CN118064341A - 一种合成乳酰-n-新四糖的无质粒重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents

一种合成乳酰-n-新四糖的无质粒重组大肠杆菌及其应用 Download PDF

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CN118064341A CN202410229553.8A CN202410229553A CN118064341A CN 118064341 A CN118064341 A CN 118064341A CN 202410229553 A CN202410229553 A CN 202410229553A CN 118064341 A CN118064341 A CN 118064341A
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Abstract

本发明公开了一种合成乳酰‑N‑新四糖的无质粒重组大肠杆菌及其应用,属于代谢工程技术领域。本发明基于蛋白组装支架PDZ和SH3,连接表达β‑1,3‑N‑乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA和β‑1,4‑半乳糖基转移酶LgtB,并将其在基因组位点进行整合表达,最终构建合成乳酰‑N‑新四糖的无质粒重组大肠杆菌。乳酰‑N‑新四糖的摇瓶产量达到1.99g/L,在不含有机氮源并以葡萄糖和乳糖作为碳源的培养基进行发酵时,乳酰‑N‑新四糖在3‑L发酵罐中的产量达到23.73g/L,为乳酰‑N‑新四糖的高效合成和进一步的产业化奠定了基础。

Description

一种合成乳酰-N-新四糖的无质粒重组大肠杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种合成乳酰-N-新四糖的无质粒重组大肠杆菌及其应用,属于代谢工程技术领域。
背景技术
母乳寡糖(Human Milk Oligosaccharides,HMOs)作为母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分,尽管无法直接被婴儿吸收,不具备营养价值,但这种生物活性成分能够促进肠道菌群,特别是双歧杆菌菌群生长,且具有抗菌抗炎、调节肠道通透性、促进免疫及大脑的发育等作用。乳酰-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose,LNnT)属于非岩藻糖基化中性HMOs,结构式为Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc,分子式为C26H45NO21,分子量为707.63。乳酰-N-新四糖已被欧洲食品安全局、美国食品药品监督管理局等批准作为新型食品添加剂添加至配方奶粉中,我国也已批准使用大肠杆菌作为微生物宿主使用微生物发酵法合成乳酰-N-新四糖。
大肠杆菌是一种工业化模式菌株,具有生长快,操作简单的特点,并且可大规模发酵,适合高密度培养。已有研究直接在大肠杆菌中引入关键酶基因以合成乳酰-N-新四糖,但这些研究中多数使用质粒进行关键基因的过表达,在工业化生产中容易造成质粒丢失以及需要添加抗生素,也不利于乳酰-N-新四糖作为食品添加剂添加至配方奶粉中,限制了其应用,较少的研究使用无质粒的微生物细胞宿主作为细胞工厂合成乳酰-N-新四糖。
众所周知,虽然整合型表达具有遗传稳定的优点,但游离型表达具有拷贝数高的优点,所以在提高异源蛋白产量时通常会通过构建游离型载体来表达关键基因。同时,外源基因的整合是一个相当复杂的问题。虽然目前人们已研究出许多有效的转化体系可将外源基因转入受体细胞中,但是转入的外源基因能否整合,整合的位置以及整合的状态等均难以控制。因此,本发明主要针对如何利用整合型表达的工程菌株高效合成乳酰-N-新四糖提出一种新的方法。
发明内容
为解决上述问题,本发明构建了一株无质粒的重组大肠杆菌细胞,通过在基因组层面阻断分支途径基因,并在基因组上表达含有蛋白组装支架的两个关键外源糖基转移酶,为富含LNnT的保健食品尤其是配方奶粉的开发奠定了基础。
