CN112501143B - 一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用 - Google Patents

一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112501143B
CN112501143B CN202011478649.6A CN202011478649A CN112501143B CN 112501143 B CN112501143 B CN 112501143B CN 202011478649 A CN202011478649 A CN 202011478649A CN 112501143 B CN112501143 B CN 112501143B
Authority
CN
China
Prior art keywords
comq
leu
mutant
seq
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011478649.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112501143A (zh
Inventor
刘艳
李伟
吴静
薛正莲
王洲
宋平
胡刘秀
周梦洁
胡汶松
汪剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Polytechnic University
Original Assignee
Anhui Polytechnic University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Polytechnic University filed Critical Anhui Polytechnic University
Priority to CN202011478649.6A priority Critical patent/CN112501143B/zh
Publication of CN112501143A publication Critical patent/CN112501143A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112501143B publication Critical patent/CN112501143B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。本发明提供的突变体，蛋白表达水平有明显的降低，而维生素K2和纳豆激酶生物合成能力有所提高。

Description

一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用。
背景技术
近年来的研究发现，细菌之间存在信号交流系统，即群体感应系统，对细菌形态变化及功能表达起着至关重要的作用。细菌通过群体感应系统检测周围环境中特定信号分子的浓度时刻监控着同类或异类细菌的数量和浓度变化，群体感应系统一旦检测到周围细菌的数量或者浓度达到特定值，便会通过所分泌的信号分子发出相应的信号，诱导细菌中特定基因的表达，协调改变细菌之间的行为方式，刺激菌内营养物质和代谢产物的信号传递。
细菌群体感应系统一般由信号分子，信号识别系统以及信号识别系统诱导的不同基因组成。革兰氏阳性菌群体感应系统的信号分子一般是自诱导肽类物质AIPS，其调控过程主要包括AIPS的合成、加工、分泌以及细菌对AIPS的信号响应等。革兰氏阳性菌的信号识别系统是双组分信号转导系统，包括感应激酶和反应调节器。反应调节器调控生物膜组成相关基因的表达，进而影响胞外蛋白质、多糖、DNA等物质的组成和含量及细菌的运动性。
在B.subtilis中，ComX-ComQ-ComP-ComA是QS系统中主要的信号途径，调控细菌感受态细胞的形成、芽孢的产生、生物膜的形成以及抗生素的产生等。由55个氨基酸组成的comX基因编码comX信息素前体，ComQ负责将没有活性的信号分子ComX转变为有活性的信号分子，然后激活ComP-ComA双组分信号转导系统，从而调控整个菌体的行为。ComQ的存在对于激活B.subtilis群体感应系统至关重要，但该酶及其突变体是否会影响维生素K2的代谢合成以及抵抗外来抗生素的合成未为可知。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用，目的是提高维生素K2和纳豆激酶的生物合成能力。
基于上述目的，本发明提供了一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供编码所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体的基因。
所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.7所示。
其中，类异戊二烯转移酶ComQ突变体，其酶活性中心附近的氨基酸突变为精氨酸、组氨酸、丙氨酸和赖氨酸。
若所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体为第95位天冬酰胺突变为精氨酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2；
若所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体为第96位天冬氨酸突变为组氨酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4；
若所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体为第99位天冬氨酸突变为丙氨酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6；
若所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体为第215位精氨酸突变为赖氨酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8。
本发明在NCBI公布的comQ基因(Accession：BAI86695)序列基础上，对其编码的氨基酸进行取代，氨基酸取代点分别为第95位天冬酰胺、第96位天冬氨酸、第99位天冬氨酸或第215位天冬酰胺。
本发明还提供含所述类异戊二烯转移酶突变体基因的表达载体、工程菌。
优选的，工程菌的出发菌为Bacillus subtilis 168，外源comQ基因来自Bacillussubtilis natto。
本发明将SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5或者SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列以P7C6或能表达该酶的质粒为表达载体，以BS168(Bacillus subtilis 168)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A或ComQD215K的高效表达。
本发明还提供表达所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体的工程菌的制备方法，包括如下步骤：
步骤一，同源重组敲除Bacillus subtilis 168中comQ基因得到△comQ菌株；
步骤二，PCR扩增编码来自Bacillus subtilis natto的类异戊二烯转移酶基因；将所得PCR产物连接表达载体pHY-P43得到重组质粒pHY-comQ，经转化后转入△comQ菌株，得到BS/pHY-comQ工程菌株；
