CN107868799A - 表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

表达载体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107868799A
CN107868799A CN201711158905.1A CN201711158905A CN107868799A CN 107868799 A CN107868799 A CN 107868799A CN 201711158905 A CN201711158905 A CN 201711158905A CN 107868799 A CN107868799 A CN 107868799A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression vector
egfp
gnlys
fragments
gnlyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711158905.1A
Other languages
English (en)
Inventor
许澎
黄巧
汤宾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan Feng Hui Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Hunan Feng Hui Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Feng Hui Biotechnology Co Ltd filed Critical Hunan Feng Hui Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201711158905.1A priority Critical patent/CN107868799A/zh
Publication of CN107868799A publication Critical patent/CN107868799A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达载体及其构建方法和应用。本发明提供了新的双表达慢病毒载体，使用具有自我剪切功能的p2A序列代替到IRES(内部核糖体进入位点序列)。感染后，慢病毒表达载体自启动子区域开始形成的mRNA可以自我剪切成2个独立的mRNA序列，分别表达两种基因，并且保证了两种蛋白的表达量相当，方便后续的研究。本发明提供的思路也适用于包括腺病毒在内的其他的病毒载体。

Description

表达载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
颗粒溶素(granulysin，GNLY)是存在于人类细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlympocytes,CFLs)和自然杀伤细胞(NKCells)胞浆颗粒中的细胞毒性蛋白。氨基酸序列分析表明其与NK溶素和阿米巴溶素(抗微生物蛋白)同源，为脂结合蛋白一皂素样蛋白(saposin-likeprotein,SAPLIP)家族的成员之一。GNLYmRNA主要在CTL和NK细胞活化后，3—5天增加，5—7天剧增，在机体免疫应答过程中。
颗粒溶素是一种溶细胞和促炎症分子，表达于活化的人类细胞毒T细胞(CTLs)和自然杀伤(NK)细胞。目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式，具有溶细胞性、溶肿瘤性、杀菌活性、趋化作用、促炎症等功能。但是颗粒溶素对正常人细胞的毒性很低，所以在对抗耐药性细菌方面具有广阔的应用前景。
目前认为颗粒溶素有9kDa和15kDa两种形式。9kDa颗粒溶素是15kDa颗粒溶素的前体。9kDa颗粒溶素通过钙依赖通道途径释放到效应细胞与靶细胞之间。该颗粒溶素与其他皂素样蛋白家族同源，通过与靶细胞表面结合引起离子流，从而对多种微生物和肿瘤起溶细胞作用。15kDa颗粒溶素是自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞(CTLs)通过非颗粒溶细胞途径释放到细胞外.其浓度在T细胞活化后升高。关于15kDa颗粒溶素溶细胞性说法不一，研究认为15kDa颗粒溶素有类似于9kDa颗粒溶素的溶细胞潜能。
目前广泛报道的颗粒溶素的表达载体的构建，主要有以下几个特点：(1)表达其一种形式：9kDa或者15kDa的。(2)使用的载体根据转染的细胞不同，可以是质粒载体也可以是病毒载体。但是，迄今为止，还没有同时将两种形式的颗粒溶素同时放到一个表达载体上的。
现在常用的同时表达两种蛋白的方式，是分别将带有不同蛋白的质粒转染或者病毒感染到同一个细胞中，让细胞表达两种蛋白。这种方式的缺点是(1)不能确定细胞是否同时表达两种基因。因为在转染的过程中，不可避免的有一种细胞表达只表达其中的一种蛋白；(2)同一个细胞中两种蛋白的表达量不一样，一个多一个少，对后续的实验的开展造成很大的麻烦。
于是，近年来，质粒的双表达载体慢慢兴起。比如美国invitrogen的pIRES载体就同时具有2个多克隆位点区，可以同时表达2个蛋白。这种质粒也存在一个问题就是：IRES序列后面的下游基因的表达不稳定。同样，市面上也有pIRES的慢病毒表达载体，但是同样的问题继续存在。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种表达载体及其构建方法和应用。本发明提供了新的双表达慢病毒载体，使用具有自我剪切功能的p2A序列代替到IRES(内部核糖体进入位点序列)。这样在感染后，慢病毒表达载体自启动子区域开始形成的mRNA可以自我剪切成2个独立的mRNA序列，分别表达两种基因，并且保证了两种蛋白的表达量相当，方便后续的研究。本发明提供的思路也适用于包括腺病毒在内的其他的病毒载体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了具有自我剪切功能的2A元件在构建表达载体中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。其中，P2A的序列如SEQ ID No.1所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体为慢病毒表达载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体含有两个多克隆位点的所述具有自我剪切功能的2A元件。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体还包括目的基因，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
本发明还提供了一种表达载体，包括含有两个多克隆位点的具有自我剪切功能的2A元件以及目的基因。
在本发明的一些具体实施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体为慢病毒表达载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