本发明的第一个目的是提供一种合成乳酰-N-新四糖的无质粒重组大肠杆菌,所述无质粒重组大肠杆菌敲除了β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因(nagB)、UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶基因(wecB)、UDP-葡萄糖脱氢酶基因(ugd),抑制基因组上6-磷酸果糖激酶编码基因(pfkA)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因(zwf)的表达,同时过表达基因组上编码碳水化合物代谢的全局转录抑制因子mlc,并在基因组位点上整合表达了至少一个拷贝的乳酰-N-新四糖合成表达框,所述乳酰-N-新四糖合成表达框至少含有C端融合SH3lig的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因(lgtA)、C端融合PDZlig的β-1,4-半乳糖基转移酶基因(lgtB)以及蛋白组装支架PDZ和SH3的编码基因。
进一步地,所述抑制基因组上6-磷酸果糖激酶编码基因和6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的表达为,在基因组上整合dCpf1基因以及用于靶向抑制6-磷酸果糖激酶编码基因和6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的crRNA。所述用于靶向抑制6-磷酸果糖激酶编码基因和6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示。
进一步地,所述过表达基因组上编码碳水化合物代谢的全局转录抑制因子mlc为,将基因组上mlc的原启动子替换为强启动子。所述强启动子为组成型启动子。
进一步地,所述基因组位点包括但不限于gsk_ybaL、mscK_ybaM等,优选地,在gsk_ybaL、mscK_ybaM位点分别整合表达一个拷贝的乳酰-N-新四糖合成表达框。
进一步地,乳酰-N-新四糖合成表达框示意图见图2,其中,浅蓝色部分为lgtA-SH3lig、浅红色部分为lgtB-PDZlig、深蓝色部分为PDZ-SH3蛋白支架,将该表达框放在整合位点上。
进一步地,所述SH3lig和PDZlig分别通过第一柔性连接肽融合在β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖基转移酶基因的C端。
进一步地,本发明实施例中使用的第一柔性连接肽为GGGGSGGGGS。当然,本领域技术人员可根据需要选择(GGGGS)m作为连接肽,其中m为1-5的整数。
进一步地,所述蛋白组装支架PDZ和SH3通过第二柔性连接肽连接。
进一步地,本发明实施例中使用的第二柔性连接肽为GSGSGSGSGSGSGS。当然,本领域技术人员可根据需要选择(GS)n作为连接肽,其中n为3-10的整数。
进一步地,C端融合SH3lig的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因、C端融合PDZlig的β-1,4-半乳糖基转移酶基因由诱导型启动子启动表达,蛋白组装支架PDZ和SH3由组成型启动子启动表达。
进一步地,本发明中所述诱导型启动子选用tac启动子,组成型启动子选用J23119启动子。
进一步地,以大肠杆菌K-12MG1655为宿主。
进一步地,β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,β-1,4-半乳糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,蛋白组装支架PDZ的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,蛋白组装支架SH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示,PDZlig的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,SH3lig的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地,所述β-半乳糖苷酶基因的ID为945006,葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因的ID为945290,UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶基因的ID为944789,UDP-葡萄糖脱氢酶基因的ID为946571,6-磷酸果糖激酶基因的ID为948412,6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的ID为946370,编码碳水化合物代谢的全局转录抑制因子mlc的ID为945510。
本发明的第二个目的是提供一种合成乳酰-N-新四糖的方法,包括以下步骤:采用所述无质粒重组大肠杆菌进行发酵生产。
进一步地,所述发酵生产为摇瓶发酵或发酵罐发酵。