步骤三，采用Dpn I法点突变，根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以重组质粒pHY-comQ为模板，通过PCR扩增出产物，经转化处理得到的重组质粒pHY-comQ'再转入△comQ菌株，得到待表达的突变株ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A和ComQD215K。
优选的，所述步骤一中得到△comQ菌株的方法包括如下步骤：
A1，将Bacillus subtilis 168原始菌培养至指数生长中期，提取全基因组DNA；
A2，将含有P7C6质粒的大肠杆菌JM109培养至指数生长中期，提取P7C6质粒；
A3，以Bacillus subtilis 168全基因组DNA作为左、右同源臂的模板；P7C6质粒DNA作为中间片段的模板，设计特异性引物进行PCR扩增，扩增产物融合纯化后，化学转化到Bacillus subtilis 168(BS168)感受态细胞中，得到△comQ菌株。
其中，特异性引物用于BS168 comQ的敲除，特异性引物如下：
L-△comQ-F：5’-GAATAAACGAATGCTCAGCATATTTAT
L-△comQ-R：5’-ATCCCCGGGTTTAACTACTTTTTAAATTATCCTGAGGCT
△comQ-P7C6-F：5’-CCTCAGGATAATTTAAAAAGTAGTTAAACCCGGGGATCCTC
△comQ-P7C6-R：5’-CGGATCAAGGAGAAAGTTCAAGCGAAAACATACCAC
R-△comQ-F：5’-TTTCGCTTGAACTTTCTCCTTGATCCGGACAG
R-△comQ-R：5’-CTTATAGTTTGTTTATCAGACTGTTCGG
所述步骤二中得到BS/pHY-comQ工程菌株的方法包括如下步骤：
B1，将Bacillus subtilis natto培养至指数生长中期，之后提取基因组DNA；
B2，设计扩增引物用于Bacillus subtilis natto中comQ基因的扩增：
comQ-F:5’–GACCGCTGGATCCATGTCCCATTTAGT
comQ-R:5’–CGTGAATTCTTAAATCCCCCTTAAT
其中上游引物酶切位点为BamHI(comQ-F中下划线部分)，下游引物酶切位点为EcoRI(comQ-R中下划线部分)。
B3，扩增产物纯化后，用BamHI和EcoRI对PCR产物和载体pHY-p43进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4h，将重组质粒pHY-comQ转到△comQ菌株，得到BS/pHY-comQ工程菌株。
步骤三的定点突变原理：点突变质粒的构建采用Dpn I法。根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以重组质粒pHY-comQ为模板，通过PCR扩增出产物。其中，PCR点突变引物为如下正向引物及反向引物：
D95R-F：TTATCTGCGGACATTTTTCGCGATATTGAGGATAAGGACAAT
D95R-R：ATTGTCCTTATCCTCAATATCGCGAAAAATGTCCGCAGATAA
D96H-F：TCTGCGGACATTTTTGACCATATTGAGGATAAGGACAATCTTC
D96H-R：GAAGATTGTCCTTATCCTCAATATGGTCAAAAATGTCCGCAGA
D99A-F：CATTTTTGACGATATTGAGGCTAAGGACAATCTTCAGGCTTC
D99A-R：GAAGCCTGAAGATTGTCCTTAGCCTCAATATCGTCAAAAATG
D215K-F：GTCGAGCAAATTGCAAATAAGCACTATGGACTTTATTACCCT
D215K-R：AGGGTAATAAAGTCCATAGTGCTTATTTGCAATTTGCTCGAC
其中下划线部分分别代表突变体基因编码的95位天冬酰胺、第96位天冬氨酸、第99位天冬氨酸和第215位天冬氨酸分别突变为精氨酸、组氨酸、丙氨酸和赖氨酸所对应的密码子。
PCR产物用Dpn I酶在37℃处理3h，去除模板DNA，消化产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，测序验证。将comQ相应位点已成功突变的重组质粒pHY-comQ'转入△comQ菌株，得到待表达的突变株ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A和ComQD215K。
本发明还提供所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体在合成维生素K2和纳豆激酶中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的突变体，蛋白表达水平有明显的降低，而维生素K2和纳豆激酶生物合成能力却有所提高。本发明通过比较野生型和突变型菌株维生素K2和纳豆激酶合成能力，结果发现突变体酶菌株ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A和ComQD215K维生素K2合成能力分别为野生型的4.25，4.86，4.27和3.86倍，纳豆激酶合成能力分别为野生型菌株的1.86，2.12，2.45和1.78倍。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是Bacillus subtilis 168comQ基因敲除的构建图谱；
图2是本发明定点突变的原理示意图；
图3是野生型菌株、空载菌株及突变菌株ComQ蛋白表达水平比较图；
图4是野生型菌株、空载菌株及突变菌株维生素K2和纳豆激酶合成量比较图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
所用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR试剂等均购于上海生工生物工程股份有限公司；质粒购于优宝生物；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、大肠杆菌DH5α菌株、大肠杆菌JM109、枯草芽孢杆菌168购于天根生物公司；引物购于英潍捷基(上海)贸易有限公司；其他试剂均为国内或者国外购买的分析纯试剂。
实施例1
B.subtilis△comQ菌株的构建
将B.subtilis 168(Bacillus subtilis 168)原始菌培养至指数生长中期，取4mL菌液，10,000×g离心5分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取全基因组DNA。将含有P7C6质粒的大肠杆菌JM109培养至指数生长中期，取4mL菌液，8,000×g离心2分钟收集菌体，弃尽培养基，按照试剂盒说明提取质粒DNA。以枯草芽孢杆菌168全基因组DNA作为左、右同源臂的模板；P7C6质粒DNA作为中间片段的模板，以设计相关的正向及反向引物(特异性引物)，通过PCR扩增出产物。
设计特异性引物如下：
L-comQ-F：5’-TGTTTATCAGACTGTTCGGCT
L-comQ-R：5’-AAATTGTTATCCGCTCTTTCTCCTTGATCCGGACAGAA
comQ-P7C6-F：5’-CGGATCAAGGAGAAAGAGCGGATAACAATTTCACACAG
comQ-P7C6-R：5’-CCACAATCTCCTTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATG
R-comQ-F：5’-TAAGAGAGGAATGTACACATGAAGGAGATTGTGGAGCAAA
R-comQ-R：5’-CAGTTTCTTGCACATCAAAACCTA