本发明还提供了所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：构建p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体；
步骤2：以步骤1获得的p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体为模板，以具有如SEQ ID No.6所示序列的正向引物和具有如SEQ ID No.7所示序列的反向引物扩增，扩增产物经EcoRI、BamHI双酶切，将目的片段插入骨架载体；或
包括如下步骤：
步骤1：获得如SEQ ID No.8所示序列；
步骤2：经EcoRI、BamHI双酶切，将目的片段插入骨架载体；
其中：所述p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体的构建方法包括如下步骤：
步骤①：取pIRES-EGFP载体，经BamHI、BstXI双酶切切除IRES，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体连接，构建获得p2A-EGFP载体；
步骤②：取步骤1获得的p2A-EGFP载体经SalI、SacII双酶切获得线性化载体片段；PCR扩增出带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段并进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-2A-EGFP载体；
步骤③：取步骤2获得的p2A-2A-EGFP载体经SacII、BamHI双酶切获得线性化载体片段；合成或扩增带有SacII、BamHI酶切位点的GNLYS片段进行双酶切，获得GNLYS片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-GNLYS-2A-EGFP载体；
步骤④：取步骤3制得的p2A-GNLYS-2A-EGFP载体，经XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个双酶切，获得线性化载体片段；合成或扩增带有XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个酶切位点的GNLYL片段进行双酶切，获得GNLYL片段，与所述线性化载体片段连接，构建p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体；或
包括如下步骤：
步骤①：在GNLYL-2A-GNLYS-2A的5’端引入EcoRI酶切位点，3’端引入MscI酶切位点，获得如SEQ ID No.9所示序列；
步骤②：将表达载体pIRES2-EGFP和如SEQ ID No.9所示序列的目的基因分别进行EcoRI和MscI双酶切后连接，构建获得p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体。
本发明还提供了所述的表达载体在表达颗粒溶素中的应用。
本发明还提供了所述的表达载体在同时表达9kDa颗粒溶素和15kDa颗粒溶素中的应用。
本发明提供了具有自我剪切功能的2A元件在构建表达载体中的应用以及含有具有自我剪切功能的2A元件的表达载体。具有如下优点：
(1)带有两个MCS(多克隆位点)p2A的慢病毒表达载体是首创的。
(2)带有颗粒溶素目的基因的双表达慢病毒表达载体，可以同时表达两种不同形式的颗粒溶素，并且保证两种不同形式的颗粒溶素的表达量相当。而且同时载体带有的GFP蛋白可以用来直观的观察转染的效率。
(3)15kDa颗粒溶素带有flag标签，9kDa颗粒溶素带有His-tag标签，后期可以使用不同的标签来纯化不同的颗粒溶素，方便操作，并且节省成本。
(4)双表达慢病毒在感染时只需要进行一次转染，相对于两个慢病毒共同感染来讲，操作简单。
本发明提供的慢病毒形式的颗粒溶素的双表达载体，既适用于贴壁细胞的感染，也适用于悬浮细胞的感染，应用范围比质粒形式的载体更广泛。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示pLVX-GNLY1-2-AcGFP1-N1的环形结构示意图；
图2示pLVX-GNLY1-2-AcGFP1-N1的线性结构示意图；
图3示实施例3中转染效率的结果；白光显示细胞的形态，GFP显示转染后细胞发出的荧光，这是同一组细胞不同光下的照片，两者对比可以看出细胞的转染后是可以发出绿色荧光；
图4示western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化结果；
图5示实施例4中转染效率的结果；由于空载体和双表达载体都具有GFP(绿色荧光蛋白)基因，所以转染后都有绿色荧光，使用流式细胞仪检测感染效率时，使用绿色荧光的通道检测；
图6示实施例4中western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化；
图7示对比例中商用的pLv-IRES-EGFP载体的环形结构示意图；
图8示对比例中转染效率的结果；白光显示细胞的形态，GFP显示转染后细胞发出的荧光，这是同一组细胞不同光下的照片，两者对比可以看出细胞的转染后是可以发出绿色荧光；
图9示对比例中western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化；
图10示p-IRES2-EGFP载体的图谱；
图11示构建完成的双表达载体p-GNLYL-2A-GNLYS-2AGNLY-EGFP的线性示意图；
图12示构建完成的双表达载体p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP的环形示意图；
图13示p2A-EGFP载体图谱；
图14示p2A-2A-EGFP载体图谱；
图15示p2A-GNLYS-2A-EGFP载体图谱；
图16示p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种表达载体及其构建方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的表达载体及其构建方法和应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一、本发明专利使用到的关键基因序列如下：
P2A sequence
P2A:GCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCC(如SEQ IDNo.1所示)。
15KD GNLY(GNLYL)
SP(信号肽)基因序列
at ggctacctgg gccctcctgc tccttgcagc catgctcctg ggcaacccag
gtctggtctt ctct(如SEQ ID No.2所示)。
CDS(蛋白质编码)区序列
9KD GNLY(GNLYs)
SP(信号肽)基因序列
at ggctacctgg gccctcctgc tccttgcagc catgctcctg ggcaacccag
gtctggtctt ctct(如SEQ ID No.4所示)。
CDS(蛋白质编码)区序列
二、设计和构建流程
1、使用的基础慢病毒表达载体是：pLVX-AcGFP1-N1。