进一步地,所述摇瓶发酵包括采用发酵培养基培养的步骤,所述发酵培养基的碳源包括葡萄糖和乳糖。
进一步地,摇瓶发酵过程中,发酵培养基包括:蛋白胨10-14g/L,酵母提取物22-26g/L,葡萄糖8-16g/L,磷酸氢二钾2.1-2.6g/L,磷酸氢二钾12.2-15g/L,乳糖3-10g/L。
进一步地,所述发酵罐发酵包括以下步骤:挑取重组大肠杆菌单菌落于一级种子培养基中,得到种子液后接入二级种子培养基中,37℃培养12-16h后,将其接种至发酵培养基中并于25-35℃下诱导生产,诱导生产过程中,待发酵培养基中的初始葡萄糖消耗尽且OD在30-50之间时,使用补料培养基进行补料,并于25-35℃下进行诱导生产,控制发酵过程中pH 6.6-6.9,葡萄糖含量0-3g/L,乳糖含量5-20g/L。
进一步地,所述一级种子培养基包括:蛋白胨10-15g/L,酵母提取物5-8g/L,氯化钠10-15g/L。
进一步地,所述二级种子培养基包括:蛋白胨10-14g/L,酵母提取物22-26g/L,甘油3-5g/L,磷酸氢二钾2.1-2.5g/L,磷酸氢二钾12.2-12.6g/L。
进一步地,所述发酵培养基包括:葡萄糖8-16g/L,磷酸二氢钾6.4-6.9g/L,柠檬酸0.5-1.0g/L,硫酸镁0.1-0.5g/L,磷酸氢二铵1-5g/L,微量元素溶液5-15mL/L。其中微量元素溶液包含:六水氯化钴0.1-0.5g/L,五水硫酸铜0.1-0.5g/L,七水硫酸亚铁5-10g/L,一水硫酸锰0.1-0.5g/L,七水硫酸锌1-5g/L,维生素B1 2.5-8.5g/L。
进一步地,所述补料培养基包括:700-800g/L葡萄糖、150-300g/L乳糖、5-20g/LMgSO4、10-30g/L(NH4)2HPO4和1-10mL/L微量元素溶液(配置同上)。
本发明的第三个目的是提供上述无质粒重组大肠杆菌在制备生物产品、化工产品、药品或食品中的应用。
进一步地,上述产品均为含有乳酰-N-新四糖的产品,或以乳酰-N-新四糖为中间产物的产品。尤其是含母乳寡糖的配方奶粉。
本发明的有益效果:
本发明构建了合成乳酰-N-新四糖的无质粒重组大肠杆菌,乳酰-N-新四糖的摇瓶产量达到1.99g/L,在不含有机氮源并以葡萄糖和乳糖作为碳源的培养基进行发酵时,乳酰-N-新四糖在3-L发酵罐中的产量达到23.73g/L,实现了乳酰-N-新四糖的高效合成,为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产乳酰-N-新四糖及其工业化奠定基础。
附图说明
图1为本发明重组大肠杆菌合成乳酰-N-新四糖的代谢途径。
图2为本发明重组大肠杆菌中基因组整合示意图。
图3为采用不同葡萄糖浓度摇瓶发酵乳酰-N-新四糖的结果。
图4为本发明中乳酰-N-新四糖发酵曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例涉及的材料及检测方法如下:
(一)菌株和载体
质粒的构建在E.coli DH5α中进行,质粒构建完成后转化到大肠杆菌宿主菌中进行发酵以合成乳酰-N-新四糖。
(二)培养基
E.coli使用LB培养基(每升含10g胰蛋白胨、5g酵母粉和10gNaCl)进行培养。
放大培养步骤:挑取重组大肠杆菌单菌落于一级种子培养基中,得到种子液后以3%-10%的接种量接入二级种子培养基中,37℃培养12-16h后,将其接种至发酵培养基中并于25-35℃下诱导生产。一级种子培养基包括:蛋白胨10-15g/L,酵母提取物5-8g/L,氯化钠10-15g/L;所述二级种子培养基包括:蛋白胨10-14g/L,酵母提取物22-26g/L,甘油3-5g/L,磷酸氢二钾2.1-2.5g/L,磷酸氢二钾12.2-12.6g/L;所述发酵培养基包括:葡萄糖10g/L,磷酸二氢钾6.65g/L,柠檬酸0.8g/L,硫酸镁0.3g/L,磷酸氢二铵2g/L,微量元素溶液10mL/L。其中微量元素溶液包含:六水氯化钴0.1g/L,五水硫酸铜0.1g/L,七水硫酸亚铁5g/L,一水硫酸锰0.33g/L,七水硫酸锌3.8g/L,维生素B1 4.5g/L。
(三)乳酰-N-新四糖的检测方法
乳酰-N-新四糖利用使用型号为CarboPac PA10(4×250mm)色谱柱,通过高效阴离子交换色谱脉冲安培检测(High Performance Anion Exchange Chromatography withPulsed Amperometric Detector,HPAEC-PAD)进行测量。流动相为NaOH(36mM),流速设置为1.00mL/min,柱温为30℃,进样量设置为25μL。进行样品测量前,配置不同浓度的乳酰-N-新四糖的标样,通过色谱峰面积绘制标准曲线进而计算各个发酵样品中各组分的含量。
