CN112111437B - 2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 - Google Patents

2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种2'‑岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于代谢工程技术领域。本发明通过融合表达重组枯草芽孢杆菌BSGL‑FF中的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因获得了可高效合成2’‑岩藻糖基乳糖的菌株，其发酵上清液中积累量高达1.62g/L，比对照菌株高了55％。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建 方法
技术领域
本发明涉及一种2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于代谢工程技术领域。
背景技术
母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,HMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。
在过去的几年中，人们开始通过微生物发酵生产2’-FL。在2012年，首先通过转化的大肠杆菌通过高细胞密度培养的分批补料发酵和全细胞生物合成来生产2’-FL，并通过LC/MS鉴定了微生物合成的2’-FL。并开始在大肠杆菌上进行代谢工程化策略，包括删除Lac操纵子修饰缺失GDP-L-岩藻糖下游基因wcaJ和lon基因(Lon蛋白酶降解正调控因子RcsA等)。首先选择了来自幽门螺杆菌26695的FucT2进行FucT2的生物合成。之后，四个从头途径基因，manB，manC，gmd和wcaG被过表达，并且回补途径也被引入到工程化大肠杆菌中。为了进一步提高从头和回补途径的2’-FL产量，有人敲除了基因fucI和fucK，并筛选了11个FucT2候选基因。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。但是现有的2’-FL合成枯草芽孢杆菌中的异源糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达水平较低，限制了重组枯草芽孢杆菌中2’-FL的合成。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过表达FKP(岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶)和FutC(岩藻糖基转移酶)融合蛋白，可以有效提高胞内岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶的表达，促进了2’-岩藻糖基乳糖的合成。
本发明的第一个目的是提供一种2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，所述的重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGL中过表达岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶(FKP)与岩藻糖基转移酶(FutC)的融合蛋白得到，其中，所述的枯草芽孢杆菌BSGL是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因得到。
进一步地，所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶(FKP)与岩藻糖基转移酶(FutC)之间通过linker连接。
进一步地，所述的linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示。
本发明的枯草芽孢杆菌BSGL的构建方法参见专利201910093684.7中实施例1的构建方法，将P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。所述乳糖运输酶基因如NCBI中Gene ID:949083所示。
本发明所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌。
进一步地，所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的核苷酸序列如NCBI上GenBank:AY849806.1所示。
进一步地，所述的岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如NCBI上GenBank:KY499613所示。
进一步地，所述的重组枯草芽孢杆菌是以pP43-mpd为表达载体。
本发明的第二个目的是提供所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：
S1、构建包含岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因、岩藻糖基转移酶基因和linker基因的重组质粒；
S2、将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌BSGL感受态中，通过验证，确认岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶、岩藻糖基转移酶融合蛋白表达成功，得到所述的重组枯草芽孢杆菌。
本发明的第三个目的是提供所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。
进一步地，所述的方法包括如下步骤：
S1、将重组大肠杆菌单菌落接种在种子培养基中培养8～12h，制备成种子液；
S2、将种子液接种至发酵培养基中，于34～36℃、180～220r/min条件下培养20～30h后，分离发酵液得到2’-岩藻糖基乳糖。
进一步地，所述的种子培养基包括胰蛋白胨8～12g/L、酵母粉4～6g/L、NaCl 8～12g/L。
进一步地，所述的发酵培养基包括：初始甘油15～25g/L、蛋白胨5～7g/L、酵母粉10～15g/L、(NH4)SO4 5～7g/L、K2HPO4·3H2O 12～13g/L、KH2PO4 2～3g/L、CaCO3 4～6g/L以及微量元素8～12ml/L；微量元素按g/L计含有：MnSO4·5H2O 0.8～1.2、CoCl2·6H2O 0.3～0.5、NaMoO4·2H2O 0.1～0.3、ZnSO4·7H2O 0.1～0.3、AlCl3·6H2O 0.08～0.12、CuCl2·H2O0.08～0.12、H3BO4 0.04～0.06、4～6M HCl。
本发明的有益效果：
本发明通过融合表达重组枯草芽孢杆菌BSGL-FF中的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因获得了可高效合成2’-岩藻糖基乳糖的菌株，其发酵上清液中积累量高达1.62g/L，比对照菌株高了55％。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为pP43-FR质粒图谱；
图2为pP43-FR-EK1质粒图谱；
图3为pP43-FR-EK2质粒图谱；
图4为pP43-FR-EK3质粒图谱；
图5为实施例中2’-岩藻糖基乳糖的含量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：表达融合蛋白FR，FR-EK1，FR-EK2，FR-EK3
根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC No.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，和幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，ATCC No.26695)的futC基因序列，通过基因fkp、futC和质粒pP43-mpd的PCR扩增和一步克隆连接，构建重组质粒pP43-FR(无linker)，pP43-FR-EK1(EK1 linker)，pP43-FR-EK2(EK2linker)，pP43-FR-EK3(EK3 linker)，其中EK1 linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EK2 linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，EK3 linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，质粒图谱如图1，图2，图3和图4。
将构建好的重组质粒电转化重组枯草芽孢杆菌BSGL(见专利201910093684.7中实施例1步骤构建的枯草芽孢杆菌168L)的感受态细胞，重组质粒的添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃好氧培养12h，挑选单克隆若干。
通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，测序后确认岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶融合蛋白是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落PCR验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶融合蛋白表达成功。
确认脆弱拟杆菌的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGL-FR，BSGL-FR-EK1，BSGL-FR-EK2，BSGL-FR-EK3。
实施例2：发酵BSGL-FR-EK1生产2’-岩藻糖基乳糖
将上述重组枯草芽孢杆菌BSGL-FR-EK1制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。
将种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH4)SO4 6g/L,K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO42.5g/L、CaCO3 5g/L、微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、AlCl3·6H2O 0.1、CuCl2·H2O 0.1、H3BO4 0.05、5M HCl，于35℃、200rpm条件下培养24h。
发酵结束时，使用液相色谱仪测定发酵上清液中的2’-岩藻糖基乳糖的含量，测定的2’-岩藻糖基乳糖的含量达到1.380g/L(图5)。
实施例3：发酵BSGL-FR-EK2生产2’-岩藻糖基乳糖
将上述重组枯草芽孢杆菌BSGL-FR-EK2制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。
将种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH4)SO4 6g/L,K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO42.5g/L、CaCO3 5g/L、微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、AlCl3·6H2O 0.1、CuCl2·H2O 0.1、H3BO4 0.05、5M HCl，于35℃、200rpm条件下培养24h。
发酵结束时，使用液相色谱仪测定发酵上清液中的2’-岩藻糖基乳糖的含量，测定的2’-岩藻糖基乳糖的含量达到1.620g/L(图5)。
实施例4：发酵BSGL-FR-EK3生产2’-岩藻糖基乳糖
将上述重组枯草芽孢杆菌BSGL-FR-EK3制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。
将种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH4)SO4 6g/L,K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO42.5g/L、CaCO3 5g/L、微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、AlCl3·6H2O 0.1、CuCl2·H2O 0.1、H3BO4 0.05、5M HCl，于35℃、200rpm条件下培养24h。
发酵结束时，使用液相色谱仪测定发酵上清液中的2’-岩藻糖基乳糖的含量，测定的2’-岩藻糖基乳糖的含量达到1.410g/L(图5)。
对比例1：发酵BSGL-FF生产2’-岩藻糖基乳糖
将重组枯草芽孢杆菌BSGL-FF(见专利201910093684.7实施例2构建的枯草芽孢杆菌168L-FF)制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。
将种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH4)SO4 6g/L,K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO42.5g/L、CaCO3 5g/L、微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、AlCl3·6H2O 0.1、CuCl2·H2O 0.1、H3BO4 0.05、5M HCl，于35℃、200rpm条件下培养24h。
发酵结束时，使用液相色谱仪测定发酵上清液中的2’-岩藻糖基乳糖的含量，测定的2’-岩藻糖基乳糖的含量达到1.042g/L(图5)。
对比例2：发酵BSGL-FR生产2’-岩藻糖基乳糖
将上述重组枯草芽孢杆菌BSGL-FR制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。
将种子液以OD值为0.1的接种量接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH4)SO4 6g/L,K2HPO4·3H2O 12.5g/L、KH2PO42.5g/L、CaCO3 5g/L、微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO4·5H2O 1.0、CoCl2·6H2O 0.4、NaMoO4·2H2O 0.2、ZnSO4·7H2O 0.2、AlCl3·6H2O 0.1、CuCl2·H2O 0.1、H3BO4 0.05、5M HCl，于35℃、200rpm条件下培养24h。
发酵结束时，使用液相色谱仪测定发酵上清液中的2’-岩藻糖基乳糖的含量，测定的2’-岩藻糖基乳糖的含量达到1.250g/L(图5)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 2'-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
gaagctgcgg caaaa 15
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
gaagctgcgg caaaagaagc tgcggcaaaa 30
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
gaagctgcgg caaaagaagc tgcggcaaaa gaagctgcgg caaaa 45
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 5
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 6
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15