2、p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体的构建：
①使用的基础质粒载体是：p-IRES2-EGFP载体。其图谱如图10所示：
②设计和构建流程(第一种方案)
(a).涉及GNLYL-2A-GNLYS-2A基因序列，交由安徽通用生物技术有限公司进行合成(892bp)。分别在5’端引入EcoRI酶切位点，3’端引入MscI酶切位点。
gaattcatggctacctgggccctcctgctccttgcagccatgctcctgggcaacccaggtctggtcttctctcgtctgagccctgagtactacgacctggcaagagcccacctgcgtgatgaggagaaatcctgcccgtgcctggcccaggagggcccccagggtgacctgttgaccaaaacacaggagctgggccgtgactacaggacctgtctgacgatagtccaaaaactgaagaagatggtggataagcccacccagagaagtgtttccaatgctgcgacccgggtgtgtaggacggggaggtcacgatggcgcgacgtctgcagaaatttcatgaggaggtatcagtctagagttacccagggcctcgtggccggagaaactgcccagcagatctgtgaggacctcaggttgtgtataccttctacaggtcccctcGATTACAAGGATGACGACGATAAGGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCatggctacctgggccctcctgctccttgcagccatgctcctgggcaacccaggtctggtcttctctggccgtgactacaggacctgtctgacgatagtccaaaaactgaagaagatggtggataagcccacccagagaagtgtttccaatgctgcgacccgggtgtgtaggacggggaggtcacgatggcgcgacgtctgcagaaatttcatgaggaggtatcagtctagagttacccagggcctcgtggccggagaaactgcccagcagatctgtgaggacctcaggCATCATCACCATCACCATGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCctggcca(如SEQ ID No.9所示)。
(b)将表达载体pIRES2-EGFP和目的基因进行EcoRI和MscI双酶切,切胶回收后，配制载体与目的片段连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP的构建。(如图11和12所示)
③以p2A-2A-EGFP载体为基础构建颗粒溶素的双表达载体(第二种方案)
目的：根据需求完成p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体的构建：在改造载体p2A-2A-EGFP载体的两个MCS分别插入带有His标签的GNLYL、GNLYS构建成重组载体。
含有双p2A序列的双表达p2A-2A-EGFP基础载体的构建方案：
目的：根据需求完成原载体pIRES-EGFP的改造：将IRES替换成P2A，并在MCS再引入一个P2A，构建成为p2A-2A-EGFP载体
方法：
a)提取pIRES-EGFP载体后，进行双酶切切除IRES(BamHI、BstXI)，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切；
b)将酶切后的线性化载体与P2A片段连接，构建成p2A-EGFP；
c)提取p2A-EGFP载体后，进行双酶切载体(SalI、SacII)，获得线性化载体片段；PCR扩增出带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段并进行双酶切；
d)将酶切后的p2A-EGFP线性化载体与P2A片段连接，完成p2A-2A-EGFP载体的构建。
实验流程：
(1)P2A片段(BamHI、BstXI)的获取
合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段(with BamHI&BstXI)：5’-CCGGATCCGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCCCACAACCATGGAAGACGTC-3’(如SEQ ID No.10所示)。
使用BamHI与BstXI进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的P2A片段。
(2)线性化载体的获取
提取pIRES-EGFP载体，配制双酶切(BamHI、BstXI)体系切除IRES，切胶回收线性化载体片段。
(3)连接转化与验证
加入线性化载体与酶切后的P2A片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-EGFP的构建，如图13所示。
(4)P2A片段(SalI、SacII)的获取
P2A片段(SalI、SacII)的获取方法可从以下选择：
1.合成带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段；
2.使用带有SalI、SacII的引物扩增上述合成的P2A片段。
获取后使用SalI、SacII进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的P2A片段。
(5)线性化载体的获取
提取p2A-EGFP载体，配制双酶切(SalI、SacII)体系，切胶回收线性化载体片段。
(6)连接转化与验证
加入线性化的p2A-EGFP载体与酶切后的P2A片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-2A-EGFP的构建，如图14所示。
p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体的构建：
(1)提取p2A-2A-EGFP载体后，进行双酶切(SacII、BamHI)，获得线性化载体片段；合成或扩增带有SacII、BamHI酶切位点的GNLYS片段进行双酶切；
(2)将酶切后的线性化载体与GNLYS片段连接，构建成p2A-GNLYS-2A-EGFP载体；
(3)提取p2A-GNLYS-2A-EGFP载体后，进行双酶切载体(可在XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个，本流程选用XhoI、SalI)，获得线性化载体片段；合成或扩增带有XhoI、SalI酶切位点的GNLYL片段进行双酶切；
(4)将酶切后的p2A-GNLYS-2A-EGFP线性化载体与GNLYL片段连接，完成p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体的构建，如图15所示。
其中，实验具体流程：
GNLYS片段(SacII、BamHI)的获取
合成或扩增GNLYS片段(with SacII、BamHI)，序列应如下：