(四)序列
β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶lgtA,SEQ ID NO.1-2,
β-1,4-半乳糖基转移酶lgtB,SEQ ID NO.3-4,
蛋白组装支架PDZ,SEQ ID NO.5-6,
蛋白组装支架SH3,SEQ ID NO.7-8,
蛋白组装支架配体PDZlig,SEQ ID NO.9,
蛋白组装支架配体SH3lig,SEQ ID NO.10,
靶向pfkA和zwf的crRNA,SEQ ID NO.11-12。
实施例1:出发菌株的构建
由于在乳酰-N-新四糖的细胞工厂合成途径中,需要外源添加乳糖作为底物,且需要内源性前体尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺和尿苷二磷酸-半乳糖,所以为了减少前体的代谢及弱化副产物的合成,以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株,使用CRISPR/Cpf1基因编辑系统,敲除了β-半乳糖苷酶基因lacZ、葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB、UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶基因wecB和UDP-葡萄糖脱氢酶基因ugd,以此构建出发菌株。基因敲除的具体步骤如下:
(1)以敲除β-半乳糖苷酶lacZ基因为例,在lacZ基因内部查找TTTV对应23bp的sgRNA序列,将其连接至质粒载体pcrEG上。将连接产物转化进克隆宿主DH5a中,提取质粒,并测序sgRNA序列。
(2)将序列测序正确的质粒使用pcrEG-AF/AR扩增并线性化质粒载体,进一步线性化,使用lacZ-HL-F/R和lacZ-HR-F/R扩增出上下游同源臂,使用无缝克隆酶进行连接,再次转化进DH5a中,经过质粒提取和测序验证,获得最终的pcrEG-lacZ质粒。
(3)将pEcCpf1质粒使用化转的方法转化进K-12MG1655中,具体操作如下:将K12MG1655使用商业化试剂盒处理成化学转化法感受态,置于冰上等待转化。转化的步骤如下:取500-1000ng的pCpf1质粒加入到100uL感受态细胞中,混合均匀后置于冰上冰浴30min,后在42℃水浴锅中热激60-90s,迅速放置于冰上2-3min,加入500-900uL的LB无抗液体培养基,在37℃后培养1h,涂布于含有卡纳抗性的LB固体培养基上,在37℃倒置培养12-16h。
(4)挑取含有pCpf1质粒的菌落于含有卡那霉素和终浓度0.1摩尔每升的阿拉伯糖中,诱导培养。当OD600为0.3-0.5时,停止培养,马上置于冰上,并使用商业化试剂盒制备成化学转化感受态。
(5)将500-1000ng步骤(2)获得的质粒加入到步骤(4)制备的100uL感受态细胞中,具体的转化步骤同步骤(3)所述。将后培养的细胞涂布于同时含有卡纳抗性和壮观霉素抗性的LB固体培养基中,37℃培养12-16h,挑取阳性克隆进行PCR验证,并测序。
(6)将验证正确的单菌落进行pcrEG和pEcCpf1质粒的消除。首先需要对pcrEG质粒进行消除,消除的原理是在pCpf1质粒上带有针对pcrEG质粒骨架上的sgRNA序列,由鼠李糖启动子严格调控,具体操作方法为:将单菌落挑取至含有卡那霉素和终浓度为0.1摩尔的鼠李糖的LB液体培养基中,培养37℃12-16h后在含有卡那霉素的LB固体培养基中划线,继续培养37℃12-16h后,将固体平板上挑取到的单菌落分别影印到含有卡那霉素的LB固体平板以及同时含有卡那霉素和壮观霉素的LB固体平板上。将两块固体平板置于37℃培养12-16h,能够在卡那霉素平板上生长,而在同时含有卡那霉素和壮观霉素平板上无法生长的单菌落,认为已经消除pcrEG质粒。
(7)消除pcrEG质粒后,接下来需要消除pCpf1质粒。在本质粒上带有sacB基因,其不能在蔗糖环境下生长作为其质粒消除的筛选标记。将消除pcrEG质粒后的单菌落挑取到LB液体培养基中,加入终浓度为5g/L的葡萄糖,37℃培养12-16h后,划线到带有终浓度为5g/L的葡萄糖和10g/L的蔗糖的LB固体培养基上。继续培养12-16h后,将固体平板上挑取到的单菌落分别影印到含有卡那霉素的LB固体平板以及不含抗生素的LB固体平板上。将两块固体平板置于37℃培养12-16h,能够在不含抗生素的LB固体平板上生长,而在含有卡那霉素的平板上无法生长的单菌落,认为已经消除pCpf1质粒。
(8)对于连续进行敲除时,可不进行pEcCpf1质粒的消除,以减少基因编辑的操作时间。
