ES2962560T3 - Célula fúngica con capacidad mejorada de producción de proteínas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al suministro de células fúngicas genéticamente modificadas, tales como células de levadura, con una capacidad mejorada para producir y secretar diferentes proteínas recombinantes. La capacidad mejorada se obtiene mediante la interrupción del transporte intracelular entre el Golgi y el endosoma. En realizaciones particulares, la alteración se logra mediante regulación negativa o eliminación del gen que codifica un homólogo de Tda3p. La célula fúngica y el método de la invención permitirían la producción a gran escala de proteínas recombinantes en células fúngicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Célula fúngica con capacidad mejorada de producción de proteínas

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente al desarrollo de microorganismos modificados genéticamente. Más específicamente, la invención se refiere a células fúngicas que contienen modificaciones que permiten la producción y secreción de altos niveles de proteínas recombinantes.

Antecedentes

La producción de proteínas recombinantes por células fúngicas juega un papel importante en diversas industrias. Por ejemplo, diversas enzimas industriales y productos biofarmacéuticos se producen por sistemas fúngicos. Por lo tanto, es deseable desarrollar cepas de plataforma fúngica que puedan producir altos niveles de diferentes proteínas recombinantes.

Se han dirigido varios esfuerzos de investigación para crear cepas de plataforma para la producción de proteínas mediante ingeniería genética de la célula huésped. Por ejemplo, varios estudios tienen que aumentar la producción de proteínas recombinantes aumentando la capacidad de plegamiento de proteínas de la célula. Tang et al (Biotechnol Bioeng. 2015 Sep;112(9):1872-82. doi: 10,1 002/bit.25596) sobreexpresaron la proteína chaperona del retículo endoplásmico (RE) y el disulfuro isomerasa Pdi1p en levadura, y por lo tanto se trató para aumentar la secreción de tres proteínas heterólogas, p-glucosidasa, endoglucanasa y a-amilasa. Además Hou et al (Appl Microbiol Biotechnol.

2013 Apr;97(8):3559-68. doi: 10,1007/s00253-012-4596-9) mostraron que la sobreexpresión de HSF1, un factor de transcripción que controla la expresión de múltiples chaperonas de proteínas, condujo a una mayor producción de aamilasa heteróloga, invertasa endógena y precursor de insulina humana. Otro factor de transcripción, HAC1, está involucrado en la respuesta de proteína desplegada general. Facilita la expresión de PDI o BiP en una célula, y se ha empleado con éxito para obtener niveles mejorados de producción de anticuerpos por Gaser et al (Biotechnol Bioeng.

2006 Jun 5;94(2):353-61.). Koskela et al (Biotechnol J. 2017 Apr 21. doi: El 10,1002/bio.201600631.) mostró que la expresión de BiP de mamífero, la cochaperona GRP170 o la peptidil-prolil isomerasa FKBP2 aumentó la producción de anticuerpos en levaduras. De Ruijter et al (Microb Cell Fact. 2016 May 23;15:87. doi: 10.1186/s12934-016-0488-5) también han mostrado que la sobreexpresión del factor de plegamiento Cpr5p podría conducir a una mayor producción de anticuerpos.

Otros estudios se han centrado en proteasas y mostraron que la supresión de proteasas podría conducir a una mayor producción de proteínas. Tomimoto et al (Biosci Biotechnol Biochem. 2013; 77:2461-6) pudieron obtener una mayor producción de interferón-p humano en levaduras por alteración de las proteasas codificadas porPEP4yPRB1.Además, Choo et al (J Biotechnol. 2010 Aug 20;149:1-7. doi: 10,1016/j.jbiotec.2010.06.014.) mostraron que la alteración de diversas proteasas de yapsina redujo la degradación proteolítica de la proteína de hormona paratiroidea humana durante la fermentación.

Otros estudios han incorporado la ingeniería del tráfico intracelular. Hou et al (Metab Eng. 2012 Mar;14(2):120-7. doi: 10,1016/j.ymben.2012.01.002) han demostrado que la sobreexpresión de Sec1p, una proteína que está implicada en la exocitosis S .cerevisiae,condujo a una mayor secreción de proteínas heterólogas precursoras de insulina humana y a-amilasa, y también la secreción de una proteína invertasa endógena alrededor de 1,5 x.

Otros estudios también han intentado diseñar los componentes implicados en el transporte de vesículas del retículo endoplásmico (RE) al Golgi, y desde el Golgi a la membrana plasmática (PM). Bao et al (Appl Environ Microbiol. 2017.

5. pii: AEM.03400-16. doi: 10.1128/AEM.03400-16) han demostrado que la sobreexpresión de Sec16p, una proteína implicada en el transporte entre el ER y el Golgi, condujo a una mayor secreción de a-amilasa heteróloga. Tang et al (Biotechnol Biofuels. 2017 Feb 27;10:53. doi: 10.1186/s13068-017-738-8.) mostraron que la modificación de los componentes dirigidos en el tráfico de la vesícula ER al Golgi, incluyendo Sec12p, Sec13p, Erv25p y Bos1p, mejoró la actividad extracelular de la endoglucanasa heteróloga. Además, la sobreexpresión de los componentes en el tráfico de las vesículas de membrana de Golgi a plasma, incluyendo Ssolp, Snc2p, Sec1p, Exo70p, Ypt32p y Sec4p, condujo a una mayor secreción de p-glucosidasa. Van Zyl et al (Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Jan; 100:505-18. doi: 10.1007/s00253-015-7022-2.) también ha demostrado que la producción de celobiohidrolasa y p-glucosidasa heteróloga podría aumentarse mediante una única sobreexpresión de algunos de los SNARE del retículo endoplásmico (RE) al Golgi (BOS1, BET1, SEC22 y SED5). Además, la solicitud de patente US- 2013/0011875 A1 describe una célulaPichia pastoriscon actividad de clasificación vacuolar interrumpida, en la que la interrupción se produce mediante la supresión del receptor de clasificación de proteína vacuolar 10 (Vps10), así como la interrupción de uno o más genes que codifican una proteína asociada con el reciclaje de Vps10 al Golgi tardío.

Un estudio de Huang et al (Proc Natl Acad Sci USA. 2015 Aug 25;112(34):E4689-96. doi: 10.1073/pnas.1506460112.) registró la combinación de mutagénesis UV y clasificación de microfluidos para descubrir los objetivos potenciales e informar de que la supresión deHDA2, HDA3ySNC2en levaduras da como resultado una mayor producción de proteínas.

TDA3 (también conocido como BTN3) es una oxidorreductasa putativa y se demostró que interactúaba con ambas epsinas Ent3 y Ent5. DAR3 es un regulador negativo de la proteína unida a la enfermedad de Bailen Btn2 implicada en la recuperación de SNARE específicos (Vti1, Snc1, TIg1 y Tlg2) desde el endosoma tardío al Golgi. Se sugirió que TDAR3 secuestra Btn2 lejos de sus sustratos, regulando así negativamente la agregación y el tráfico de proteínas. Se demostró que en células mutantesbfn3A,la clasificación endosómica de las cargas ubiquitiladas y el reciclaje endosómico de Snc1 SNARE se retrasan.

COG5 es un componente del complejo de Golgi oligomérico conservado que funciona en el tráfico de proteínas para mediar la fusión de las vesículas de transporte a los compartimentos de Golgi.

Kanneganti et al. (Molecular Biology of the Cell 2011 22: 1648-1663) describe que la levadura Btn2 facilita la recuperación de proteínas específicas de endosomas tardíos (LEs) al Golgi.BTN3se describe como el ortólogo de levadura del gen de deficiencia de complejo I humano. La sobreexpresión deBTN3localiza incorrectamente las proteínas de Golgi a Les y altera la localización Btn2. Btn3 se describe como un regulador negativo de la clasificación de proteínas intracelulares, que puede ser importante en el inicio de la deficiencia del complejo I y la enfermedad de Barten en seres humanos.

Resumen

Es un objetivo general proporcionar una célula fúngica mejorada.

Es un objetivo particular proporcionar una célula fúngica que pueda utilizarse para la producción basada en fermentación de proteínas recombinantes.

Estos y otros objetivos se cumplen con las realizaciones según se describen en la presente descripción.

La presente invención se define en las reivindicaciones independientes. Otras realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

Un aspecto de las realizaciones se refiere a una célula fúngica. Según las realizaciones, la célula fúngica carece de un gen que codifica Tda3p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Tda3p. La célula fúngica también comprende un gen heterólogo que codifica una proteína heteróloga. La célula fúngica tiene un transporte alterado entre el Golgi y el endosoma.

Otro aspecto de las realizaciones se refiere a un método para producir una proteína recombinante. El método comprende cultivar una célula fúngica según cualquiera de las realizaciones en un medio de cultivo y en condiciones de cultivo adecuadas para la producción de la proteína recombinante por la célula fúngica. El método también comprende recoger la proteína recombinante del medio de cultivo y/o de la célula fúngica.

La célula fúngica de las realizaciones comprende modificaciones en el transporte intracelular entre el Golgi y el endosoma, combinadas con la expresión de una proteína recombinante.

Breve descripción de los dibujos

Las realizaciones, junto con otros objetivos y ventajas de las mismas, pueden entenderse mejor haciendo referencia a la siguiente descripción conjuntamente con las figuras adjuntas, en las que:

Figura 1: Descripción general del tráfico intracelular en una célula fúngica. Las proteínas se transportan desde el retículo endoplásmico (RE) al Golgi, donde se clasifican en vesículas de transporte anterógrado para proteínas residentes e R, en vesículas secretoras para membrana plasmática (PM) y secreción, y en vesículas de clasificación de proteínas vacuolares para proteínas vacuolares que pasan a través de los endosomas. La presente invención implica la interrupción del transporte entre el Golgi y el endosoma.

Figura 2: La alteración de genes seleccionados, especialmenteHDA2, HDA3, PGM2, PXA1, EMC1, GOS1, VPS5, DAR3oSNC2en la levaduraSaccharomyces cerevisiaeej., conduce a un aumento en la producción de proteínas recombinantes. a) Rendimiento de proteína recombinante. b) Porcentaje intracelular: la fracción de la proteína que se retiene en la célula c) Peso de células secas. En este estudio se utilizó la a-amilasa como proteína modelo.

Figura 3: Efecto combinatorio de la eliminación génica en la producción de proteínas en levadura. a) Rendimiento de la proteína recombinante. b) Porcentaje intracelular: la fracción de la proteína que se retiene en la célula. c) Peso de células secas. En este estudio se utilizó la a-amilasa como proteína modelo.

Figura 4: La alteración deVPS17aumenta la producción de proteínas recombinantes a) y disminuye el porcentaje de proteína recombinante intracelular b), lo que sugiere una mayor secreción. En este estudio se utilizó la a-amilasa como proteína modelo.

Figura 5: Efecto deERVE29y/o sobreexpresión de COG5 sobre el rendimiento total de proteínas a), porcentaje de proteína intracelular b) y el peso de células secas c). En este estudio se utilizó la a-amilasa como proteína modelo.

Figura 6: La combinación de alteración génica y sobreexpresión seleccionadas aumenta la producción de proteínas a) Rendimiento total de proteínas. b) Porcentaje de proteína intracelular. c) Peso de células secas. En este estudio se utilizó la a-amilasa como proteína modelo. La figura muestra que la combinación de supresiones deHDA2, VPS5,GOS1 yTDA3con sobreexpresión de COG5 y UF/1 genera un aumento de la producción de la proteína a-amilasa y reduce el porcentaje de a-amilasa intracelular, lo que sugiere una mayor secreción.