左、右同源臂PCR扩增体系为：dd H2O 10uL，全基因组模板0.5uL，上下游引物各1.0uL，Primer star 12.5uL。PCR扩增条件：98℃变性5min，34个循环(98℃10s，55℃5s，72℃10s)，最后72℃延伸5min。
中间片段PCR扩增条件：98℃变性5min，34个循环(98℃10s，55℃5s，72℃12s)，最后延伸72℃5min。
三个扩增片段纯化融合后，再采用PCR扩增目的基因条带。PCR扩增条件：98℃变性5min，34个循环(98℃10s，55℃5s，72℃32s)，最后72℃延伸5min。
将目的基因条带扩增产物纯化后，化学转化到B.subtilis感受态细胞中，待平板上长出转化子转化，挑取转化子液体培养，PCR菌液验证获取△comQ菌株。
重组质粒的构建
将B.subtilis natto(Bacillus subtilis natto)培养至指数生长中期，取3mL菌液10,000×g离心5min弃去上清，按照试剂盒说明提取基因组DNA。
设计如下引物用于B.subtilis natto comQ基因的扩增：
comQ-F:5’–GACCGCTGGATCCATGTCCCATTTAGT
comQ-R:5’–CGTGAATTCTTAAATCCCCCTTAAT
其中上游引物酶切位点为BamHI(comQ-F中下划线部分)，下游引物酶切位点为EcoRI(comQ-R中下划线部分)。
PCR扩增条件：94℃变性5min，30个循环(95℃30s，58℃30s，72℃90s)，最后72℃延伸10min。
扩增产物纯化后，用BamHI和EcoRI对PCR产物和载体pHY-p43进行双酶切，两者的回收产物，用T4连接酶22℃下连接4h，将重组质粒pHY-comQ转到△comQ菌株，得到BS/pHY-comQ工程菌。
定点突变
定点突变原理(如图2所示)：点突变质粒的构建采用Dpn I法。根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以重组质粒pHY-comQ为模板，通过PCR扩增出产物。其中，PCR点突变引物为如下正向引物及反向引物：
D95R-F：TTATCTGCGGACATTTTTCGCGATATTGAGGATAAGGACAAT
D95R-R：ATTGTCCTTATCCTCAATATCGCGAAAAATGTCCGCAGATAA
D96H-F：TCTGCGGACATTTTTGACCATATTGAGGATAAGGACAATCTTC
D96H-R：GAAGATTGTCCTTATCCTCAATATGGTCAAAAATGTCCGCAGA
D99A-F：CATTTTTGACGATATTGAGGCTAAGGACAATCTTCAGGCTTC
D99A-R：GAAGCCTGAAGATTGTCCTTAGCCTCAATATCGTCAAAAATG
D215K-F：GTCGAGCAAATTGCAAATAAGCACTATGGACTTTATTACCCT
D215K-R：AGGGTAATAAAGTCCATAGTGCTTATTTGCAATTTGCTCGAC
其中下划线部分分别代表突变体基因编码的95位天冬酰胺、第96位天冬氨酸、第99位天冬氨酸和第215位天冬氨酸分别突变为精氨酸、组氨酸、丙氨酸和赖氨酸所对应的密码子。PCR扩增体系为：质粒DNA0.5uL，5×Primer star Buffer 5uL，引物各0.5uL，dNTP2uL，Primer star 0.25uL，ddH2O补至25uL，PCR扩增条件95℃变性1min，循环18次(95℃，40s，50℃15s，66℃，390s)，72℃10min。
PCR产物用Dpn I酶在37℃处理3h，去除模板DNA，消化产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到相关突变株的转化子，提取质粒，测序验证。将comQ相应位点已成功突变的重组质粒pHY-comQ'转入△comQ菌株，得到待表达的突变株ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A和ComQD215K。
△comQ菌株、野生型BS168菌株、BS/pHY–comQ及各类突变菌株ComQ蛋白表达水平和维生素K2、纳豆激酶生产能力检测表达测试：
挑取△comQ菌株、野生型BS168菌株、BS/pHY–comQ及各类突变菌株，接种于有Amp(100ug/mL)抗性的5mL的液体发酵培养基(蛋白胨10-20g/L，酵母粉15-35g/L，甘油50-70g/L，K2HPO4 0.1-0.8g/L，MgSO4 0.2-0.8g/L，pH 7.3)中，37℃200rpm培养7天。
提取：菌液在8000×g、4℃离心10min，弃上清。加入40mL、pH8.0裂解缓冲液(10mmol/L Tris·HCl，10mmol/L NaCl，0.2％NP-40)吹打混匀菌体，之后在8000×g、4℃离心10min，上清用于纳豆激酶含量的检测。收集菌体，取出部分用于维生素K2含量的检测，其余冰上放置，加入NETN裂解液，CK和PMSF(蛋白酶抑制剂)，取出一部分利用Bradford法检测其蛋白含量，剩余用于检测蛋白表达水平。
Western blot检测ComQ表达水平：在另外的干净管中分别加入相同蛋白质量(约50ug)的待测液，加入loading buffer后100℃煮沸10min，SDS PAGE凝胶电泳分离，分离胶浓度为10％。SDS PAGE蛋白电泳后得到的Resolving胶切除杂边，转至PVDF膜(用前甲醇浸泡10min)上，冰浴加有20％甲醇的trans buffer完成转膜(100V，2h)。转膜完成后，5％脱脂牛奶封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜。TBST清洗三次后加入二抗室温避光孵育2h，暗室显影，具体如图3所示。
野生菌和突变菌维生素K2生产能力测定：
出发菌、△comQ、BS/pHY-comQ及各突变株经发酵培养后，离心得到湿菌体，冷冻破碎后，甲醇提取，提取液高效液相248nm检测维生素K2含量，具体测定结果如图4所示。由图4可以看出，BS168中维生素K2含量为8.42±0.47mg/L，敲除内源comQ后，维生素K2产量降低到4.62±0.86mg/L，说明comQ基因有利于维生素K2的合成。导入纳豆芽孢杆菌comQ基因后，产量增加为12.56±0.57mg/L，说明纳豆芽孢杆菌comQ基因更有利于维生素K2的代谢合成。ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A和ComQD215K与BS168相比，突变体酶菌株维生素K2合成能力分别为野生型的4.25，4.86，4.27和3.86倍，说明这些位点的改造对于促进维生素K2的合成，具有非常重要的作用。
野生菌和突变菌纳豆激酶生产能力测定：
取1mL不同菌种发酵液，8000×g离心2min，稀释一定浓度后取10μL上清液点于纤维蛋白平板上，37℃恒温箱中保温18h后，测量透明圈的垂直直径，并根据尿激酶标准曲线计算纳豆激酶活力。具体测定结果如图4所示。由图4可以看出，BS168中纳豆激酶活力为3120±23U/mL，敲除内源comQ后，纳豆激酶活力降低到2464±56U/mL，说明comQ基因有利于纳豆激酶活力。导入纳豆芽孢杆菌comQ基因后，活力增加为4140±51U/mL，说明纳豆芽孢杆菌comQ基因更有利于纳豆激酶活力提升。ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A和ComQD215K与BS168相比，突变体酶菌株纳豆激酶合成能力分别为野生型菌株的1.86，2.12，2.45和1.78倍，说明这些位点的改造对于促进纳豆激酶活力，具有非常重要的作用。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽工程大学
<120> 一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用
