CN105255803A - 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。本发明的重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk(NCBI上Gene？ID:938206)，BSGNK以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并在此基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK。本发明的重组菌，可高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖，其摇瓶发酵产量可达到11.13g/L，比敲除前菌株提高了67.8％，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

Description

一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种广泛使用的食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。201510394205.7构建的重组枯草芽孢杆菌(BSGNK-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1)可在合成培养基中较快生长、发酵生产乙酰氨基葡萄糖，但是存在产量不高、底物/产物摩尔转化率较低的缺点。因此，如何提高乙酰氨基葡萄糖合成途径代谢通量以进一步提高GlcNAc产量，是提高乙酰氨基葡萄糖产量的亟待解决问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。由于培养基中含有葡萄糖时，枯草芽孢杆菌主要采用磷酸转运途径转运葡萄糖，将磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸根转运给葡萄糖并将其磷酸化，在该过程中会产生大量的丙酮酸。同时磷酸烯醇式丙酮酸还可以通过丙酮酸激酶转化为丙酮酸，导致流向三羧酸循环的碳通量较大。所以本发明通过阻断宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应、磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸的反应，从而获得一种高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖的高产重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk(NCBI上GeneID:938206)。

所述枯草芽孢杆菌BSGNK，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并在此基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK。

在本发明的一种实施方式中，通过pP₄₃-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-P_xylA-glmS质粒整合表达glmS基因。

在本发明的一种实施方式中，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达的重组菌命名为BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1，具体构建方法可参见文献Liu,Y.etal.ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng.23:42-52,2014。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNK，是专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK。

在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸激酶编码基因pyk是NCBI中GeneID:936596的基因；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上GeneID:937235的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNK是专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK。

本发明的第二个目的是提供一种所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，所述构建方法是先构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框、丙酮酸激酶编码基因敲除框，经同源重组，敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk，阻断宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应和磷酸烯醇式丙酮酸至丙酮酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量、提高流向乙酰氨基葡萄糖的碳通量，促进乙酰氨基葡萄糖积累。

本发明的第三个目的是提供一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的方法，是以重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖；BSGNKAP是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk。

在本发明的一种实施方式中，所述pckA是NCBI上GeneID:937235的基因，pyk是NCBI中GeneID:936596的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵使用的发酵培养基，按g/L计含有：葡萄糖60，蛋白胨6，酵母粉12，(NH₄)SO₄6，K₂HPO₄·3H₂O12.5，KH₂PO₄2.5，CaCO₃5，微量元素10ml/L；其中微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O1.0，CoCl₂·6H₂O0.4，NaMoO₄·2H₂O0.2，ZnSO₄·7H₂O0.2，Alcl₃·6H₂O0.1，Cucl₂·H₂O0.1，H₃BO₄0.05，含5MHCl(即1L微量元素中含有5molHCl)。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将生产菌株活化后，以5％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于摇瓶中、35-37℃、200-220rpm条件下培养36-52h。

在本发明的一种实施方式中，木糖用量为5g/L。

本发明的有益效果：

本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可高效利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖，其摇瓶发酵产量可达到11.13g/L，比敲除pckA和pyk前的BSGNK菌株提高了67.8％，比单独敲除pckA的BSGNKA菌株提高了55.8％。同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵乙酰氨基葡萄糖得率已提高到0.192g/g葡萄糖，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

具体实施方式

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1200，RID检测器，NH₂柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。

发酵培养基(g/L)，为合成培养基：葡萄糖60，蛋白胨6，酵母粉12，，(NH₄)SO₄6，K₂HPO₄·3H₂O12.5，KH₂PO₄2.5，CaCO₃5，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O1.0，Cocl₂·6H₂O0.4，NaMoO₄·2H₂O0.2，ZnSO₄·7H₂O0.2，Alcl₃·6H₂O0.1，Cucl₂·H₂O0.1，H₃BO₄0.05，含5MHCl。

培养条件：将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖5g/L，于35-37℃、200-220rpm条件下培养。

实施例1：敲除丙酮酸激酶编码基因pyK

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168购自美国典型微生物保藏中心，ATCCNo.27370)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQIDNO.1所示的敲除框。

将构建好的敲除框转化重组枯草芽孢杆菌BSGNK-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1(即专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK)，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKA；然后在BSGNKA的基础上，进一步敲除丙酮酸激酶(pyk)，敲除成功后得到重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP。重组枯草芽孢杆菌BSGNK-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1是在文献(Liu,Y.etal.ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng.23:42-52,2014)构建的BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1的基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK，pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，pM7Z6M-P_xylA-glmS质粒整合表达glmS基因。

实施例2：发酵生产乙酰氨基葡萄糖

将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于30-37℃、200-220rpm条件下培养36-52h。发酵36h，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到11.13g/L，与BSGNKA相比，产量提高了55.8％，与BSGNK相比，产量提高了67.8％(结果如表1所示)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。

表1敲除前后细胞生长和乙酰氨基葡萄糖合成情况

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk；所述枯草芽孢杆菌BSGNK，以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达，并在此基础上敲除了葡萄糖激酶编码基因glcK。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述丙酮酸激酶编码基因pyk是NCBI中GeneID:936596的基因；所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA是NCBI上GeneID:937235的基因。

3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BSGNK是专利申请201510394205.7中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNK。

4.一种权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法是先构建磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因敲除框、丙酮酸激酶编码基因敲除框，经同源重组，敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk，阻断宿主菌胞内磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的反应和磷酸烯醇式丙酮酸至丙酮酸的反应，减少流向三羧酸循环的碳通量、提高流向乙酰氨基葡萄糖的碳通量，促进乙酰氨基葡萄糖积累。

5.一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的方法，是以重组枯草芽孢杆菌BSGNKAP为生产菌株发酵生产乙酰氨基葡萄糖；BSGNKAP是在枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因pckA和丙酮酸激酶编码基因pyk。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pckA是NCBI上GeneID:937235的基因，pyk是NCBI中GeneID:936596的基因。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基，按g/L计含有：葡萄糖60，蛋白胨6，酵母粉12，(NH₄)SO₄6，K₂HPO₄·3H₂O12.5，KH₂PO₄2.5，CaCO₃5，微量元素10ml/L；其中微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O1.0，CoCl₂·6H₂O0.4，NaMoO₄·2H₂O0.2，ZnSO₄·7H₂O0.2，Alcl₃·6H₂O0.1，Cucl₂·H₂O0.1，H₃BO₄0.05，含5MHCl。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵是将生产菌株活化后，以5％的接种量转入发酵培养基，接种2h后加入诱导剂木糖，于摇瓶中、35-37℃、200-220rpm条件下培养36-52h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，木糖用量为5g/L。