Figura 7: Combinación de modificaciones seleccionadas con proteínas recombinantes adicionales. Este ejemplo muestra que la cepa de mejor producción (que contiene supresiones enHDA2, VPS5, GOS1yTDA3y sobreexpresión de COG5 yUF/1)también se puede usar para aumentar la producción de glucano 1,4-a-glucosidasa.

Figura 8: Fermentación discontinua por lotes de la cepa que contiene la cepa de mejor producción con supresiones enHDA2, VPS5,GOS1 yTDA3y sobreexpresión de COG5 yUF/1.En este estudio se utilizó la a-amilasa como proteína modelo.

Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas de la misma

La presente invención se describirá más detalladamente a continuación en la presente memoria con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestran realizaciones de la invención. Esta descripción no pretende ser un catálogo detallado de todas las diferentes formas en que la invención puede implementarse, o todas las características que pueden añadirse a la presente invención. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una realización pueden incorporarse en otras realizaciones, y las características ilustradas con respecto a una realización particular pueden eliminarse de esa realización. Además, la presente invención también contempla que, en algunas realizaciones de la invención, se pueda excluir u omitir cualquier característica o combinación de características expuestas en la presente memoria. Además, numerosas variaciones y adiciones a las diversas realizaciones sugeridas en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, que no se apartan de la presente invención. Por lo tanto, las siguientes descripciones pretenden ilustrar algunas realizaciones particulares de la invención, y no pretenden especificar exhaustivamente todas las permutaciones, combinaciones y variaciones de las mismas.

A menos que se defina lo contrario en la presente descripción, los términos científicos y técnicos usados en la presente descripción tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la técnica.

En general, las nomenclaturas usadas en relación con técnicas de bioquímica, enzimología, biología molecular y celular, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos, descritas en el presente documento, son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica.

Los métodos y técnicas convencionales mencionadas en la presente descripción se explican con más detalle, por ejemplo, en Molecular Cloning, a laboratory manual [second edition] Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, for example in Sections 1.21 “ Extraction And Purification Of Plasmid DNA” , 1.53 “ Strategies For Cloning In Plasmid Vectors” , 1.85 “ Identification Of Bacterial Colonies That Contain Recombinant Plasmids” , 6 “ Gel Electrophoresis Of DNA” , 14 “ In vitro Amplification Of DNA By The Polymerase Chain Reaction” , and 17 “ Expression Of Cloned Genes In Escherichia coli” .

Los números de la Comisión de Enzimas (EC) (también denominados “ clases” en el presente documento), a lo largo de esta memoria descriptiva, son según el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB) en su recurso “ Nomenclatura enzimática” (1992, incluyendo los Suplementos 6-17) disponibles, por ejemplo, como “ Enzyme nomenclature 1992: recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes” , Webb, E. C. (1992), San Diego: Published for the International Union of Biochemistry and Molecular Biology by Academic Press (ISBN 0-12-227164-5). Este es un esquema de clasificación numérica basado en las reacciones químicas catalizadas por cada clase de enzima.

La terminología utilizada para describir la invención en la presente descripción únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa de la invención.

A menos que el contexto indique lo contrario, se pretende específicamente que las diversas características de la invención descritas en la presente memoria se puedan usar en cualquier combinación. Además, la presente invención también contempla que, en algunas realizaciones de la invención, se pueda excluir u omitir cualquier característica o combinación de características expuesta en la presente memoria. A modo ilustrativo, si la memoria descriptiva indica que un complejo comprende los componentes A, B y C, se pretende específicamente que cualquiera de A, B o C, o una combinación de los mismos, se pueda omitir y excluir de forma específica o en cualquier combinación.

Como se usan en la descripción de la invención y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “ un” , “ una” y “ el/la” también pretenden incluir las formas en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Asimismo, como se usa en la presente memoria, “y/o” se refiere a y abarca todas y cada una de las posibles combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa (“ o” ).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de esta especificación, las palabras "comprende" y "contiene" y las variaciones de las palabras, por ejemplo "que comprende" y "comprende", significan "que incluye, pero sin limitarse a", y no excluyen otros restos, aditivos, componentes, números enteros o pasos. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones de la presente memoria descriptiva, el singular abarca el plural, a menos que el contexto requiera lo contrario. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, debe entenderse que la memoria descriptiva contempla tanto la pluralidad como la singularidad, a menos que el contexto requiera lo contrario.

Como se usa en la presente memoria, la expresión transitoria “ que consiste” significa básicamente que el alcance de una reivindicación debe interpretarse de forma que incluye los materiales o los pasos citados y aquellos que no afectan materialmente a la característica o las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. Por lo tanto, el término “ que consiste esencialmente en” cuando se usa en una reivindicación de esta invención no pretende interpretarse como equivalente a “ que comprende”

Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación se definen una serie de términos.

Paralelamente como se usa en la presente memoria, los términos “ secuencia de nucleótidos” , “ ácido nucleico” , “ molécula de ácido nucleico” , “ oligonucleótido” y “ polinucleótido” se refieren a ARN o ADN, que incluye ADNc, un fragmento o sección de ADN, ADN genómico, ADN sintético, ADN plasmídico, ARNm y ARN antisentido, cualquiera de los cuales puede ser monocatenario o bicatenario, lineal o ramificado, o un híbrido de los mismos. Las moléculas de ácido nucleico y/o las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente memoria se presentan en el presente documento en la dirección 5” a 3” , de izquierda a derecha y están representadas usando el código estándar para representar los caracteres de nucleótidos como se establece en las reglas de secuenciación de EE. UU., 37 CFR §§1.821-1,825 y la norma de Organización de Propiedad Intelectual Mundial (WIPO) ST.25. Cuando el ARNbc se produce sintéticamente, las bases menos comunes, tales como la inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otros también pueden usarse para el apareamiento antisentido, de dsARN y de ribozima. Por ejemplo, se ha demostrado que los polinucleótidos que contienen análogos de propino C-5 de uridina y citidina se unen al ARN con alta afinidad y son potentes inhibidores antisentido de la expresión génica. También se pueden hacer otras modificaciones, tales como la modificación a la cadena principal del fosfodiéster, o el 2'-hidroxi en el grupo de azúcar ribosa del ARN.

El término “ recombinante” significa que un ácido nucleico específico (ADN o ARN) es el producto de diversas combinaciones de etapas de clonación, restricción y/o ligación que resultan en una construcción que tiene una secuencia estructural codificante o no codificante distinguible de los ácidos nucleicos endógenos que se encuentran en sistemas naturales. El término “ proteína recombinante” se refiere a la proteína que puede resultar de la expresión del ADN recombinante dentro de una célula.

Como se usa en el presente documento, el término “ gen” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de usarse para producir ARNm, ARN antisentido, miARN, ligodesoxiribonucleótido antisentido anti-microARN (AMO) y similares. Los genes pueden o no ser capaces de usarse para producir una proteína funcional o un producto génico. Los genes pueden incluir regiones codificantes y no codificantes, por ejemplo intrones, elementos reguladores, promotores, potenciadores, secuencias de terminación y/o regiones no traducidas 5” y 3” . Un gen puede “ aislarse” mediante lo cual se entiende un ácido nucleico que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que se encuentran normalmente en asociación con el ácido nucleico en su estado natural. Dichos componentes incluyen otro material celular, medio de cultivo de producción recombinante y/o diversos productos químicos utilizados en la síntesis química del ácido nucleico.

Un “ gen interrumpido” como se define en la presente descripción implica cualquier mutación o modificación en un gen que da como resultado un gen y un producto génico parcial o completamente no funcional. Dicha mutación o modificación incluye, entre otros, una mutación de sentido erróneo, una mutación sin sentido, una supresión, una sustitución, una inserción, una adición de una secuencia de direccionamiento y similares. Además, una alteración de un gen puede lograrse también, o alternativamente, mediante mutación o modificación de elementos de control que controlan la transcripción del gen, tal como una mutación o una modificación en un promotor, terminador y/o elementos de mejora. En tal caso, dicha mutación o modificación da como resultado una pérdida parcial o total de la transcripción del gen, es decir, una transcripción inferior o reducida en comparación con los elementos de control nativos y no modificados. Como resultado, una cantidad reducida, si la hay, del producto génico estará disponible después de la transcripción y traducción. Además, la alteración de un gen también podría implicar añadir o eliminar una señal de localización del gen, lo que da como resultado una menor presencia del producto génico en su compartimento subcelular nativo.

El objetivo de la alteración génica es reducir la cantidad disponible del producto génico, incluyendo la prevención total de cualquier producción del producto génico, o para expresar un producto génico que carece o que tenga una actividad enzimática más baja en comparación con el producto génico nativo o natural.

Una versión “ con codones optimizados” de un gen se refiere a un gen exógeno introducido en una célula y donde los codones del gen se han optimizado con respecto a la célula particular. Generalmente, no todos los ARNt se expresan por igual o al mismo nivel a través de las especies. La optimización de codones de una secuencia génica implica de este modo cambiar los codones para que coincidan con los ARNt más frecuentes, es decir, para cambiar un codón reconocido por un ARNt poco frecuente con un codón sinónimo reconocido por un ARNt que es comparativamente más frecuente en la célula específica. De esta manera, el ARNm del gen optimizado por codones se traduce más eficientemente. El codón y el codón sinónimo codifican preferiblemente el mismo aminoácido.

Como se usa en el presente documento, el término “ alelo” se refiere a una forma variante de un gen dado. Esto puede incluir una forma mutada de un gen donde uno o más de los aminoácidos codificados por el gen se han eliminado o sustituido por un aminoácido diferente.

Como se usa en el presente documento, los términos “ péptido” , “ polipéptido” y “ proteína” se usan indistintamente para indicar a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos “ péptido” , “ polipéptido” y “ proteína” también incluyen modificaciones que incluyen, entre otros, unión de lípidos, glicosilación, glicosilación, sulfatación, hidroxilación, Y-carboxilación de residuos de ácido L-glutámico y ADP-ribosilación.

Como se usa en el presente documento, el término “ enzima” se define como una proteína que cataliza una reacción química o bioquímica en una célula. Habitualmente, según la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima está unida operativamente a una secuencia de nucleótidos (promotor) que causa una expresión suficiente del gen correspondiente en la célula para conferir a la célula la capacidad de producir metabolitos deseados.

Como se usa en el presente documento, el término “ marco de lectura abierto (ORF)” se refiere a una región de ARN que codifica ARN o ADN, un péptido o proteína.

Como se usa en el presente documento, el término “ genoma” abarca tanto los plásmidos como los cromosomas en una célula huésped. Por ejemplo, la codificación de ácidos nucleicos de la presente divulgación que se introducen en las células huésped puede ser parte del genoma si se integran cromosómicamente o se localizan en plásmidos.

Como se usa en el presente documento, el término “ promotor” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que tiene funciones para controlar la transcripción de uno o más genes, que se ubica aguas arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen. Los promotores adecuados en este contexto incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles, así como promotores manipulados por ingeniería molecular, que son bien conocidos por el experto en la técnica.

Los promotores adecuados para su uso en células fúngicas pueden ser los promotores dePDC, GPD1, TEF1, PGK1yTDH.Otros promotores adecuados incluyen los promotores deGAL1, GAL2, GAL10, GAL7, CUP1, HIS3, CYC1, ADH1, PGL, GAPDH, ADC1, URA3, TRP1, LEU2, TPI, AOX1yENO1.

Como se usa en el presente documento, el término “ terminador” se refiere a una “ señal de terminación de la transcripción” si no se observa de otro modo. Los terminales son secuencias que dificultan o detienen la transcripción de una polimerasa.