表1引物信息
实施例2:基因组整合
在大肠杆菌中,β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶(由lgtA基因编码)将UDP-GlcNAc上的N-乙酰氨基葡萄糖糖苷转移至乳糖上,生成乳酰-N-三糖(LNT II),接着β-1,4-半乳糖基转移酶(由lgtB基因编码)再将UDP-Gal上的半乳糖糖苷转移至LNT II上,最终形成产物乳酰-N-新四糖。为避免在发酵生产中使用抗生素以维持质粒的扩增表达,本发明将带有蛋白组装支架的两个糖基转移酶在基因组上进行整合表达。具体步骤如下:
将实施例1得到的重组大肠杆菌菌株作为出发宿主,将gsk_ybaL和mscK_ybaM作为目标靶点,进行外源基因的整合表达。为进行基因组整合,需要使用不同的lgtAB-F/R扩增整个带有蛋白组装支架的表达框并连接于上下同源臂之间,进行基因组整合表达。其中,分别在β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶的C端连接上SH3lig和PDZlig,并同时表达蛋白组装支架PDZSH3。结果发现,当在基因组上gsk_ybaL位点和mscK_ybaM位点分别整合一个拷贝的PDZSH3、lgtA-SH3lig、lgtB-PDZlig时最有利于乳酰-N-新四糖的合成。
同时,在phr_dtpD位点整合一个由阿拉伯糖启动子表达的dCpf1基因,在fliK位点整合靶向pfkA和zwf基因的crRNA,以抑制两个基因的表达,增强产物合成途径的碳代谢流。使用的引物和crRNA序列如下:
所使用靶向crRNA:
pfkA:ATCGAGAAAGAAACCGGTCGTGA
zwf;TACGTCGCGACGAAGTGGAAGAA
摇瓶发酵:首先使用无抗LB培养基对重组菌进行活化,在37℃下倒置培养12-16 h后,接种于LB培养基中培养种子液,培养12 h后将工程菌的种子液以6%的接种量接入发酵培养基中,待OD600达到0.8时,在30℃下,以终浓度0.2 mM的IPTG和0.1-1 mM的阿拉伯糖进行诱导60 h。发酵培养基的配方为:蛋白胨12 g/L,酵母提取物24 g/L,甘油5 g/L,磷酸氢二钾2.31 g/L,磷酸氢二钾12.43 g/L,乳糖5 g/L。
发酵结束后,将发酵液离心后的上清稀释后过0.22μm的膜使用高效阴离子交换色谱脉冲安培检测进行产量检测,实验菌株使用PDZ/PDZlig及SH3/SH3lig支架后,乳酰-N-新四糖的产量达到1.73g/L。
表2基因整合所需引物
实施例3:无质粒重组大肠杆菌的碳源的优化
首先尝试使用葡萄糖进行发酵,后对葡萄糖转运相关基因进行改造,最后确定最适的葡萄糖浓度。
相比甘油,葡萄糖在工业发酵上是一种更加理想的碳源底物,主要原因是甘油的粘度较大,不适合管路的补料输送,所以本发明拟尝试在以葡萄糖作为底物进行发酵。对实施例2的重组大肠杆菌菌株在10g/L葡萄糖进行发酵时,乳酰-N-新四糖的产量有所下降,为1.36g/L,乳酰-N-新四糖的前体LNT II也下降,从0.59g/L到0.13g/L,其可能的原因是当使用葡萄糖和乳糖作为碳源时,由于葡萄糖存在碳源阻遏效应,影响了乳糖的供给,所以对葡萄糖的摄入进行优化。
mlc基因,Gene ID:945510,编码碳水化合物代谢的全局转录抑制因子,对其进行过表达,能够减缓葡萄糖的吸收,从而减轻碳源阻遏效应。本发明对基因组mlc基因进行过表达,过表达的方式为替换原有的启动子为组成型启动子tac。构建新的重组菌株。
最后,采用上述构建得到的过表达mlc重组菌株进行摇瓶发酵,发酵条件同实施例2,唯一区别是将甘油替换为葡萄糖,并对葡萄糖浓度进行优化。具体地,葡萄糖浓度设置:10、20、30、40 g/L(分别对应图3中的B、C、D、E,A为5 g/L甘油)。根据发酵结果可知,如果过表达mlc,当葡萄糖浓度为10 g/L时为最优,乳酰-N-新四糖的产量为1.99 g/L,比使用甘油的产量要高,且细胞干重、前体LNTII积累均比使用甘油要好。
相应的引物:
对应的crRNA:TTGACGACACGTATTGAAGTGCT
实施例4:发酵罐的放大
为使得重组大肠杆菌菌株更适合于工业上的放大,并同时降低生产成本,本发明使用工业上更加常用的葡萄糖和无机铵盐进行发酵。具体的发酵过程如下:
S1、从甘油管上挑取部分菌液在无抗LB固体平板上划线,于37℃上倒置12-16 h
S2、挑取单菌落接种于LB无抗液体培养基中,37℃220rpm震荡培养12-16h,获得一级种子液
S3、将3%-10%的一级种子液接种于二级种子培养基中,37℃220rpm震荡培养12-16h,获得二级种子液
