CN102190735B - 一种融合蛋白tat-oct4及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种融合蛋白TAT-OCT4及其编码基因与应用。本发明提供的融合蛋白，TAT跨膜肽以及结合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的细胞重编程相关因子。将本发明的融合蛋白TAT-OCT4处理HAF细胞后，促进了成纤维细胞增殖，促进成纤维细胞中细胞周期蛋白表达量增强。TAT跨膜肽输送核转录因子蛋白可作为一个细胞重编程的方法，将在细胞诱导和临床上具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白TAT-OCT4及其编码基因与应用。
背景技术
OCT4与NANOG是参与胚胎干(ES)细胞多能性维持和自我更新的两个核心转录因子。同时也在体外诱导成体细胞向诱导性多潜能干细胞(iPS cell)重编程过程中起着关键作用。在早期的iPS细胞诱导研究中，大都采用病毒转染等基因修饰的方法，但此方法存在着很大安全隐患。在09年底有文献报道，利用多精氨酸蛋白跨膜肽与诱导因子OCT4，SOX2，c-MYC，KLF4也可以成功的诱导出人类和小鼠的iPS细胞。但是目前关于单独诱导因子在重编程中功能的研究很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白，命名为TAT-OCT4。
本发明提供的融合蛋白，包括TAT跨膜肽以及结合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的细胞重编程相关因子；
所述细胞重编程相关因子为OCT4转录因子、c-myc因子、klf4因子或SOX2因子；所述OCT4转录因子的氨基酸序列如序列表中序列6所示。
上述TAT跨膜肽是如下1)或2)所述的多肽：
1)序列表中序列2所示的氨基酸残基组成的多肽；
2)序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的N末端和/或C末端加上1-10个任意氨基酸残基且具有跨膜功能的由1)衍生的多肽；
所述TAT跨膜肽2)是如下a)或b)或c)：
a)在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA标签；
b)在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的N末端加上His标签；
c)在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的C末端加上序列表中序列4所示的HA标签并在序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的N末端加上His标签。
进一步，上述蛋白是如下I)或II)的蛋白质：
I)其氨基酸序列如序列表中序列8的第22-403位所示；
II)其氨基酸序列如序列表中序列8所示。
上述的蛋白的编码基因属于本发明的保护范围。
进一步讲，上述基因是如下1)或2)：
1)其核苷酸序列如序列表中序列7的第64-1212位；
2)其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
含有上述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
具体地讲，上述重组表达载体是将上述的基因插入载体pET-28a的多克隆位点得到的载体。
上述的蛋白或上述的基因在制备如下(1)-(4)中任一所述产品中的应用：
(1)促进细胞向诱导性多潜能干细胞转变的产品；
(2)促进细胞增殖的产品；
(3)促进细胞中内源NANOG转录因子或OCT4转录因子表达量增强的产品；
(4)促进细胞中细胞周期蛋白表达量增强的产品。
上述NANOG转录因子的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述NANOG转录因子的编码基因如序列表中序列9所示；所述细胞周期蛋白是CDC25A或CDK6。
上述细胞是成纤维细胞；优选是是HAF细胞
实施例5证明：HAF细胞内源性的OCT4和NANOG的转录均可被外源加入的TAT-OCT4和TAT-NANOG融合蛋白所激活。TAT跨膜肽输送核转录因子蛋白可作为一个细胞重编程的方法，将在iPS细胞诱导和临床上具有重要的应用前景。可见，我们制备的导肽融合蛋白TAT-OCT4和TAT-NANOG均可以激活成纤维细胞内源的OCT4与NANOG表达，这也反应了在iPS重编程过程中转录因子OCT4和NANOG的自我调控与相互调控。而且TAT-NANOG可以在体外显著的提高细胞的增殖速度，这样为细胞的体外扩增及组织工程的临床应用提供了一种更加可控，更加安全的有效途径。
附图说明