Como se usa en el presente documento, “ células fúngicas recombinantes” según la presente descripción se define como células que contienen copias adicionales o copia de una secuencia de ácido nucleico endógena o se transforman o modifican genéticamente con polipéptido o una secuencia de nucleótidos que no se produce naturalmente en las células fúngicas. Las células fúngicas naturales se definen como las células parentales de las células fúngicas recombinantes, como se usa en el presente documento.

Como se usa en la presente descripción, los términos “ aumentar” , “ aumenta” , “ aumento” , “ mejorar” , “ mejora” y “ mejorar” (y las variaciones gramaticales de los mismos) indican una elevación de al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, el 150 %, el 90 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 150 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 100 %, el 500 % o más, o cualquier intervalo en el mismo, en comparación con un control.

Como se usa en el presente documento, los términos “ reducir” , “ reduce” , “ reducción” , “ disminuir” , “ suprimir” y “ disminución” y términos similares significan una disminución de al menos aproximadamente, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %,85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más, o cualquier intervalo en el mismo, en comparación con un control.

Una “ expresión reducida” de un gen como se usa en el presente documento implica una modificación genética que reduce la transcripción del gen, reduce la traducción del ARNm transcrito a partir del gen y/o reduce el procesamiento postraduccional de la proteína traducida del ARNm. Dicha modificación genética incluye las inserciones, supresiones, reemplazos o mutaciones aplicadas a la secuencia de control, tal como un promotor y potenciador, del gen. Por ejemplo, el promotor del gen podría reemplazarse por un promotor menos activo o inducible para así dar como resultado una transcripción reducida del gen. También una desactivación del promotor daría como resultado una expresión reducida, típicamente cero, del gen.

Como se usa en la presente descripción, los términos “ desactivación” , “ supresión” o “ disrupción” se refieren a un gen que es inoperativo o inactivado y/o un producto génico no funcional, por ejemplo, un polipéptido que no tiene esencialmente actividad, por ejemplo, menos de aproximadamente el 10 % o incluso el 5 % en comparación con la actividad del polipéptido de tipo salvaje.

Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término “ sección” o “ fragmento” de una secuencia de nucleótidos de la invención significa una secuencia de nucleótidos de longitud reducida con respecto a una secuencia de ácido nucleico o nucleótidos de referencia y que comprende, consiste esencialmente en y/o consiste en una secuencia de nucleótidos de nucleótidos contiguos idénticos o casi idénticos, por ejemplo, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 98 %, 99 % idéntica, a la secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos de referencia. Dicho fragmento o porción de ácido nucleico según la invención puede, cuando sea apropiado, incluirse en un polinucleótido más grande del que es un constituyente.

Los diferentes ácidos nucleicos o proteínas que tienen homología se denominan en el presente documento “ homólogos” El término homólogo incluye secuencias homólogas de la misma y otras secuencias ortólogas y las secuencias ortólogas de la misma y otras especies. “ Homología” se refiere al nivel de similitud entre dos o más secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos en términos del porcentaje de identidad posicional, es decir, similitud de secuencia o identidad. La homología también se refiere al concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes ácidos nucleicos o proteínas. Por lo tanto, las composiciones y los métodos de la invención comprenden además homólogos a las secuencias de nucleótidos y secuencias de polipéptidos de esta invención. “ Ortólogo” , como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de nucleótidos homólogas y/o secuencias de aminoácidos en diferentes especies que surgieron de un gen ancestral común durante la especiación. Un homólogo de una secuencia de nucleótidos de esta invención tiene una identidad de secuencia sustancial, por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % y/o 100 %, a dicha secuencia de nucleótidos.

El término “ sobreexpresar” , “ sobreexpresa” o “ sobreexpresión” como se usa en el presente documento se refiere a niveles más altos de actividad de un gen, por ejemplo, transcripción del gen; niveles más altos de traducción del ARNm en proteína; y/o niveles más altos de producción de un producto génico, por ejemplo, polipéptido, que estaría en la célula en su nativo o control, por ejemplo, no transformado con los polipéptidos heterólogos o recombinantes particulares que se sobreexpresan. Un ejemplo típico de un gen sobreexpresado es un gen bajo control de la transcripción de otro promotor en comparación con el promotor nativo del gen. También, o alternativamente, otros cambios en los elementos de control de un gen, tales como potenciadores, podrían usarse para sobreexpresar el gen particular. Además, las modificaciones que afectan, es decir, aumentan, la traducción del ARNm transcrito a partir del gen podrían usarse, alternativamente o además, para lograr un gen sobreexpresado como se usa en el presente documento. Estos términos también pueden referirse a un aumento en el número de copias de un gen y/o un aumento en la cantidad de ARNm y/o producto génico en la célula. La sobreexpresión puede dar como resultado niveles que son 25 %, 50 %, 100 %, 200 %, 500 %, 1000 %, 2000 % o más en la célula, o cualquier intervalo en el mismo, en comparación con los niveles de control.

Como se usa en el presente documento, los términos “ exógeno” o “ heterólogo” cuando se usan con respecto a un ácido nucleico (ARN o ADN), proteína o gen se refieren a un ácido nucleico, proteína o gen que se produce de forma no natural como parte de la secuencia celular, organismo, genoma, ARN o ADN en la que se introduce, incluyendo múltiples copias de origen no natural de una secuencia de nucleótidos natural. Dicho gen exógeno podría ser un gen de otra especie o cepa, una versión modificada, mutada o evolucionada de un gen que se produce naturalmente en la célula huésped o una versión quimérica de un gen que se produce naturalmente en las células huésped o genes de fusión. En estos casos anteriores, la modificación, mutación o evolución provoca un cambio en la secuencia de nucleótidos del gen para obtener de este modo un gen modificado, mutado o evolucionado con otra secuencia de nucleótidos en comparación con el gen que se produce naturalmente en la célula huésped. El gen evolucionado se refiere a genes que codifican genes evolucionados y obtenidos mediante modificación genética, tal como mutación o exposición a una presión evolutiva, para derivar un nuevo gen con una secuencia de nucleótidos diferente en comparación con el gen natural o el gen nativo. Un gen quimérico se forma a través de la combinación de secciones de una o más secuencias codificantes para producir un nuevo gen. Estas modificaciones son distintas de un gen de fusión, que fusiona secuencias de genes completas en un solo marco de lectura y a menudo conservan sus funciones originales.

Un ácido nucleico, secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos “ endógeno” , “ nativo” o “ de tipo salvaje” se refiere a una secuencia de ácido nucleico, secuencia de nucleótidos, polipéptido o aminoácidos de origen natural o endógeno. Por lo tanto, por ejemplo, un “ARNm de tipo salvaje” es un ARNm que se produce naturalmente en o endógeno al organismo. Una secuencia de ácido nucleico “ homóloga” es una secuencia de nucleótidos asociada naturalmente con una célula huésped en la que se introduce.

Como se usa en el presente documento, el término “ modificado” , cuando se usa con respecto a un organismo, se refiere a un organismo huésped que se ha modificado para aumentar la producción de proteínas, en comparación con un organismo huésped idéntico que no se ha modificado de este modo. En principio, tal “ modificación” según la presente descripción puede comprender cualquier modificación fisiológica, genética, química u otra modificación que altera adecuadamente la producción de proteínas en un organismo huésped en comparación con tal producción en un organismo idéntico que no está sujeto a dicha modificación. En la mayoría de las realizaciones, no obstante, la modificación comprenderá una modificación genética. En ciertas realizaciones, como se describe en la presente descripción, la modificación comprende introducir genes en una célula huésped y particularmente en una célula huésped que se altera en el tráfico del endosoma de Golgi. En algunas realizaciones, una modificación comprende al menos una modificación; sustancia fisiológica, química, u otra modificación; en otras realizaciones, una modificación comprende más de una modificación química, genética, fisiológica u otra. En ciertos aspectos donde se hace uso de más de una modificación, tales modificaciones pueden incluir cualquier combinación de modificaciones fisiológicas, genéticas, químicas u otras (por ejemplo, una o más modificaciones genéticas, químicas y/o fisiológicas). Las modificaciones genéticas que estimulan la actividad de un polipéptido incluyen, sin carácter restrictivo: introducir una o más copias de un gen que codifica el polipéptido (que puede distinguir de cualquier gen ya presente en la célula huésped que codifica un polipéptido que tiene la misma actividad); alterar un gen presente en la célula para aumentar la transcripción o traducción del gen (por ejemplo, alterar, añadir una secuencia adicional a la sustitución de uno o más nucleótidos, eliminar una secuencia o intercambiar, por ejemplo, un regulador, un promotor u otra secuencia); y alterar la secuencia (por ejemplo, no codificante o codificante) de un gen que codifica el polipéptido para reforzar la actividad (por ejemplo, al aumentar la actividad enzimática, disminuir la inhibición de la retroalimentación, dirigirse a una ubicación subcelular específica, reforzar la estabilidad del ARNm, reforzar la estabilidad de la proteína). Las modificaciones genéticas que reducen la actividad de un polipéptido incluyen, entre otras: eliminar una parte o la totalidad de un gen que codifica el polipéptido; insertar una secuencia de ácido nucleico que altera un gen que codifica el polipéptido; cambiar un gen presente en la célula para reducir la transcripción o la traducción del gen o la estabilidad del ARNm o polipéptido codificado por el gen (por ejemplo, agregando una secuencia adicional para alterar, eliminar la secuencia, reemplazar uno o más nucleótidos o intercambiar, por ejemplo, la sustitución de uno o más nucleótidos, un promotor, regulador u otra secuencia).

El término “ sobreproducir” se usa en la presente descripción con referencia a la producción de FAEE en una célula huésped e indica que la célula huésped produce más del FAEE en virtud de la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos diferentes implicados en las rutas metabólicas de la célula huésped o como resultado de otras modificaciones en comparación con la célula huésped natural o no modificada.

Como se usa en el presente documento, el término “ secreción” o “ secretar” se refiere a la excreción de material, tal como proteínas de la célula.

Como se usa en la presente descripción, el término “ flujo” , “ flujo metabólico” o “ flujo de carbono” se refiere a la tasa de renovación de las moléculas a través de una reacción dada o un conjunto de reacciones. El flujo en una ruta metabólica está regulado por las enzimas involucradas en la ruta. Las vías o reacciones caracterizadas por un estado de flujo aumentado en comparación con un control tienen una mayor tasa de generación de productos a partir de sustratos dados. Las vías o reacciones caracterizadas por un estado de flujo disminuido en comparación con un control tienen una tasa disminuida de generación de productos a partir de sustratos dados. El flujo hacia los productos de interés puede aumentarse eliminando o disminuyendo las reacciones competitivas o aumentando las actividades de las enzimas involucradas en la generación de dichos productos.

El término “vector de expresión” se define en la presente descripción como una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención y que está unido operativamente a nucleótidos adicionales que aseguran su expresión.

“ Introducción” en el contexto de una célula de levadura significa poner en contacto una molécula de ácido nucleico con la célula de tal manera que la molécula de ácido nucleico obtenga acceso al interior de la célula. Por consiguiente, los polinucleótidos y/o moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de levadura en un solo evento de transformación, en eventos de transformación separados. Por lo tanto, el término “ transformación” como se usa en el presente documento se refiere a la introducción de un ácido nucleico heterólogo en una célula. La transformación de una célula de levadura puede ser estable o transitoria.

“T ransformación transitoria” en el contexto de un polinucleótido significa que un polinucleótido se introduce en la célula y no se integra en el genoma de la célula.

Por “ introducir de manera estable” o “ introducido de manera estable” en el contexto de un polinucleótido introducido en una célula se pretende que el polinucleótido introducido se incorpore de manera estable en el genoma de la célula y, por lo tanto, la célula se transforma de manera estable con el polinucleótido.

