CN105755029A - 一种基于dacA提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于dacA提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法，涉及基因工程与发酵工程领域。本发明通过过量表达D?丙氨酰?D?丙氨酸羧肽酶基因，获得重组蛋白胞外分泌水平过了表达的重组大肠杆菌。本发明提供一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平方法。采用该方法可显著提高大肠杆菌菌株的重组蛋白分泌能力。采用淀粉酶为模式重组蛋白，通过该方法可将大肠杆菌胞外重组淀粉酶含量由对照组的8.54％提高至51.77％。该方法对重组蛋白在大肠杆菌中的高效分泌与生产具有重要指导意义。

Description

一种基于dacA提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法
技术领域
本发明涉及基因工程与发酵工程领域，具体涉及一种基于dacA提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法及其应用。
技术背景
大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统，有操作简单、成本低廉等优点，可以快速大规模地生产目的蛋白，但是在大肠杆菌的异源表达中，大部分重组蛋白在信号肽的引导下分泌到周质空间，会导致中间体大量积聚，对蛋白质的生产造成阻碍。
肽聚糖是由双糖单位，四肽尾还有肽桥聚合而成得多层网状大分子结构。肽聚糖层的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1，4糖苷键连接而成，糖链间由肽链交联，构成稳定的网状结构，这样构成了整个细菌表面的细胞壁。作为细胞壁的主要成分，肽聚糖的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、细菌的抗干燥能力和耐热性等均密切相关。dacA基因表达的D,D-羧肽酶能够从肽聚糖五肽上移除最后一个末端D-Ala，导致转肽反应中供体不可用，可以控制肽聚糖的网状交联水平，从而改变细胞的通透性。
发明内容
本发明提供一种基于dacA提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法。
为实现上述目的，本发明涉及的技术方案包括以下步骤：
1)羧肽酶重组质粒的构建：PCR扩增D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因dacA，然后用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，质粒pRSFDuet也用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，胶回收纯化后，采用DNA连接酶将基因片段连接至酶切后质粒pRSFDuet上，获得重组质粒pRSFDuet-dacA。
2)转化：将重组质粒pRSFDuet-dacA转化到含有淀粉酶重组质粒pETDuet-AmyK的E.coli BL21(DE3)中。
3)诱导表达：接单菌落于LB液体培养基过夜培养，然后按1％的接种量转接TB液体培养基，37℃培养，加入IPTG，25℃诱导。
本发明中所用到的材料和方法：
1)培养基
LB固体培养基：15g/L琼脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/L NaCl，pH7.0。
LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/L NaCl，pH 7.0。
TB液体培养基：12g/L胰蛋白胨，24g酵母提取粉，甘油4mL，2.31g KH2PO4
12.54g K2HPO4，pH 7.5，定容到1L。
2)培养方法
种子培养：将平板划线长出的单菌落接到LB液体培养基中，培养转速200r/min，在37℃下恒温摇床培养8h。
发酵培养：按1％(v/v)的接种量，将液体种子接种到发酵培养基TB中，发酵培养基的装液量为250mL三角瓶中装入30mL培养基，转速200r/min，37℃培养，加入IPTG，25℃下恒温摇床培养。
3)分析方法
生物量测定：测定600nm下的吸光光度值。
淀粉酶活性测定：采用采用DNS氧化还原法测定。
附图说明
图1 pRSFDuet-dacA双酶切验证电泳图。
图2羧肽酶dacA过量表达对E.coli胞外分泌重组淀粉酶的影响。
图3羧肽酶过量表达对淀粉酶胞内外分布的影响。
图4羧肽酶过量表达对胞内可溶性肽聚糖的影响。
具体实施方式
实施例1本实施例说明过量表达dacA对E.coli胞外分泌重组淀粉酶的影响
将构建成功的重组质粒pRSFDuet-dacA双酶切验证后(图1)，转化到含有淀粉酶重组质粒pETDuet-AmyK的E.coli BL21(DE3)中后，诱导发酵24h时，过量表达羧肽酶dacA的E.coli胞外分泌重组淀粉酶的水平显著提高，胞外淀粉酶酶活力达到6.77U/mL(图2)。但没有过量表达任何羧肽酶的对照菌株诱导发酵24h后，在E.coli胞外测得的重组淀粉酶的酶活力仅为1.74U/mL。
实施例2本实施例说明过量表达dacA对重组淀粉酶在E.coli胞内外分布的影响
在E.coli中过量表达羧肽酶dacA时，诱导24h后，重组淀粉酶在胞内的含量由对照组的91.46％降低至48.23％。胞外重组淀粉酶的含量由对照组的8.54％提高至51.77％(图3)。
实施例3本实施例说明过量表达dacA对E.coli胞内可溶性肽聚糖的影响
在E.coli中过量表达羧肽酶dacA时，诱导6h后，E.coli胞内可溶性肽聚糖的含量显著提高，胞内可溶性肽聚糖的含量达到92.79mg/g(图4)。但没有过量表达任何羧肽酶的对照菌株诱导发酵6h后，在E.coli胞内测得的可溶性肽聚糖的含量仅为29.17mg/g。

Claims (8)

1.一种基于dacA提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法，其特征在于是通过过量表达羧肽酶基因后获得。
2.根据权利要求1所述的过量表达方法，其特征在于，构建重组羧肽酶质粒。
3.根据权利要求1所述的过量表达方法，其特征在于，羧肽酶合成的相关基因是D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因dacA。
4.根据权利要求1所述的过量表达方法，其特征在于，过量表达羧肽酶的载体是pRSFDuet。
5.权利要求1-4所述的过量表达大肠杆菌在制备重组蛋白胞外可溶性方面的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于将所述蛋白的编码基因插入表达载体后，转化至权利要求1-4之一所述过量表达大肠杆菌中，获得重组菌。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述表达载体为pETDuet。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于诱导培养所述重组菌，将发酵液离心取上清液，得到所述可溶性蛋白。
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