5’-CCGCGGATGGCTACCTGGGCCCTCCTGCTCCTTGCAGCCATGCTCCTGGGCAACCCAGGTCTGGTCTTCTCTGGCCGTGACTACAGGACCTGTCTGACGATAGTCCAAAAACTGAAGAAGATGGTGGATAAGCCCACCCAGAGAAGTGTTTCCAATGCTGCGACCCGGGTGTGTAGGACGGGGAGGTCACGATGGCGCGACGTCTGCAGAAATTTCATGAGGAGGTATCAGTCTAGAGTTACCCAGGGCCTCGTGGCCGGAGAAACTGCCCAGCAGATCTGTGAGGACCTCAGGCATCATCACCATCACCATGGATCC-3’(如SEQ ID No.11所示)。
使用SacII、BamHI进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的GNLYS片段。
线性化载体的获取：
提取p2A-2A-EGFP载体，配制双酶切(SacII、BamHI)体系，切胶回收线性化载体片段。
连接转化与验证：
加入线性化载体与酶切后的GNLYS片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-GNLYS-2A-EGFP的构建。GNLYL片段(XhoI、SalI)的获取：
合成或扩增GNLYL片段(with XhoI、SalI)，序列应如下：
5’-CTCGAGATGGCTACCTGGGCCCTCCTGCTCCTTGCAGCCATGCTCCTGGGCAACCCAGGTCTGGTCTTCTCTCGTCTGAGCCCTGAGTACTACGACCTGGCAAGAGCCCACCTGCGTGATGAGGAGAAATCCTGCCCGTGCCTGGCCCAGGAGGGCCCCCAGGGTGACCTGTTGACCAAAACACAGGAGCTGGGCCGTGACTACAGGACCTGTCTGACGATAGTCCAAAAACTGAAGAAGATGGTGGATAAGCCCACCCAGAGAAGTGTTTCCAATGCTGCGACCCGGGTGTGTAGGACGGGGAGGTCACGATGGCGCGACGTCTGCAGAAATTTCATGAGGAGGTATCAGTCTAGAGTTACCCAGGGCCTCGTGGCCGGAGAAACTGCCCAGCAGATCTGTGAGGACCTCAGGTTGTGTATACCTTCTACAGGTCCCCTCGATTACAAGGATGACGACGATAAGGTCGAC-3’(如SEQ ID No.12所示)。
使用XhoI、SalI进行双酶切，回收后获得带有粘性末端的GNLYL片段。线性化载体的获取：
提取p2A-GNLYS-2A-EGFP载体，配制双酶切(XhoI、SalI)体系，切胶回收线性化载体片段。
连接转化与验证：
加入线性化的p2A-GNLYS-2A-EGFP载体与酶切后的GNLYL片段，配制连接体系，过夜连接后转化大肠杆菌，通过菌落PCR、测序验证。完成p2A-2A-EGFP的构建，如图16所示。
3、慢病毒载体构建流程(第一种方案)
(1)设计引物：以设计的p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体为模板，进行PCR扩增出引入EcoRI、BamHI的GNLYL+2A+GNLYS+2A目的片段，引物如下：
Forward primer：gaattc ATGGCTACCTGGGC(EcoRI)(如SEQ ID No.6所示)。
Reverse primer：Ggatccg CGGGGCCGGGGTTCT(BamHI)(如SEQ ID No.7所示)。
PCR完成后于1％琼脂糖凝胶100V 30min电泳检测，切胶回收符合预期大小的目的条带。
双酶切：配制双酶切体系(EcoRI、BamHI)，分别加入pLVX-AcGFP1-N1载体与GNLYL+2A+GNLYS+2A目的片段，过夜酶切后于1％琼脂糖凝胶100V 30min电泳检测，分别切胶回收线性化载体和酶切片段。
连接：测定回收后的线性化载体和目的片段浓度，配制连接体系，计算比例添加片段与载体(目的片段：线性化载体摩尔比值＝1:5)，16℃过夜连接。转化：将过夜连接后的反应体系加入至制备好的大肠杆菌感受态，冰浴30min后，42℃热激100s，转入冰浴2min，恢复培养1小时后涂至含有Amp抗生素的LB固体平板，倒置过夜培养。
鉴定：挑取平板上长出的转化子进行菌落PCR检测，鉴定获得的阳性转化子扩大培养后送交测序。
经过以上步骤，确认已完成GNLYL-2A-GNLYS-2A目的片段插入骨架载体pLVX-AcGFP1-N1，获得慢病毒载体pLVX-GNLY1-2-AcGFP1-N1(见图1和2)
实施例2
设计和构建流程(第二种方案)
1)将下面序列外包给安徽通用生物技术有限公司合成(892bp)
gaattcatggctacctgggccctcctgctccttgcagccatgctcctgggcaacccaggtctggtcttctctcgtctgagccctgagtactacgacctggcaagagcccacctgcgtgatgaggagaaatcctgcccgtgcctggcccaggagggcccccagggtgacctgttgaccaaaacacaggagctgggccgtgactacaggacctgtctgacgatagtccaaaaactgaagaagatggtggataagcccacccagagaagtgtttccaatgctgcgacccgggtgtgtaggacggggaggtcacgatggcgcgacgtctgcagaaatttcatgaggaggtatcagtctagagttacccagggcctcgtggccggagaaactgcccagcagatctgtgaggacctcaggttgtgtataccttctacaggtcccctcGATTACAAGGATGACGACGATAAGGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCatggctacctgggccctcctgctccttgcagccatgctcctgggcaacccaggtctggtcttctctggccgtgactacaggacctgtctgacgatagtccaaaaactgaagaagatggtggataagcccacccagagaagtgtttccaatgctgcgacccgggtgtgtaggacggggaggtcacgatggcgcgacgtctgcagaaatttcatgaggaggtatcagtctagagttacccagggcctcgtggccggagaaactgcccagcagatctgtgaggacctcaggCATCATCACCATCACCATGCCACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCctggcca。(如SEQ ID No.8所示)。
其中，gaattc为EcoRI，ctggcca为MscI。
2)双酶切：配制双酶切体系(EcoRI、MscI)，分别加入pLVX-AcGFP1-N1载体与合成片段，过夜酶切后于1％琼脂糖凝胶100V 30min电泳检测，分别切胶回收线性化载体和酶切片段。
3)连接：测定回收后的线性化载体和目的片段浓度，配制连接体系，计算比例添加片段与载体(目的片段：线性化载体摩尔比值＝1:5)，16℃过夜连接。
4)转化：将过夜连接后的反应体系加入至制备好的大肠杆菌感受态，冰浴30min后，42℃热激100s，转入冰浴2min，恢复培养1小时后涂至含有Amp抗生素的LB固体平板，倒置过夜培养。