“Transformación estable” o “ transformada de manera estable” como se usa en el presente documento significa que una molécula de ácido nucleico se introduce en una célula y se integra en el genoma de la célula. Como tal, la molécula de ácido nucleico integrada es capaz de ser heredada por la progenie de la misma, más particularmente, por la progenie de múltiples generaciones sucesivas. “ Genoma” , como se usa en el presente documento, incluye el genoma nuclear. La transformación estable como se usa en el presente documento también puede referirse a una molécula de ácido nucleico que se mantiene extracromosomalmente, por ejemplo, como un minicromosoma.

La transformación transitoria puede detectarse mediante, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o transferencia Western, que puede detectar la presencia de un péptido o polipéptido codificado por una o más moléculas de ácido nucleico introducidas en un organismo. La transformación estable de una célula puede detectarse mediante, por ejemplo, un ensayo de hibridación de transferencia Southern del ADN genómico de la célula con secuencias de ácido nucleico que se hibridan específicamente con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico introducida en un organismo (por ejemplo, una levadura). La transformación estable de una célula puede detectarse mediante, por ejemplo, un ensayo de hibridación de transferencia Northern de ARN de la célula con secuencias de ácido nucleico que se hibridan específicamente con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico introducida en una levadura u otro organismo. La transformación estable de una célula también puede detectarse mediante, por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otra reacción de amplificación como se conoce bien en la técnica, que emplea secuencias de cebadores específicos que se hibridan con una secuencia o secuencias diana de una molécula de ácido nucleico, lo que da como resultado la amplificación de la(s) secuencia (s) diana, que puede detectarse según los métodos estándar, la transformación también puede detectarse mediante protocolos directos de secuenciación y/o hibridación bien conocidos en la técnica.

Las realizaciones de la presente invención también abarcan variantes de los polipéptidos como se define en el presente documento. Como se usa en el presente documento, una “variante” significa un polipéptido en el que la secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de bases de la que se deriva en que uno o más aminoácidos dentro de la secuencia están sustituidos por otros aminoácidos. Por ejemplo, una variante de la id. de sec. n°:1 puede tener una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 50 % idéntica a la id. de sec. n°:1, por ejemplo, al menos aproximadamente 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o aproximadamente 100 % idéntica. Las variantes y/o fragmentos son variantes funcionales/fragmentos en que la secuencia variante tiene características de actividad enzimática funcionales similares o idénticas a la enzima que tiene la secuencia de aminoácidos no variante especificada en el presente documento (y esto es el significado del término “variante funcional” como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva).

Una “variante funcional” o un “ fragmento funcional” de cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, por lo tanto, es cualquier secuencia de aminoácidos que permanece dentro de la misma categoría de enzima (es decir, tiene el mismo número EC) que las secuencias no variantes. Los métodos para determinar si una enzima cae dentro de una categoría particular son bien conocidas por el experto, que pueden determinar la categoría de enzima sin usar la habilidad inventiva. Los métodos adecuados pueden, por ejemplo, obtenerse de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular.

Las sustituciones de aminoácidos pueden considerarse como “ conservativas” donde un aminoácido se reemplaza con un aminoácido diferente con propiedades ampliamente similares. Las sustituciones no conservativas son donde los aminoácidos se reemplazan con aminoácidos de un tipo diferente.

Por “ sustitución conservadora” se entiende la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido de la misma clase, en la que las clases se definen de la siguiente manera:

Ejemplos de aminoácidos de clase

No polar: A, V, L, I, P, M, F, W

Polar no cargado: G, S, T, C, Y, N, Q

Ácido: D, E

Básico: K, R, H.

Como es bien conocido por los expertos en la técnica, alterar la estructura primaria de un polipéptido por una sustitución conservadora puede no alterar significativamente la actividad de ese polipéptido porque la cadena lateral del aminoácido que se inserta en la secuencia puede ser capaz de formar enlaces similares y contactos como la cadena lateral del aminoácido que se ha sustituido. Esto es así incluso cuando la sustitución está en una región que es crítica para determinar la conformación del polipéptido.

En realizaciones de la presente invención, son posibles sustituciones no conservativas siempre que no interrumpa las actividades enzimáticas de los polipéptidos, como se define en otra parte de la presente memoria. Las versiones sustituidas de las enzimas deben retener características de manera que permanezcan en la misma clase de enzima que la enzima no sustituida, según se determina usando la nomenclatura de NC-IUBMB descrita anteriormente.

En términos generales, serán posibles menos sustituciones no conservativas que las sustituciones conservativas sin alterar la actividad biológica de los polipéptidos. La determinación del efecto de cualquier sustitución (y, de hecho, de cualquier supresión o inserción de aminoácidos) está completamente dentro de las capacidades rutinarias del experto, que pueden determinar fácilmente si un polipéptido variante conserva la actividad enzimática según aspectos de la invención. Por ejemplo, cuando se determina si una variante del polipéptido se encuentra dentro del alcance de la invención (es decir, es una “variante funcional o fragmento” como se ha definido anteriormente), la persona experta determinará si la variante o fragmento conserva la actividad enzimática de conversión del sustrato como se define con referencia a la nomenclatura de NC-IUBMB mencionada en otra parte de la presente memoria. Todas estas variantes están dentro del alcance de la invención.

Usando el código genético convencional, las secuencias de ácido nucleico adicionales que codifican los polipéptidos pueden concebirse y fabricarse fácilmente por el experto en la técnica, además de los descritos en la presente descripción. La secuencia de ácido nucleico puede ser ADN o ARN, y donde es una molécula de ADN, puede comprender, por ejemplo, un ADNc o ADN genómico. El ácido nucleico puede estar contenido dentro de un vector de expresión, como se describe en otra parte de la presente descripción.

Las realizaciones de la invención, por lo tanto, abarcan secuencias de ácido nucleico variantes que codifican los polipéptidos contemplados por las realizaciones de la invención. El término “variante” en relación con una secuencia de ácido nucleico significa cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, supresión o adición de uno o más nucleótidos de o a una secuencia de polinucleótidos, proporcionando la secuencia polipeptídica resultante codificada por el polinucleótido exhibe al menos las mismas o similares propiedades enzimáticas que el polipéptido codificado por la secuencia básica. El término incluye variantes alélicas y también incluye un polinucleótido (una “ secuencia de sonda” ) que se hibrida sustancialmente con la secuencia polinucleotídica de las realizaciones de la presente invención. Dicha hibridación puede producirse en o entre condiciones de rigurosidad baja y alta. En términos generales, las condiciones de baja rigurosidad pueden definirse como hibridación en la que la etapa de lavado tiene lugar en una solución tampón NaCl de 0,330-0,825 M a una temperatura de aproximadamente 40-48 °C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) calculada o real de la secuencia de la sonda (por ejemplo, aproximadamente temperatura de laboratorio ambiente a aproximadamente 55 °C), mientras que las condiciones de alta rigurosidad implican un lavado en una solución tampón de NaCl 0,0165-0,0330 M a una temperatura de aproximadamente 5-10 °C por debajo de la Tm calculada o real de la secuencia de la sonda (por ejemplo, aproximadamente 65 °C). La solución tampón puede ser, por ejemplo, tampón SSC (NaCl 0,15 M y citrato trisódico 0,015M), con el lavado de baja rigurosidad que tiene lugar en 3 x tampón SSC y el lavado de alta rigurosidad tiene lugar en 0,1xSSC tampón. Las etapas involucradas en la hibridación de secuencias de ácido nucleico se han descrito, por ejemplo, en Molecular Cloning, a laboratory manual [second edition] Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, por ejemplo en la Sección 11 “ Sondas de oligonucleótido sintéticas” .

Preferiblemente, las variantes de secuencia de ácido nucleico tienen aproximadamente el 55 % o más de los nucleótidos en común con la secuencia de ácido nucleico de las realizaciones de la presente invención, más preferiblemente al menos 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, o incluso 90 %, 95 %, 98 % o 99 % o más de identidad de secuencia.

Los ácidos nucleicos variantes de la invención pueden ser codones optimizados para la expresión en una célula huésped particular.

Como se usa en la presente descripción, identidad de secuencia se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos o dos secuencias de péptidos o proteínas. La similitud se determina por alineación de secuencias para determinar las relaciones funcionales y/o estructurales entre las secuencias.

La identidad de secuencia entre las secuencias de aminoácidos se puede determinar comparando una alineación de las secuencias con la herramienta de alineación de secuencia de Needleman-Wunsch Global, disponible en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (ncbi), Bethesda, Md., EE. UU http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, usar ajustes de parámetros predeterminados (para la alineación de proteínas, el coste de los huecos Existencia:11 Extensión:1). Las comparaciones de secuencias y las identidades porcentuales mencionadas en esta memoria descriptiva se han determinado usando este software. Cuando se compara el nivel de identidad de secuencia con, por ejemplo, la id. de sec. n°.:1, esto debe realizarse preferiblemente en relación con la longitud completa de la id. de sec. n°.:1 (es decir, se usa un método de alineación global), para evitar regiones cortas de alta identidad de identidad, lo que da como resultado una alta evaluación general de identidad. Por ejemplo, un fragmento de polipéptido corto que tiene, por ejemplo, cinco aminoácidos podría tener una secuencia idéntica al 100 % a una región de cinco aminoácidos dentro de la totalidad de la id. de sec. n°.:1, pero esto no proporciona una identidad de aminoácidos del 100 % a menos que el fragmento forme parte de una secuencia más larga que también tiene aminoácidos idénticos en otras posiciones equivalentes a las posiciones en la id. de sec. n°.:1. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por el mismo aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. La puntuación de un alineamiento como porcentaje de identidad es una función del número de aminoácidos idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. Cuando se comparan secuencias, las alineaciones óptimas pueden requerir que se introduzcan huecos en una o más de las secuencias, para tener en cuenta posibles inserciones y supresiones en las secuencias. Los métodos de comparación de secuencias pueden emplear penalizaciones de huecos para que, para el mismo número de moléculas idénticas en secuencias que se comparan, un alineamiento de secuencia con tan pocos huecos como sea posible, lo que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas, logrará una puntuación más alta que uno con muchos huecos. El cálculo del porcentaje máximo de identidad implica la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones de huecos. Como se ha mencionado anteriormente, la identidad de secuencia porcentual puede determinarse mediante el uso de la herramienta de alineación de secuencia Global Needleman-Wunsch con configuraciones de parámetros predeterminados. El algoritmo Needleman-Wunsch se publicó en J. Mol. Biol. (1970) vol. 48:443-53.

Un aspecto de las realizaciones se refiere a una célula fúngica. Según las realizaciones, la célula fúngica carece de un gen que codifica Tda3p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Tda3p. La célula fúngica también comprende un gen heterólogo que codifica una proteína heteróloga. La célula fúngica tiene un transporte alterado entre el Golgi y el endosoma.

Las presentes realizaciones se basan en la ingeniería del tráfico intracelular como un medio para aumentar la producción de proteínas recombinantes en células fúngicas. Sorprendentemente, se detectó que al interrumpir el transporte entre el Golgi y el endosoma, específicamente mediante la interrupción de la proteína Tda3p, opcionalmente en combinación con otras dianas, como Gos1p, era posible aumentar la producción y secreción de proteínas recombinantes varias veces en la célula fúngica.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención pueden ser como se describe en relación con cualquiera de los otros aspectos.

Otras características de la presente invención resultarán evidentes a partir de los siguientes ejemplos. En términos generales, la invención se extiende a cualquier nueva combinación, o cualquier combinación novedosa, de las características descritas en esta memoria descriptiva (incluidas las reivindicaciones adjuntas y los dibujos). Debe entenderse que los rasgos, integrantes, características, compuestos o restos químicos descritos junto con un aspecto, realización o ejemplo particulares de la invención son aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descritos en el presente documento, a menos que sea incompatible con el mismo.

