CN112111522A - 逆转录病毒载体、应用及car-t细胞杀伤功能评估方法 - Google Patents

逆转录病毒载体、应用及car-t细胞杀伤功能评估方法 Download PDF

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CN112111522A CN202011034059.4A CN202011034059A CN112111522A CN 112111522 A CN112111522 A CN 112111522A CN 202011034059 A CN202011034059 A CN 202011034059A CN 112111522 A CN112111522 A CN 112111522A
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Abstract

本发明公开了一种逆转录病毒载体、应用及CAR‑T细胞杀伤功能评估方法，逆转录病毒载体包含编码IFN‑γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN‑γ启动子的转录控制；CAR‑T细胞杀伤评估方法包括如下步骤：利用逆转录病毒载体感染CAR‑T细胞；将CAR‑T细胞与靶细胞共培养；取共培养后的细胞进行流式细胞分析，检测荧光蛋白基因表达情况。本发明逆转录病毒载体感染宿主CAR‑T细胞后，逆转录IFN‑γ启动子序列和荧光蛋白基因；宿主CAR‑T细胞受到靶细胞刺激时，激活IFN‑γ启动子序列，开始荧光蛋白基因和IFN‑γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN‑γ即γ干扰素的分泌情况；实现快速方便的CAR‑T杀伤功能评估方法，普及性强。