S4、将二级种子培养基离心重悬,使用100mL发酵培养基进行重悬,并将其全部接种于900mL发酵培养基中。此时,参数设置为:温度37℃,转速300-1000rpm,pH 6.6-6.9
S5、初始培养基中葡萄糖耗完后,且OD在30-50之间时,开始使用补料培养基进行补料,此时加入0.1-1mM的阿拉伯糖和IPTG进行诱导,并控制参数如下:温度30℃,转速600-1000rpm,pH 6.6-6.9,葡萄糖及乳糖的含量控制在0-3g/L及5-20g/L,IPTG的终浓度控制为0.1-0.5mM。其中,补料培养基包括:750g/L葡萄糖、200g/L乳糖、10g/L MgSO4、20g/L(NH4)2HPO4和5mL/L微量元素溶液。
放大培养结果见图4。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种无质粒重组大肠杆菌,其特征在于:
所述无质粒重组大肠杆菌敲除了β-半乳糖苷酶基因、葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因、UDP-乙酰氨基葡萄糖表异构酶基因、UDP-葡萄糖脱氢酶基因,抑制基因组上6-磷酸果糖激酶基因和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的表达,同时过表达基因组上编码碳水化合物代谢的全局转录抑制因子mlc,并在基因组位点上整合表达了至少一个拷贝的乳酰-N-新四糖合成表达框,所述乳酰-N-新四糖合成表达框至少含有C端融合SH3lig的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因、C端融合PDZlig的β-1,4-半乳糖基转移酶基因以及蛋白组装支架PDZ和SH3的编码基因。
2.根据权利要求1所述的无质粒重组大肠杆菌,其特征在于,所述抑制基因组上6-磷酸果糖激酶编码基因和6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的表达为,在基因组上整合dCpf1基因以及用于靶向抑制6-磷酸果糖激酶编码基因和6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因的crRNA;所述过表达基因组上编码碳水化合物代谢的全局转录抑制因子mlc为,将基因组上mlc的原启动子替换为强启动子。
3.根据权利要求1所述的无质粒重组大肠杆菌,其特征在于,所述基因组位点包括gsk_ybaL、mscK_ybaM中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的无质粒重组大肠杆菌,其特征在于,所述SH3lig和PDZlig分别通过柔性连接肽融合在β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶基因和β-1,4-半乳糖基转移酶基因的C端;所述蛋白组装支架PDZ和SH3通过柔性连接肽连接。
5.根据权利要求1所述的无质粒重组大肠杆菌,其特征在于,以大肠杆菌K-12MG1655为宿主。
6.一种合成乳酰-N-新四糖的方法,其特征在于,包括以下步骤:采用权利要求1-5任一项所述的无质粒重组大肠杆菌进行发酵生产。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述发酵生产为摇瓶发酵,所述摇瓶发酵包括采用发酵培养基培养的步骤,所述发酵培养基以葡萄糖和乳糖为碳源。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基包括:蛋白胨10-14g/L,酵母提取物22-26g/L,葡萄糖8-16g/L,磷酸氢二钾2.1-2.6g/L,磷酸氢二钾12.2-15g/L,乳糖3-10g/L。
9.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述发酵生产为发酵罐发酵,所述发酵罐发酵包括采用发酵培养基培养的步骤,所述发酵培养基包括:葡萄糖8-16g/L,磷酸二氢钾6.4-6.9g/L,柠檬酸0.5-1.0g/L,硫酸镁0.1-0.5g/L,磷酸氢二铵1-5g/L,微量元素溶液5-15mL/L。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述发酵罐发酵包括以下步骤:将种子液接种至发酵培养基中,待发酵培养基中的初始葡萄糖消耗尽且OD在30-50之间时,使用补料培养基进行补料,并于25-35℃下进行诱导生产,控制发酵过程中pH 6.6-6.9,葡萄糖含量0-3g/L,乳糖含量5-20g/L。
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