Además, a menos que se indique lo contrario, cualquier característica descrita en el presente documento puede reemplazarse por una característica alternativa que sirva para un propósito igual o similar.

A continuación, se describirán con más detalle diversas realizaciones de la presente invención.

Preferiblemente, la célula fúngica a modificar puede seleccionarse de cualquier género y especie de hongo conocido. En una realización, la célula fúngica se selecciona de un grupo que consiste enSaccharomyces, Kluyveromyces, Zygosaccharomyces, Candida, Hansenula, Torulopsis, Kloeckera, Pichia, Schizosaccharomyces, Trigonopsis, Brettanomyces, Debaromyces, Nadsonia, Lipomyces, Cryptococcus, Aureobasidio, Tricoston, Lipomyces, Rhodotorula, Yarrowia, Rhodosporidium, Phaffia, Schwaniomyces, Aspergillus,yAshbya. Saccharomyces cerevisiaees una levadura comúnmente usada en procesos industriales, pero la divulgación no se limita a esta. Otras especies de levadura útiles en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a,Pichia pastoris, Ashbyuna gossypii, Saccharomyces boulardii, Zygosaccharomyces bailii, Kluyveromyces lactis, Rhodosporidium toruloidesyYarrowia lipolytica.

En algunas realizaciones, el transporte entre el Golgi y el endosoma se interrumpe en la célula fúngica. La(s) modificación(es) permite(n) aumentar la producción y/o la secreción de proteínas recombinantes en la célula fúngica. Esto puede lograrse mediante la regulación negativa de proteínas involucradas en el transporte entre el Golgi y el endosoma. Por ejemplo, en S .cerevisiae,esto incluye las proteínas Tda3p, Gos1p, Vps5p, Vps17p, Vps10p, Cczlp, Hselp, Pep8p, Vps29p, Vps35p, Snx41p, Btn2p, Dop1p, Trs130p, Trs120p, Snx4p, Fab1p, Ypt7p, Ent5p, Vps53p, Laa1p, Atg20p, Vps52p, Sftlp, Sft2p, Vps51p, Ent3p, Snx3p, Ypt31p, Vps54p, Ypt32p, Ykt6p Mvp1p, Tlg1p, Trs65p, Tca17p, Rcylp, Ypt6p, Vtilp, Rgp1p, Ric1p, Got1p, Rhb1p, Gga1p, Gga2p, Mon2p, Vta1p and Vps45p. Estas proteínas están codificadas por los genesTDA3, GOS1, VPS5, VPS17, VPS10, CCZ1, HSE1, PEP8, VPS29, VPS35, SNX41, BTN2, DOP1, TRS130, TRS120, SNX4, FAB1, YPT7, ENT5, YKR078W, VPS53, LAA1, ATG20, VPS52, SFT1, SFT2, VPS51, ENT3, SNX3, YPT31, VPS54, YPT32, YKT6, MVP1, TLG1, TLG2, TRS65, TCA17, RCY1, YPT6, VTI1, RGP1, RIC1, GOT1, RHB, GGA1, GGA2, MON2, VTA1 y VPS45,respectivamente.

En una realización preferida, las modificaciones al transporte entre el Golgi y el endosoma implican la interrupción de Tda3p (id. de sec. n°.: 1). Esto podría lograrse mediante la eliminación del gen endógeno que codifica esta proteína. Por ejemplo, el endógenoTDA3el gen que codifica Tda3p podría eliminarse en S.cerevisiae.Por lo tanto, la célula fúngica carece preferiblemente de un gen que codifica Tda3p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Tda3p.

En otra realización, las modificaciones al transporte entre el Golgi y el endosoma implican la interrupción de Goslp (id. de sec. n°.: 2). Esto podría lograrse mediante la eliminación del gen endógeno que codifica esta proteína. Por ejemplo, el gen GOS1 endógeno que codifica Gos1p podría eliminarse en S.cerevisiae.

Por lo tanto, otro aspecto de las realizaciones se refiere a una célula fúngica. Según las realizaciones, la célula fúngica carece de un gen que codifica Gos1p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Gos1p. La célula fúngica también comprende un gen que codifica una proteína recombinante.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica carece de un gen que codifica Gos1p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Gos1p.

Los dos aspectos descritos anteriormente pueden combinarse. En tal enfoque, las células fúngicas carecen de un gen que codifica Tda3p y carece de un gen que codifica Gos1p; carece de un gen que codifica Tda3p y comprende un gen endógeno alterado que codifica Gos1p; carece de un gen que codifica Gos1p y comprende un gen endógeno alterado que codifica Tda3p; o comprende un gen endógeno alterado que codifica Tda3p y comprende un gen endógeno alterado que codifica Gos1p. La célula fúngica también comprende un gen que codifica una proteína recombinante.

En una realización, cualquiera de las modificaciones anteriores o siguientes se combinan con la regulación negativa de proteínas que forman el complejo retromer para el transporte desde el endosoma hasta el Golgi. Esto podría lograrse interrumpiendo algunas de las proteínas que componen este complejo, tal como Vps5p (id. de sec. n°.: 3), Vps17p (id. de sec. n°.: 4), Pps8p (id. de sec. n°.: 5), Vps29p (id. de sec. n°.: 6) y/o Vps35p (id. de sec. n°.: 7). Por ejemplo, los genes endógenosVPS5, VPS17, PEP8, VPS29y/o VPS35 que forman este complejo podrían eliminarse en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica comprende un complejo retromer endógeno alterado para el transporte del endosoma a Golgi.

En una realización particular, la célula fúngica se modifica genéticamente para reducir la expresión de al menos una proteína seleccionada de un grupo que consiste en Vps5p (id. de sec. n°.: 3), Vps17p (id. de sec. n°.: 4), Pep8p (id. de sec. n°.: 5), Vps29p (id. de sec. n°.: 6), Vps35p (id. de sec. n°.: 7) y variantes de las mismas que tienen al menos 50 % de homología con cualquiera de las id. de sec. n°.: 3-7).

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse adicionalmente combinando cualquier modificación anterior o inferior con alteración en proteínas que actúan como subunidades del complejo de histona desacetilasa HDA1. La eliminación de tales subunidades aumenta la producción de proteínas. La interrupción del complejo de histona desacetilasa HDA1 podría lograrse, por ejemplo, interrumpiendo las proteínas que forman este complejo, tal como Hda2p (id. de sec. n°.: 8) y/o Hda3p (id. de sec. n°.: 9). Esto podría lograrse al eliminar los genes endógenosDAR 2y/oDA3que codifican subunidades del complejo de histona desacetilasa HDA1 en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica carece de genes que codifican subunidades de complejo de histona desacetilasa HDA1, preferiblemente al menos uno de Hda2p y Hda3p, o comprende genes endógenos alterados que codifican las subunidades de complejo de histona desacetilasa HDA1, preferiblemente al menos uno de Hda2p y Hda3p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse mediante la alteración de Pgm2p (id. de sec. n°.: 10), que codifica fosfoglucomutasa, también denominada fosfoglucomutasa (alfa-D-glucosa-1,6-bisfosfato dependiente) (EC 5.4.2.2). Esto puede lograrse, por ejemplo, eliminando el gen endógeno que codifica fosfoglucomutasa. Por ejemplo, los genesPGM2y/oPGM1podrían eliminarse en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica carece de genes que codifican Pg2p y/o Pgm1 p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Pg2p y/o Pgm1p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse mediante la alteración de subunidades del complejo de transporte de ABC peroxisomal. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la eliminación de los genes endógenos que codifican subunidades del complejo peroxisomal ABC, tal como Pxa1p (id. de sec. n°.: 11) y/o Pxa2p (id. de sec. n°.: 12). Por ejemplo, el genPXA1y/oPXA2podría eliminarse enS.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica carece de genes que codifican subunidades de complejo de transporte de ABC peroxisomal, preferiblemente al menos uno de Pxa1 P y Pxa2p, o comprende genes endógenos alterados que codifican las subunidades del complejo de transporte de ABC peroxisomal, preferiblemente al menos uno de Pxa1 P y Pxa2p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse mediante la alteración de los miembros del complejo conservado de membrana del retículo endoplásmico. Por ejemplo, el Emc1p (id. de sec. n°.: 13) podría interrumpirse. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la eliminación del gen endógenoEMC1en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica carece de genes que codifican miembros del complejo conservado de membrana del retículo endoplásmico, preferiblemente Emc1p, o comprende genes endógenos alterados que codifican los miembros del complejo conservado de membrana endoplásmico, preferiblemente Emc1p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse mediante la alteración de proteínas receptoras de membrana de vesícula, por ejemplo Snc1p (id. de sec. n°.: 14) y/o Snc2p (id. de sec. n°.: 15). Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la eliminación del gen endógenoSNC1y/oSNC2en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica carece de genes que codifican proteínas receptoras de membrana de vesícula, preferiblemente al menos uno de Snc1 p y Snc2p, o comprende genes endógenos alterados que codifican las proteínas receptoras de membrana de vesícula, preferiblemente al menos uno de Snc1p y Snc2p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse subiendo los niveles de proteínas que actúan como componentes del complejo de anclaje a red citosólico, tales como Cog1p, Cog2p, Cog3p, Cog4p, Cog5p, Cog6p, Cog7p y/o Cog8p. Esto puede lograrse mediante la sobreexpresión de los genes endógenos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, en una realización preferente, la proteína Cog5p endógena (id. de sec. n°.: 16) se sobreexpresa en S .cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica se modifica genéticamente para mejorar la expresión de al menos un componente del complejo de anclaje a red citosólico, preferiblemente el al menos un componente se selecciona de un grupo que consiste en Cog1p, Cog2p, Cog3p, Cog4p, Cog5p, Cog6p, Cog7p y Cog8p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con aumentos en las actividades de las proteínas chaperonas. Esto puede lograrse mediante la sobreexpresión de proteínas que actúan como chaperonas. Por ejemplo, la actividad de la proteína enzimática disulfuro isomerasa (PDI) (EC 5.3.4.1) podría aumentarse mediante la sobreexpresión del genPDI1(id. de sec. n°.: 17) en S.cerevisiae.Esto incluye homólogos de levadura PDI, tales comoPDI1, MPD1, MPD2, EUG1,yEPS1.Alternativamente, o además, se podrían sobreexpresar otras chaperonas. Por ejemplo, podría sobreexpresarse la proteína de inmunoglobulina de unión (BiP), codificada porKAR2en S.cerevisiae,la tiol oxidasa ERO1, codificada porERO1,las proteínas de tipo Sm SEC1 oSLY1,codificado porSEC1ySLY1.Las chaperonas de otras especies también podrían introducirse adicional o alternativamente. Por ejemplo, la cochaperona GRP170 de mamífero y la coenzima-prolil isomerasa FKBP2 podrían sobreexpresarse en S .cerevisiae.Otros genes que podrían introducirse en una célula fúngica para mejorar aún más la producción de proteínas incluyen Dsbc yFkpAdeEscherichia coliy S.cerevisiaepeptidil-prolil cis-trans isomerasa (codificada porCPR5).

En una realización, la célula fúngica se modifica genéticamente para mejorar la expresión de al menos una proteína chaperona endógena y preferiblemente al menos una proteína endógena se selecciona de un grupo que consiste en Pd1p, Mpd1p, Mpd2p, Eug1p, Eps1p, Kar2p, Ero1p, Sec1p, Sllp y Cpr5p.