5)鉴定：挑取平板上长出的转化子进行菌落PCR检测，鉴定获得的阳性转化子扩大培养后送交测序
经过以上步骤，确认已将目的基因插入到骨架载体pLVX-AcGFP1-N1上，得到慢病毒载体pLVX--GNLY1+2-AcGFP1-N1(见图1和2)。
实施例3贴壁细胞感染的实验流程和检测：
使用构建成功的颗粒溶素的双表达慢病毒载体，制备成慢病毒后，以MOI＝100的比例，感染到293T-人胚肾细胞中进行表达，使用的对照慢病毒表达载体是我们构建的含有双p2A序列的不含有颗粒溶素的空载体。48h后拍照，并收集细胞，进行western blot检测。
实验结果如下：
(1)转染效率的结果如图3所示。实验分组：空载体组，双表达载体组。由于空载体和双表达载体都具有GFP(绿色荧光蛋白)基因，所以转染后都有绿色荧光。拍照倍数100x。
(2)western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化。实验分组：双表达慢病毒载体组。实验中分别使用anti-flag抗体(abcam公司，货号ab49763)检测15kDa的颗粒溶素、anti-His tag抗体检测9kDa的颗粒溶素(abcam公司，货号ab18184)、anti-GNLY抗体(abcam公司，货号ab213561)检测检测15kDa和9kDa的颗粒溶素。
对双表达载体组的细胞进行了颗粒溶素的蛋白检测，使用了3种不同的抗体。由图4显示，两种形式的颗粒溶素的表达效果相当，并且带有不同的标签。并且我们对westernblot的结果进行了灰度分析，灰度分析的数值可以代表蛋白的表达量，数值如表1所示：
表1灰度分析：
Anti-GNLY Anti-FLAG Anti-Histag
15kDa 50103.123 53263.558 -
9kDa 40157.505 - 45690.525
实施例4悬浮细胞感染的实验流程和检测：
使用构建成功的颗粒溶素的双表达慢病毒载体，制备成慢病毒后，以MOI＝500的比例，感染到K562人白血病细胞系中进行表达，使用的对照慢病毒表达载体是我们构建的含有双p2A序列的不含有颗粒溶素的空载体。48h后收集细胞，进行流式检测和westernblot检测。
实验结果如下：
(1)转染效率的结果如图5所示。实验分组：空载体组，双表达载体组。由于空载体和双表达载体都具有GFP(绿色荧光蛋白)基因，所以转染后都有绿色荧光，使用流式细胞仪检测感染效率时，使用绿色荧光的通道检测。
空载体慢病毒组和双表达慢病毒组的感染效率相近，都在60％左右。
(2)western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化。实验分组：双表达慢病毒载体组。实验中分别使用anti-flag抗体(abcam公司，货号ab49763)检测15kDa的颗粒溶素、anti-His tag抗体检测9kDa的颗粒溶素(abcam公司，货号ab18184)、anti-GNLY抗体(abcam公司，货号ab213561)检测检测15kDa和9kDa的颗粒溶素。
对双表达载体慢病毒组的细胞进行了颗粒溶素的蛋白检测，使用了3种不同的抗体。由图6显示，两种形式的颗粒溶素的表达效果相当，并且带有不同的标签。并且我们对western blot的结果进行了灰度分析，灰度分析的数值可以代表蛋白的表达量，数值如表2所示：
表2灰度分析：
Anti-GNLY Anti-FLAG Anti-Histag
15kDa 11759.501 12022.489 -
9kDa 10514.3 - 11059.53
对比例：贴壁细胞感染的实验流程和检测：
使用商用的pLv-IRES-EGFP载体构建成功的颗粒溶素的双表达慢病毒载体，结构图如图7所示，制备成慢病毒后，以MOI＝100的比例，感染到293T-人胚肾细胞中进行表达，使用的对照慢病毒表达载体是我们构建的含有双IRES序列的不含有颗粒溶素的空载体。48h后拍照，并收集细胞，进行western blot检测。
实验结果如下：
(1)转染效率的结果如图8所示。实验分组：空载体组，双表达载体组。由于空载体和双表达载体都具有GFP(绿色荧光蛋白)基因，所以转染后都有绿色荧光。拍照倍数100x。
(2)western blot检测转染后9kDa和15kDa的颗粒溶素的蛋白水平变化。实验分组：双表达慢病毒载体组。实验中分别使用anti-flag抗体(abcam公司，货号ab49763)检测15kDa的颗粒溶素、anti-His tag抗体检测9kDa的颗粒溶素(abcam公司，货号ab18184)、anti-GNLY抗体(abcam公司，货号ab213561)检测检测15kDa和9kDa的颗粒溶素。
对双表达载体组的细胞进行了颗粒溶素的蛋白检测，使用了3种不同的抗体。由图9显示，两种形式的颗粒溶素的表达效果明显不同，并且带有不同的标签。并且对westernblot的结果进行了灰度分析，灰度分析的数值可以代表蛋白的表达量，数值如表3所示：
表3灰度分析：
通过对p2A慢病毒和pIRES慢病毒感染后的western blot结果的对比，可以发现，使用p2A慢病毒进行感染后，两种蛋白的表达情况相当，无论是使用GNLY抗体检测或者使用标签抗体检测，结果都是一样的。但是，使用pIRES慢病毒感染后，两种蛋白的表达量明显不同，后一种比前一种明显要多，具有显著差异(P＜0.05)。无论是使用GNLY抗体检测或者使用标签抗体检测，结果都是如此。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南丰晖生物科技有限公司
<120> 表达载体及其构建方法和应用
<130> MP1719311
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> P2A sequence
<400> 1
gccaccaact tctccctgct gaagcaggcc ggcgacgtgg aggagaaccc cggccc 56
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213> 15KD GNLY SP Sequence
<400> 2
atggctacct gggccctcct gctccttgca gccatgctcc tgggcaaccc aggtctggtc 60
ttctct 66
<210> 3
<211> 372
<212> DNA
<213> 15KD GNLY CDS Sequence
<400> 3
cgtctgagcc ctgagtacta cgacctggca agagcccacc tgcgtgatga ggagaaatcc 60
tgcccgtgcc tggcccagga gggcccccag ggtgacctgt tgaccaaaac acaggagctg 120
ggccgtgact acaggacctg tctgacgata gtccaaaaac tgaagaagat ggtggataag 180
cccacccaga gaagtgtttc caatgctgcg acccgggtgt gtaggacggg gaggtcacga 240
tggcgcgacg tctgcagaaa tttcatgagg aggtatcagt ctagagttac ccagggcctc 300
