CN103540561A

CN103540561A - 一种产白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法

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Publication number: CN103540561A
Application number: CN201310499812.0A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 周景文; 吴俊俊; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2014-01-29

Abstract

本发明公开了一种产白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法，属于合成生物学和代谢工程领域。本发明分别将编码丙二酸转运的基因matB，编码的丙二酸吸收途径的基因matC,以及酪氨酸脱氨酶、4-香桂酸：辅酶A连接酶、芪合酶等五个基因组成的合成途径引入大肠杆菌E.coli(BL21)，从而获得了一株能以酪氨酸为底物合成白藜芦醇的重组菌，并通过模块化改造理论优化合成途径，最终菌株在摇瓶中以酪氨酸为底物发酵72h后，白藜芦醇的产量达到35mg/L。本发明利用合成生物学的方法，在大肠杆菌体内成功构建五基因组成的合成途径，成功实现了从酪氨酸合成白藜芦醇。本发明采用的策略为今后微生物法生产天然小分子物质提供了一定的借鉴。

Description

一种产白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种产白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法，属于合成生物学和代谢工程领域。

背景技术

白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，是降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂，对心血管疾病和癌症具有有益作用，对激素依赖性肿瘤有明显的预防作用。还可对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用，具有抗病毒及免疫调节作用。对人体内部一种单体抗衰老酶起作用，进而发挥预防各种年龄相关疾病。

由于白藜芦醇具有多种生物和药理活性，使其广泛应用于食品、医药、保健品、化妆品等领域。白藜芦醇具有优良药理活性和保健功能其市场需求很大且与日剧增，目前已有大部分国家和地区都开发了白藜芦醇及其制品。美国已把白藜芦醇作为膳食补充剂，日本已将从植物提取的白藜芦醇作为食品添加剂，中国已将含白藜芦醇的植物提取物制成降脂美容的天然保健食品，因此白黎芦醇的发展前景十分广阔。

目前，工业上生产白藜芦醇主要采用植物提取的方法，但是如何从植物复杂的提取液中得到所需要的高纯度白藜芦醇仍然是人类无法解决的一个技术难题，而高污染、使用有毒和有害化学试剂、以及白藜芦醇的复杂结构等因素限制了化学法的使用，正因如此，微生物发酵法以使用廉价无污染的原料、较低的污染的排放、较低的能源需求等优点受到越来越多的关注。目前国内外关于微生物发酵法生产白藜芦醇的研究都需要在发酵液添加价格昂贵的前体物质香豆酸，难以应用于大规模的工业生产。另外目前的发酵法都采用的是两步法生产，即菌株首先在营养丰富的培养基中生长，在达到一定菌浓的时候，通过离心等方法收集所有的菌体置于基本培养基中发酵，显然这种发酵方式无法应用于大规模工业化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种以酪氨酸为底物直接合成白藜芦醇的基因工程菌株，是在Escherichia coli(BL21)中共表达了3个质粒：pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-STS，pACYCD-matB-matC。

所述pCDF-RgTAL-Pc4CL是携带编码酪氨酸脱氨酶TAL的基因和4-香桂酸：辅酶A连接酶4CL的基因的pCDFDuet-1，所述pET-STS是携带编码芪合酶STS基因的pETDuet-1，所述pACYCD-matB-matC是携带编码丙二酸转运、丙二酸吸收酶的基因matB、matC的pACYCDuet-1。所述pCDFDuet-1采用启动子Trc，质粒拷贝数为20；所述pETDuet-1采用启动子为T7，质粒拷贝数为40；所述pACYCDuet-1采用启动子T7，质粒拷贝数为10。

编码所述丙二酸转运酶的基因matB核苷酸序列如SEQ ID NO.1，所述丙二酸吸收酶的基因matC核苷酸序列如SEQ ID NO.2，编码所述酪氨酸脱氨酶TAL的基因核苷酸序列如SEQ IDNO.3，编码所述4-香桂酸：辅酶A连接酶4CL的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4，编码所述芪合酶STS的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

构建含有所述途径的基因工程菌的方法主要包括以下内容：

（1）采用全基因合成方法获得途径所需要的五个基因，

（2）通过酶切连接构建得到三个共表达质粒pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-STS，pACYCD-matB-matC；

（3）挑选能在含有100ug/mL的氨苄、35ug/mL的氯霉素、50ug/mL的链霉素等三种抗生素LB平板上生长的菌落，使其在含上述的三种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子，进一步PCR测序验证五个途径基因已成功转入到Escherichia coli(BL21)中。

利用含有所述合成途径的Escherichia coli(BL21)重组菌发酵生产白藜芦醇的方法：

（1）MOPS培养基(g/L)：葡萄糖5，氯化铵9.1，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，MOPS83.7，N-{三（羧甲基）甲基}甘氨酸7.1668，硫酸铁0.03，硫酸钾0.5，氯化镁1.1，氯化钠29.2，微量元素（ATCC BAA-232的配方）10ml,，自来水定容至1L。MOPS培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏性材料配制后0.22μm膜过滤除菌，接种前加入。

