽酶，采用所述九肽底物对改造的脯氨酰内肽酶进行酶催化效率的测定，挑选得到酶催化效率最高的突变体。

2.如权利要求1所述的提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其特征在于，步骤3）中所述虚拟筛选包括以下步骤：

对所有突变体进行约束动力学模拟以优化其结构，即使底物序列中Pro的C原子和所述脯氨酰内肽酶序列中Ser537的O原子之间的距离保持在在2 Å，谐波力常数为10 kcal/(mol•Å)，再使用MM/GBSA方法计算所有结构优化后的虚拟单点突变体的酶与底物的结合自由能，将结合自由能从低到高排序，尽量选择不同的原始残基并选择结合自由能较低的至少前8个突变体，留待下一步实验验证。

3.如权利要求1所述的提高脯氨酰内肽酶催化效率的分子改造设计方法，其特征在于，步骤4）中所述酶催化效率的测定包括酶活的测定和酶促反应动力学参数的测定。