gtggccggag aaactgccca gcagatctgt gaggacctca ggttgtgtat accttctaca 360
ggtcccctct ga 372
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 9KD GNLY SP Sequence
<400> 4
atggctacct gggccctcct gctccttgca gccatgctcc tgggcaaccc aggtctggtc 60
ttctct 66
<210> 5
<211> 225
<212> DNA
<213> 9KD GNLY CDS Sequence
<400> 5
ggccgtgact acaggacctg tctgacgata gtccaaaaac tgaagaagat ggtggataag 60
cccacccaga gaagtgtttc caatgctgcg acccgggtgt gtaggacggg gaggtcacga 120
tggcgcgacg tctgcagaaa tttcatgagg aggtatcagt ctagagttac ccagggcctc 180
gtggccggag aaactgccca gcagatctgt gaggacctca ggtga 225
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaattcatgg ctacctgggc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggatccgcgg ggccggggtt ct 22
<210> 8
<211> 892
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaattcatgg ctacctgggc cctcctgctc cttgcagcca tgctcctggg caacccaggt 60
ctggtcttct ctcgtctgag ccctgagtac tacgacctgg caagagccca cctgcgtgat 120
gaggagaaat cctgcccgtg cctggcccag gagggccccc agggtgacct gttgaccaaa 180
acacaggagc tgggccgtga ctacaggacc tgtctgacga tagtccaaaa actgaagaag 240
atggtggata agcccaccca gagaagtgtt tccaatgctg cgacccgggt gtgtaggacg 300
gggaggtcac gatggcgcga cgtctgcaga aatttcatga ggaggtatca gtctagagtt 360
acccagggcc tcgtggccgg agaaactgcc cagcagatct gtgaggacct caggttgtgt 420
ataccttcta caggtcccct cgattacaag gatgacgacg ataaggccac caacttctcc 480
ctgctgaagc aggccggcga cgtggaggag aaccccggcc ccatggctac ctgggccctc 540
ctgctccttg cagccatgct cctgggcaac ccaggtctgg tcttctctgg ccgtgactac 600
aggacctgtc tgacgatagt ccaaaaactg aagaagatgg tggataagcc cacccagaga 660
agtgtttcca atgctgcgac ccgggtgtgt aggacgggga ggtcacgatg gcgcgacgtc 720
tgcagaaatt tcatgaggag gtatcagtct agagttaccc agggcctcgt ggccggagaa 780
actgcccagc agatctgtga ggacctcagg catcatcacc atcaccatgc caccaacttc 840
tccctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg gccccctggc ca 892
<210> 9
<211> 892
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaattcatgg ctacctgggc cctcctgctc cttgcagcca tgctcctggg caacccaggt 60
ctggtcttct ctcgtctgag ccctgagtac tacgacctgg caagagccca cctgcgtgat 120
gaggagaaat cctgcccgtg cctggcccag gagggccccc agggtgacct gttgaccaaa 180
acacaggagc tgggccgtga ctacaggacc tgtctgacga tagtccaaaa actgaagaag 240
atggtggata agcccaccca gagaagtgtt tccaatgctg cgacccgggt gtgtaggacg 300
gggaggtcac gatggcgcga cgtctgcaga aatttcatga ggaggtatca gtctagagtt 360
acccagggcc tcgtggccgg agaaactgcc cagcagatct gtgaggacct caggttgtgt 420
ataccttcta caggtcccct cgattacaag gatgacgacg ataaggccac caacttctcc 480
ctgctgaagc aggccggcga cgtggaggag aaccccggcc ccatggctac ctgggccctc 540
ctgctccttg cagccatgct cctgggcaac ccaggtctgg tcttctctgg ccgtgactac 600
aggacctgtc tgacgatagt ccaaaaactg aagaagatgg tggataagcc cacccagaga 660
agtgtttcca atgctgcgac ccgggtgtgt aggacgggga ggtcacgatg gcgcgacgtc 720
tgcagaaatt tcatgaggag gtatcagtct agagttaccc agggcctcgt ggccggagaa 780
actgcccagc agatctgtga ggacctcagg catcatcacc atcaccatgc caccaacttc 840
tccctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg gccccctggc ca 892
<210> 10
<211> 85
<212> DNA
<213> 带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段(P2A fragments With BamHI andBstXI )
<400> 10
ccggatccgc caccaacttc tccctgctga agcaggccgg cgacgtggag gagaaccccg 60
gccccccaca accatggaag acgtc 85
<210> 11
<211> 318
<212> DNA