图1为目的蛋白结构示意图，及其表达纯化的SDS-PAGE电泳检测与western blot鉴定；A，融合蛋白结构示意图；B，目的蛋白表达的SDS-PAGE电泳检测：1，Marker；2，5，空白对照的上清液和包涵体沉淀；3，6，TAT-OCT4表达菌株的上清液和包涵体沉淀；4，6，TAT-NANOG表达菌株的上清液和包涵体沉淀；C，D，分别为TAT-NANOG和TAT-OCT4的镍柱纯化及western blot鉴定。
图2为免疫荧光的方法对TAT融合蛋白的跨膜效率检测。
图3为TAT-OCT4和TAT-NANOG细胞内转录活性检测。
图4为空白对照组，TAT-NANOG组，TAT-OCT4组HAF细胞中OCT4的内源表达。
图5为空白对照组，TAT-NANOG组，TAT-OCT4组HAF细胞中NANOG的内源表达。
图6为融合蛋白TAT-NANOG进入成纤维细胞后提高细胞的增殖速度。
图7为TAT-NANOG处理后HAF细胞中CDC25A的表达相对于TAT-OCT4组和对照组显著上调，而CDK6的表达略有上调。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、TAT跨膜肽核转录因子构建
利用TRIZOL试剂盒(购自Invitrogen公司)提取PA-1细胞(购自ATCC)的总RNA，用Dnase I(购自Invitrogen)消化后，用反转录酶Super Transcript III(Invitrogen)将上述PA-1细胞的总RNA反转录为cDNA，以该cDNA为模板，分别设计OCT4的上游引物5’-GCGGAGCTCATGGCGGGACACCTGG-3’和下游引物5’-ATAGCGGCCGCTTATCAGTTTGAATGCA-3’，NANOG的上游引物5’-GAGCTCATGAGTGTGGATCCAGCTT-3’和下游引物5’-GCGGCCGCTCACACGTCTTCAGGTT-3’，用
Pfx DNA聚合酶(购自Invitrogen公司)进行PCR反应。
回收上述PCR反应产物，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果分别获得1090bp的OCT4扩增产物和918bp的NANOG扩增产物，回收该条带连入pMD18-T克隆载体中并进行序列测定。测序结果表明，获得条带与OCT4 GenBank Accession Number：NM_002701.4和NANOG GenBank Accession Number：NM_024865.2的序列一致。也即所述1090bp的OCT4扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列5所示，可编码序列表中序列6所示的蛋白。
然后我们又通过搭桥PCR的方法将跨膜肽TAT与标签HA分别构建在转录因子OCT4和NANOG的5’末端。跨膜肽TAT的编码基因如序列表中序列1所示，可编码序列表中序列2所示的蛋白。标签HA的编码基因如序列表中序列3所示，可编码序列表中序列4所示的蛋白。
具体方法如下：第一轮PCR反应分别用OCT4内部上游引物：5’CGCCGCTATCCGTATGATGTGCCGGATGTGGCGGAGCTCATGGCGGGACACCTGG 3’，和OCT4下游引物5’ataGCGGCCGCTTATCAGTTTGAATGCA 3’以上述所得正确的OCT4序列为模板得到扩增产物1，然后再以扩增产物1为模板分别用OCT4外部上游引物5’ataCATATGTATGGCCGCAAAAAACGCCGCCAGCGCCGCCGCTATCCGTATG3’与OCT4下游引物5’ataGCGGCCGCTTATCAGTTTGAATGCA 3’进行第二轮PCR扩增反应得到TAT-HA-OCT4的DNA序列。
我们用同样的方法得到了TAT-HA-NANOG的DNA序列，接着我们利用设计在引物上的NdeI(5’端)与NotI(3’端)酶切位点使用这两种限制性内切酶(Takara公司)进行双酶切反应，然后连入原核表达载体pET28a中，然后进行测序鉴定，结果显示序列正确，将这两种表达载体分别命名为PET-TAT-OCT4，PET-TAT-NANOG。融合蛋白的结构示意图如图1所示。测序表明：表达载体PET-TAT-OCT4是将序列表中序列7的自5’端第64-1212位的DNA片段插入pET28a中构建而成的。其中序列表中序列7的自5’端第64-1212位的DNA片段可编码序列表中序列8的第22-403位所示的蛋白。
实施例2、TAT跨膜肽核转录因子的表达纯化
将表达载体PET-TAT-OCT4，PET-TAT-NANOG和对照空载体pET28a转入大肠杆菌E.coli的BL21 Rostta-Gami(购自Invitrogen公司)菌株中，在37℃的条件下用1mMIPTG(购自Sigma公司)诱导表达5小时后，离心收集菌体，进行超声破碎，通过镍柱(购自GE公司)利用HIS标签对目的蛋白进行了纯化，最后分别用OCT4的抗体(购自Santa Cruze公司)和NANOG的抗体对目的蛋白进行了western blot鉴定。表达纯化及鉴定的结果如图1所示。其中表达载体PET-TAT-OCT4表达出的融合蛋白(TAT-OCT4)的氨基酸序列如序列表中序列8所示。序列表中序列8的第1-21位是pET28a载体上自带的基因所编码的包括His标签在内的蛋白。