En una realización, la célula fúngica comprende al menos un gen heterólogo que codifica una proteína chaperona heteróloga respectiva, preferiblemente la chaperona heteróloga respectiva se selecciona de un grupo que consiste en GRP170 de mamífero, FKBP2 de mamífero,Escherichia coliDsbcE.coliFkpA.

En otra realización, la actividad de los factores de transcripción que controlan la expresión de las chaperonas de proteínas podría aumentarse para subir aún más la producción de proteínas recombinantes. Por ejemplo, la actividad del factor de choque térmico del factor de transcripción (HSF) podría aumentarse mediante la sobreexpresión del gen endógeno que codifica la HSF, tal comoHSF1(id. de sec. n°.: 18) en S.cerevisiae.Además, en otra realización, se expresa una versión mutante de HSF1. Por ejemplo,HSF1desde S.cerevisiaedonde la arginina 206 se reemplaza, preferiblemente por serina (R206S), podría sobreexpresarse en una célula fúngica.

En una realización adicional, la actividad del factor de transcripción Hac1p (id. de sec. n°.: 19) se aumenta para activar la respuesta de proteína desplegada para facilitar aún más el plegamiento y la producción de proteínas. La actividad del factor de transcripción Hac1p podría aumentarse mediante la sobreexpresión del gen endógeno que codifica Hac1 p, tal comoHAC1en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica se modifica genéticamente para mejorar la expresión de al menos un factor de transcripción que controla la expresión de proteínas chaperonas, y preferiblemente al menos un factor de transcripción se selecciona de un grupo que consiste en Hsf1p y Hac1p.

En una realización adicional, el transporte entre el retículo endoplásmico (RE) y el Golgi podría aumentarse. Esto podría lograrse, por ejemplo, mediante la sobreexpresión de las proteínas endógenas involucradas en el transporte de ER-Golgi, tal como Yptlp, Boslp, Betlp, Sec22p, Sed5p, Sarlp, Sec12p, Sec23p, Sec24p, Sec13p, sec14p, Sec15p, Sec16p, Sec17p, Sec18p, Sec19p, Sec20p, Sec21p, Sec22p, Sec25p, Sec26p, Sec27p, Sec28p, Sec29p, Sec30p, Sec31p, Erv14p, Erv26p, Emp24p, Erv25p y/o mostraron que la sobreexpresión de HSF1 Erv29p. Por ejemplo, cualquiera de los genes endógenos que codifican estas actividades,YPT1, BOS1, BET1, SEC22, SED5, SARI, SEC12, SEC23, SEC24, SEC13, SEC14, SEC15, SEC16, SEC17, SEC18, SEC19, SEC20, SEC21, SEC22, SEC25, SEC26, SEC27, SEC28, SEC29, SEC30, SEC31, ERV14, ERV26, EMP24, ERV25,yERV29,respectivamente, podrían sobreexpresarse en una célula de S.cerevisiae.En una realización preferente, el gen sobreexpresado se coge del grupo deSEC12, SEC13, SEC16yERV25.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica se modifica genéticamente para la sobreexpresión de al menos una proteína endógena implicada en el transporte entre el retículo endoplásmico y el Golgi, preferiblemente la al menos una proteína endógena se selecciona de un grupo que consiste en Ypt1p, Bos1p, Bet1p, Sec22p, Sed5p, Sar1p, Sec12p, Sec23p, Sec24p, Sec13p, sec14p, Sec15p, Sec16p, Sec17p, Sec18p, Sec19p, Sec20p, Sec21p, Sec22p, Sec25p, Sec26p, Sec27p, Sec28p, Sec29p, Sec30p, Sec31p, Erv14p, Erv26p, Emp24p, Erv25p and Erv29p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica se aumenta combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con un aumento en el transporte entre el Golgi y la membrana plasmática (PM). Esto se puede lograr aumentando los niveles de componentes de vesícula implicados en el transporte de Golgi-PM. Por ejemplo, los niveles de Sec3p, Sec5p, Sec10p, Sec6p, Sec8p, Exo70p, Exo84p, Ssolp, Sec1 p, Ypt32p y/o Sec4p podrían aumentarse. Esto podría lograrse mediante la sobreexpresión de cualquiera de los genes endógenos que codifican estas actividades. Por ejemplo, los genes endógenosSEC3, SEC5, SEC10, SEC6, SEC8, EXO70, EXO84, SSO1, SEC1, EXO70, YPT32y/os Ec 4podrían sobreexpresarse en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica se modifica genéticamente para la sobreexpresión de al menos una proteína endógena implicada en el transporte entre el Golgi y la membrana plasmática, preferiblemente la al menos una proteína endógena se selecciona de un grupo que consiste en Sec3p, Sec5p, Sec10p, Sec6p, Sec8p, Exo70p, Exo84p, Sso1p, Sec1p, Ypt32p y Sec4p.

En algunas realizaciones, la glicosilación de la célula fúngica se puede modificar para lograr la glicosilación humanizada. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la interrupción de la glicosilación de N-hipermanosa a través de la alteración de Ochlp, alginato y/o Mnn9p. Por ejemplo, los genes endógenos que codifican estas proteínas(OCH1, ALG3,yMN9,respectivamente) se podrían eliminar en S.cerevisiae.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con supresión en el regulador lipídico Opi1p. Por ejemplo, el gen endógeno que codificaOPI1podría eliminarse en S.cerevisiae.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con supresión de proteasas para evitar la degradación proteolítica de la proteína diana. Esto podría incluir proteasas vacuolares. Por ejemplo, podrían eliminarse las proteasas vacuolares Pep4p y/o Prb1p. Esto podría lograrse mediante la eliminación de los genes endógenosPEP4y/oPRB1en S.cerevisiae.Alternativa o adicionalmente, también podrían alterarse las proteasas de yapsina, que son una familia de proteasas aspárticas ubicadas en la superficie celular. Por ejemplo, las proteasas de yapsina Yps1p, Yps2p, Yps3p, Yps5p, Yps6p y/o Yps7p podrían estar reguladas negativamente. Esto podría lograrse mediante la supresión de los genes endógenosYPS1, YPS2, YPS3, YPS5, YPS6y/oYPS7en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica carece de genes que codifican proteasas o comprende genes alterados que codifican proteasas endógenas, preferiblemente seleccionados de un grupo que consiste en Pep4p, Prb1p, Yps1p, Yps2p, Yps3p, Yps5p, Yps6p e Yps7p.

En una realización adicional, la degradación de proteínas no nativas se puede reducir mediante la supresión o la regulación negativa del genHTM1en S.cerevisiae,codificando una exomanosidasa específica de alfa-1,2.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con el aumento de los niveles de componentes de translocación cotranslativa. Esto se puede lograr, por ejemplo, por sobreexpresión de los componentes de SRP endógenos, tales como Srp14p, Srp21p, Srp68p, Srp72p, Sec65p y/o Srp54p. Por ejemplo, los genes endógenosSRP14, SRP21, SRp 68, SRP72, SEC65y/oSRP54podrían sobreexpresarse en S.cerevisiae.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica se modifica genéticamente para la sobreexpresión de al menos una proteína de translocación cotranslativa endógena, preferiblemente seleccionada de un grupo que consiste en Srp14p, Srp21p, Srp68p, Srp72p, Sec65p y Srp54p.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con modificaciones en la expresión génica hipóxica. Por ejemplo, la proteína endógena Roxlp podría interrumpirse mediante la supresión del genROX1(un represor dependiente de Heme de genes hipóxicos) en S.cerevisiae.Alternativamente, se pudo aumentar la actividad del factor de transcripción Upc2p. Por ejemplo, el aleloUPC 2-1,que tiene una mutación G888D en el extremo C y como resultado activa constitutivamente la biosíntesis de ergosterol, podría sobreexpresarse en S.cerevisiae.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con endocitosis reducida. Esto se puede lograr interrumpiendo las proteínas endógenas asociadas con la endocitosis, tales como Rvs161p y Endap. Por ejemplo, los genes endógenosRVS161yEND3podrían estar regulados negativamente en S.cerevisiae.

En otra realización, la producción de proteínas recombinantes en una célula fúngica podría aumentarse combinando cualquiera de las modificaciones descritas anteriormente o más abajo con alteración en la clasificación vacuolar. Esto podría lograrse mediante la interrupción de genes implicados en la clasificación vacuolar. Por ejemplo, Vps30p, Rgp1p,Mrl1p, Vam3p, Vps2p, Vps3p, Vps4p, Vps11p, Vps13p, Vps16p, Vps18p, Vps20p, Vps22p, Vps23p, Vps24p, Vps25p, Vps27p, Vps28p, Vps31p, Vps32p, Vps33p, Vps36p, Vps37p, Vps39p, Vps41p, Vps43p, Vps44p y/o Vps46p.

Por lo tanto, en una realización, la célula fúngica se modifica genéticamente para la regulación negativa de al menos una proteína involucrada en la clasificación vacuolar, preferiblemente seleccionada de un grupo que consiste en Vps30p, Rgp1p, Mrl1p, Vam3p, Vps2p, Vps3p, Vps4p, Vps11p, Vps13p, Vps16p, Vps18p, Vps20p, Vps22p, Vps23p, Vps24p, Vps25p, Vps27p, Vps28p, Vps31p, Vps32p, Vps33p, Vps36p, Vps37p, Vps39p, Vps41p, Vps43p, Vps44p y Vps46p.

En una realización, la célula fúngica carece del gen que codifica Tda3p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Tda3p. La célula fúngica también se modifica genéticamente para la expresión reducida de Vps5p, tal como carece del gen que codifica Vps5p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Vps5p. La célula fúngica carece además de un gen que codifica Hda2p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Hda2p.En una realización, la célula fúngica comprende un gen heterólogo que codifica la proteína recombinante.

Las realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse.

Otro aspecto de las realizaciones se refiere a un método para producir una proteína recombinante. El método comprende cultivar una célula fúngica según cualquiera de las realizaciones en un medio de cultivo y en condiciones de cultivo adecuadas para la producción de la proteína recombinante por la célula fúngica. El método también comprende recoger la proteína recombinante del medio de cultivo y/o de la célula fúngica.

Ejemplos

Ejemplo 1

Efecto de eliminaciones únicas en la producción de proteínas en levadura

En este ejemplo, el efecto de las supresiones de un solo gen deECM3, EMC1, ERV29, GOS1, VPS5, DAR3,COG5SNC2, HDA2, HDA3, TAN1, PGM2yPXA1en la producción y secreción de proteínas recombinantes se examinó en una cepa BY4742 de S.cerevisiae.

Estas cepas de supresión de genes individuales se adquirieron de la Euroeeche y se transformaron con el plásmido de expresión de a-amilasa p426GPD-amilasa. Las cepas de supresión de un solo gen de BY4742 que albergan el plásmido p426GPD-amilasa se seleccionaron en placas SD-ura y luego se cultivaron en medio SD-2xSCAA para la producción de a-amilasa.

Para la producción de proteínas en tubos o matraces de agitación, las cepas de levadura se cultivaron a 30 °C y 200 rpm durante 96 horas en el medio SD-2xSCAA 2 que contiene 20 g/L de glucosa, 6,9 g/L de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 190 mg/L Arg, 400 mg/L Asp, 1260 mg/L Glu, 130 mg/L Gly, 140 mg/L His, 290 mg/L Ile, 400 mg/L Leu, 440 mg/L Lys, 108 mg/L Met, 200 mg/L Phe, 220 mg/L Thr, 40 mg/L Trp, 52 mg/L Tyr, 380 mg/L Val, 1 g/L BSA, 5,4 g/L Na2HPO4y 8,56 g/L de NaH2PO4-H2 O (pH = 6,0 por NaOH).