Description

逆转录病毒载体、应用及CAR-T细胞杀伤功能评估方法
技术领域
本发明涉及CAR-T免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种逆转录病毒载体和应用以及CAR-T细胞放行检测方法。
背景技术
随着CAR(chimeric antigen receptor)技术的发展，正成为肿瘤免疫治疗的新星技术手段。慢病毒或逆转录病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。目前慢病毒载体与逆转录病毒载体被广泛用于CAR-T免疫细胞治疗领域。
在CAR-T研究中，常常需要对某种CAR-T进行体外细胞水平和体内小鼠肿瘤模型的功能验证。对CAR-T杀伤功能评估的重要指标之一就是IFN-γ的分泌水平；同时在临床研究中，由于在靶细胞刺激下会促进CAR-T细胞分泌IFN-γ，因此通常CAR-T产品的放行指标之一就是肿瘤抗原刺激下IFN-γ的分泌水平。
目前通常使用Elisa试剂盒进行细胞因子的检测，但是Elisa检测耗费时间长，成本高，操作也较繁琐，不利于CAR-T细胞的快速放行检测。
因此急需一种快速方便的检测受肿瘤抗原刺激后CAR-T细胞分泌IFN-γ情况的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种逆转录病毒载体和应用以及CAR-T细胞放行检测方法，以解决现有技术中采用Elisa试剂盒进行细胞因子的检测，检测耗费时间长，成本高，操作也较繁琐，不利于CAR-T细胞的快速放行检测的技术问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
本发明第一方面公开了一种逆转录病毒载体，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN-γ启动子的转录控制。
通过采用上述方案，本发明的逆转录病毒载体感染宿主CAR-T细胞后，能够逆转录IFN-γ启动子序列和荧光蛋白基因；当宿主CAR-T细胞受到靶细胞刺激时，会同时激活逆转录的IFN-γ启动子序列以及宿主DNA中的IFN-γ启动子序列，从而开始荧光蛋白基因和IFN-γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN-γ即γ干扰素的分泌情况，从而对CAR-T杀伤功能进行评估。
在本发明的某一个实施例中，所述IFN-γ启动子序列为SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示序列中的一种。
在本发明的某一个实施例中，所述荧光蛋白基因为GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一种或多种组合。
在本发明的某一个实施例中，所述逆转录病毒载体不包含增强子。
通过采用上述方案，避免增强子增强荧光蛋白基因表达，从而影响对于荧光蛋白基因的表达情况与IFN-γ基因表达情况的相关性，影响分析结果。
在本发明的某一个实施例中，所述逆转录病毒为慢病毒。
本发明第二方面公开了包括上述逆转录病毒载体的CAR-T细胞。
本发明第三方面公开了上述逆转录病毒载体在CAR-T细胞中的应用。
本发明第四方面公开了上述逆转录病毒载体在CAR-T细胞杀伤功能评估中的应用。
本发明第五方面公开了一种CAR-T细胞杀伤功能评估方法：包括如下步骤：
S1利用如权利要求1至5任一所述的逆转录病毒载体感染CAR-T细胞；
S2将步骤S1得到的CAR-T细胞与靶细胞共培养；
S3取共培养后的细胞进行流式细胞分析，检测荧光蛋白基因表达情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明逆转录病毒载体包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，在感染宿主CAR-T细胞后，能够逆转录IFN-γ启动子序列和荧光蛋白基因；当宿主CAR-T细胞受到靶细胞刺激时，会同时激活逆转录的IFN-γ启动子序列以及宿主DNA中的IFN-γ启动子序列，从而开始荧光蛋白基因和IFN-γ基因的表达，通过检测荧光蛋白基因的表达情况能够分析IFN-γ即γ干扰素的分泌情况，从而对CAR-T杀伤功能进行评估；相对于费时费力、操作繁琐、成本高的Elisa试剂盒检测方法，实现了快速方便的CAR-T杀伤功能评估方法，普及性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明的实施例一的逆转录病毒载体构建结构示意图。
图2是本发明的实施例二的GFP荧光表达情况细胞流式检测结果图。
图3是本发明的对照例二的GFP荧光表达情况细胞流式检测结果图。
图4是本发明的对照例一和对照例二中的Elisa试剂盒检测IFN-γ分泌数据对比图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例一：
如图1所示，本实施例提供了一种逆转录病毒载体，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，其中荧光蛋白基因受到IFN-γ启动子的转录控制，即在逆转录后DNA序列上荧光蛋白基因位于IFN-γ启动子的下游。
其中，逆转录病毒为慢病毒；IFN-γ启动子(pIFN)序列为SEQ ID NO.1所示序列，同样也可以是SEQ ID NO.1所示序列裁剪后得到的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4中所示序列。
荧光蛋白基因为GFP绿色荧光蛋白基因，同样也可以是EGFP、RFP、mcherry等常用荧光蛋白基因中的一种或多种组合，上述均为本领域常规技术手段。
本实施例逆转录病毒载体不包含增强子，避免增强子增强荧光蛋白基因表达，从而影响荧光蛋白基因的表达情况与IFN-γ基因表达情况的相关性。
实施例二：
本实施例提供了实施例一的逆转录病毒载体即pIFN-GFP慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
1)将含有IFN-γ启动子基因片段的pUC57-CAR质粒，用Nhe I和Xho I进行双酶切，凝胶回收试剂盒(全式金)回收IFN-γ启动子基因片段。
2)将慢病毒载体质粒pELNS-GFP用Nhe I和Xho I双酶切后，回收酶切后的产物，应用T4 DNA连接酶(Takara)将载体片段和IFN-γ启动子片段进行连接。连接产物(pELNS-pIFN-GFP)转入感受态细胞进行扩增，提取质粒进行酶切鉴定与测序鉴定。
3)用无内毒素质粒大提试剂盒(QIAGEN)提取pELNS-pIFN-GFP质粒、2个包装质粒pRSV-rev和pGAG-Pol，包膜蛋白质粒pVSV-G，使用分光光度计测定质粒的浓度。
4)转染前一天，取2瓶T75培养的293T细胞，PBS洗一次后，加入胰酶消化细胞，细胞分散后，每瓶加入约5ml的DMEM完全培养基(10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，计数。