<130> 1
<141> 2020-12-15
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 948
<212> DNA
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 1
atgtcccatt tagtaaaatg gaatgggagg ggggaagtcg ttattgagca gatatgttta 60
gattctgtcc ggatcaagga gaaaatgaag gagattgtgg atgaaaatat tttaaatgag 120
gacttaaaag tgaagctcat ttcttttatc aaagaaaaaa aacaattttc atttgcagaa 180
ctggcttatt accattacat agcatttgat ggaaaaaacg acaaagcaat tgagttattg 240
gcgtcaggta tagaactttt aattttatct gcggacattt ttcgcgatat tgaggataag 300
gacaatcttc aggcttcttg gatgaaatta gatccttcta tagcaactaa cgcagctacc 360
gcactttata cattaagtct gcaagtaata ggttcagtct caaatcatcc aaaactttta 420
agccttactt tgcaatattc actccaatct ttacaaggac aacatgtaga tttgaattta 480
acagcctcat cagaatcaga gtatattgaa atgattaaac ttaagtcggg ttctctggta 540
acattgccca gtattcttgg tgtatatctg gcaactggag aatataatga aacagttgag 600
gagtattcac gttatttagg tatagtcgag caaattgcaa atgatcacta tggactttat 660
taccctaact ataatgactt caaaactaga catacgcttg ccttcaatta tcttaaaaat 720
aaatttaacc aatcatcaat tgacttatta aatttttatg cgcaagaaaa tcatatgata 780
aataatttgg aagatttgaa gggaaagtta agagaatcag gtgtaataca atatttgaat 840
gttataaaaa atttagcagt ggaaaatttt aaggaatcat tcaaaaaact gagattagat 900
gaacaaagaa aaaataaatt acttattcaa ttattaaggg ggatttaa 948
<210> 2
<211> 315
<212> PRT
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 2
Met Ser His Leu Val Lys Trp Asn Gly Arg Gly Glu Val Val Ile Glu
1 5 10 15
Gln Ile Cys Leu Asp Ser Val Arg Ile Lys Glu Lys Met Lys Glu Ile
20 25 30
Val Asp Glu Asn Ile Leu Asn Glu Asp Leu Lys Val Lys Leu Ile Ser
35 40 45
Phe Ile Lys Glu Lys Lys Gln Phe Ser Phe Ala Glu Leu Ala Tyr Tyr
50 55 60
His Tyr Ile Ala Phe Asp Gly Lys Asn Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ile Glu Leu Leu Ile Leu Ser Ala Asp Ile Phe Arg Asp
85 90 95
Ile Glu Asp Lys Asp Asn Leu Gln Ala Ser Trp Met Lys Leu Asp Pro
100 105 110
Ser Ile Ala Thr Asn Ala Ala Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ser Leu Gln
115 120 125
Val Ile Gly Ser Val Ser Asn His Pro Lys Leu Leu Ser Leu Thr Leu
130 135 140
Gln Tyr Ser Leu Gln Ser Leu Gln Gly Gln His Val Asp Leu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Glu Ser Glu Tyr Ile Glu Met Ile Lys Leu Lys Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Val Thr Leu Pro Ser Ile Leu Gly Val Tyr Leu Ala Thr
180 185 190
Gly Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Tyr Ser Arg Tyr Leu Gly Ile
195 200 205
Val Glu Gln Ile Ala Asn Asp His Tyr Gly Leu Tyr Tyr Pro Asn Tyr
210 215 220
Asn Asp Phe Lys Thr Arg His Thr Leu Ala Phe Asn Tyr Leu Lys Asn
225 230 235 240
Lys Phe Asn Gln Ser Ser Ile Asp Leu Leu Asn Phe Tyr Ala Gln Glu
245 250 255
Asn His Met Ile Asn Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly Lys Leu Arg Glu
260 265 270
Ser Gly Val Ile Gln Tyr Leu Asn Val Ile Lys Asn Leu Ala Val Glu
275 280 285
Asn Phe Lys Glu Ser Phe Lys Lys Leu Arg Leu Asp Glu Gln Arg Lys
290 295 300
Asn Lys Leu Leu Ile Gln Leu Leu Arg Gly Ile
305 310 315
<210> 3
<211> 948
<212> DNA
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 3
atgtcccatt tagtaaaatg gaatgggagg ggggaagtcg ttattgagca gatatgttta 60
gattctgtcc ggatcaagga gaaaatgaag gagattgtgg atgaaaatat tttaaatgag 120
gacttaaaag tgaagctcat ttcttttatc aaagaaaaaa aacaattttc atttgcagaa 180
ctggcttatt accattacat agcatttgat ggaaaaaacg acaaagcaat tgagttattg 240
gcgtcaggta tagaactttt aattttatct gcggacattt ttgaccatat tgaggataag 300
gacaatcttc aggcttcttg gatgaaatta gatccttcta tagcaactaa cgcagctacc 360