La actividad de a-amilasa en el sobrenadante de cultivo se midió mediante el uso del kit de ensayo de a-amilasa (Megazyme K-CERA, Irlanda) y se utilizó una a-amilasa comercial deAspergillus oryzae(Sigma, Estados Unidos) de forma estándar. El peso de la a-amilasa se puede calcular con 69,6 U/mg como coeficiente de conversión de a-amilasa según Liu et al (Biotechnol Bioeng. 2012 May; 109(5):1259-68. doi: 10.1 002/bit.24409). Para las mediciones intracelulares de a-amilasa, el sedimento celular se recogió de 0,5 ml de cultivos celulares mediante centrifugación a 1200 x g durante 3 min. El sedimento celular se lavó con agua destilada y se resuspendió en 0,5 ml de tampón PBS que contenía 5 pl de cóctel de inhibidor de proteasa (Thermo Fisher, EE. UU.). La suspensión celular se añadió a un tubo de matriz de lisis y la lisis celular se procesó en un tejido FastPrep-24 y un homogeneizador celular (MP Biomedicals, EE. UU.) a una velocidad de 6,5 m/s durante 2 min. Los restos celulares se retiraron por centrifugación y la fracción sobrenadante se usó para la cuantificación de a-amilasa.

Como se muestra en la Figura 2, la producción de amilasa mejoró tras la interrupción deHDA2, HDA3, PGM2, PXA1, EMC1, GOS1, VPS5, DAR3ySNC2(Figura 2a). Además, estas modificaciones se asociaron generalmente con una disminución en el porcentaje intracelular de amilasa (Figura 2b), lo que sugiere una mayor secreción.

Ejemplo 2

Efectos combinatorios de las supresiones de genes

Los mejores cuatro objetivos génicos del Ejemplo 1 anterior (HDA2, VPS5, GOS1yTDA3) se seleccionaron para estudios adicionales en el fondo de la cepa CEN.PK.

La eliminación génica en CEN.PK se realizó usando el gen amdS como marcador de selección y siguiendo los protocolos descritos por Solis-Eescalante et al (FEMS Yeast Res. 2013 Feb;13(1):126-39. doi: 10.1111/1567-1364.12024). Los pares de cebadores HDA2F y HDA2R y ADN polimerasa PrimmeSTAR S (Takara, Kioto, Japón) se usaron para amplificar el casete de supresión de HDA2 mediante el uso del plásmido pE-amdSYM como plantilla. El casete de supresión de HDA2 se transformó en la cepa K01 para supresión de DAR 2 usando un método estándar LiAc/SS ADN/PEG por Gietz et al (Methods Enzymol. 2002350, 87-96). Las colonias crecieron en las placas de SM-Ac selectivas y se verificaron para la supresión correcta de hd2 mediante el diagnóstico de los cebadores HDA2P1 y HDA2P2. Como el cebador HDA2R contiene una secuencia homóloga a la región aguas arriba deHDA2,el marcador amdS se puede enlazar con el cromosoma por recombinación homóloga. De manera similar, los casetes de supresión VPS5, GOS1 y TDA3 se amplificaron a partir del plásmido pE-amdSYM mediante el uso de los pares de cebadores VPS5F/VPS5R, GOS1F/GOS1R y TDAR3F/TDAR3R, respectivamente. La supresión deVPS5, GOS1yTDA3en CEN.PK se llevó a cabo mediante transformación de casetes de supresión y se seleccionaron en placas SM-Ac. Se cultivaron cepas de supresión de un solo gen CEN.PK en medio SD-2xSCAA, y la secreción de amilasa se midió como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Como se muestra en la Figura 3, en todos los casos, la supresión génica única aumentó la producción y secreción de amilasa. Para mejorar aún más la producción de amilasa, se realizaron eliminaciones de genes combinatorios. Las supresiones combinatorias aumentaron aún más la secreción de proteínas, la cepa de triple gen de la cepa K10(Ahd2, Avps5 y Afda3)puede secretar una amilasa 4 veces superior a las cepas de control en la fermentación de tubos. Se observó que la supresión de VPS5 redujo significativamente la retención intracelular de amilasa, con solo el 10 % de amilasa retenida en cepas con supresión VPS5. Como Vps5p formó un subcomplejo retromer con Vps17p, también se probó la supresión deVPS17en la secreción de amilasa. La supresión deVPS17se llevó a cabo mediante transformación del casete de supresión VPS17, que se amplificó a partir del plásmido pUG-amdSYM usando pares de cebadores VPS17F/VPS17R. Se obtuvo un resultado similar de producción de amilasa en la cepa de supresiónVPS17,donde no solo aumentó el rendimiento de amilasa sino que también se redujo la retención de amilasa significativamente (Figura 4). Este resultado enfatizó la importancia del tráfico entre Golgi y el endosoma en la secreción de proteínas.

Ejemplo 3

Efecto de la sobreexpresión de ERV29 y COG5 en la producción de proteínas

El efecto de la sobreexpresión deERVE29y COG5 en la secreción de proteínas también se probó.

El fragmento del genERVE29se amplificó a partir del genoma CEN.PK 530-1C de S.cerevisiaeusando los cebadores ERV29EP1 y ERV29EP2, digerido con enzimas de restricción No l y Sacl, e insertando en los sitios de clonación correspondientes del plásmido pSPGM1, dando como resultado el plásmido pGM-ERV29. El genERVE29fue controlado por el promotor TEF1p en el plásmido pGM-ERV29. El fragmento del gen COG5 se amplificó a partir del genoma CEN.PK 530-1C de S .cerevisiaemediante el uso de los cebadores COG5EP1 y COG5EP2, digerido con las enzimas de restricción BamHI yKpnl,y se insertó en los sitios de clonación correspondientes del plásmido pSPGM1, lo que da como resultado el plásmido pGM-COG5. El gen COG5 estaba controlado por el promotor PGK1p sobre el plásmido pGM-COG5. De manera similar, el fragmento de gen COG5 se insertó en los puntos de clonaciónBamHI-Kpnlde pGM-ERV29, dando como resultado el plásmido pGM-ERV-COG, que sobreexpresa simultáneamente ambose R vE29y COG5. Junto con el plásmido pAlphaAmmiCPOT, los plásmidos pGM-ERV29, pGM-COG5 y pGM-ERV-COG se transformaron en la cepa CEN.PK 53.1D como se describe en el Ejemplo 1 anterior, dando como resultado la cepa E02, E03 y E05, respectivamente. La cepa E01 con plásmido vacío pSPGM1 se usó como cepa de referencia. Todas las cepas se cultivaron y analizaron para determinar la producción de amilasa como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Como se muestra en la Figura 5, la sobreexpresión de genes individuales mejoró la secreción de amilasa y disminuyó la retención intracelular de amilasa. Por el contrario, la sobreexpresión combinatoria solo disminuyó la retención intracelular de amilasa, pero no aumentó la secreción de amilasa. La razón para no aumentar la secreción de amilasa en la cepa de sobreexpresión combinatoria fue más probable que la sobreexpresión de dos genes por un plásmido de alto número de copias aumentó la carga de las células y consumió demasiado recurso, que debe usarse para la proteína diana.

Ejemplo 4

Combinación de supresión génica y sobreexpresión génica en la producción de proteínas

Para reducir la carga celular y aumentar la estabilidad celular, se aplicó una fuerte sustitución del promotor para la sobreexpresión de genes diana. El reemplazo del promotor se realizó en la cepa de supresiones de genes triples K30 (eliminación deHDA2, VPS5yTDA3).El casete de amdS-TEF1 p para el reemplazo del promotor nativoERVE29se construyó como sigue. Se usaron cebadores ERVPR1 y amdSR1 para amplificar el marcador amdS usando el plásmido pUG-amdSYM como plantilla. Los cebadores ERVPR3 y ERVPR4 se usaron para amplificar el fragmento p de TEF1 usando el plásmido pGM-ERV29 como plantilla. El marcador amdS y el fragmento TEF1p se fusionaron conjuntamente mediante PCR de fusión y dio como resultado un casete amdS-TEF1p. El casete 5” de amdS-TEF1p es homólogo a la corriente ascendiente del promotor nativoERVE29y el casete 3” de amdS-TEF1 p es homólogo a la corriente descendiente del promotor nativo ERV29. El reemplazo del promotor nativoERVE29por el promotor TEF1p se logró mediante la transformación del casete amdS-TEF1p a la cepa K30 y se seleccionó en placas SM-Ac. Los cebadores ERV29P2 y ERVPR5 se usaron para la verificación del promotor de reemplazoERVE29.De manera similar, el casete de amdS-PGKp para el reemplazo del promotor de COG5 nativo se construyó mediante el uso de pares de cebadores COGPR1/amdSR1 y COGPR3/COGPR4, y el plásmido pUG-amdSYM y pGM-COG5 como plantilla, respectivamente. El reemplazo del promotor nativo COG5 por el promotor PGK1 p se logró mediante la transformación del casete de amdS-PGKp a la cepa K30 y se seleccionó en placas SM-Ac, lo que dio como resultado la cepa K13. Los cebadores COG5P2 y COGPR5 se usaron para la verificación del reemplazo del promotor COG5.

También nos interesó saber si la sobreexpresión deUF/1es compatible con otras modificaciones de la diana génica y aumenta aún más la capacidad de producción de proteínas de cepas modificadas. Por lo tanto, se ensayó tanto la sustitución del promotor como la integración génica para el genUF/ i . El promotor nativoUF /1se reemplazó por un promotor fuerte FBA1p. El casete de amdS-FBA1p para el reemplazo del promotor nativoUF /1se construyó como sigue. Se usaron los cebadores PDIFPR1 y amdSR1 para amplificar el marcador amdS mediante el uso del plásmido pE-amdSYM como plantilla. Se usaron cebadores PDIFPR3 y PDIFPR4 para amplificar el fragmento de FBA1 p usando el genoma S.cerevisiaeCEN. PK 530-1C como plantilla. El marcador amdS y el fragmento FBA1p se fusionaron conjuntamente mediante PCR de fusión y dio como resultado un casete amdS-FBA1p. Como la supresión de GOS1 se mostró positiva en la secreción de proteínas, la posición para la integración de una copia de UF /1 el gen se eligió en el locus GOS1. Por lo tanto, la integración de UF /1 se logró con el reemplazo deGOSl.Se probaron dos casetes de integración dePDI1diferentes. Uno estaba controlado por el promotor nativoUF /1PDI1p. El otro uno estaba controlado por el promotor TEF1p. El casete amdS-PDI1p-PDI1 para la integración de UF /1 bajo control por el promotor PDI1p se construyó como sigue. Se usaron los cebadores GOPGI1 y amdSR1 para amplificar el marcador de amdS mediante el uso del plásmido pE-amdSYM como plantilla. Se usaron los cebadores GOPDI3 y GOSPDI4 para amplificar el fragmento PDI1p-PDI1 usando el genoma S.cerevisiaeCEN. PK 530-1C como plantilla. El marcador amdS y el fragmento PDI1p-PDI1 se fusionaron juntos mediante PCR de fusión y dio como resultado el casete de reemplazo amdS-PD11p-PDI1. El casete amdS-TEF1p-PDI1 se construyó como sigue. Se usaron los cebadores NGOSPDI1 y amdSR1 para amplificar el marcador de amdS usando el plásmido pE-amdSYM como plantilla.El fragmento del gen UF/1se amplificó a partir del genoma S.cerevisiaeCEN.PK 530-1C mediante el uso de los cebadores PDI1EP1 y PDI1EP2. A continuación, el fragmento del genUF /1se digirió porNotly Sacl para insertar después TEF1p en el plásmido pSPGM1, lo que da como resultado pGM-PDI1. Se usaron los cebadores NGOIDI3 y NGOSPDI4 para amplificar el fragmento TEF1p-PDI1 usando pGM-PDI1 como plantilla. El marcador amdS y el fragmento TEF1p-PDI1 se fusionaron juntos mediante PCR de fusión y dio como resultado el casete de reemplazo amdS-TEF1p-PDl1. Los casetes de amdS-FBA1p, amdS-PDI1p-PDI1 y amdS-TEF1p-PDI1 se transformaron en la cepa de levadura K40 para el reemplazo del promotorPDI1o la integración dePDI1,dando como resultado la cepa K15, K16 y K17, respectivamente. Todas las transportaciones, cultivos y mediciones de amilasa se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.