<213> 带有SacII和BamHI酶切位点的GNLYS片段(GNLYS segments with SacII andBamHI )
<400> 11
ccgcggatgg ctacctgggc cctcctgctc cttgcagcca tgctcctggg caacccaggt 60
ctggtcttct ctggccgtga ctacaggacc tgtctgacga tagtccaaaa actgaagaag 120
atggtggata agcccaccca gagaagtgtt tccaatgctg cgacccgggt gtgtaggacg 180
gggaggtcac gatggcgcga cgtctgcaga aatttcatga ggaggtatca gtctagagtt 240
acccagggcc tcgtggccgg agaaactgcc cagcagatct gtgaggacct caggcatcat 300
caccatcacc atggatcc 318
<210> 12
<211> 471
<212> DNA
<213> 带有XhoI和SalI酶切位点的GNLYL片段(GNLYL fragments with XhoI andSalI)
<400> 12
ctcgagatgg ctacctgggc cctcctgctc cttgcagcca tgctcctggg caacccaggt 60
ctggtcttct ctcgtctgag ccctgagtac tacgacctgg caagagccca cctgcgtgat 120
gaggagaaat cctgcccgtg cctggcccag gagggccccc agggtgacct gttgaccaaa 180
acacaggagc tgggccgtga ctacaggacc tgtctgacga tagtccaaaa actgaagaag 240
atggtggata agcccaccca gagaagtgtt tccaatgctg cgacccgggt gtgtaggacg 300
gggaggtcac gatggcgcga cgtctgcaga aatttcatga ggaggtatca gtctagagtt 360
acccagggcc tcgtggccgg agaaactgcc cagcagatct gtgaggacct caggttgtgt 420
ataccttcta caggtcccct cgattacaag gatgacgacg ataaggtcga c 471

Claims (12)

1.具有自我剪切功能的2A元件在构建表达载体中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述表达载体含有两个多克隆位点的所述具有自我剪切功能的2A元件。
5.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述表达载体还包括目的基因，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
6.一种表达载体，其特征在于，包括含有两个多克隆位点的具有自我剪切功能的2A元件以及目的基因。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述具有自我剪切功能的2A元件选自P2A、T2A或E2A。
8.根据权利要求6或7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体。
9.根据权利要求6至8任一项所述的表达载体，其特征在于，所述目的基因为编码9kDa颗粒溶素的基因和/或15kDa颗粒溶素的基因。
10.根据权利要求6至9任一项所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体；
步骤2：以步骤1获得的p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体为模板，以具有如SEQID No.6所示序列的正向引物和具有如SEQ ID No.7所示序列的反向引物扩增，扩增产物经EcoRI、BamHI双酶切，将目的片段插入骨架载体；
或
包括如下步骤：
步骤1：获得如SEQ ID No.8所示序列；
步骤2：经EcoRI、BamHI双酶切，将目的片段插入骨架载体；
其中：所述p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP-1质粒载体的构建方法包括如下步骤：
步骤①：取pIRES-EGFP载体，经BamHI、BstXI双酶切切除IRES，获得线性化载体片段；合成带有BamHI与BstXI酶切位点的P2A片段进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体连接，构建获得p2A-EGFP载体；
步骤②：取步骤1获得的p2A-EGFP载体经SalI、SacII双酶切获得线性化载体片段；PCR扩增出带有SalI、SacII酶切位点的P2A片段并进行双酶切，获得P2A片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-2A-EGFP载体；
步骤③：取步骤2获得的p2A-2A-EGFP载体经SacII、BamHI双酶切获得线性化载体片段；合成或扩增带有SacII、BamHI酶切位点的GNLYS片段进行双酶切，获得GNLYS片段，与所述线性化载体片段连接，构建获得p2A-GNLYS-2A-EGFP载体；
步骤④：取步骤3制得的p2A-GNLYS-2A-EGFP载体，经XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个双酶切，获得线性化载体片段；合成或扩增带有XhoI、SacI、EcoRI、SalI中任选2个酶切位点的GNLYL片段进行双酶切，获得GNLYL片段，与所述线性化载体片段连接，构建p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体；或
包括如下步骤：
步骤①：在GNLYL-2A-GNLYS-2A的5’端引入EcoRI酶切位点，3’端引入MscI酶切位点，获得如SEQ ID No.9所示序列；
步骤②：将表达载体pIRES2-EGFP和如SEQ ID No.9所示序列的目的基因分别进行EcoRI和MscI双酶切后连接，构建获得p-GNLYL-2A-GNLYS-2A-EGFP载体。
11.根据权利要求6至9任一项所述的表达载体在表达颗粒溶素中的应用。
12.根据权利要求6至9任一项所述的表达载体在同时表达9kDa颗粒溶素和15kDa颗粒溶素中的应用。
CN201711158905.1A 2017-11-20 2017-11-20 表达载体及其构建方法和应用 Pending CN107868799A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711158905.1A CN107868799A (zh) 2017-11-20 2017-11-20 表达载体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711158905.1A CN107868799A (zh) 2017-11-20 2017-11-20 表达载体及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107868799A true CN107868799A (zh) 2018-04-03