实施例3、TAT跨膜肽核转录因子的细胞转染检测
我们分别将终浓度为0.2M的TAT-NANOG和TAT-OCT4加入到HAF细胞的培养基中，2小时后我们通过免疫荧光的方法用HA的抗体(购自Sigma公司)对TAT融合蛋白的跨膜效率进行了检测。结果表明TAT融合蛋白已穿过细胞膜进入胞质中，并且已有部分蛋白定位在细胞核中(图2)。
实施例4、TAT跨膜肽核转录因子转录活性检测
对进入细胞核的转录因子TAT-OCT4和TAT-NANOG，我们分别利用带有OCT4和NANOG特异结合序列的报告质粒进行了双荧光素酶报告系统分析，来对其转录活性进行了检测。与阴性对照相比，TAT-OCT4和TAT-NANOG组均有显著上调(图3)。
实施例5、内源性的OCT4和NANOG的转录活性检测
OCT4，NANOG和SOX2是调控ES细胞多能型维持以自我更新的核心因子，文献报道它们可以通过自调控和互调控的方式来维持在细胞内的平衡。因此我们使用SYBRGreen(购自Applied Biosystems公司)通过定量PCR方法来检测用跨膜肽融合蛋白刺激后HAF细胞内源相关基因的表达变化。处理组与对照组的cDNA制备与实施例1中方法相同。检测序列表中序列5所示的OCT4基因和序列表中序列9所示的NANOG基因的所用引物如表2所示。通过研究我们发现，HAF细胞内源性的OCT4和NANOG的转录均可被外源加入的TAT-OCT4和TAT-NANOG融合蛋白所激活(图4，图5)。
表2
| 基因名称 | 上游引物 | 下游引物 |
| OCT4 | 5’CGACCATCTGCCGCTTTG3’ | 5’GCCGCAGCTTACACATGTTCT3’ |
| NANOG | 5’CCAAAGGCAAACAACCCACTT3’ | 5’CGGGACCTTGTCTTCCTTTTT 3’ |
| β-actin | 5′-ACCGAGCGCGGCTACAG-3 | 5′CTTAATGTCACGCACGATTTCC3′ |
实施例6、TAT-NANOG进入成纤维细胞后促进细胞的增殖
融合蛋白TAT-NANOG进入成纤维细胞后，可以在低血清培养条件下可以显著的提高细胞的增殖速度，我们的统计结果显示，以相同的细胞密度接种HAF，在加入0.2μMTAT融合蛋白48小时后，TAT-NANOG组的细胞密度已达到14.22X104cells/mm2，显著高于TAT-OCT4组的9.73X104cells/mm2和空白对照组的9.54X104cells/mm2(图6)。
实施例7、TAT-NANOG调控基因表达
在人类的ES细胞中，NANOG通过调控CDC25A与CDK6这两种重要的细胞周期蛋白来促进细胞增殖。我们也通过荧光定量PCR的方法来检测融合蛋白处理后这两种周期蛋白的表达变化。所用引物如表3所示。结果显示(图7)TAT-NANOG处理后HAF细胞中CDC25A的表达相对于TAT-OCT4组和对照组显著上调，而CDK6的表达略有上调。
表3
| 基因名称 | 上游引物 | 下游引物 |
| CDC25A | 5’AGCTCCAGCACTCGGTCAGT 3’ | 5’CCAGGTGGAGACTCCTCTTGAG3’ |
| CDK6 | 5TGAACCAAAATGCCACATACACT 3’ | 5’TTCGGCCTTTCGCATAGG3’ |
| β-actin | 5’-ACCGAGCGCGGCTACAG-3 | 5’CTTAATGTCACGCACGATTTCC3’ |
可见，我们制备的导肽融合蛋白TAT-OCT4和TAT-NANOG均可以激活成纤维细胞内源的OCT4与NANOG表达，这也反应了在iPS重编程过程中转录因子OCT4和NANOG的自我调控与相互调控。而且TAT-NANOG可以在体外显著的提高细胞的增殖速度，这样为细胞的体外扩增及组织工程的临床应用提供了一种更加可控，更加安全的有效途径。
Claims (4)
1.一种融合蛋白在制备促进成纤维细胞中内源NANOG转录因子和/或内源OCT4转录因子表达量增强的产品中的应用：
所述融合蛋白，包括TAT跨膜肽以及结合在所述TAT跨膜肽的氨基端或羧基端的细胞重编程相关因子；所述细胞重编程相关因子为OCT4转录因子；所述OCT4转录因子的氨基酸序列如序列表中序列6所示；所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列8所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述NANOG转录因子的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述NANOG转录因子的编码基因如序列表中序列9所示。
3.权利要求1中所述融合蛋白的编码基因在制备促进成纤维细胞中内源NANOG转录因子和/或内源OCT4转录因子表达量增强的产品中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。
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