gcactttata cattaagtct gcaagtaata ggttcagtct caaatcatcc aaaactttta 420
agccttactt tgcaatattc actccaatct ttacaaggac aacatgtaga tttgaattta 480
acagcctcat cagaatcaga gtatattgaa atgattaaac ttaagtcggg ttctctggta 540
acattgccca gtattcttgg tgtatatctg gcaactggag aatataatga aacagttgag 600
gagtattcac gttatttagg tatagtcgag caaattgcaa atgatcacta tggactttat 660
taccctaact ataatgactt caaaactaga catacgcttg ccttcaatta tcttaaaaat 720
aaatttaacc aatcatcaat tgacttatta aatttttatg cgcaagaaaa tcatatgata 780
aataatttgg aagatttgaa gggaaagtta agagaatcag gtgtaataca atatttgaat 840
gttataaaaa atttagcagt ggaaaatttt aaggaatcat tcaaaaaact gagattagat 900
gaacaaagaa aaaataaatt acttattcaa ttattaaggg ggatttaa 948
<210> 4
<211> 315
<212> PRT
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 4
Met Ser His Leu Val Lys Trp Asn Gly Arg Gly Glu Val Val Ile Glu
1 5 10 15
Gln Ile Cys Leu Asp Ser Val Arg Ile Lys Glu Lys Met Lys Glu Ile
20 25 30
Val Asp Glu Asn Ile Leu Asn Glu Asp Leu Lys Val Lys Leu Ile Ser
35 40 45
Phe Ile Lys Glu Lys Lys Gln Phe Ser Phe Ala Glu Leu Ala Tyr Tyr
50 55 60
His Tyr Ile Ala Phe Asp Gly Lys Asn Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ile Glu Leu Leu Ile Leu Ser Ala Asp Ile Phe Asp His
85 90 95
Ile Glu Asp Lys Asp Asn Leu Gln Ala Ser Trp Met Lys Leu Asp Pro
100 105 110
Ser Ile Ala Thr Asn Ala Ala Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ser Leu Gln
115 120 125
Val Ile Gly Ser Val Ser Asn His Pro Lys Leu Leu Ser Leu Thr Leu
130 135 140
Gln Tyr Ser Leu Gln Ser Leu Gln Gly Gln His Val Asp Leu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Glu Ser Glu Tyr Ile Glu Met Ile Lys Leu Lys Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Val Thr Leu Pro Ser Ile Leu Gly Val Tyr Leu Ala Thr
180 185 190
Gly Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Tyr Ser Arg Tyr Leu Gly Ile
195 200 205
Val Glu Gln Ile Ala Asn Asp His Tyr Gly Leu Tyr Tyr Pro Asn Tyr
210 215 220
Asn Asp Phe Lys Thr Arg His Thr Leu Ala Phe Asn Tyr Leu Lys Asn
225 230 235 240
Lys Phe Asn Gln Ser Ser Ile Asp Leu Leu Asn Phe Tyr Ala Gln Glu
245 250 255
Asn His Met Ile Asn Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly Lys Leu Arg Glu
260 265 270
Ser Gly Val Ile Gln Tyr Leu Asn Val Ile Lys Asn Leu Ala Val Glu
275 280 285
Asn Phe Lys Glu Ser Phe Lys Lys Leu Arg Leu Asp Glu Gln Arg Lys
290 295 300
Asn Lys Leu Leu Ile Gln Leu Leu Arg Gly Ile
305 310 315
<210> 5
<211> 948
<212> DNA
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 5
atgtcccatt tagtaaaatg gaatgggagg ggggaagtcg ttattgagca gatatgttta 60
gattctgtcc ggatcaagga gaaaatgaag gagattgtgg atgaaaatat tttaaatgag 120
gacttaaaag tgaagctcat ttcttttatc aaagaaaaaa aacaattttc atttgcagaa 180
ctggcttatt accattacat agcatttgat ggaaaaaacg acaaagcaat tgagttattg 240
gcgtcaggta tagaactttt aattttatct gcggacattt ttgacgatat tgaggctaag 300
gacaatcttc aggcttcttg gatgaaatta gatccttcta tagcaactaa cgcagctacc 360
gcactttata cattaagtct gcaagtaata ggttcagtct caaatcatcc aaaactttta 420
agccttactt tgcaatattc actccaatct ttacaaggac aacatgtaga tttgaattta 480
acagcctcat cagaatcaga gtatattgaa atgattaaac ttaagtcggg ttctctggta 540
acattgccca gtattcttgg tgtatatctg gcaactggag aatataatga aacagttgag 600
gagtattcac gttatttagg tatagtcgag caaattgcaa atgatcacta tggactttat 660
taccctaact ataatgactt caaaactaga catacgcttg ccttcaatta tcttaaaaat 720
aaatttaacc aatcatcaat tgacttatta aatttttatg cgcaagaaaa tcatatgata 780
aataatttgg aagatttgaa gggaaagtta agagaatcag gtgtaataca atatttgaat 840