Claims (7)

1.一种2'-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGL中过表达岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶与岩藻糖基转移酶的融合蛋白得到，其中，所述的枯草芽孢杆菌BSGL是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因得到；
所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶与岩藻糖基转移酶之间通过linker连接；
所述的linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的核苷酸序列如NCBI上GenBank:AY849806.1所示；所述的岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如NCBI上GenBank:KY499613所示。
2.根据权利要求1所述的重组芽孢杆菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌是以pP43-mpd为表达载体。
3.一种权利要求1~2任一项所述的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建包含岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因、岩藻糖基转移酶基因和linker基因的重组质粒；
S2、将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌BSGL感受态中，通过验证，确认岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶、岩藻糖基转移酶融合蛋白表达成功，得到所述的重组枯草芽孢杆菌。
4.一种权利要求1~2任一项所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的方法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
S1、将所述重组枯草芽孢杆菌单菌落接种在种子培养基中培养8~12h，制备成种子液；
S2、将种子液接种至发酵培养基中，于34~36℃、180~220 r/min条件下培养20~30h后，分离发酵液得到2'-岩藻糖基乳糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括胰蛋白胨8~12 g/L、酵母粉4~6 g/L、NaCl 8~12 g/L。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括：初始甘油15~25g/L、蛋白胨5~7 g/L、酵母粉10~15 g/L、(NH4)SO4 5~7 g/L、K2HPO4·3H2O 12~13 g/L、KH2PO42~3 g/L、CaCO3 4~6 g/L以及微量元素8~12 ml/L；微量元素按g/L计含有：MnSO4·5H2O 0.8~1.2、CoCl2·6H2O 0.3~0.5、NaMoO4·2H2O 0.1~0.3、ZnSO4·7H2O 0.1~0.3、AlCl3·6H2O0.08~0.12、CuCl2·H2O 0.08~0.12、H3BO4 0.04~0.06、4~6M HCl。
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