Como se muestra en la Figura 6, la sobreexpresión dePDI1fue compatible con otras modificaciones génicas en cepas de levadura para la mejora de la secreción de amilasa.

Ejemplo 4

Prueba de modificaciones clave con otras proteínas

Para demostrar que las modificaciones descritas en el presente documento son beneficiosas para diferentes proteínas, la cepa de mejor producción también se probó con glucano 1,4-a-glucosidasa en lugar de amilasa. El plásmido de expresión de amilasa pAlphaAmmyCPOT se eliminó de la mejor cepa modificada K17 mediante la transferencia en serie en medio YPE no de selección. La cepa K17 sin plásmido pAlphaAmmiCPOT se renombró como CEN. PK 530-1CK303. Otro plásmido pCP-aGLA, que expresa el glucano 1,4-a-glucosidasa, se transformó en CEN PK 530-1CK303, y las colonias se seleccionaron en placas de YPD. Después, la cepa CEN.PK 530-1CK303 que alberga el plásmido pCP-aGLA se cultivó en medio SD-2xSCAA y el glucano 1,4-a-glucosidasa se midió usando reactivo de ensayo de amiloglucosidasa (Megazyme, Irlanda).

Como se muestra en la Figura 7, en comparación con la cepa de referencia, se logró un rendimiento más alto del glucano 1,4-a-glucosidasa mediante la cepa modificada por ingeniería genética. Este resultado respaldó que las dianas génicas identificadas tienen un efecto general positivo en la producción de proteínas y pueden usarse ampliamente en la construcción de fábricas celulares para la producción de proteínas.

Ejemplo 5

Fermentación discontinua por lotes y fermentación por lotes

Para el cultivo alimentado por lotes, se inocularon primero cultivos de semillas de cepa K17 a 200 ml de medio SD-2xSCAA (5,4 g/L de Na Na<2>HPO<4>y 8,56 g/L de NaH<2>PO<4>H<2>O se reemplazaron por 2 g/L de KH<2>PO<4>) con una DO inicial<6oo )>de 0,1. El sistema del biorreactor se operó a 30 °C, 600 rpm como velocidad de agitación inicial y aumentó como máximo a 1200 rpm, 18 L/h como flujo de aire inicial y aumentó al máximo 48 L/h, pH = 6 (mantenido mediante el uso de KOH 4 M y HCl 2 M), el nivel de oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 30 % controlando la velocidad de agitación, el flujo de aire y la alimentación del medio. Medio de alimentación de baja glucosa 10x contenido: 1 g/L de glucosa, 69 g/L de base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 50 g/L de casaminoácidos (Formedio, Norfolk, Reino Unido), 1 g/L de BSA, 20 g/L de KH<2>PO<4>(pH=5 por KOH). Para el medio de alimentación de alta glucosa 10x, se reemplazó una glucosa de 200 g/L en medio de alimentación 10x de baja glucosa por 600 g/L de glucosa. Después de que la glucosa y el etanol se consumieron en cultivo discontinuo (200 ml de medio SD-2xSCAA), se inició la alimentación exponencial usando el medio de alimentación de baja glucosa 10 x y se controló a una tasa de crecimiento específica de 0,08 h<-1>. Cuando tanto la velocidad de agitación como el flujo de aire alcanzaron el valor máximo (1200 rpm y 48 L/h, respectivamente), la alimentación del medio se activó por nivel de oxígeno disuelto>30 %. Después de alimentar aproximadamente 330 ml de medio de alimentación de baja glucosa 10x, se usó medio de alimentación de alto contenido de glucosa 10x. Y la fermentación se detuvo cuando se alimentaron 330 ml de medio de alimentación 10x de alto contenido de glucosa en el biorreactor. Totalmente, se añadieron 660 ml de medio de alimentación al biorreactor. Los experimentos duplicados biológicos se realizaron en cultivo semicontinuo. Como se muestra en la Figura 8, el título final de a-amilasa alcanzó 2,5 g/L, y la retención de a-amilasa intracelular mantuvo un nivel bajo (la mayor parte del tiempo por debajo del 10 % y el valor máximo fue del 12 % ) en todo el proceso.

Tanto los resultados de cultivo discontinuo como alimentado por lotes confirmaron que la secreción de proteínas mejoró sustancialmente en la cepa de levadura con modificaciones combinatorias. La cepa manipulada por ingeniería genética fue capaz de adaptar la fermentación de alta densidad y mostró una posible aplicación industrial.

Tabla 1. Plásmidos y cepas

Tabla 2. Cebadores

Las realizaciones descritas anteriormente deben entenderse como unos pocos ejemplos ilustrativos de la presente invención. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse diversas modificaciones, combinaciones y cambios en las realizaciones sin abandonar el ámbito de la invención. En particular, pueden combinarse diferentes soluciones parciales en las diferentes realizaciones en otras configuraciones, cuando sea técnicamente posible. El ámbito de la presente invención queda definido, sin embargo, por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una célula fúngica, en donde

dicha célula fúngica carece de un gen que codifica Tda3p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Tda3p;

dicha célula fúngica comprende un gen heterólogo que codifica una proteína heteróloga; y dicha célula fúngica tiene un transporte alterado entre el Golgi y el endosoma.

2. Una célula fúngica según la reivindicación 1, en donde dicha célula fúngica carece de un gen que codifica Gos1p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Gos1p.

3. Una célula fúngica según la reivindicación 1-2, en donde dicha célula fúngica se modifica genéticamente para reducir la expresión de al menos una proteína seleccionada de un grupo que consiste en Vps5p (id. de sec. n°.:3), Vps17p (id. de sec. n°.: 4), Pep8p (id. de sec. n°.: 5), Vps29p (id. de sec. n°.: 6), Vps35p (id. de sec. n°.: 7), y variantes de las mismas que tienen al menos 50 % de homología con cualquiera de la id. de sec. n°.: 3-7, en donde dicha célula fúngica carece de un gen que codifica la al menos una proteína y dicha célula fúngica es una célulaSaccharomyces cerevisiae.

4. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha célula fúngica carece de genes que codifican subunidades de complejo de histona desacetilasa HDA1, preferiblemente al menos uno de Hda2p y Hda3p, o comprende genes endógenos alterados que codifican dichas subunidades de complejo de histona desacetilasa HDA1, preferiblemente al menos uno de Hda2p y Hda3p.

5. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha célula fúngica carece de un gen que codifica Pg2p y/o un gen que codifica Pgm1p o comprende un gen endógeno alterado que codifica Pg2p y/o un gen endógeno alterado que codifica Pgm1p.

6. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha célula fúngica carece de genes que codifican subunidades de complejo de transporte de ABC peroxisomal, preferiblemente al menos uno de Pxa1P y Pxa2p, o comprende genes endógenos alterados que codifican dichas subunidades de complejo de transporte de ABC peroxisomal, preferiblemente al menos uno de Pxa1P y Pxa2p.

7. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha célula fúngica carece de genes que codifican miembros del complejo conservado de membrana del retículo endoplásmico, preferiblemente Emc1p, o comprende genes endógenos alterados que codifican dichos miembros de dicho complejo conservado de membrana endoplásmica, preferiblemente Emc1p.

8. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha célula fúngica carece de genes que codifican proteínas receptoras de membrana vesicular, preferiblemente al menos uno de Snc1p y Snc2p, o comprende genes endógenos alterados que codifican dichas proteínas receptoras de membrana vesicular, preferiblemente al menos uno de Snc1p y Snc2p.

9. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde

dicha célula fúngica se modifica genéticamente para una expresión mejorada, en comparación con una célula fúngica natural, de al menos un componente del complejo de anclaje a red citosólico, preferiblemente dicho al menos un componente se selecciona de un grupo que consiste en Cog1p, Cog2p, Cog3p, Cog4p, Cog5p, Cog6p, Cog7p y Cog8p; y/o

dicha célula fúngica se modifica genéticamente para la sobreexpresión, en comparación con la célula fúngica natural, de al menos una proteína endógena implicada en el transporte entre el retículo endoplásmico y el Golgi, preferiblemente dicha al menos una proteína endógena se selecciona de un grupo que consiste en Ypt1p, Bos1p, Bet1p, Sec22p, Sed5p, Sar1p, Sec12p, Sec23p, Sec24p, Sec13p, sec14p, Sec15p, Sec16p, Sec17p, Sec18p, Sec19p, Sec20p, Sec21p, Sec22p, Sec25p, Sec26p, Sec27p, Sec28p, Sec29p, Sec30p, Sec31p, Erv14p, Erv26p, Emp24p, Erv25p y Erv29p; y/o

dicha célula fúngica se modifica genéticamente para la sobreexpresión, en comparación con la célula fúngica natural, de al menos una proteína endógena implicada en el transporte entre el Golgi y la membrana plasmática, preferiblemente dicha al menos una proteína endógena se selecciona de un grupo que consiste en Sec3p, Sec5p, Sec10p, Sec6p, Sec8p, Exo70p, Exo84p, Ssolp, Sec1p, Ypt32p y Sec4p.

10. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha célula fúngica se modifica genéticamente para mejorar, en comparación con una célula fúngica natural, la expresión de al menos una proteína chaperona endógena, preferiblemente dicha al menos una proteína endógena se selecciona de un grupo que consiste en Pdi1p, Mpd1p, Mpd2p, Eug1p, Eps1p, Kar2p, Ero1p, Sec1p, SIy1p y Cpr5p.

11. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha célula fúngica se modifica genéticamente para mejorar, en comparación con una célula fúngica natural, la expresión de al menos un factor de transcripción que controla la expresión de proteínas chaperonas, preferiblemente dicho al menos un factor de transcripción se selecciona de un grupo que consiste en Hsf1 p y Hac1 p.

12. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicha célula fúngica carece de genes que codifican proteasas o comprende genes alterados que codifican proteasas endógenas, preferiblemente seleccionados de un grupo que consiste en Pep4p, Prb1p, Yps1p, Yps2p, Yps3p, Yps5p, Yps6p e Yps7p.

13. Una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde dicha célula fúngica se modifica genéticamente para la regulación negativa, en comparación con una célula fúngica natural, de al menos una proteína involucrada en la clasificación vacuolar, preferiblemente seleccionada de un grupo que consiste en Vps30p, Rgp1p, Mrl1p, Vam3p, Vps2p, Vps3p, Vps4p, Vps11p, Vps13p, Vps16p, Vps18p, Vps20p, Vps22p, Vps23p, Vps24p, Vps25p, Vps27p, Vps28p, Vps31p, Vps32p, Vps33p, Vps36p, Vps37p, Vps39p, Vps41p, Vps43p, Vps44p y Vps46p.

14. Un método para producir una proteína recombinante que comprende:

cultivar una célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en un medio de cultivo y en condiciones de cultivo adecuadas para la producción de dicha proteína heteróloga por dicha célula fúngica; y

recoger dicha proteína heteróloga de dicho medio de cultivo y/o de dicha célula fúngica.