gttataaaaa atttagcagt ggaaaatttt aaggaatcat tcaaaaaact gagattagat 900
gaacaaagaa aaaataaatt acttattcaa ttattaaggg ggatttaa 948
<210> 6
<211> 315
<212> PRT
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 6
Met Ser His Leu Val Lys Trp Asn Gly Arg Gly Glu Val Val Ile Glu
1 5 10 15
Gln Ile Cys Leu Asp Ser Val Arg Ile Lys Glu Lys Met Lys Glu Ile
20 25 30
Val Asp Glu Asn Ile Leu Asn Glu Asp Leu Lys Val Lys Leu Ile Ser
35 40 45
Phe Ile Lys Glu Lys Lys Gln Phe Ser Phe Ala Glu Leu Ala Tyr Tyr
50 55 60
His Tyr Ile Ala Phe Asp Gly Lys Asn Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ile Glu Leu Leu Ile Leu Ser Ala Asp Ile Phe Asp Asp
85 90 95
Ile Glu Ala Lys Asp Asn Leu Gln Ala Ser Trp Met Lys Leu Asp Pro
100 105 110
Ser Ile Ala Thr Asn Ala Ala Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ser Leu Gln
115 120 125
Val Ile Gly Ser Val Ser Asn His Pro Lys Leu Leu Ser Leu Thr Leu
130 135 140
Gln Tyr Ser Leu Gln Ser Leu Gln Gly Gln His Val Asp Leu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Glu Ser Glu Tyr Ile Glu Met Ile Lys Leu Lys Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Val Thr Leu Pro Ser Ile Leu Gly Val Tyr Leu Ala Thr
180 185 190
Gly Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Tyr Ser Arg Tyr Leu Gly Ile
195 200 205
Val Glu Gln Ile Ala Asn Asp His Tyr Gly Leu Tyr Tyr Pro Asn Tyr
210 215 220
Asn Asp Phe Lys Thr Arg His Thr Leu Ala Phe Asn Tyr Leu Lys Asn
225 230 235 240
Lys Phe Asn Gln Ser Ser Ile Asp Leu Leu Asn Phe Tyr Ala Gln Glu
245 250 255
Asn His Met Ile Asn Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly Lys Leu Arg Glu
260 265 270
Ser Gly Val Ile Gln Tyr Leu Asn Val Ile Lys Asn Leu Ala Val Glu
275 280 285
Asn Phe Lys Glu Ser Phe Lys Lys Leu Arg Leu Asp Glu Gln Arg Lys
290 295 300
Asn Lys Leu Leu Ile Gln Leu Leu Arg Gly Ile
305 310 315
<210> 7
<211> 948
<212> DNA
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 7
atgtcccatt tagtaaaatg gaatgggagg ggggaagtcg ttattgagca gatatgttta 60
gattctgtcc ggatcaagga gaaaatgaag gagattgtgg atgaaaatat tttaaatgag 120
gacttaaaag tgaagctcat ttcttttatc aaagaaaaaa aacaattttc atttgcagaa 180
ctggcttatt accattacat agcatttgat ggaaaaaacg acaaagcaat tgagttattg 240
gcgtcaggta tagaactttt aattttatct gcggacattt ttgacgatat tgaggataag 300
gacaatcttc aggcttcttg gatgaaatta gatccttcta tagcaactaa cgcagctacc 360
gcactttata cattaagtct gcaagtaata ggttcagtct caaatcatcc aaaactttta 420
agccttactt tgcaatattc actccaatct ttacaaggac aacatgtaga tttgaattta 480
acagcctcat cagaatcaga gtatattgaa atgattaaac ttaagtcggg ttctctggta 540
acattgccca gtattcttgg tgtatatctg gcaactggag aatataatga aacagttgag 600
gagtattcac gttatttagg tatagtcgag caaattgcaa ataagcacta tggactttat 660
taccctaact ataatgactt caaaactaga catacgcttg ccttcaatta tcttaaaaat 720
aaatttaacc aatcatcaat tgacttatta aatttttatg cgcaagaaaa tcatatgata 780
aataatttgg aagatttgaa gggaaagtta agagaatcag gtgtaataca atatttgaat 840
gttataaaaa atttagcagt ggaaaatttt aaggaatcat tcaaaaaact gagattagat 900
gaacaaagaa aaaataaatt acttattcaa ttattaaggg ggatttaa 948
<210> 8
<211> 315
<212> PRT
<213> 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto comQ)
<400> 8
Met Ser His Leu Val Lys Trp Asn Gly Arg Gly Glu Val Val Ile Glu
1 5 10 15
Gln Ile Cys Leu Asp Ser Val Arg Ile Lys Glu Lys Met Lys Glu Ile
20 25 30
Val Asp Glu Asn Ile Leu Asn Glu Asp Leu Lys Val Lys Leu Ile Ser
35 40 45
Phe Ile Lys Glu Lys Lys Gln Phe Ser Phe Ala Glu Leu Ala Tyr Tyr
50 55 60