（2）将构建得到的基因工程菌株接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37℃、250rpm条件下培养12-20h至菌株OD₆₀₀达到1.0-2.0；然后再加入25ml相同的MOPS培养基及终浓度1mM的IPTG，30℃，250rpm条件下培养60h。

本发明的有益效果：以一株E.coli(BL21)为出发菌株，利用合成生物学和代谢工程手段在菌株体内构建了一条从酪氨酸到白藜芦醇的由TAL、4CL、STS、matB、matC等五个基因构成的合成途径。重组菌Escherichia coli(BL21)在以酪氨酸为底物，发酵72h后，白黎芦醇的产量达到35mg/L，成功实现了直接以酪氨酸为底物来合成白黎芦醇，无需添加贵重的前体物质。其中采用的模块化改造策略为今后微生物法生产其他天然小分子化合物提供了一定的借鉴意义。

附图说明

图1菌株体内构建的白藜芦醇合成途径。

图2LC-MS分析重组工程菌产生的白藜芦醇；(A)跟对照菌相比，优化后的菌株中间产物大量减少，目标产物积累增多；（B）发酵液中白黎芦醇(左)和香豆酸（右）的光谱图；（C）表样白藜芦醇(左)和香豆酸（右）的光谱图。

具体实施方式

白藜芦醇浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)

仪器：Agilent1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：

色谱柱：Aminex HPX-87H ion exchange column

流动相：5mM H₂SO₄

流速：0.6mL/min

柱温：35℃

进样量：5μL

紫外检测器波长：320nm

样品制备：500μL发酵液在10,000rpm下离心10min，取上清液移入1.5mL离心管中测白黎芦醇的含量。取100μL上清液移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0.45μm滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。

MOPS培养基(g/L)：葡萄糖5，氯化铵9.1，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，MOPS83.7，N-{三（羧甲基）甲基}甘氨酸7.1668，硫酸铁0.03，硫酸钾0.5，氯化镁1.1，氯化钠29.2,，微量元素（ATCC BAA-232的配方）10ml，自来水定容至1L。MOPS培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏性材料配制后0.22μm膜过滤除菌，接种前加入。

实施例1途径基因的选择

苯丙氨酸脱氨酶(TAL)广泛存在于高等植物、真菌、酵母以及一种原核生物链霉菌，人类至今还没在真细菌或者动物组织中发现该酶。尽管TAL分布很广，但是只有R.glutinis用来做商业用途，同时R.glutinis对酪氨酸的催化活性也比其他种类要高。最近研究中已经有人用P.crispum的4-香桂酸：辅酶A连接酶(4CL)、V.vinifera的芪合酶（STS）组合来获得非天然的白黎芦醇。因此选择深红酵母(Rhodotorula glutinis)的TAL、香芹菜(Petroselinum crispum)的4CL、葡萄（Vitis vinifera）的STS。

天然产物生产平台的发展通常受到前体物质或者辅助因子的限制，因为宿主菌中这些物质的量通常都不能满足大规模工业化生产的要求。在形成黄酮类骨架物质时，每生成一个分子的骨架物质需要3mol的丙二酰辅酶A。而大肠杆菌在补充了葡萄糖的培养基指数生长时，其中乙酰辅酶A是辅酶A代谢池中主要组分，丙二酰辅酶A只占其中很少的一部分。因此源于大肠杆菌细胞内的丙二酰辅酶A分子成为限制性前体分子。丙二酰辅酶A的生成途径有两种，一种是乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的作用下转化为丙二酰辅酶A,因此可以通过共表达ACC基因、生物素连接酶基因(birA)以及乙酰辅酶A合成酶(ACS)来提高产量；另一种是通过丙二酰辅酶A合成酶直接将丙二酰和辅酶A转化为丙二酰辅酶A，这时可以通过过量表达丙二酸转运的基因(matB)和丙二酸吸收途径的基因(matC)基因来提高产量。但是前一种代谢途径因为要添加生物素，对大规模生产化不利，因此选用后种代谢途径优化。

实施例2基于模块化改造理论的合成途径优化

对于构建好的合成途径，本研究欲将其分为三个模块，主要基于以下原则：i)4CL的产物香豆酰辅酶A/肉桂酰辅酶A会抑制途径中的TAL基因，因此将TAL和4CL划分为一个模块，将STS划分为一个模块，欲通过强化下游模块，弱化上游模块来减轻这种反馈抑制；ii)菌体异源合成黄酮类骨架物质时，丙二酰辅酶A较低的含量通常限制了菌体内的黄酮，因此将丙二酰辅酶A合成途径（matB和matC）置于一个单独模块，通过改变此模块的代谢通量来寻找最优丙二酰辅酶A含量。由此将总个途径分为三个模块分别是：模块一由TAL和4CL组成；模块二为STS组成；模块三为matB和matC组成。每个模块的代谢通量由质粒拷贝数和启动子的力度来决定，本系统用到的四个质粒分别为pACYCDuet-1（Novagen:71430），pCDFDuet-1（Novagen:71330），pETDuet-1（Novagen:71353）和pRSFDuet-1（Novagen:71363），其中质粒拷贝数分别为10，20，40和100；启动子选为T7和Trc，其中T7的力度为5，Trc的力度为1。通过系统改变每个模块的质粒拷贝数和启动子力度从而改变模块的代谢通量，通过鉴定中间产物和最终产物的含量，来确定最优的模块组合。最终找到最优的模块组合：模块一表达质粒为pCDFDuet-1，启动子为Trc；模块二表达质粒为pETDuet-1，启动子为T7；模块三表达质粒为pACYCDuet-1，启动子为T7。