5)取3个T150细胞培瓶，每瓶接入2×107个293T细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养约24h，此时细胞的汇合率约为80％-90％。
6)第二天，转染前30～60min，弃去原培养液，换上新配制的的DMEM培养液(10％FBS，1％HEPES，不含双抗)。
7)磷酸钙法转染试剂盒(碧云天)：在50ml离心管中加入4.5ml CaCl2溶液，分别加入如下量的质粒：36ug pRSV-rev，36ug pGAG-Pol，36ug pVSVG，72ug pELNS-pIFN-GFP，充分混匀；
8)向离心管中加入4.5ml BBS溶液，边加边混匀，室温孵育20min；
9)向每个T150培养瓶中液逐滴加入3ml质粒-转染混合液，边加边混匀。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
10)6～8小时后弃去转染培养液，换新鲜DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱。
11)转染48h后，吸出含有病毒颗粒的培养液，用0.45μm的滤器过滤后，置于4℃保存。
12)在细胞培养皿中再加入20ml预热DMEM完全培养基，继续培养24h，收集上清用0.45μm滤器过滤，收集病毒上清。
13)将0.45μm滤器过滤后的病毒上清样品分装到超速离心管中。
14)盖上金属盖，将离心管连同金属盖一起配平，用1XPBS调整使重量偏差在0.02g范围内。
15)将配平的离心管对称放置于超速离心机中，设置离心转速50,000g，20℃离心2小时。
16)离心结束后，小心将离心管从转子中拿出，可以看到在离心管底有一小团沉淀，用Marker笔在外管壁上做标记，倒掉上清，将离心管倒扣在预先铺好的纸巾上，使残余液体流掉，用移液枪将挂在壁上的液滴吸走。
17)向每个离心管中加入400μl的Opti-MEM，用200μl移液器吹打使沉淀溶解，尽量减少泡沫的产生；将病毒分成25到50μl一管，冻存到-80℃冰箱，进行长期保存。
实施例三：
本实施例提供了一种CAR-T细胞杀伤功能评估方法，包括如下步骤：
1)采集外周血，分离人T细胞。
2)用含5％自体血浆+300IU/ml IL-2的完全培养基培养新制备的T细胞，并加入CD3/CD28 Dynabeads活化T细胞并培养，优选地，细胞培养条件为5％CO2、37℃。
3)第二天按分别按MOI＝3加入CD19 CAR慢病毒和pIFN-GFP慢病毒制备pIFN-GFP/CD19 CAR-T细胞。
4)第四天，离心去慢病毒，继续培养，优选地，细胞密度为0.5×106细胞/ml，每隔1～2天补充培养基。
5)培养到第八天，将pIFN-GFP/CD19 CAR-T和与靶细胞(Nalm-6)进行共培养，优选地CAR-T与靶细胞的比例为2：1，共培养24h后，收集上清与细胞。
6)取共培养后的细胞进行流式检测GFP荧光表达情况，所用抗体为CD3-APC(BDBiosciences公司)，得到图2的检测结果。
对照例一：
本对照例采用Elisa试剂盒进行CAR-T细胞杀伤功能评估，包括如下步骤：
1)采集外周血，分离人T细胞。
2)用含5％自体血浆+300IU/ml IL-2的完全培养基培养新制备的T细胞，并加入CD3/CD28 Dynabeads活化T细胞并培养，优选地，细胞培养条件为5％CO2、37℃。
3)第二天按分别按MOI＝3加入CD19 CAR慢病毒和pIFN-GFP慢病毒制备pIFN-GFP/CD19 CAR-T细胞。
4)第四天，离心去慢病毒，继续培养，优选地，细胞密度为0.5×106细胞/ml，每隔1～2天补充培养基。
5)培养到第八天，将pIFN-GFP/CD19 CAR-T和与靶细胞(Nalm-6)进行共培养，优选地CAR-T与靶细胞的比例为2：1，共培养24h后，收集上清与细胞。
6)取共培养的上清，用Elisa试剂盒(R&D)检测IFN-γ的分泌。
对照例二：
1)采集外周血，分离人T细胞。
2)用含5％自体血浆+300IU/ml IL-2的完全培养基培养新制备的T细胞，并加入CD3/CD28 Dynabeads活化T细胞并培养，优选地，细胞培养条件为5％CO2、37℃。
3)第二天按MOI＝3加入pIFN-GFP慢病毒制备pIFN-GFP T细胞。
4)第四天，离心去慢病毒，继续培养，优选地，细胞密度为0.5×106细胞/ml，每隔1～2天补充培养基。
5)培养到第十天，收集上清与细胞。
6)取共培养的上清，用Elisa试剂盒(R&D)检测IFN-γ的分泌。
7)取共培养后的细胞进行流式检测GFP荧光表达情况，所用抗体为CD3-APC(BDBiosciences公司)，得到图3的检测结果。
效果例：
图4为对照例一和对照例二中Elisa试剂盒分析结果对比图。由图4可以看出在Nalm-6阳性靶细胞刺激下，pIFN-GFP/CD19 CAR-T分泌很高水平的IFN-γ，达到9000pg/mL。作为对照，IFN-pGFP T细胞几乎不分泌IFN-γ。
分析图2和图3，流式检测显示，pIFN-GFP/CD19 CAR-T具有非常高比例的细胞为GFP阳性，达到58.33％。而作为对照，IFN-pGFP T细胞具有非常少的GFP阳性，仅为6.30％。
因此，能够通过细胞流式分析pIFN-GFP/CD19 CAR-T的荧光蛋白表达情况，来快速评判IFN-γ的分泌情况，相比于即繁琐又耗时的Elisa检测，此种方法能快速的通过流式评判CAR-T受靶细胞刺激的情况。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京艾德免疫治疗研究院有限公司
<120> 逆转录病毒载体、应用及CAR-T细胞杀伤功能评估方法
<130> 2020
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列（artificial sequence）
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tttaaaaggc tgcccctttg taaaggtttg agaggcccta gaatttcgtt tttcacttgt 180
tcccaaccac aagcaaatga tcaatgtgct ttgtgaatga agagtcaaca ttttaccagg 240
gcgaagtggg gaggtacaaa aaaatttcca gtccttgaat ggtgtgaagt aaaagtgcct 300
tcaaagaatc ccaccagaat ggcacaggtg ggcataatgg gtctgtctca tcgtcaaagg 360
acccaaggag tctaaaggaa actctaacta caacacccaa atgccacaaa accttagtta 420
ttaatacaaa ctatcatccc tgcctatctg tcaccatctc atcttaaaaa acttgtgaaa 480
atacgtaatc ctcaggagac ttcaattagg tataaatacc agcagccaga ggaggtgcag 540
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ga 242