His Tyr Ile Ala Phe Asp Gly Lys Asn Asp Lys Ala Ile Glu Leu Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gly Ile Glu Leu Leu Ile Leu Ser Ala Asp Ile Phe Asp Asp
85 90 95
Ile Glu Asp Lys Asp Asn Leu Gln Ala Ser Trp Met Lys Leu Asp Pro
100 105 110
Ser Ile Ala Thr Asn Ala Ala Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ser Leu Gln
115 120 125
Val Ile Gly Ser Val Ser Asn His Pro Lys Leu Leu Ser Leu Thr Leu
130 135 140
Gln Tyr Ser Leu Gln Ser Leu Gln Gly Gln His Val Asp Leu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Ala Ser Ser Glu Ser Glu Tyr Ile Glu Met Ile Lys Leu Lys Ser
165 170 175
Gly Ser Leu Val Thr Leu Pro Ser Ile Leu Gly Val Tyr Leu Ala Thr
180 185 190
Gly Glu Tyr Asn Glu Thr Val Glu Glu Tyr Ser Arg Tyr Leu Gly Ile
195 200 205
Val Glu Gln Ile Ala Asn Lys His Tyr Gly Leu Tyr Tyr Pro Asn Tyr
210 215 220
Asn Asp Phe Lys Thr Arg His Thr Leu Ala Phe Asn Tyr Leu Lys Asn
225 230 235 240
Lys Phe Asn Gln Ser Ser Ile Asp Leu Leu Asn Phe Tyr Ala Gln Glu
245 250 255
Asn His Met Ile Asn Asn Leu Glu Asp Leu Lys Gly Lys Leu Arg Glu
260 265 270
Ser Gly Val Ile Gln Tyr Leu Asn Val Ile Lys Asn Leu Ala Val Glu
275 280 285
Asn Phe Lys Glu Ser Phe Lys Lys Leu Arg Leu Asp Glu Gln Arg Lys
290 295 300
Asn Lys Leu Leu Ile Gln Leu Leu Arg Gly Ile
305 310 315

Claims (10)

1.一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
2.一种编码权利要求1所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示。
4.一种含权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.一种含权利要求2或3所述基因的工程菌。
6.根据权利要求5所述基因的工程菌，其特征在于，出发菌株为Bacillus subtilis168，外源comQ基因来自Bacillus subtilis natto。
7.表达权利要求1所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体的工程菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤一，同源重组敲除Bacillus subtilis 168中comQ基因得到△comQ菌株；
步骤二，PCR扩增编码来自Bacillus subtilis natto的类异戊二烯转移酶基因；将所得PCR产物连接表达载体pHY-P43得到重组质粒pHY-comQ；
步骤三，采用Dpn I法点突变，根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物，以重组质粒pHY-comQ为模板，通过PCR扩增出产物，经转化处理得到的重组质粒pHY-comQ'再转入△comQ菌株，得到待表达的突变株ComQD95R、ComQD96H、ComQD99A和ComQD215K。
8.根据权利要求7所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中得到△comQ菌株的方法包括如下步骤：
A1，将Bacillus subtilis 168原始菌培养至指数生长中期，提取全基因组DNA；
A2，将含有P7C6质粒的大肠杆菌JM109培养至指数生长中期，提取P7C6质粒；
A3，以Bacillus subtilis 168全基因组DNA作为左、右同源臂的模板；P7C6质粒DNA作为中间片段的模板，设计特异性引物进行PCR扩增，扩增产物融合纯化后，化学转化到Bacillus subtilis 168感受态细胞中，得到△comQ菌株。
9.根据权利要求7所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤三中转化处理得到的重组质粒pHY-comQ'再转入△comQ菌株的方法是将PCR产物用Dpn I酶在37℃处理3h，去除模板DNA，消化产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到相关突变株的转化子，经提取质粒，测序验证后，将comQ相应位点已成功突变的重组质粒pHY-comQ'转入△comQ菌株。
10.根据权利要求1所述类异戊二烯转移酶ComQ突变体在合成维生素K2和纳豆激酶中的应用。
CN202011478649.6A 2020-12-15 2020-12-15 一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用 Active CN112501143B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011478649.6A CN112501143B (zh) 2020-12-15 2020-12-15 一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011478649.6A CN112501143B (zh) 2020-12-15 2020-12-15 一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112501143A CN112501143A (zh) 2021-03-16
CN112501143B true CN112501143B (zh) 2022-03-08

Family

ID=74973729

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011478649.6A Active CN112501143B (zh) 2020-12-15 2020-12-15 一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112501143B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231554B (zh) * 2021-12-27 2023-07-28 安徽工程大学 一种维生素k2系列产物的生物合成方法
CN114807102B (zh) * 2022-05-16 2023-08-04 安徽工程大学 一种耐乙醇酰胺酶、基因、表达载体、工程菌及制备方法和应用