实施例3含优化模块工程菌的构建

分别利用酶切连接技术将TAL，4CL基因与经NcoI和HindIII，NdeI和BlnI酶切后的质粒连接，将STS基因与经NcoI和XhoI酶切后的质粒连接，将matB和matC基因与经过EcoRI和HindIII，NdeI和KpnI酶切后的质粒连接，由此得到三个共表达质粒pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-STS，pACYCD-matB-matC。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将三个共表达质粒以化学法转化Escherichia coli(BL21)感受态细胞。挑选能在含有100ug/mL的氨苄，35ug/mL的氯霉素，50ug/mL的链霉素等三种抗生素LB平板上生长的菌落，使其在含上述的三种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子，测序验证结果，表明五个途径基因已成功转入到Escherichiacoli(BL21)中。

其中：

LB培养基(g/L)

氯化钠10g，Tryptone10g，Yeast extract5g，固体培养基添加20g琼脂。

LB+氨苄、氯霉素、链霉素的抗性平板(g/L)

LB+100mg氨苄、35mg氯霉素、50mg链霉素，固体培养基添加20g琼脂。

实施例4发酵生产白藜芦醇的方法

采用所述基因工程菌为出发菌株，接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37℃、250rpm条件下培养12-20h至菌株OD600达到1.0-2.0；然后再加入25ml相同的MOPS培养基和终浓度为1mM的IPTG，30℃，250rpm条件下培养60h。

重组菌与转化空质粒的对照菌相比较，对照菌中没有检测出白藜芦醇的产量，而重组菌中白藜芦醇的产量达到35mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种产白藜芦醇的基因工程菌，其特征在于，是在Escherichia coli(BL21)中表达了白藜芦醇合成途径中的关键酶系：酪氨酸脱氨酶TAL、4-香桂酸：辅酶A连接酶4CL、芪合酶STS、丙二酸转运酶matC以及丙二酸吸收酶matB，以酪氨酸为底物合成白藜芦醇。

2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述丙二酸转运酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述丙二酸吸收酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述酪氨酸脱氨酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述4-香桂酸：辅酶A连接酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述芪合酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述5个基因通过3个质粒进行共表达，所述3个质粒为：（1）pCDFDuet-1携带编码酪氨酸脱氨酶TAL和4-香桂酸：辅酶A连接酶4CL的基因，得到质粒pCDF-RgTAL-Pc4CL，（2）pETDuet-1携带编码芪合酶STS的基因，得到质粒pET-STS，（3）pACYCDuet-1携带编码丙二酸转运、丙二酸吸收酶的基因matB、matC，得到质粒pACYCD-matB-matC。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述pCDFDuet-1采用启动子Trc，质粒拷贝数为20；所述pETDuet-1采用启动子为T7，质粒拷贝数为40；所述pACYCDuet-1采用启动子T7，质粒拷贝数为10。

5.构建权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用全基因合成方法获得途径所需要的五个基因；

（2）通过酶切连接构建得到三个共表达质粒pCDF-RgTAL-Pc4CL、pET-STS，pACYCD-matB-matC，测序验证后，将三个共表达质粒以化学法转化E.coli(BL21)感受态细胞；

（3）挑选能在含有100ug/mL的氨苄、35ug/mL的氯霉素、50ug/mL的链霉素三种抗生素LB平板上生长的菌落，使其在含上述的三种抗生素的LB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子，进一步PCR验证五个途径基因已成功转入到E.coli(BL21)中。

6.应用权利要求4所述基因工程菌生产白藜芦醇的方法，其特征在于，是将构建得到的基因工程菌接种到MOPS培养基中，500mL摇瓶装液25mL，于37℃、250rpm条件下培养12-20h至菌株OD₆₀₀达到1.0-2.0；然后加入25ml相同的MOPS培养基及终浓度为1mM的IPTG，30℃，250rpm条件下继续培养60h。

7.根据权利要求书6所述的方法，其特征在于，MOPS培养基组成为(g/L)：葡萄糖5，氯化铵9.1，磷酸氢二钾0.3，丙二酸2，MOPS83.7，N-{三（羧甲基）甲基}甘氨酸7.1668，硫酸铁0.03，硫酸钾0.5，氯化镁1.1，氯化钠29.2，微量元素10ml，自来水定容。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述微量元素采用ATCC BAA-232的配方。