Family

ID=61754231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711158905.1A Pending CN107868799A (zh) 2017-11-20 2017-11-20 表达载体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107868799A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109295102A (zh) * 2018-10-09 2019-02-01 新乡医学院 肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用
CN112522286A (zh) * 2020-12-29 2021-03-19 扬州大学 Ep402r、cp204l和e183l共表达重组腺病毒及构建和应用
CN112592937A (zh) * 2020-12-29 2021-04-02 扬州大学 D117l、f317l和ep364r共表达重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101869714A (zh) * 2009-04-24 2010-10-27 独立机构近畿中央胸部疾患中心 传染病治疗剂
WO2016172764A1 (en) * 2015-04-27 2016-11-03 Peter Maccallum Cancer Institute Breast cancer risk assessment

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101869714A (zh) * 2009-04-24 2010-10-27 独立机构近畿中央胸部疾患中心 传染病治疗剂
WO2016172764A1 (en) * 2015-04-27 2016-11-03 Peter Maccallum Cancer Institute Breast cancer risk assessment

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDELILAH IBRAHIMI ET AL.: ""Highly Efficient Multicistronic Lentiviral Vectors with Peptide 2A Sequences"", 《HUMAN GENE THERAPY》 *
张欢等: ""基于2A肽策略构建多基因表达载体的研究进展"", 《中国生物工程杂志》 *
江峰等: ""人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测"", 《中国组织工程研究》 *
王晚霞等: ""颗粒溶素和穿孔素真核共表达及其对A549细胞的影响"", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109295102A (zh) * 2018-10-09 2019-02-01 新乡医学院 肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用
CN109295102B (zh) * 2018-10-09 2021-06-01 新乡医学院 肿瘤特异性基因表达盒、重组表达载体及构建方法和应用
CN112522286A (zh) * 2020-12-29 2021-03-19 扬州大学 Ep402r、cp204l和e183l共表达重组腺病毒及构建和应用
CN112592937A (zh) * 2020-12-29 2021-04-02 扬州大学 D117l、f317l和ep364r共表达重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107868799A (zh) 表达载体及其构建方法和应用
CN104725515B (zh) 一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用
CN104774270A (zh) 一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白及其制备方法
CN106987559A (zh) 一种重组chok1细胞株的构建方法及其应用
CN109402069A (zh) 一种假病毒颗粒及其制备方法和应用
CN104328138A (zh) 基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒
CN107759674A (zh) 一种牛支原体免疫相关性蛋白、含有该蛋白的检测试剂盒及其在牛支原体抗体检测中的用途
CN102174649B (zh) 快速检测锌指核酸酶介导基因定点整合的方法
CN102190735B (zh) 一种融合蛋白tat-oct4及其编码基因与应用
CN111560341B (zh) 一种泛性型惰性载体大肠杆菌及其潜在应用
CN105175554A (zh) 一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白及其制备方法和应用
CN107058363A (zh) 基于淀粉样蛋白实现小分子肽类高效分泌表达的方法及其应用
CN107904252A (zh) 质粒载体及其构建方法、应用
CN112111522A (zh) 逆转录病毒载体、应用及car-t细胞杀伤功能评估方法
CN109055416A (zh) 一种可溶性重组蛋白的制备方法
CN108251546A (zh) 一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用
CN105296478B (zh) 一种多标签抗原及其制备方法和应用
Zhou et al. Establishment of an efficient and flexible genetic manipulation platform based on a fosmid library for rapid generation of recombinant pseudorabies virus
WO2014015227A1 (en) Engineering cell surfaces for orthogonal selectability
CN110616230B (zh) 一种促进玉米赤霉烯酮降解酶zhd 518蛋白分泌表达的方法及应用
CN104059141B (zh) 一种小鼠rankl突变体及其表达载体的构建、表达及应用
CN108303539B (zh) 一种乳腺癌细胞检测生物试剂及应用
CN102212141B (zh) 一种融合蛋白tat-nanog及其编码基因与应用
CN114457078B (zh) 一种可促进伪狂犬病毒增殖的猪源mlkl基因缺失细胞株及其应用
CN103805532A (zh) 一种坏死梭杆菌重组omp蛋白及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180403