Claims (9)

1.一种逆转录病毒载体，其特征在于，包含编码IFN-γ启动子和荧光蛋白基因的序列，所述荧光蛋白基因受所述IFN-γ启动子的转录控制。
2.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体，其特征在于，所述IFN-γ启动子序列为SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示序列中的一种。
3.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体，其特征在于，所述荧光蛋白基因为GFP、EGFP、RFP、mcherry中的一种或多种组合。
4.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体，其特征在于，不包含增强子。
5.根据权利要求1所述的逆转录病毒载体，其特征在于，所述逆转录病毒为慢病毒。
6.一种包括如权利要求1至5任一所述的逆转录病毒载体的CAR-T细胞。
7.一种如权利要求1至5任一所述的逆转录病毒载体在CAR-T细胞中的应用。
8.一种如权利要求1至5任一所述的逆转录病毒载体在CAR-T细胞杀伤功能评估中的应用。
9.一种CAR-T细胞杀伤功能评估方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1利用如权利要求1至5任一所述的逆转录病毒载体感染CAR-T细胞；
S2将步骤S1得到的CAR-T细胞与靶细胞共培养；
S3取共培养后的细胞进行流式细胞分析，检测荧光蛋白基因表达情况。
CN202011034059.4A 2020-09-27 2020-09-27 逆转录病毒载体、应用及car-t细胞杀伤功能评估方法 Pending CN112111522A (zh)

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