CN116064633B (zh) * 2022-11-03 2024-06-11 安徽工程大学 一种构建高效生物合成维生素k2工程菌的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008079895A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Novozymes, Inc. Methods of obtaining genetic competence in bacillus cells
CN103805550A (zh) * 2014-01-25 2014-05-21 吉林大学 荧光假单胞菌CB113 QS系统comQ基因缺失突变菌株及应用
CN106591253A (zh) * 2016-11-26 2017-04-26 安徽工程大学 一种4‑羟苯甲酸‑聚异戊二烯转移酶突变体及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008079895A2 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Novozymes, Inc. Methods of obtaining genetic competence in bacillus cells
CN101657538A (zh) * 2006-12-21 2010-02-24 诺维信股份有限公司 在芽孢杆菌属细胞中获得遗传感受态的方法
CN103805550A (zh) * 2014-01-25 2014-05-21 吉林大学 荧光假单胞菌CB113 QS系统comQ基因缺失突变菌株及应用
CN106591253A (zh) * 2016-11-26 2017-04-26 安徽工程大学 一种4‑羟苯甲酸‑聚异戊二烯转移酶突变体及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Competence regulatory protein ComQ [Bacillus subtilis]，GenBank: AOR99463.1;Jeon,S. et al.;《genbank》;20161101;第1-2页 *
Divergent structure of the ComQXPA quorum-sensing components: molecular basis of strain-specific communication mechanism in Bacillus subtilis;Lam-Son Phan Tran et al.;《Molecular Microbiology》;20001231;第37卷(第5期);第1159-1171页 *
Enhanced Production of Vitamin K2 from Bacillus subtilis (natto) by Mutation and Optimization of the Fermentation Medium;Junying Song et al.;《BRAZILIAN ARCHIVES OF BIOLOGY AND TECHNOLOGY》;20140831;第57卷(第4期);第606-612页 *
Specificity and Genetic Polymorphism of the Bacillus Competence Quorum-Sensing System;P. TORTOSA et al.;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;20010131;第183卷(第2期);第451-460页 *
利用基因工程改良枯草芽孢杆菌;罗楚平等;《江苏农业学报》;20081231;第24卷(第2期);第204-209页 *
枯草芽孢杆菌 ComQXPA 群体感应系统及其潜在生防应用;王俊芳等;《河南农业科学》;20191231;第48卷(第6期);第8-13页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112501143A (zh) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112501143B (zh) 一种类异戊二烯转移酶ComQ突变体、基因、载体、工程菌及制备方法和应用
CN109943546B (zh) 一种谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法和应用
CN111676203A (zh) 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用
CN108034667B (zh) 一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用
WO2012122765A1 (zh) 一种表面展示家蚕乙醇脱氢酶重组芽孢及其制备方法
AU2002327268B2 (en) Novel glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase and the gene encoding the same
CN113430181B (zh) 一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因
CN111004785A (zh) 一种酪氨酸酶蛋白序列及其在制备酪氨酸酶中的应用
CN112661820B (zh) 天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用
CN111850008B (zh) 促进蛋白胞外表达的信号肽
CN106591253B (zh) 一种4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶突变体及其制备方法和应用
CN110129305B (zh) 一种用于制备7-aca的头孢菌素c酰化酶突变体
CN110358751B (zh) 一种重组脂肪酶突变体、编码基因、重组工程菌及应用
CN106084016B (zh) 一种能提高重组普鲁兰酶表达量的信号肽突变体及其应用
CN112080479A (zh) 一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用
CN115247158B (zh) 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用
CN115896050A (zh) 7α-羟基类固醇脱氢酶末端改造组合点突变及高效合成熊去氧胆酸中间体
CN113249240B (zh) 一种高产羟基酪醇的酿酒酵母及其构建方法
CN113265345B (zh) 一株纳豆激酶真核高效表达双启动子系统重组基因工程菌及其构建方法和应用
CN111808836B (zh) 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用
CN112410353B (zh) 一种fkbS基因、含其的基因工程菌及其制备方法和用途
CN110157691B (zh) 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用
CN112794886A (zh) 类植物乳杆菌LuxS蛋白、其应用及类植物乳杆菌重组菌
CN111018957A (zh) 一种介导PGase分泌表达的信号肽及其应用
CN116790538B (zh) 一种具有耐碱性的氧化硫化酶突变体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant