CN113930349A - 一种以l-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用 - Google Patents

一种以l-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以L‑酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用，属于生物技术领域。本发明为白藜芦醇的安全生物转化提供了简单且有效的实施方法，通过对TAL、4CL和STS模块采取共表达，在细胞内实现了L‑酪氨酸至白藜芦醇的生物合成，并通过表达乙酰辅酶A羧化酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因，显著地提高了产物白藜芦醇的含量，该工程菌生物转化白藜芦醇的产量高达5.5‑6g/L。

Description

一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌的构建及应用。
背景技术
白藜芦醇，又名芪三酚，是一种非黄酮类多酚有机化合物，是许多植物受到刺激时产生的一种抗毒素，可在葡萄叶及葡萄皮中合成，是葡萄酒和葡萄汁中的生物活性成分。口服容易吸收，代谢后通过尿液及粪便排出。白藜芦醇在植物中主要有4种存在形式:反式白藜芦醇、顺式白藜芦醇、反式白藜芦醇苷和顺式白藜芦醇苷,其中以反式形式为主，且反式白藜芦醇的生物活性高于顺式白藜芦醇。目前已知至少有34科、69属,100种不同的植物可产生白藜芦醇,主要涉及植物的根、茎、叶、花、果实和种子等部位，不同部位其白藜芦醇含量差异较大。天然白藜芦醇的主要来源植物是虎杖和葡萄。
白藜芦醇一种植物次级代谢产物，白藜芦醇已被证明在抗氧化、抗炎、抗癌、雌激素、神经保护、心脏保护、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗糖尿病、抗骨质疏松和减肥中的调节作用，备受人们的青睐，在医药、保健品、化妆品等方面有着广阔的应用前景。尤其是近年来在临床上对细胞癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、白血病等多种肿瘤细胞均有显著抑制作用，所以成为人们研究的热点。目前单纯依靠天然植物提取白藜芦醇的方法已经无法满足人们的需要，化学合成法又因为污染严重和安全性受质疑而推广困难，随着微生物代谢工程与合成生物学技术的进步，在大肠杆菌、酿酒酵母等宿主中设计与构建高效的异源合成途径，结合工程菌株的大规模发酵是实现白藜芦醇等植物源珍稀天然产物工业化生产，可为大规模工业化生产白藜芦醇提供重要支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌的构建及应用。该工程菌可以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇，产量高，利于白藜芦醇的大规模生产。
以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)利用酶切方法对质粒载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；
(2)利用特异性引物分别对L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶基因进行PCR扩增，回收得到目的片段；
(3)利用DNA连接酶将所述含有L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶编码基因的目的片段与所述线性化载体进行连接、转化，得到重组表达质粒载体-TAL、质粒载体-4CL、质粒载体-STS；
(4)利用前述重组表达质粒载体-TAL、质粒载体-4CL、质粒载体-STS构建重组质粒-TAL-4CL-STS
(5)将重组质粒-TAL-4CL-STS经酶切，线性化后利用转入解脂耶氏酵母Po1f中，培养挑取阳性转化子，获得能够产生白藜芦醇的初始工程菌；
按上述方案，步骤(4)所述的构建重组质粒TAL-4CL-STS的具体步骤为：
分别使用特异性引物扩增hp4d-4CL-XPR2、hp4d-STS-XPR2表达框，并使用OverlapPCR连接，扩增得到hp4d-4CL-XPR2-hp4d-STS-XPR2双重表达框，通过无缝克隆插入线性化质粒pINA1269-TAL，最终得到重组质粒TAL-4CL-STS；
或分别使用特异性引物扩增hp4d-4CL-XPR2、hp4d-TAL-XPR2表达框，并使用OverlapPCR连接，扩增得到hp4d-4CL-XPR2-hp4d-TAL-XPR2双重表达框，通过无缝克隆插入线性化质粒pINA1269-STS，最终得到重组质粒pINA1269-TAL-4CL-STS；
或分别使用特异性引物扩增hp4d-TAL-XPR2、hp4d-STS-XPR2表达框，并使用OverlapPCR连接，扩增得到hp4d-TAL-XPR2-hp4d-STS-XPR2双重表达框，通过无缝克隆插入线性化质粒pINA1269-4CL，最终得到重组质粒pINA1269-TAL-4CL-STS；
按上述方案，上述构建方法还包括：
(6)以人工合成的ACC基因为模板，使用特异性引物进行扩增，酶切连接后构建得到重组质粒-ACC；
或以人工合成的ACC、ACS基因为模板，使用Overlap PCR扩增得到融合基因：ACC-ACS酶切连接后构建得到重组质粒-ACC-ACS；
(7)将重组质粒质粒-ACC或-ACC-ACS用限制性内切酶酶切，线性化后转化入前述能够产生白藜芦醇的初始工程菌，培养挑取阳性转化子，获得能够生成白藜芦醇的工程菌株。
一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌，过表达L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶，同时过表达乙酰辅酶A羧化酶基因，或过表达乙酰辅酶A羧化酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因。
按上述方案，所述过表达L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶的方法是将所述L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶基因全部置于表达质粒的启动子之后进行表达，所述L-酪氨酸氨解酶基因、白藜芦醇合成酶基因序列和对香豆酰基辅酶A连接酶基因通过整合型质粒在解脂耶氏酵母中进行共表达，所述L-酪氨酸氨解酶基因、香豆酰基辅酶A连接酶和藜芦醇合成酶在工程菌株中通过hp4d启动子启动转录。通过整合L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶，利用hp4d启动子使L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶在解脂耶氏酵母中共表达，从而提高了白藜芦醇产物产量，为大规模工业化生产白藜芦醇提供了支撑。
按上述方案，所述的整合型质粒为pINA1269。
按上述方案，所述L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶来源于异源酶。具体地，所述L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶来源于异源酶，所述L-酪氨酸氨解酶基因来源于粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)(RgTAL)，核苷酸序列如SEQ ID No.1所述；铜锈菌(Cupriavidusmetallidurans)(CmTAL)，核苷酸序列如SEQ ID No.4所述；白色链霉菌(Streptomycesalbulus)(SaTAL)，核苷酸序列如SEQ ID No.7所述；
所述4-香豆酰辅酶A连接酶基因来源于大豆(Glycine max)(Gm4CL)，核苷酸序列如SEQ ID No.2所述；拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At4CL)，核苷酸序列如SEQ ID No.5所述；烟草(Nicotiana tabacum)(Nt4CL)，核苷酸序列如SEQ ID No.8所述；
所述白藜芦醇合酶基因来源于花生(Arachis hypogaea)(AhSTS)，核苷酸序列如SEQ ID No.3所述；葡萄(Vitis vinifera)(VvSTS)，核苷酸序列如SEQ ID No.6所述；虎杖(Polygonum cuspidatum)(PcSTS)，核苷酸序列如SEQ ID No.9所述。
所述异源乙酰辅酶A羧化酶基因来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)(CgACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.10所述；蜜环菌(Armillaria solidipes)(AsACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.11所述；鸡油菌(Cantharellus anzutake)(CaACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.12所述；优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(CgACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.10所述。
所述异源乙酰辅酶A合成酶基因来源于小豆(Vigna angularis)(VaACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.13所述；辣椒(Capsicum annuum)(CaACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.14所述；蓝球藻(Bathycoccus prasinos)(BpACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.15所述，优选为小豆(Vigna angularis)(VaACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.13所述。
所述L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶的核苷酸序列是根据解脂耶氏酵母密码子偏爱性进行密码子优化后的序列。
本发明还有一个目的在于提供一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌株在白藜芦醇生物合成中的应用。
按上述方案，所述的应用方法包括以下步骤：
(3)将工程菌在YPD培养基中培养10-15h，得到种子液，所述种子液的OD600＝5-10；
(4)将所述的种子液接入到YPD培养基中，进行发酵培养；
(3)发酵一定时间后添加诱导剂进行诱导表达，诱导至一定时间后，添加底物L-酪氨酸进行生物转化，合成白藜芦醇。
按上述方案，所述YPD培养基(质量百分比)为20g/L葡萄糖为碳源，含酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L；
按上述方案，所述种子液的培养条件为28-40℃，160-230rpm，培养时间为1-3h,优选为2h.；
按上述方案，所述种子液接入YPD培养基的比例为1％-2％，优选为2％。
按上述方案，底物L-酪氨酸的浓度为5-30g/L,优选为20g/L。
本发明采用具有较高的乙酰辅酶A内源水平的解脂耶氏酵母，使用酶偶联法同时催化三个反应体系，L-酪氨酸在L-酪氨酸氨解酶催化下生成对香豆酸、对香豆酰基辅酶A连接酶催化对香豆酸生成对香豆酰基辅酶A，然后白藜芦醇合成酶酶体系下生白藜芦醇；同时利用乙酰辅酶A羧化酶基因和/或乙酰辅酶A合成酶基因，乙酰辅酶A合成酶促进乙酰辅酶A的生成，乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A生成丙二酰辅酶A，白藜芦醇合成酶以对香豆酰辅酶A为底物结合三分子丙二酰辅酶A合成白藜芦醇，从而大幅度提高产物白藜芦醇的产量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明为白藜芦醇的安全生物转化提供了简单且有效的实施方法，通过对TAL、4CL和STS模块采取共表达，在细胞内实现了L-酪氨酸至白藜芦醇的生物合成，并通过表达乙酰辅酶A羧化酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因，显著地提高了产物白藜芦醇的含量，该工程菌生物转化白藜芦醇的产量高达5.5-6g/L。
附图说明
图1为表达L-酪氨酸氨解酶、4-香豆跣辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶的重组质粒pINA1269-CmTAL-At4CL-VvSTS的构建示意图。
图2为表达乙酰辅酶A羧化酶和乙酰辅酶A合成酶的重组质粒pINA1311-CgACC-VaACS的构建示意图。
具体实施方式
实施例1pINA1269-TAL-4CL-STS质粒的构建方法
1.pINA1269-TAL、pINA1269-4CL和pINA1269-STS质粒的构建
(1)以人工合成的RgTAL基因(为模板，以引物RgTAL-F和RgTAL-R进行PCR扩增，回收得到目的片段RgTAL。
(2)以人工合成的Gm4CL基因为模板，以引物Gm4CL-F和Gm4CL-R进行PCR扩增，回收得到目的片段Gm4CL。
(3)以人工合成的AhSTS基因为模板，以引物AhSTS-F和AhSTS-R进行PCR扩增，回收得到目的片段AhSTS。
(4)以人工合成的CmTAL基因为模板，以引物CmTAL-F和CmTAL-R进行PCR扩增，回收得到目的片段CmTAL。
(5)以人工合成的At4CL基因为模板，以引物At4CL-F和At4CL-R进行PCR扩增，回收得到目的片段At4CL。
(6)以人工合成的VvSTS基因为模板，以引物VvSTS-F和VvSTS-R进行PCR扩增，回收得到目的片段VvSTS。
(7)以人工合成的SaTAL基因为模板，以引物SaTAL-F和SaTAL-R进行PCR扩增，回收得到目的片段SaTAL。
(8)以人工合成的Nt4CL基因为模板，以引物Nt4CL-F和Nt4CL-R进行PCR扩增，回收得到目的片段Nt4CL。
(9)以人工合成的PcSTS基因为模板，以引物PcSTS-F和PcSTS-R进行PCR扩增，回收得到目的片段PcSTS。
人工合成的RgTAL基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，长度2082bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.16所述。
人工合成的Gm4CL基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，长度1689bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.17所述。
人工合成的AhSTS基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，长度1170bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.18所述。
人工合成的CmTAL基因核苷酸序列如SEQ ID No.4所述，长度1602bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.19所述。
人工合成的At4CL基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所述，长度1620b，编码氨基酸序列如SEQ ID No.20所述。
以人工合成的VvSTS基因核苷酸序列如SEQ ID No.6所述，长度1179bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.21所述。
人工合成的SaTAL基因核苷酸序列如SEQ ID No.7所述，长度1611bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.22所述。
人工合成的Nt4CL基因核苷酸序列如SEQ ID No.8所述，长度1644bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.23所述。
人工合成的PcSTS基因核苷酸序列如SEQ ID No.9所述，长度1167bp，编码氨基酸序列如SEQ ID No.24所述。
(10)将上述回收片段与pINA1269质粒DNA同时用PmlI、KpnI双酶切，分别连接后转化大肠杆菌DH5α，经验证成功获得9种重组质粒：pINA1269-RgTAL、pINA1269-Gm4CL、pINA1269-AhSTS、pINA1269-CmTAL、pINA1269-At4CL、pINA1269-VvSTS、pINA1269-SaTAL、pINA1269-Nt4CL、pINA1269-PcSTS。
2.hp4d-4CL-XPR2-hp4d-STS-XPR2双重表达框片段的获得
(1)分别以3种pINA1269-4CL质粒DNA为模板，使用引物Expression Cassette-F1、R1进行PCR扩增，回收获得包含不同4CL基因的3种hp4d-4CL-XPR2 DNA片段。
(2)分别以3种pINA1269-STS质粒DNA为模板，使用引物Expression Cassette-F2、R2进行PCR扩增，回收获得包含不同STS基因的3种hp4d-STS-XPR2 DNA片段。
(3)分别以1种上述hp4d-4CL-XPR2 DNA片段、1种hp4d-STS-XPR2 DNA片段同时作为模板，使用引物Expression Cassette-F1、R2进行PCR扩增，回收获得包含不同4CL、STS基因的3种DNA片段，3个代表DNA片段列举如下：hp4d-Gm4CL-XPR2-hp4d-AhSTS-XPR2、hp4d-At4CL-XPR2-hp4d-VvSTS-XPR2、hp4d-Nt4CL-XPR2-hp4d-PcSTS-XPR2。
3.pINA1269-TAL-4CL-STS质粒的构建
(1)使用限制性内切酶SpeI对上述构建的3种pINA1269-TAL质粒进行酶切，回收酶切产物pINA1269-RgTAL、pINA1269-CmTAL、pINA1269-SaTAL。
(2)分别将酶切产物与双重表达框片段进行无缝连接，获得3种重组质粒：pINA1269-RgTAL-Gm4CL-AhSTS、pINA1269-CmTAL-At4CL-VvSTS、pINA1269-SaTAL-Nt4CL-PcSTS。
上述质粒构建方法中所用引物如下表：
Figure BDA0003293085170000071
Figure BDA0003293085170000081
实施例2解脂耶氏酵母工程菌的构建及摇瓶发酵
(1)将实施例1所得的质粒pINA1269-RgTAL-Gm4CL-AhSTS、pINA1269-CmTAL-At4CL-VvSTS、pINA1269-SaTAL-Nt4CL-PcSTS经限制性内切酶NotⅠ酶切，线性化后利用LiAC转化法转入解脂耶氏酵母Po1f中，并涂布到SC-Leu酵母缺陷型培养基上，于30℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子，获得能够产生白藜芦醇的初始工程菌株1、工程菌株2和工程菌株3。
(2)将工程菌株1、工程菌株2和工程菌株3进行划线到YPD培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落，接种至种子培养基中，培养15h，得到种子液，所述种子培养基为YPD培养基：20g/L葡萄糖为碳源，含酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，所述种子液的培养条件为30℃，225rpm，所述种子液的OD600＝10；
(3)将2％所述的种子液接入到含50mLYPD培养基的摇瓶中，进行摇瓶发酵培养；
(4)培养2h时间后,添加20g/L底物L-酪氨酸进行生物转化，转化36h结束后利用高效液相色谱(HPLC)检测白藜芦醇的产量。
高效液相色谱检测白藜芦醇：
(1)向1mL上述转化液中加入1mL甲醇进行溶解，得到产物溶解物；
(2)所述产物溶解物经5000rpm离心10min，取上清液；
(3)所述上清液经0.22μm滤膜过滤于棕色液相瓶中，得到待测样品；
(4)高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18(250mm*4.6mm，5μm)或等效色谱柱，流动相为72wt％的水和28wt％乙腈，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温箱温度为30℃；
(5)根据白藜芦醇标准品的峰面积，最终计算白藜芦醇的含量，结果见表1。
实施例3表达乙酰辅酶A羧化酶(ACC)增加白藜芦醇产量
1.pINA1311-ACC质粒的构建
(1)以人工合成的CgACC(序列如SEQ ID No.10所述，长度1776bp)、AsACC(序列如SEQ ID No.11所述，长度6699bp)、CaACC基因(序列如SEQ ID No.12所述，长度6693bp)为模板，分别利用CgACC-F和CgACC-R，AsACC-F和AsACC-R，CaACC-F和CaACC-R进行PCR扩增，所述扩增产物经回收后得到CgACC、AsACC、CaACC的目的片段，片段大小分别为1776bp、6699bp、6693bp，所述引物CgACC-F序列5'-CCCCACGTGATGTCTGTTGAAACAAGAAAAATAACCAAAGTGC-3',如，SEQ ID No.47所述，所述引物CgACC-R序列5'-CGGGGTACCTTATTTGATTTCCAATAAAACCACTCCTTTGTTAACAG-3'，如SEQ ID No.48所述；所述引物AsACC-F序列5'-CCCCACGTGATGAGCGCGTATGATCAT-3'，如SEQ ID No.49所述；所述引物AsACC-R序列5'-CGGGGTACCGCTGCTATGCGCATAGCT-3'，如SEQ ID No.50所述；所述引物CaACC-F序列5'-CCCCACGTGATGAGCGAAGAACATGCG-3'，如SEQ ID No.51所述；所述引物CaACC-R序列5'-CGGGGTACCGCTGCCGGTATCCAGG-3'，如SEQ ID No.52所述。
(2)使用限制性内切酶PmlI、KpnI同时对CgACC、AsACC、CaACC回收产物与pINA1311质粒DNA进行双酶切，连接后得到重组质粒pINA1311-CgACC、pINA1311-AsACC、pINA1311-CaACC。
2.解脂耶氏酵母工程菌的构建及摇瓶发酵
(1)将实施例3所得的质粒pINA1311-CgACC、pINA1311-AsACC、pINA1311-CaACC用限制性内切酶NotⅠ酶切，线性化后利用LiAC转化法转化入工程菌2中，并涂布到SC-Ura酵母缺陷型培养基上，于30℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子，获得能够生成白藜芦醇的初始工程菌株4、工程菌株5、工程菌株6。
(2)将工程菌株4、工程菌株5、工程菌株6进行划线到YPD培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落，接种至种子培养基中，培养15h，得到种子液，所述种子培养基为YPD培养基：20g/L葡萄糖为碳源，含酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，所述种子液的培养条件为30℃，225rpm，所述种子液的OD600＝10；
(3)将2％所述的种子液接入到含50mLYPD培养基的摇瓶中，进行摇瓶发酵培养；
(4)培养2h时间后,添加20g/L底物L-酪氨酸进行生物转化，转化36h结束后利用高效液相色谱(HPLC)检测白藜芦醇的产量。
高效液相色谱检测白藜芦醇：
(1)向1mL上述转化液中加入1mL甲醇进行溶解，得到产物溶解物；
(2)所述产物溶解物经5000rpm离心10min，取上清液；
(3)所述上清液经0.22μm滤膜过滤于棕色液相瓶中，得到待测样品；
(4)高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18(250mm*4.6mm，5μm)或等效色谱柱，流动相为72wt％的水和28wt％乙腈，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温箱温度为30℃；
(5)根据白藜芦醇标准品的峰面积，最终计算白藜芦醇的含量，结果见表1。
实施例4表达乙酰辅酶A合成酶(ACS)增加白藜芦醇产量
1.pINA1311-ACC-ACS质粒的构建
(1)以人工合成的CgACC基因为模板，利用引物CgACC-VaACS-F1和CgACC-VaACS-R1进行PCR扩增，所述扩增产物经回收后得到CgACC的目的片段所述引物CgACC-VaACS-F1序列5'-CCCCACGTGATGTCTGTTGAAACAAGAAAAATAACCAAAGTGC-3',如SEQ ID No.53所述，所述引物CgACC-VaACS-R1序列5'-GAACCACCTCCACCTTTGATTTCCAATAAAACCACTCCTTTGTTAACAG-3'，如SEQ ID No.54所述。
(2)以人工合成的VaACS(序列如SEQ ID No.13所述)、CaACS(序列如SEQ ID No.14所述)、BpACS(序列如SEQ ID No.15所述)基因为模板，利用引物CgACC-VaACS-F2和CgACC-VaACS-R2、CgACC-CaACS-F2和CgACC-CaACS-R2、CgACC-BpACS-F2和CgACC-BpACS-R2进行PCR扩增，所述扩增产物经回收后得到VaACS、CaACS、BpACS的目的片段，所述引物CgACC-VaACS-F2序列5'-ATTGGAAATCAAAGGTGGAGGTGGTTCCATGATTCCACTTAGTAGAAATTCTG-3'，如SEQ IDNo.55所述,所述引物CgACC-VaACS-R2序列5'-CGGGGTACCTTAACTGTCCGCTATCTCGATCAATTGAT-3'，如SEQ ID No.56所述；所述引物CgACC-CaACS-F2序列5'-ATTGGAAATCAAAGGTGGAGGTGGTTCCATGAGCCTGGATTGCG-3'，如SEQ ID No.57所述，,所述引物CgACC-CaACS-R2序列5'-CGGGGTACCGCAATCCGCCAGCGCAAT-3'，如SEQ ID No.58所述；所述引物CgACC-BpACS-F2序列5'-ATTGGAAATCAAAGGTGGAGGTGGTTCCATGACCCTGATGCTGCCG-3'，如SEQ ID No.59所述,所述引物CgACC-BpACS-R2序列5'-CGGGGTACCGTTTTCCGCTTCGTTCGC-3'，如SEQ ID No.60所述。
(3)以上述回收的CgACC分别与VaACS、CaACS、BpACS目的片段同时做为模板，利用引物CgACC-VaACS-F1分别和CgACC-VaACS-R2、CgACC-CaACS-F2、CgACC-BpACS-R2进行PCR扩增，所述扩增产物经回收后得到CgACC-VaACS、CgACC-CaACS、CgACC-BpACS的融合基因片段。
(4)使用限制性内切酶PmlI、KpnI同时对CgACC-VaACS、CgACC-CaACS、CgACC-BpACS回收产物与pINA1311质粒DNA进行双酶切，连接后得到重组质粒pINA1311-CgACC-VaACS、pINA1311-CgACC-CaACS、pINA1311-CgACC-BpACS。
2.解脂耶氏酵母工程菌的构建及摇瓶发酵
(1)将实施例4所得的质粒pINA1311-CgACC-VaACS、pINA1311-CgACC-CaACS、pINA1311-CgACC-BpACS用限制性内切酶NotⅠ酶切，线性化后利用LiAC转化法转化入工程菌2中，并涂布到SC-Ura酵母缺陷型培养基上，于30℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子，获得能够生成白藜芦醇的初始工程菌株7、工程菌株8、工程菌株9。
(2)将工程菌株7、工程菌株8、工程菌株9进行划线到YPD培养基上培养至长出单菌落，挑取单菌落，接种至种子培养基中，培养15h，得到种子液，所述种子培养基为YPD培养基：20g/L葡萄糖为碳源，含酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，所述种子液的培养条件为30℃，225rpm，所述种子液的OD600＝10；
(3)将2％所述的种子液接入到含50mLYPD培养基的摇瓶中，进行摇瓶发酵培养；
(4)培养2h时间后,添加20g/L底物L-酪氨酸进行生物转化，转化36h结束后利用高效液相色谱(HPLC)检测白藜芦醇的产量。
高效液相色谱检测白藜芦醇：
(1)向1mL上述转化液中加入1mL甲醇进行溶解，得到产物溶解物；
(2)所述产物溶解物经5000rpm离心10min，取上清液；
(3)所述上清液经0.22μm滤膜过滤于棕色液相瓶中，得到待测样品；
(4)高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18(250mm*4.6mm，5μm)或等效色谱柱，流动相为72wt％的水和28wt％乙腈，流速为1mL/min，进样量为10μL，柱温箱温度为30℃；
(5)根据白藜芦醇标准品的峰面积，最终计算白藜芦醇的含量，结果见表1。
表1：实施例1-4生物转化白藜芦醇的含量
Figure BDA0003293085170000111
Figure BDA0003293085170000121
上述实施例中载体、基因和耗材均可从商业途径中得到。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
说明书核苷酸和氨基酸序列表
＜110＞ 河北维达康生物科技有限公司
＜120＞ 一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌、构建及应用
＜160＞ 60
＜210＞ 1
＜211＞2082bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞1
atggccccta gacctacctc tcaatctcaa gccagaactt gtccgaccac tcaggttaca 60
caggtcgata tagtcgagaa aatgctagct gccccaaccg acagcacctt agaattagat 120
ggttattcac taaatttggg tgacgtagta tcagcagcta ggaagggtag acctgttagg 180
gtgaaagata gtgatgaaat aagatctaag attgataaaa gcgtggaatt cttgagatct 240
cagctgtcta tgtccgtcta cggtgtaact acaggtttcg gtggctccgc agacacaagg 300
actgaggacg ctatcagtct acaaaaagct ttgttggaac atcaattgtg cggggttcta 360
ccatcatctt tcgactcttt tagattgggc cgtggactag agaattctct gccacttgaa 420
gttgtaagag gtgctatgac tatcagagtt aactcattga ctagaggtca ttccgctgtg 480
cgtttggtcg tcttagaagc attaactaat tttcttaatc acggcattac accgatagta 540
cctctaagag gtacaatatc cgctagtggg gatctttcac cgttatctta tattgcagca 600
gctattagtg gacatccaga tagtaaggta catgttgtac acgaaggtaa ggaaaagatt 660
ttatacgcca gagaggctat ggccctattt aatttagaac cagtggtttt gggaccaaaa 720
gaaggtttgg ggttagttaa tggtacagcg gtgtcagcct ccatggctac tttagccctt 780
catgatgccc atatgctatc tttacttagc cagagtctta cagctatgac agtcgaagct 840
atggtaggcc atgctggttc tttccacccg tttttacatg acgttacacg tcctcaccca 900
acacaaattg aagttgctgg taatatcaga aagttgcttg aaggatctag atttgccgta 960
catcatgaag aggaagtcaa agtaaaagat gatgaaggta tcttaaggca ggacagatac 1020
cctttaagaa catcacctca gtggttgggt cctttggttt cagatttgat ccatgctcat 1080
gccgtgttga ctatcgaagc aggtcaatca acaacggaca atccactgat agatgttgaa 1140
aacaaaactt ctcatcacgg tggcaatttt caagcggctg cagttgctaa cacgatggaa 1200
aagacaagac ttggcctggc tcaaataggt aagttaaatt ttacccaact tacggaaatg 1260
ctaaatgccg gtatgaacag aggtctacct tcttgtttag cagcggaaga cccatcctta 1320
tcttatcact gcaagggtct ggatattgca gccgctgcgt atacgtccga attggggcat 1380
ctagcgaacc ctgttactac tcatgtacaa cctgctgaaa tggctaacca agccgttaac 1440
agcttagctc ttataagtgc acgtagaact acagaatcta acgacgtttt atcattgttg 1500
ttagcaacac acctgtattg cgttttacaa gcgattgatc ttagggcaat cgaattcgag 1560
tttaaaaaac aatttggacc cgccattgtc agtctgattg accaacattt tggctcagcc 1620
atgaccggta gtaatctgcg tgacgagctg gtagaaaagg ttaataaaac tttggccaag 1680
agattagaac aaaccaattc atacgacctg gtgccaagat ggcacgatgc cttctcattc 1740
gccgccggaa cagttgtgga ggttctgtca tctaccagtc tttcactggc agctgtaaat 1800
gcctggaaag tagccgctgc tgaaagtgct atttccttga ctagacaagt tagagaaaca 1860
ttttggtcag ctgcgtctac atcatctcca gccttgagct atttgtctcc aagaacacag 1920
attttgtatg catttgtgag ggaagaattg ggagtaaagg ctaggagggg tgacgtgttc 1980
ttgggtaaac aagaagttac aataggctcc aacgttagca aaatttatga agctataaaa 2040
tctggacgta ttaacaacgt cttacttaag atgttggctt aa 2082
＜210＞ 2
＜211＞ 1689 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞2
atgattacac tggccccatc tctagacacc ccaaaaacag atcaaaacca ggtctctgat 60
ccacaaacca gccacgtatt caagagcaaa ctaccagaca taccaatatc aaatcactta 120
cctttgcatt cctattgttt tcaaaatctt tctcagttcg cacatagacc ttgcctaata 180
gtgggtcccg cgtctaaaac attcacgtac gcagatactc atttaatttc ttctaagatt 240
gcagccggct tgtctaactt gggtattttg aaaggtgacg tagtaatgat tttgttacaa 300
aacagtgcag atttcgtttt ctccttctta gccatctcaa tgattggagc cgtcgctact 360
acagcctctc ccttctatac ggcacctgaa atctttaagc aatttaccgt ttctaaggaa 420
aagttggtta ttacgcaagc gatgtatgtt gacaagctta gaaaccacga tggcgccaag 480
ctaggagaag attttaaagt tgtgaccgta gatgatccac ctgaaaactg tttacatttt 540
tctgtgcttt cagaagcaaa tgaaagcgat gttccagaag ttgagataca tccagatgat 600
gcagtggcta tgcctttctc atctggcaca accggactac caaaaggcgt tattttgact 660
cataagtctt taactactag tgtggctcag aagattgacg gtgaaaaccc taatttatat 720
ttgaccacag aagacgtact attgtgtgtg ttgcctttat ttcatatttt ttccttgaat 780
tcagttttgc tgtgtgctct gagagctgga tcagcagtgc tgttaatgca aaaatttgaa 840
atcggcactt tattagaatt gatacaaaga catcgtgtgt cagttgcaat ggtcgtacct 900
cccttagtcc tagcccttgc caaaaaccca atggttgctg attttgattt atcctctata 960
agactagtct tgtctggcgc agcccctcta ggtaaagagc ttgaagaagc cttaagaaat 1020
agaatgcctc aagctgtttt ggggcaaggc tatggtatga cagaagctgg acctgtacta 1080
tcaatgtgct tgggttttgc aaaacaacca tttcaaacaa agagcggatc ctgtggcact 1140
gtggttagaa atgccgaatt gaaagtcgtt gatccagaga ctggtagatc tttgggttac 1200
aaccaacctg gagaaatatg tatcagaggc caacaaatta tgaagggtta tttaaacgac 1260
gaggcagcta cagcttcaac aatagattct gagggttggc tacacaccgg cgatgtcgga 1320
tatgtggatg acgatgatga gatctttatt gttgatcgtg tgaaagaact tatcaaatat 1380
aaaggtttcc aagtacctcc tgctgaattg gaaggactat tggttagtca ccccagtatc 1440
gccgacgcag cagtcgtccc tcaaaaagac gttgcagcag gagaagttcc agtcgctttc 1500
gttgtgagat caaatggctt tgatttaacc gaagaagctg tcaaagaatt tattgctaaa 1560
caagttgttt tctataagag attacataag gtctactttg tgcatgctat acccaaaagt 1620
ccatctggta agatcctgag aaaggatttg agagctaagc ttgaaacagc agcaacacaa 1680
accccataa 1689
＜210＞ 3
＜211＞1170bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞3
atggtctccg tatctggcat taggaaagtt caacgtgctg aaggtccagc taccgttctg 60
gcgattggca cagctaaccc tccaaattgc gtggatcagt caacatatgc cgattactat 120
tttagagtta caaatagtga acacatgacc gatctaaaaa aaaaatttca gaggatttgt 180
gagcgtactc aaattaagaa tagacatatg tacctaacag aggagatttt gaaagaaaat 240
ccaaatatgt gtgcctataa ggccccttct ctagatgcta gggaagacat gatgattaga 300
gaagtgccaa gagtaggaaa ggaggctgct accaaagcca ttaaggaatg ggggcaacca 360
atgtcaaaga ttacgcactt gattttttgt acaacatctg gggtggctct tccaggtgtt 420
gactatgaat tgatagttct gcttggatta gacccatcag tcaagaggta tatgatgtac 480
catcagggtt gctttgctgg tggtactgtc ttaagacttg ctaaagattt ggccgaaaat 540
aacaaggacg ccagagtatt gatcgtttgt tctgaaaaca catccgttac ttttagagga 600
ccatcagaaa cagatatgga tagcttggta ggtcaagctc tattcgcgga tggtgccgca 660
gccataatta tcggtagcga tccagttccc gaggtagaaa accccttgtt tgaaattgta 720
tctactgatc aacaattagt gcccaattca catggtgcga ttggtggttt attgagagaa 780
gtgggtttga ctttctattt aaacaagtct gtaccagaca ttatttctca aaacattaat 840
gatgctttat ctaaggcctt tgatcctttg ggcatttctg actacaactc aattttttgg 900
attgcacatc ctggtggtag agccatattg gatcaagtcg aagaaaaagt taacttgaaa 960
ccagaaaaga tgaaggctac cagggatgtt ctgagtaatt acggtaatat gtcttccgct 1020
tgtgtctttt tcattatgga tttaatgagg aaaaaaagtc tagaagctgg tttaaagaca 1080
acaggtgaag gtttagattg gggtgttttg tttggcttcg ggccaggcct gactatcgaa 1140
acagtcgtct taagatcaat ggctatttaa 1170
＜210＞ 4
＜211＞ 1602 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞4
atgcctcatg cccacccagc agatatagac ggccatcatt tgactccaga tactgttgca 60
gccatagcta gaggtcaaag agccgctatt gtcacggaac ctgttcttgg gaaggttgct 120
gatgcaaggg caagattcga gcaagtggca gctgctaatg tacctatata tggcgtaagc 180
accggttttg gtgaattggt tcataactgg gttgatatag aacacggtag ggcactacaa 240
gaaaacttat tacgtagtca ttgtgctggt gtcggcccat tatttagtag agacgaggtt 300
cgtgctatga tggtagctag agctaacgct ttggcgagag gttattccgc cgtaaggccg 360
gcagtcatag agcagctgtt aaagtactta gaagcaggaa ttactccggc ggtcccacaa 420
gtgggtagtc tgggagcgag cggagatcta gctcccctat cacatgttgc catcaccttg 480
ataggtgaag gaaaggtatt gaccgatgat gggggaactg cacccacggc tgaggttcta 540
agagaaagag gtattacacc attagcactg gcgtataagg aaggtcttgc tttaataaat 600
ggtacaagtg ctatgactgg tgtttcttgt ttactgttag aaacattgag ggctcaagtc 660
agacaagccg agattattgc agctctggct ttagaggggt tatctgcctc cgctgatgcc 720
tttatggccc atggccacga cattgccaaa cctcatccag gtcaaattag gtcagctgca 780
aatatgaggg cattattagc cgattcagca agattgtccg gtcacggcga attaagtgca 840
gaaatgaaaa caagagcggg cgaagcgaag aatactggta caggcgtttt catacagaag 900
gcttatacct tgaggtgtat tcctcaagtt cttggcgcag ttagagacac attggatcat 960
tgtgctactg ttgttgaaag agaattaaat tctagtaacg ataatcccct gttttttgag 1020
gatggtgaac tattccatgg tggtaacttt catggccaac aggtagcttt tgctatggac 1080
ttccttgcga ttgcggctac ccaattggga gtcgttagtg aacgtaggct gaacagatta 1140
ttatctccgc acctaaacaa taatttacct gcttttttgg ctgccgcaaa tgagggactg 1200
tcttgtgggt ttgctggagc tcaataccca gcgacagcct taatcgctga aaacagaacc 1260
atatgctccc cagcttccat tcaatcagta ccttctaatg gtgataacca agatgtggtt 1320
tctatgggac tgattgctgc aaggaatgcc agaagaattc tagataacaa ccagtacatt 1380
ttagctttag aattattagc ttcttgtcag gcagcggaat tggctggtgc cgtagaacaa 1440
ttagctccgg ccgggagagc agtttttgct ttcgtcagag aaagagttcc atttttgtcc 1500
attgatagat atatgacaga tgatattgag gctatggccg ctttgctgcg tcagggagct 1560
ttggttgaag tggtcagggg tgctggaatt gaactggctt aa 1602
＜210＞ 5
＜211＞ 1620 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞
atggcgccac aagaacaagc agtaagtcaa gttatggaaa agcaatcaaa taataataat 60
tccgacgtga tctttagaag taagctacct gacatctaca ttccaaatca cttgtcactg 120
catgactata tttttcaaaa catctctgaa ttcgccacaa aaccttgttt aatcaatgga 180
ccaaccggtc atgtgtacac ttattcagat gtccatgtta ttagtaggca aattgccgct 240
aattttcata aattgggagt taaccaaaat gatgttgtca tgttactgct accaaactgc 300
cctgagtttg tcttgagttt tctagccgca tcattcagag gcgcaacagc tacagcagcc 360
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atgttaactc ataagggtct ggtaactagt gtggcgcaac aagttgatgg agaaaatcct 720
aatttatatt ttcattcaga tgacgtcatt ctgtgtgtgt tacctatgtt tcacatctat 780
gcactgaaca gtatcatgtt atgcggttta agagtcggcg ccgctatcct gatcatgcct 840
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atggttccac cgattgtcct tgctattgct aagtctagtg aaacagaaaa atacgattta 960
tcaagtatta gagttgttaa gagtggtgcc gcccctttag gcaaagaact agaagatgcc 1020
gttaatgcta agtttccgaa tgctaagtta ggtcaaggct acggtatgac ggaagccggt 1080
ccggtcttag ctatgtctct tggttttgcc aaggagccgt ttccggttaa atccggtgca 1140
tgcggtacag tggtcaggaa tgccgagatg aagatagtcg accctgatac cggcgattct 1200
ctttctagaa atcagcccgg cgaaatttgc ataagaggtc accaaattat gaagggttat 1260
cttaataacc cagcggctac tgcagagact attgataaag acggctggtt gcatactggt 1320
gacattggct taattgacga tgatgacgag ttgttcatag ttgacagatt aaaagagttg 1380
ataaaatata agggattcca agtggctcct gccgaattgg aagccctttt gattggtcat 1440
cccgacatta cagatgtggc cgtcgtcgcc atgaaggaag aagcagctgg tgaagtacca 1500
gttgcctttg tagttaaatc taaagattct gaactgtcag aagacgatgt gaaacaattc 1560
gtttccaagc aagttaaatc atgtgtttta caagagaatc aacaatccgt tctgcattaa 1620
＜210＞ 6
＜211＞ 1179 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞6
atggcttcag ttgaagagtt tcgtaacgct caacgtgcta agggcccagc cactattttg 60
gctataggaa ccgcaactcc tgatcattgt gtctaccaat ccgattacgc tgattattac 120
ttcagagtta ctaaatccga gcatatgacg gaattaaaga aaaaatttaa tagaatctgc 180
gacaaatcca tgatcaagaa gcgttatatc catttaactg aagaaatgct tgaagaacat 240
cctaatatcg gtgcttatat ggctccatca cttaatataa gacaagaaat tataacagcc 300
gaagtgccaa gattaggcag agatgccgca cttaaagctt tgaaggaatg ggggcagcca 360
aagtcaaaga ttacgcattt agtattttgt acaacatctg gcgttgaaat gcctggggca 420
gattacaaac tggctaatct tctaggcttg gaaacgagtg ttcgtagagt catgctatat 480
caccaaggtt gttacgcggg cggaacagtt ttacgtacgg ctaaggatct tgccgaaaat 540
aatgcaggtg cccgtgtctt agttgtatgt tcagaaatta cagtagtcac attcagaggc 600
ccatctgaag acgcattaga tagcttagtt ggtcaggcat tgtttggtga cggatcaagt 660
gctgtgattg tcgggtcaga tcccgatgta tcaatagaaa gaccattgtt tcagttggtc 720
tcagccgctc aaacttttat tcccaactca gcaggtgcaa tagccggtaa cctacgtgag 780
gtggggttaa ccttccattt atggcctaat gttccaactt tgatatctga aaatatagaa 840
aaatgcttaa cacaagcgtt cgaccccttg ggtatttcag actggaattc tttgttttgg 900
atagctcatc cgggtggtcc agctatctta gacgcagtag aggcaaagtt gaacctggaa 960
aaaaagaagc tagaagccac tagacatgtc ctatccgagt acggaaacat gagctccgca 1020
tgcgttttgt tcattttgga tgaaatgaga aaaaagagcc ttaaaggaga aaatgccact 1080
actggtgaag gtttggattg gggcgttttg ttcggttttg gtcctggatt gactattgag 1140
actgtagtac tacactcaat ccctacagtt accaattaa 1179
＜210＞ 7
＜211＞ 1611bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞7
atgactacca ccgtttcaac tactaccgaa agcattgctt tcgacggaga gaacctagca 60
atagaggatg tgagaaggat tgctgaacat tatgttcctt gttccgtgac acctgaagtc 120
cttacaaaag ctgcagcttc aagacaacaa tttgaagata ttgttaggga tggagcggcg 180
gtctatggtg ttaccactgg ttatggtgag atgatctata tgcaagtgga tcccagtaag 240
gaggttgaat tgcaaactaa cttaatcagg tcacactctg caggggttgg tccattgttc 300
gctgaagatg aagctagggc aatattagct gctagattga atgctttgtc tagaggctat 360
tccgccgtac gtccagaaat tttggaacgt ttagcattgt acttaaatct gggaatcact 420
cccgctatcc cagagatcgg tagtcttggc gcctctggag acttagctac tttaagtcat 480
atagcttgca ccgtaattgg agagggctac gttcttagag atggtaagag agtgcctact 540
ggcgaagttt tgagagaaag gggtatagaa ccactggaaa tgaggtttaa agagggtttg 600
gcactgatta acggtacttc tggtatgact ggtttgggta gccttgttgt tggaagggca 660
ttagatcaac ttcatcagtc tgaaattgta tctgccttgc tactagagac tcttagatgc 720
tctacatctc catttttagc cgaagggcat gaattagcta gacctcatag aggacaaatc 780
gactccgctg ctaacttgag aacgttatta gctgattccc gtttggctgt gtcacattca 840
gatttaagag ctgaatacca atctaaaaag tcaggtgacg atgttactag aacagacgtt 900
tatcttcaaa aagcttatag cctgagagct attcctcagg tgcttggtgc agttagagac 960
accttgaggc atgcagaagg tactttgaat accgaattga attcagcaac cgataaccct 1020
ttattcttcc caggaaagga agtattccat ggtggcaatt accatggtca accagttgct 1080
tttgcaatgg attttacaac aatcgctttg actcaacttg gtgtccttag tgaacgtcaa 1140
tccaaccgtt tatttaatag acatttatct tacggtttgc ctgaattcct ggttgctggt 1200
gaaccgggac taaatagcgg ttttgcggga gcacaatacc ctgccactgc tcttatagca 1260
gaaaacagaa ctatcggtcc tgcttccaca caatcagtcc cgagtaatgg tgacaatcaa 1320
gacattgtat ctatggggct aatatctgct agaaacgcga gaagggtttt gtccaataac 1380
acaaaaatac tggctgttga gtaccttgcc gcagcgcaag cggtcgattt aaccgggaga 1440
tatgaaggct tgtcaaccgc cggtaaagcg acgtatgaaa aggttagatc attggcccct 1500
acattagatc atgatagata catgtcagat gaaatagaaa ctgtagctgg tgcagtggcc 1560
agaggtgaat ttttaacaac cgttagatca gcaggtattc agctgaggta a 1611
＜210＞ 8
＜211＞1644 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞8
atgcctatgg agacaactac tgaaaccaaa caaagtggag atctaatttt tcgttccaaa 60
ttgccagata tttacatacc aaagcatcta cccttgcact cctactgctt tgagaacata 120
agtgaattta gctcaagacc atgtttgatt aatggagcta acgatcaaat ctatacatac 180
gcagaagtcg aactaacttg tagaaaggtc gccgttggct tgaataaact aggaatacaa 240
caaaaagaca ccatcatgat cctgttaccc aatagtccag agtttgtttt tgccttcatg 300
ggtgcatcct acttaggtgc catctctact atggccaacc cattatttac acctgccgaa 360
gttgtgaagc aagcaaaagc tagttcagcc aaaataataa tcactcaatc ttgctttgtt 420
ggtaaggtaa aagattatgc atcagaaaat gatgttaaag ttatttgcat tgattcagcc 480
ccagaggggt gtcttcattt ctctgaactg acacagtcag acgaacatga gatccctgaa 540
gtcaaaattc aacctgatga tgttgtcgca ctaccttact cttctggaac cacaggctta 600
ccaaagggtg tgatgctaac tcataaaggt cttgtgactt cagtagctca gcaagtcgat 660
ggtgaaaacg ccaatttata tatgcactct gaggatgttc tgatgtgtgt attgccttta 720
tttcacattt acagtttgaa cagcattcta ttgtgtggcc taagagtagg cgctgcgatc 780
cttataatgc aaaagtttga tattgctcca tttctggaat taatccaaaa gtataaagta 840
tccattggac ccttcgttcc gccaatagta ctggctatcg ctaaaagtcc aatcgtggac 900
tcatacgacc tatcttccgt tagaaccgtt atgagcggtg ctgctccctt aggtaaggaa 960
ttagaagacg ctgttaggac aaaatttcct aacgccaaat taggtcaggg ctacggaatg 1020
accgaggccg gtccagttct agccatgtgt ttggcttttg cgaaggaacc atttgacata 1080
aagtcaggtg cttgtggtac tgtagttcgt aatgctgaaa tgaaaattgt agatccagat 1140
actggatgct cattaccaag aaaccagccg ggtgaaattt gtataagagg tgaccaaatc 1200
atgaaaggat atttgaacga tccagaagct actacacgta ccattgacaa ggaaggctgg 1260
ctacatacgg gggatatagg atttatcgat gaggatgatg aattatttat tgttgatagg 1320
cttaaggagt tgattaagta caaaggcttt caagtagcgc ctgctgaaat cgaagctttg 1380
cttcttaatc atccaaatat cagtgatgct gctgtagtcc caatgaaaga tgagcaagct 1440
ggagaggtcc cggtagcttt cgtagtgcgt agcaacggtt cagccataac agaagacgaa 1500
gttaaagatt ttatcagtaa gcaagttata ttctacaaaa gagttaagag agtgttcttc 1560
gttgagaccg ttcctaagtc tccttccggt aagatcttga ggaaagactt acgtgctaga 1620
ctagcagccg gagtaccaaa ttaa 1644
＜210＞ 9
＜211＞1167 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞9
atggcagctt caactgacga aatgacaaag gctctgaccg ccgcaacagt gttagcaatt 60
ggcacagcta atcctccaaa ttgttattac caagcagact ttccagattt ctattttaga 120
gcaactaata gtgaccattt aactcatctt aaacataaat tcaaaagaat ttgcgagaaa 180
tctatgattg aaaaaagata cctacagttg actgaagaca tattgaagga aaatcctaac 240
attggtgcct acgaggcacc ctctttagat gtgagacacg aaatacaagt taaaggcgtt 300
gcccagttag gtaaagaagc tgctttgaaa gcaatgcagg agtggggtca gccaaaaagc 360
aaaattacac acttgattgt ttgttgtatt gctggagttg atatgccagg tgctaattat 420
cagctaacaa aactattaga tttgaactct tcagtgaagc gttttatgtt ctaccaccta 480
ggttgttacg ctgggggtac agttttgcgt ttggctaaag atatcgctga gaataacaaa 540
ggtgccaggg tccttattgt atgttcagaa atgacgccaa tatgcttcag aggtccaagt 600
gaaacacata tcgatagcat ggttggacaa gctatatttg gggacggtgc tgctgcagtc 660
attgtcggtg caaatccaga ccttactgtc gaggaaccga tattcgaatt gatatcaaca 720
gctcaaacaa taatcccaga gtctgacgga gctatcgaag gccatttatt ggaggtcggc 780
ttgtcttttc aattatacca aaacgtccct gcattgattt ctaattcaat cggtacgtgt 840
ttatctgaag ctttcacccc actaaatatc tctaattgga actcactttt ttggatcgca 900
catccggggg gtcctgctat tttggaccat gtcgaagcaa ccgtaggtct aaataaggaa 960
aagctgaaag ctaccagaca agtacttaac gattacggaa acatgtcatc cgcatgcgtc 1020
tttttcataa tggatgagat gagaaaaaag tcattggaga acggacatgc gactactggt 1080
gagggtttgc agtggggcgt tttatttggg tttggcccag gtattacagt tgaaactgtc 1140
gtcttaagat ctgttccaat aatttaa 1167
＜210＞ 10
＜211＞1776 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞10
atgtctgttg aaacaagaaa aataaccaaa gtgctagtgg ccaatagagg cgagattgct 60
atacgtgtct ttagagctgc tagagatgaa ggaattgggt ccgtcgccgt ctatgctgaa 120
ccagatgcag acgccccttt cgtttcatac gctgatgagg ccttcgcttt gggtggccag 180
acttctgcag agagctactt ggttattgac aaaataattg acgccgccag gaaatccgga 240
gctgacgcaa ttcatccagg ctacggcttc ttagcagaaa acgcggattt tgccgaagca 300
gttattaatg aaggactaat ttggataggt ccaagccctg aatccattag agcacttgga 360
gacaaagtaa cagctagaca tattgccgat actgctaaag cgccgatggc gcctggtaca 420
aaagaaccag ttaaggatgc agctgaagtt gtcgcatttg ccgaggagtt cggtttacct 480
atagctataa aggcagcttt cggcggcgga ggtaggggta tgaaagttgc ttataaaatg 540
gaagaagttg ccgacttgtt cgaatcagct acgagggaag ccacagcagc ttttggacgt 600
ggcgaatgct tcgtagaaag atatttggac aaagctagac acgttgaagc acaagtcatt 660
gccgacaaac acggtaacgt tgttgtcgcg ggaactaggg actgttcttt acagagacgt 720
ttccaaaaac tggtcgagga ggccccggcc ccatttttaa cagatgatca acgtgagaga 780
ctacattcaa gtgctaaggc gatttgtaag gaggccggat attatggtgc tggaacagtt 840
gaatacctgg tcggtagtga cggtttaatt tcatttcttg aggttaacac aaggttgcaa 900
gttgaacacc cggttacaga ggagacaaca ggcattgatt tggtccgtga aatgtttagg 960
atagcggaag gacatgagtt gtctatcaaa gaggatccag ctccgagagg ccacgctttt 1020
gaatttagaa taaatggtga agacgctggt agtaatttta tgcctgctcc tggtaaaatt 1080
accagttata gggaaccaca gggtccagga gttcgtatgg attctggtgt tgttgaaggt 1140
tcagaaatca gcggtcaatt tgattccatg ttagctaaac taatagtttg gggagacaca 1200
agagagcaag ctcttcaaag gtctagaaga gcattggctg aatatgtagt ggaaggtatg 1260
ccaaccgtaa tcccgtttca ccaacatatt gttgaaaacc ctgcatttgt aggtaacgat 1320
gaaggtttcg aaatatatac caagtggata gaagaggttt gggataaccc aattgctccc 1380
tacgtcgacg cgagtgaatt agatgaagat gaagataaga caccagctca aaaagttata 1440
gtagaaatta atggaagacg tgttgaagta gcattacccg gtgatcttgc cttaggtggc 1500
actgctggcc caaaaaagaa ggctaagaag agaagggctg gcggagcgaa ggccggtgtt 1560
tccggtgacg ctgtcgctgc accaatgcaa ggaactgtaa tcaaagtgaa cgttgaggaa 1620
ggtgcagaag taaacgaagg tgatactgta gttgtgttgg aggcgatgaa aatggaaaac 1680
cccgttaaag ctcacaagag cggcacagtg acgggtctga cagttgcagc aggtgagtct 1740
gttaacaaag gagtggtttt attggaaatc aaataa 1776
＜210＞ 11
＜211＞6699 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞11
atgagcgcgt atgatcatag ccgcgtgcag cattttattg gcggcaacag cctggatgcg 60
gcgccgctga gcagcatgca tgattttgtg aaagaaaacg gcggccatac cgtgattacc 120
aaagtgctga ttgcgaacaa cggcattgcg gcggtgaaag aaattcgcag cattcgccag 180
tggagctatg aaacctttgg ccgcgaacgc gaagtggaat ttaccgtgat ggcgaccccg 240
gaagatctga aagtgaacgc ggaatatatt cgcatggcgg atcgctatgt ggaagtgccg 300
ggcggcagca acaacaacaa ctatgcgaac gtggatctga ttgtggatat tgcggaacgc 360
gcgggcgtgc atgcggtgtg ggcgggctgg ggccatgcga gcgaaaaccc gcgcctgccg 420
gaaagcctgg cggcgagcaa acataaaatt gtgtttattg gcccgccggg caccgcgatg 480
cgcagcctgg gcgataaaat tagcagcacc attgtggcgc agcatgcgga agtgccgacc 540
atgccgtgga gcggcaccgg cattcgcgat accgtgctga gcaaagaagg ctatgtgacc 600
gtgccggata aagcgtatat ggatgcgtgc gtgaccagcg tggaagaagg cctgaaacgc 660
gcggaagaaa ttggctatcc gattatgatt aaagcgagcg aaggcggcgg cggcaaaggc 720
attcgcatgg tggatagccc gggcggcttt aaaaacgcgt ttcatgcggt ggcgggcgaa 780
attccgggca gcccgatttt tattatgaaa ctggcgggcc aggcgcgcca tctggaagtg 840
cagctgctgg cggatcagta tggcaacgcg attagcctgt ttggccgcga ttgcagcgtg 900
cagcgccgcc atcagaaaat tattgaagaa gcgccggtga ccattgcgcc ggaagtgacc 960
tttgaaaaaa tggaacgcgc ggcggtgcgc ctggcgaaac tggtgggcta tgtgagcgcg 1020
ggcaccgtgg aatatctgta tagccatagc gaagattatt tttattttct ggaactgaac 1080
ccgcgcctgc aggtggaaca tccgaccacc gaaatggtga gcggcgtgaa cctgccggcg 1140
gcgcagctgc aggtggcgat gggcattccg ctgcatcgca ttcgccatat tcgccagctg 1200
tatggcgtgg cgccgaacgc gagcagcgaa attgattttg atatgattaa accggatgcg 1260
aaccagctgc agcgcaaacc gcgcccgaaa ggccatgtgg tggcggtgcg cattaccgcg 1320
gaaaacccgg atgcgggctt taaaccgagc agcggcagcc tgcaggaact gaactttcgc 1380
agcagcacca acgtgtgggg ctattttagc gtgagcaccg cgggcggcct gcatgaattt 1440
gcggatagcc agtttggcca tatttttgcg tatggcgaag atcgcagcga aagccgcaaa 1500
aacatgatta ttgcgctgaa agaaattagc attcgcggcg aatttcgcac caccgtggaa 1560
tatctgatta aactgctgga actggaagcg tttaaaaaca acaccattac caccggctgg 1620
ctggatagcc tgattagcaa ccgcctgacc gcggaacgcc cggatgcgac cctggcggtg 1680
attagcggcg cggtgaccaa agcgtatctg gcgagcgaag cgtgctggaa cgaatataaa 1740
cgcattctgg ataaaggcca ggtgccgagc cgcgataccc tgaaaaccat ttttagcatt 1800
gattttattt atgaaaacgt gcgctatagc tttaccgcgg cgcgcagcag catgaccgtg 1860
tggaccctgt atctgaacgg cggccgcacc atggtgggcg cgcgcccgct ggcggatggc 1920
ggcctgctgg tgctgctgga tggcaaaagc catagcgtgt attggcagga agaagtgggc 1980
gcgctgcgcc tgatggtgga tgcgaaaacc tgcctgattg aacaggaaaa cgatccgacc 2040
cagctgcgca gcccgagccc gggcaaactg attcgctatt ttgtggatag cggcgatcat 2100
attaacgcgg gcgaacatta tgcggaaatt gaagtgatga aaatgtatat gccgctggtg 2160
gcgagcgaag atggcattgt gcagctgatt aaacagccgg gcgtgagcct ggatccgggc 2220
gatattgtgg gcattctgac cctggatgat ccggcgcgcg tgaaacatgc gaaaccgttt 2280
gaaggcctgc tgccgagcat gggcaccccg ggcgtggtgg gcaacaaaac ccatcagcgc 2340
ctggtgtatt gcctgaccct gctgaacgat attctggatg gctttgataa ccaggcgatt 2400
atggcgagca ccgtgcgcga tctgattgaa gtgctgcatg atcatgatct gccgtatagc 2460
gaagtgggcg cgattctgag cgcgctgagc ggccgcatgc cgagcaaact ggaagatagc 2520
attcgcgcgg cgctggatag cgcgaaagcg aaaggcgata cccaggattt tccggcggtg 2580
cgcattaaaa aactgctgga acattatgtg caggatcatg tgctgccgca ggatcgcacc 2640
atgtttcgcg cgcagctggg cgatctgttt gatgtggtgg aacgctttgc gagcggcctg 2700
aaaggccatg aaaccgaaac cattaccaac ctgctggaac gctatgaagc gaccgaaaaa 2760
ctgtttggcg gcagcattga agcgcgcgtg ctgaccctgc gcgatcagca taaagatgat 2820
ctgggcaaag tggtggcgct ggtgctgagc catattaaag tgcagagcaa agcgaaactg 2880
gtgatgaccc tgctggatca tgtgaaaaac ggcggcctga ccgtgagcga tccggaaagc 2940
cgcctgtatc aggtgctgca gagcctggcg gtgctggaag cgaaaagcag caccagcgtg 3000
agcctgaaag cgcgcgaagt gctgattttt ggccagatgc cgagctatga agaacgcatg 3060
gcgcagatgg aaagcgtgct gaaaaacagc gtgaccaacc agtattatgg cgaacagggc 3120
cgcggccgcc gcaccccgag cgcggaagtg ctgaaagaac tgagcgatag ccagtttacc 3180
gtgtatgatg tgctgccgac cttttttaac catccggatc cgatggtgac cctggcggcg 3240
tttgaagtgt atgtgcgccg cgcgtatcgc gcgtatagcg tgctgagcat tgattatgaa 3300
gaaggcgata ccctggatga tggcgaaatt ccgagcgtgc tgacctggcg ctttaacatt 3360
ggccagagcc atagcccgcc gagcaccccg cgcatggcgg cgtttggcga accgcgccgc 3420
agcggcagcg tgagcgatct gacctatctg attagcaaaa gccaggcgca gccgattcgc 3480
accggcgcga ttgcgagctt tccggatttt gcggcgctgg tgcgcggctt tggcaaagtg 3540
gcgagcatgc tgccgccgtt tgatgcggaa gaacataaag aacgccatgg caaagatgat 3600
cagccgccga acgtgattaa cattgcgctg cgcctgttta acaaagaaga tgatatgagc 3660
gaagatgatt ggtttgcgaa aattattccg tttattaacg gccagcgcga aaccctggcg 3720
cgccgcggcg tgcgccgcgt gagcgtgctg ctgtgccgcc agggccagta tccggtgtat 3780
gtgaccctgc gcgaagtgga tggcgtgtgg ggcgaagaac aggcgattcg caacattgaa 3840
ccggcgctgg cgtttcagat tgaactgagc cgcctgaaaa actatattct gaaaccggtg 3900
tttattgaaa gcaaacagat tcatatgtat catgcggtgg cgcgcgaaaa ccagctggat 3960
aaccgctttt ttgtgcgcgc gctggtgcgc ccgggccgcc tgcgcggcac catgagcacc 4020
gcggaatatc tgattagcga aaccgatcgc ctggtgacca gcgtgctgga tggcctggaa 4080
tttgtgagcg cgcagtatcg caacgcggat tgcaacaaca tttttattaa ctttgtgtat 4140
accctggcgg tgacctatga agatgtgctg gcggcgatta gcggctttat tgaacgccat 4200
ggcaaacgcc tgtggcgcct gcatgtgacc ggcagcgaaa ttcgcattgc gctggaagat 4260
gatgaaggca acgtgacccc gattcgctgc gtgattgaaa acgtgagcgg ctttattgtg 4320
aactatcatg cgtatcagga aattaccacc gataaaggca ccaccattct gaaaagcatt 4380
ggcgaaaaag gcccgctgca tctgcagccg gtgcatcagg cgtatccgac caaagaaagc 4440
ctgcagccga aacgctatca ggcgcatctg attggcacca cctatgtgta tgattttccg 4500
gatctgttta gcaaagcgct gcagaacgtg tgggcggcgg cgcgcaaaac cgatagcagc 4560
ctggtgccgc cgaaaagctt tctggaaagc aaagaactgg tgctggatga acatgatcag 4620
attaccgaag tggatcgcgc gccgggcaac aacacctttg gcatggtggc gtgggtgttt 4680
accatgaaaa ccccggaata tccgaacggc cgccgcgtgg tggcggtggc gaacgatatt 4740
acctttaaaa ttggcagctt tggcccgctg gaagatcagt ttttttatct ggtgacccag 4800
tatgcgcgcg aacatggcat tccgcgcatt tatctgagcg cgaacagcgg cgcgcgcctg 4860
ggcgtggcgg atgaagtggt gccgctgctg agcgcggcgt ggaacgatga tgcgcagccg 4920
gaaaaaggcg tgagctatct gtatctgacc catgaaaact ttctgaaact ggaagaaaaa 4980
ggcccgagcg tgaaaaccat tgaagtgcat gaaaacggcg aacgccgcca taaaattacc 5040
gatgtgattg gcctgcagga tggcctgggc gtggaaagcc tgaaaggcag cggcctgatt 5100
gcgggcgaaa ccagccgcgc gtatgatgat atttttacca ttaccctggt gaccgcgcgc 5160
agcgtgggca ttggcgcgta tctggtgcgc ctgggcgaac gcgcggtgca ggtggaaggc 5220
cagccgatta ttctgaccgg cgcgggcgcg ctgaacaaag tgctgggccg cgaagtgtat 5280
accagcaacc tgcagctggg cggcacccag attatgttta aaaacggcgt gagccatctg 5340
accgcgagca gcgatctgca gggcgcgacc cagattctgg aatggatgag ctatgtgccg 5400
gatgtgaaag atggcgcgat tccggtgcgc gaaaccccgg atagctggga tcgcgatatt 5460
ggctataccc cgccgaaagg cccgtatgat ccgcgctggt ttattgaagg caaagaagat 5520
gaaaccagca gcgaatggct gagcggcttt tttgataaag gcagctttca ggaaaccctg 5580
agcggctggg cgcagaccgt ggtggtgggc cgcgcgcgcc tgggcggcat tccgatgggc 5640
gtgattgcgg tggaaacccg caccattgaa cgcattgtgc cggcggatcc ggcgaacccg 5700
gcgagctttg aacagcatat tatggaagcg ggccaggtgt ggtatccgaa cagcgcgtat 5760
aaaaccgcgc aggcgatttt tgattttgaa cgcgaaggcc tgccgctgat tatttttgcg 5820
aactggcgcg gctttagcgg cggccagcag gatatgtatg atgaagtgct gaaacagggc 5880
agcaaaattg tggatggcct gagcagctat aaacagccga tttttgtgta tattgtgccg 5940
aacggcgaac tgcgcggcgg cgcgtgggtg gtgctggatc cgagcattaa caaagaacag 6000
atggaaatgt atgcggatgt ggatgcgcgc gcgggcgtgc tggaaccgga aggcattgtg 6060
gaaattaaaa tgcgccgcga taaactgctg ggcctgatgg aacgcctgga tgaaacctat 6120
gcgagcctga aacgcgatag caaagatggc ggcaaaaccc cggaagaacg cgcggcggcg 6180
aacgcggcgc tgagcagccg cgaaaaactg ctggcgccga cctataaaca gattgcgatt 6240
ctgtttgcgg atctgcatga tcgcaccggc cgcatggaag cgaaaggctg cgcgaaaccg 6300
gcggtgtgga aagatgcgcg ccgctttttt tattgggcgg tgcgcgcgcg cgtggcgcgc 6360
agcgcggcgc tgcgcgaact ggcggatgcg agcccgggcg cgacctatga atatcgcgcg 6420
cgcctgctgg ataccctggc gagcctggaa ccgaccaccc cgtatcgcca gatggcggaa 6480
aacctggaag atctggatct ggcgccgacc gtggtgcagc tgcgcgcgga tcatctgctg 6540
cgccgcctga tggaactggc gaaagaagat cgcaaagcga ccatgaacag cattatgcgc 6600
ctggcggata acatgagcgc ggatgaaaaa gcgagcctga ttggcgtgct gcagaccagc 6660
agccgcagcc cgggcccgcc gagctatgcg catagcagc 6699
＜210＞ 12
＜211＞6693 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞12
atgagcgaag aacatgcgaa agtggcgcat tttattggcg gcaacagcgt ggatcgcgcg 60
ccgccgggcc aggtgaaaga ttttgtggcg agccatggcg gccataccgt gattagcaaa 120
gtgctgattg cgaacaacgg cattgcggcg gtgaaagaaa ttcgcagcgt gcgccagtgg 180
agctatgaaa cctttggcag cgaacgcgcg attgaattta ccgtgatggc gaccccggaa 240
gatctgaaag tgaacgcgga ttatattcgc atggcggatc gctatattga agtgccgggc 300
ggcaccaaca acaacaacta tgcgaacgtg gatctgattg tggatgtggc ggaacgcgcg 360
ggcgtgcatg cggtgtgggc gggctggggc catgcgagcg aaaacccgcg cctgccggaa 420
agcctggcgg cgagcaaaca taaaattgtg tttattggcc cgccgggcag cgcgatgcgc 480
agcctgggcg ataaaattag cagcaccatt gtggcgcagc atgcgaaagt gccgaccatg 540
gcgtggagcg gcaccggcat tgcggatacc gtgatgagca gccagggcta tgtgaccgtg 600
ccggatgaag cgtatgcgcg cgcgtgcgtg accagctggg aagaaggcct ggatcgcgcg 660
aacaaaattg gctttccggt gatgattaaa gcgagcgaag gcggcggcgg caaaggcatt 720
cgcaaagtgg aaagcgcgca gggctttcag attgcgtata gcgcggtgtg cggcgaagtg 780
ccgggcagcc cggtgtttat tatgaaactg gcgggcaccg cgcgccatct ggaagtgcag 840
ctgctggcgg atcagtatgg caacggcatt agcatttttg gccgcgattg cagcgtgcag 900
cgccgccatc agaaaattat tgaagaagcg ccggtgacca ttgcgaaacc gcatcgcttt 960
gaagaaatgg aaaaagcggc ggtgcgcctg gcgaaactgg tgggctatgt gagcgcgggc 1020
accgtggaat atctgtatag cccggcggaa gatctgtttt attttctgga actgaacccg 1080
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cagctgcaga ttgcgatggg cctgccgctg catcgcatta aagatattcg ccatctgtat 1200
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aacaccaacg tgtggggcta ttttagcgtg ggcgcggcgg gcggcctgca tgaatttgcg 1440
gatagccagt ttggccatgt gtttgcgtat ggcgcggatc gcaacgaagc gcgcaaaaac 1500
atggtggtgg cgctgaaaga tctgaacatt cgcggcgatt ttcgccatac cgtggaatat 1560
cagattaaac tgctggaaac ccaggcgttt gaagataaca ccattaccac cggctggctg 1620
gataccctga ttcaggataa agtgaccgcg gaacgcccgg aaagcaccct ggcggtgatt 1680
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attctggaaa aaggccaggt gccgccgcgc gataccatta aaaccgtggc gatggtggaa 1800
tttatttatg aaggccagcg ctatagcttt accgcgaacc gcagcagcct gaccagctgg 1860
accctgtatc tgaacggcgg ccgcaccgaa gtgggcgcgc gcccgattgc gggcgatggc 1920
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aacgcgggcg aaccgtatgc ggatattgaa gtgatgaaaa tgtatatgcc gctgattgcg 2160
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attctgggca ttctgaccct ggatgatccg ggccgcgtga aacatgcgaa accgtatgaa 2280
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gatcgcgata ttgaaattct gagcaacatt ctggatggct ttgataacag cgcggtgatg 2400
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cgcggcgtga ttgaaaccac ccaggcgaaa agcgcggatt ttccggcgct gcgcattcgc 2580
aaatttattg atagctttct gaccgaaaac gtgaaaccgc aggatcgcac cacctttcgc 2640
acccagctgg gcagcctgat tgaagtggtg gataaatata aaaacggcac caaagtggcg 2700
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ctggtggaaa ttattcgcga tctggcgagc ctggatagcc gcagcaccac cgcggtgagc 3000
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gaaggcgatg gcgaagatga agcgccgagc gcgattacct ggcgctttaa actgggccag 3360
agcaacagcc cgccggtgac cccggcgatt accccgaaaa ccagcccgtt tgcggaaaaa 3420
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attcgcaccg gcgtgattag cgcgtttccg aacgcgaaag cgctgcgcga tggctttttt 3540
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ccgtgctttg tggaaaaccg ccagattcat atttatcatg cggtggcgcg cgaaaaccag 3960
tttgatagcc gcttttttgt gcgcgcgctg gtgcgcccgg gccgcctgcg cggcaccatg 4020
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ctggaaattg tgaccgcgca gcatcgcaac accgattgca accatattgc gctgaacttt 4140
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cgccatggca aacgcctgtg gcgcctgcat gtgaacggcg cggaaattcg cattgtgctg 4260
gaagatagcg atggcattgc gaccccgatt cgcgcggtga ttgaaaacgt gagcggcttt 4320
attattaaat atcatggcta tcaggaaatt accaccgaac gcggccagac cattctgaaa 4380
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tttccggatc tgtttcagaa aagcctgtat aacatttgga gcgatctgaa acagcgcgat 4560
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accctgtatg cgcgcgcgca tggcctgccg cgcgtgtatc tgagcgcgaa cagcggcgcg 4860
cgcattggca ttgcggaaga aaccctgggc ctgtttagcg tggcgtggaa cgtgccgggc 4920
catccggaaa aaggcattaa atatatttat ctgaccccgg aagcgaacga aaaactgaac 4980
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aaaattaccg atattattgg caaacaggat ggcctgggcg tggaaagcct gcgcggcagc 5100
ggcctgattg cgggcgaaac cagccgcgcg tatgatgata tttttaccat taccctggtg 5160
accgcgcgca gcgtgggcat tggcgcgtat ctggtgcgcc tgggccatcg cagcattcag 5220
gtggaaggcc agccgattat tctgaccggc gcgccggcgc tgaacaaagt gctgggccgc 5280
gaagtgtata ccagcaacct gcagctgggc ggcacccaga ttatgtataa aaacggcgtg 5340
agccatctgg tggcgagcag cgatctggat ggcaccacca aaattctgat gtggctgggc 5400
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cgcgatatta gctattatcc gccgaaagcg ccgtatgatc cgcgctggtt tctggcgggc 5520
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ccggtgggcg cgattgcggt ggaaacccgc accattgaaa aagtgattcc ggcggatccg 5700
gcgaacccgg cgagctttga acagcgcatt atggaagcgg gccaggtgtg gtatccgaac 5760
agcgcgtata aaaccgcgca ggcgattttt gattttcagc gcgaaggcct gccgctgatt 5820
atttttgcga actggcgcgg ctttagcggc ggccagcagg atatgtatga tgaagtgctg 5880
aaacagggca gcaaaattgt ggatggcctg agcagctatc gccagccggt gtatgtgtat 5940
attatgccga acggcgaact gcgcggcggc gcgtgggtgg tgctggatcc gagcattaac 6000
ccggatcata tggaaatgta tgcggatgtg gaaagccgcg cgggcgtgct ggaaccggaa 6060
ggcgtggtgg aaattaaaat tcgccgcgat aaaattctgg cgctgatgga tcgcctggat 6120
ccggattata gcgcgtttaa aaaagcgagc aaagatgcgg cgctgagcga acaggaacgc 6180
gcgcaggcgg cggaaaaact ggcggcgcgc gaaaaacatc tgcagccgac ctttcagcag 6240
ctggcgctgc tgtatgcgga tctgcatgat cgcgcgggcc gcatggaagc gaaaggctgc 6300
gcgaaaccga ccgtgtggac caacgcgcgc cgctattttt attgggcgct gcgcgcgaaa 6360
ctgctgcgcc tgaactttat taaccagatt attggcgcga gcccggcgac cacccgcgat 6420
gaagcggata aaattctgtt taccctgctg ccgccgaccc tgaacaccaa agatcatcgc 6480
gcggtggcgg atgcgctgga aaccattcgc attgaaccga ccctggtgga actgcgcagc 6540
gcggcgattg cgcagcagat tcgcgatctg ctgaccagcg ataaccgcaa agcgaccgtg 6600
accggcctga ttaacgtggt ggatagcctg aacgatgaag aaaaaattct gctgcaggcg 6660
gtgctgagcc gcagcggcct ggataccggc agc 6693
＜210＞ 13
＜211＞2418bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞13
atgattccac ttagtagaaa ttctgtctcc gttcacttag gtggtgtccc aagagatcct 60
ctgcatccaa ttactcttga ttacagctta aataacccct ttagctcact gtcattgttt 120
tggaactgta aacgtaaaaa atggaagatt tccacgacta tggcttccaa tatacgtaca 180
aacaattatc taagacacgt tgagagcatg aaactgatgc cttctggagc gggtcacata 240
agtcatctta atgctgtcat tttgggggac agtttagcta cagaggaaga tgacttcgtg 300
ttacctagtg aggattttgc aagccaggct aacgtacagt ccccagagca atacctgaag 360
atgtataaga gatccataga agaccctgca ggtttttggt ctgagattgc cgaagaattc 420
tactggaaac aaaaatgggg tcataaagtc tgcgatgaaa attttgacgt gcgtaagggt 480
aatatcaaaa ttgaaagact gatcgttgca gttagatgcg tcgtttgctt gttttccttg 540
gttgccttac tgcaatggtt caagggggga attactaata tttgctacaa ctgcttggat 600
agaaatgttg aagctggatt aggagataaa gttgcaattt actgggaggg taatgaacca 660
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tacctaaaag ataacggtgt caaaaagggt gatgcagtta taatctactt gcccatgcta 780
atggaactgc ccatagccat gcttgcctgt gctcgtattg gtgcagttca ttccgtggtc 840
tttgcagggt tcagtgctga agctttggcc caaagaataa tagattgtaa accaaaagtt 900
gtgataacct gcaacgctgt gaaaaggggc cccaaagtgt tgtatttgaa ggatattgtt 960
gacgttgcaa ttaaagattc cgctcaaaat ggagtatcca tcgacaagtg cctagtttat 1020
gagaattctt gggctacaaa acgtgaggac actaagtggg aggatggtag agacgtatgg 1080
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gaccctttgt ttttgttgta tacctccggc tccacgggta aacctaaggg agtgttacat 1200
actaccggtg gatatatggt ttatactgct actactttta agtacgcatt cgattataag 1260
cagtctgata tttactggta tcctttggag gcattttcat ctaatttatt cattttcgac 1320
atgttcctaa tgaatcttgt tcattataga tatatgaatg ccctgtattc cgactacagg 1380
tgtactgctg attgtggatg gataactggt cactcttatg ttacgtacgg tccaatgttg 1440
aatggtgcca gcgtcatcgt ttatgaaggt gcccctaact accctgactc tggaagatgt 1500
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tcactaatga gagatggaga cgaatttgtc actagacatt ctaggaagag tttgagagtt 1620
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tccagagaca aagatggtta tcattggtta accggcaggg tggacgatgt catcaatgtt 2040
tcaggtcata gaattggtac tgcagaagtt gaatctgcct tggtatctca cccaaaatgc 2100
gctgaagcag ccgttgtcgg agtagaacac gcagtaaaag gtcaagggat ttatgccttt 2160
gttacagtgg ttgacggtgt accatattca gaggaattaa ggaaagattt aatcttaatt 2220
gttagaaagc aaattggcgc ttttgctgca cctgataaaa tccattgggc tccaggtctt 2280
cctaaaacga gatccggaaa gatcatgagg cgtatattga gaaagatcgc atctcgtcag 2340
ttagatgaat taggagatac atccacgctt gcagatccaa atgtagtcaa tcaattgatc 2400
gagatagcgg acagttaa 2418
＜210＞ 14
＜211＞1380 bp
＜212＞ DNA
＜213＞ 人工合成
＜400＞14
atgagcctgg attgcggcaa cattagcgtg gattgcggca tgagcagctt tagcaccctg 60
ccgcgcaaat ggaaaatggg cctgattttt tatgcgcgca aaaccaacgg cctggcgctg 120
attctgctgc gcatgccgtt tccgggcaac tttctgagcg tgggcgtgca tggcaaactg 180
ggccgcccga gcgaagaaag cgcgctgtgg ttttttctgg tgttttgcga taacgtggtg 240
ctgattgata aaacctgggg cggcgtgaac gataaactgg aagtgtggat tcagccgctg 300
gaaagcaaac gctttcgcct gagccgcacc aaaaccgaat atctggaatg caaatttaac 360
gaactgaccc tggaaaccga tgtggtggtg aaactggata gccaggtgat tcgcaaaggc 420
gatagcttta aatatctggt gtatggcccg agcaaaagct ataaagtgac cgatcgcccg 480
accatgctgt atggcgcgga atgctgggtg atgaaaaaca gccatattca gaaactgaaa 540
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＜210＞ 15
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＜213＞ 人工合成
＜400＞15
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catccgggcg cgttttgggc ggaactggcg tatgaaaact atagctggga aaaccgcgat 360
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ctggcgaacc atctgattta tgtgtgcaac gtgaaaccgg gcgatgtggt ggtgtgctat 660
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cataacgtgg tgtttgcggg ctatagcgcg gaagcgctgg cgaaacgcat tattgatagc 780
gaagcgaaag tgctggtgag cgcggcgatg agctatcgcg gcggcaaagc gattgaactg 840
tttaaaattg tggcggaagc ggaaaaaatt tgcgaaattc agggccatcg cattgaagaa 900
cgcgtgtgcc attttaacct gccgggcagc gaaccgcata ccgattggcc gaaagaaaaa 960
gcggaaattc tggcggcgta taaacagcgc catggcggca acgaaatgag cccggcgtgg 1020
accgatgcgc cgcatggcat tatgcgcccg tattatggcc tgtgcctgct ggaaagcttt 1080
gatctggcgc tggatgaaca ggaaagccgc ccgccgccgg tgaccatttg gcgcgatgcg 1140
gaagatccgg cgtttattct gtataccagc ggcagcaccg gcgcgccgaa aggcgtggtg 1200
catgtgattg gcggctatat ggtgcatgtg ggcgaaacca tgaaagaagc gtttaacgtg 1260
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ctggtgtatg gcccgctgct gaacggctgc accagcattc tgtatgaagg caaaccggat 1380
tatccgaacg cgagccgcct gtgggaaatt tgcgataaat atcgcgcgaa agtgctgtat 1440
accgcgccga ccgtgattcg cagcctgaaa aaacagggcg atgaatgggt gaccaaaacc 1500
aaacgcgata gcctggaaat tctgggcacc gtgggcgaac cgattggcga aagcgcgtgg 1560
acctggtttc atgatgtggt gggcgaaggc aaactgccga ttgtggatac ctggtggcag 1620
accgaaaccg gcggccatgt gattctgagc ctgccgaacg tgggcgaaca gaaaccgggc 1680
cgctgcggcc tgccgtttta tggctgcatt ccggcgattc tggatccgca gaccggcaaa 1740
gaactggatg gcccgaacgt ggaaggcctg ctggcgctga aaccgccggc gctgccgggc 1800
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accggccgcg tggatgatgt gattaactgc agcggccatc gcattggcac cgcggaagtg 1980
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ctgatggata cctgcgcgaa agaaattggc agctttgcga aaccgaccgg cggcattctg 2220
ctgctgcagc cgggcaccgg cattccgaaa acccgcagcg gcaaactggt gcgccgcgtg 2280
ctgcgcaaaa ttgcgaaagg cgatctgacc ggcgattttg gcgatctgag cgcggtggcg 2340
aacccggaaa gcattcagtg cattattcag gcgaaaaaaa aagcgaacga agcggaaaac 2400
＜210＞ 16
＜211＞693
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞16
MAPRPTSQSQ ARTCPTTQVT QVDIVEKMLA APTDSTLELD GYSLNLGDVV SAARKGRPVR 60
VKDSDEIRSK IDKSVEFLRS QLSMSVYGVT TGFGGSADTR TEDAISLQKA LLEHQLCGVL 120
PSSFDSFRLG RGLENSLPLE VVRGAMTIRV NSLTRGHSAV RLVVLEALTN FLNHGITPIV 180
PLRGTISASG DLSPLSYIAA AISGHPDSKV HVVHEGKEKI LYAREAMALF NLEPVVLGPK 240
EGLGLVNGTA VSASMATLAL HDAHMLSLLS QSLTAMTVEA MVGHAGSFHP FLHDVTRPHP 300
TQIEVAGNIR KLLEGSRFAV HHEEEVKVKD DEGILRQDRY PLRTSPQWLG PLVSDLIHAH 360
AVLTIEAGQS TTDNPLIDVE NKTSHHGGNF QAAAVANTME KTRLGLAQIG KLNFTQLTEM 420
LNAGMNRGLP SCLAAEDPSL SYHCKGLDIA AAAYTSELGH LANPVTTHVQ PAEMANQAVN 480
SLALISARRT TESNDVLSLL LATHLYCVLQ AIDLRAIEFE FKKQFGPAIV SLIDQHFGSA 540
MTGSNLRDEL VEKVNKTLAK RLEQTNSYDL VPRWHDAFSF AAGTVVEVLS STSLSLAAVN 600
AWKVAAAESA ISLTRQVRET FWSAASTSSP ALSYLSPRTQ ILYAFVREEL GVKARRGDVF 660
LGKQEVTIGS NVSKIYEAIK SGRINNVLLK MLA 693
＜210＞ 17
＜211＞562
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞17
MITLAPSLDT PKTDQNQVSD PQTSHVFKSK LPDIPISNHL PLHSYCFQNL SQFAHRPCLI 60
VGPASKTFTY ADTHLISSKI AAGLSNLGIL KGDVVMILLQ NSADFVFSFL AISMIGAVAT 120
TASPFYTAPE IFKQFTVSKE KLVITQAMYV DKLRNHDGAK LGEDFKVVTV DDPPENCLHF 180
SVLSEANESD VPEVEIHPDD AVAMPFSSGT TGLPKGVILT HKSLTTSVAQ KIDGENPNLY 240
LTTEDVLLCV LPLFHIFSLN SVLLCALRAG SAVLLMQKFE IGTLLELIQR HRVSVAMVVP 300
PLVLALAKNP MVADFDLSSI RLVLSGAAPL GKELEEALRN RMPQAVLGQG YGMTEAGPVL 360
SMCLGFAKQP FQTKSGSCGT VVRNAELKVV DPETGRSLGY NQPGEICIRG QQIMKGYLND 420
EAATASTIDS EGWLHTGDVG YVDDDDEIFI VDRVKELIKY KGFQVPPAEL EGLLVSHPSI 480
ADAAVVPQKD VAAGEVPVAF VVRSNGFDLT EEAVKEFIAK QVVFYKRLHK VYFVHAIPKS 540
PSGKILRKDL RAKLETAATQ TP 562
＜210＞ 18
＜211＞389
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞18
MVSVSGIRKV QRAEGPATVL AIGTANPPNC VDQSTYADYY FRVTNSEHMT DLKKKFQRIC 60
ERTQIKNRHM YLTEEILKEN PNMCAYKAPS LDAREDMMIR EVPRVGKEAA TKAIKEWGQP 120
MSKITHLIFC TTSGVALPGV DYELIVLLGL DPSVKRYMMY HQGCFAGGTV LRLAKDLAEN 180
NKDARVLIVC SENTSVTFRG PSETDMDSLV GQALFADGAA AIIIGSDPVP EVENPLFEIV 240
STDQQLVPNS HGAIGGLLRE VGLTFYLNKS VPDIISQNIN DALSKAFDPL GISDYNSIFW 300
IAHPGGRAIL DQVEEKVNLK PEKMKATRDV LSNYGNMSSA CVFFIMDLMR KKSLEAGLKT 360
TGEGLDWGVL FGFGPGLTIE TVVLRSMAI 389
＜210＞ 19
＜211＞533
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞19
MPHAHPADID GHHLTPDTVA AIARGQRAAI VTEPVLGKVA DARARFEQVA AANVPIYGVS 60
TGFGELVHNW VDIEHGRALQ ENLLRSHCAG VGPLFSRDEV RAMMVARANA LARGYSAVRP 120
AVIEQLLKYL EAGITPAVPQ VGSLGASGDL APLSHVAITL IGEGKVLTDD GGTAPTAEVL 180
RERGITPLAL AYKEGLALIN GTSAMTGVSC LLLETLRAQV RQAEIIAALA LEGLSASADA 240
FMAHGHDIAK PHPGQIRSAA NMRALLADSA RLSGHGELSA EMKTRAGEAK NTGTGVFIQK 300
AYTLRCIPQV LGAVRDTLDH CATVVERELN SSNDNPLFFE DGELFHGGNF HGQQVAFAMD 360
FLAIAATQLG VVSERRLNRL LSPHLNNNLP AFLAAANEGL SCGFAGAQYP ATALIAENRT 420
ICSPASIQSV PSNGDNQDVV SMGLIAARNA RRILDNNQYI LALELLASCQ AAELAGAVEQ 480
LAPAGRAVFA FVRERVPFLS IDRYMTDDIE AMAALLRQGA LVEVVRGAGI ELA 533
＜210＞ 20
＜211＞539
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞20
MAPQEQAVSQ VMEKQSNNNN SDVIFRSKLP DIYIPNHLSL HDYIFQNISE FATKPCLING 60
PTGHVYTYSD VHVISRQIAA NFHKLGVNQN DVVMLLLPNC PEFVLSFLAA SFRGATATAA 120
NPFFTPAEIA KQAKASNTKL IITEARYVDK IKPLQNDDGV VIVCIDDNES VPIPEGCLRF 180
TELTQSTTEA SEVIDSVEIS PDDVVALPYS SGTTGLPKGV MLTHKGLVTS VAQQVDGENP 240
NLYFHSDDVI LCVLPMFHIY ALNSIMLCGL RVGAAILIMP KFEINLLLEL IQRCKVTVAP 300
MVPPIVLAIA KSSETEKYDL SSIRVVKSGA APLGKELEDA VNAKFPNAKL GQGYGMTEAG 360
PVLAMSLGFA KEPFPVKSGA CGTVVRNAEM KIVDPDTGDS LSRNQPGEIC IRGHQIMKGY 420
LNNPAATAET IDKDGWLHTG DIGLIDDDDE LFIVDRLKEL IKYKGFQVAP AELEALLIGH 480
PDITDVAVVA MKEEAAGEVP VAFVVKSKDS ELSEDDVKQF VSKQVKSCVL QENQQSVLH 539
＜210＞ 21
＜211＞392
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞21
MASVEEFRNA QRAKGPATIL AIGTATPDHC VYQSDYADYY FRVTKSEHMT ELKKKFNRIC 60
DKSMIKKRYI HLTEEMLEEH PNIGAYMAPS LNIRQEIITA EVPRLGRDAA LKALKEWGQP 120
KSKITHLVFC TTSGVEMPGA DYKLANLLGL ETSVRRVMLY HQGCYAGGTV LRTAKDLAEN 180
NAGARVLVVC SEITVVTFRG PSEDALDSLV GQALFGDGSS AVIVGSDPDV SIERPLFQLV 240
SAAQTFIPNS AGAIAGNLRE VGLTFHLWPN VPTLISENIE KCLTQAFDPL GISDWNSLFW 300
IAHPGGPAIL DAVEAKLNLE KKKLEATRHV LSEYGNMSSA CVLFILDEMR KKSLKGENAT 360
TGEGLDWGVL FGFGPGLTIE TVVLHSIPTV TN 392
＜210＞ 22
＜211＞536
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞15
MTTTVSTTTE SIAFDGENLA IEDVRRIAEH YVPCSVTPEV LTKAAASRQQ FEDIVRDGAA 60
VYGVTTGYGE MIYMQVDPSK EVELQTNLIR SHSAGVGPLF AEDEARAILA ARLNALSRGY 120
SAVRPEILER LALYLNLGIT PAIPEIGSLG ASGDLATLSH IACTVIGEGY VLRDGKRVPT 180
GEVLRERGIE PLEMRFKEGL ALINGTSGMT GLGSLVVGRA LDQLHQSEIV SALLLETLRC 240
STSPFLAEGH ELARPHRGQI DSAANLRTLL ADSRLAVSHS DLRAEYQSKK SGDDVTRTDV 300
YLQKAYSLRA IPQVLGAVRD TLRHAEGTLN TELNSATDNP LFFPGKEVFH GGNYHGQPVA 360
FAMDFTTIAL TQLGVLSERQ SNRLFNRHLS YGLPEFLVAG EPGLNSGFAG AQYPATALIA 420
ENRTIGPAST QSVPSNGDNQ DIVSMGLISA RNARRVLSNN TKILAVEYLA AAQAVDLTGR 480
YEGLSTAGKA TYEKVRSLAP TLDHDRYMSD EIETVAGAVA RGEFLTTVRS AGIQLR 536
＜210＞ 23
＜211＞547
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞23
MPMETTTETK QSGDLIFRSK LPDIYIPKHL PLHSYCFENI SEFSSRPCLI NGANDQIYTY 60
AEVELTCRKV AVGLNKLGIQ QKDTIMILLP NSPEFVFAFM GASYLGAIST MANPLFTPAE 120
VVKQAKASSA KIIITQSCFV GKVKDYASEN DVKVICIDSA PEGCLHFSEL TQSDEHEIPE 180
VKIQPDDVVA LPYSSGTTGL PKGVMLTHKG LVTSVAQQVD GENANLYMHS EDVLMCVLPL 240
FHIYSLNSIL LCGLRVGAAI LIMQKFDIAP FLELIQKYKV SIGPFVPPIV LAIAKSPIVD 300
SYDLSSVRTV MSGAAPLGKE LEDAVRTKFP NAKLGQGYGM TEAGPVLAMC LAFAKEPFDI 360
KSGACGTVVR NAEMKIVDPD TGCSLPRNQP GEICIRGDQI MKGYLNDPEA TTRTIDKEGW 420
LHTGDIGFID EDDELFIVDR LKELIKYKGF QVAPAEIEAL LLNHPNISDA AVVPMKDEQA 480
GEVPVAFVVR SNGSAITEDE VKDFISKQVI FYKRVKRVFF VETVPKSPSG KILRKDLRAR 540
LAAGVPN 547
＜210＞ 24
＜211＞388
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞24
MAASTDEMTK ALTAATVLAI GTANPPNCYY QADFPDFYFR ATNSDHLTHL KHKFKRICEK 60
SMIEKRYLQL TEDILKENPN IGAYEAPSLD VRHEIQVKGV AQLGKEAALK AMQEWGQPKS 120
KITHLIVCCI AGVDMPGANY QLTKLLDLNS SVKRFMFYHL GCYAGGTVLR LAKDIAENNK 180
GARVLIVCSE MTPICFRGPS ETHIDSMVGQ AIFGDGAAAV IVGANPDLTV EEPIFELIST 240
AQTIIPESDG AIEGHLLEVG LSFQLYQNVP ALISNSIGTC LSEAFTPLNI SNWNSLFWIA 300
HPGGPAILDH VEATVGLNKE KLKATRQVLN DYGNMSSACV FFIMDEMRKK SLENGHATTG 360
EGLQWGVLFG FGPGITVETV VLRSVPII 388
＜210＞ 25
＜211＞30bp
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞25
ccccacgtga tggcccctag acctacctct 30
＜210＞ 26
＜211＞ 45bp
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞26
cggggtacct taagccaaca tcttaagtaa gacgttgtta atacg 45
＜210＞ 27
＜211＞26bp
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞27
ccccacgtga tgcctcatgc ccaccc 26
＜210＞ 28
＜211＞33bp
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞28
cggggtacct taagccagtt caattccagc acc 33
＜210＞ 29
＜211＞36bp
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞29
ccccacgtga tgactaccac cgtttcaact actacc 36
＜210＞ 30
＜211＞35bp
＜212＞ PRT
＜213＞ 人工合成
＜400＞30
cggggtacct tacctcagct gaatacctgc tgatc 35
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
ccccacgtga tgattacact ggccccatct ct 32
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
cggggtacct tatggggttt gtgttgctgc tg 32
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
ccccacgtga tggcgccaca agaacaagc 29
<210> 34
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
cggggtacct taatgcagaa cggattgttg attctcttg 39
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
ccccacgtga tgcctatgga gacaactact gaaacc 36
<210> 36
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
cggggtacct taatttggta ctccggctgc tagt 34
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
ccccacgtga tggtctccgt atctggcatt ag 32
<210> 38
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
cggggtacct taaatagcca ttgatcttaa gacgactgtt tcg 43
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
ccccacgtga tggcttcagt tgaagagttt cgtaac 36
<210> 40
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
cggggtacct taattggtaa ctgtagggat tgagtgtagt act 43
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
ccccacgtga tggcagcttc aactgacgaa atg 33
<210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
cggggtacct taaattattg gaacagatct taagacgaca gtttcaac 48
<210> 43
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
cgcgcgaggc agcagatcca ctagtagaga ccgggttggc ggc 43
<210> 44
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
tcagcatgca cgcgtatcga taagctagct tgcaaattaa agccttcgag cgtcccaa 58
<210> 45
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt tgcaagctag cttatcgata cgcgtgca 58
<210> 46
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
tttaccgcag cagatccgcg gctatttaca acaatatctg gtcaaatttc agtttcgt 58
<210> 47
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
ccccacgtga tgtctgttga aacaagaaaa ataaccaaag tgc 43
<210> 48
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
cggggtacct tatttgattt ccaataaaac cactcctttg ttaacag 47
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
ccccacgtga tgagcgcgta tgatcat 27
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 50
cggggtaccg ctgctatgcg catagct 27
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
ccccacgtga tgagcgaaga acatgcg 27
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 52
cggggtaccg ctgccggtat ccagg 25
<210> 53
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 53
ccccacgtga tgtctgttga aacaagaaaa ataaccaaag tgc 43
<210> 54
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 54
gaaccacctc cacctttgat ttccaataaa accactcctt tgttaacag 49
<210> 55
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 55
attggaaatc aaaggtggag gtggttccat gattccactt agtagaaatt ctg 53
<210> 56
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 56
cggggtacct taactgtccg ctatctcgat caattgat 38
<210> 57
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 57
attggaaatc aaaggtggag gtggttccat gagcctggat tgcg 44
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 58
cggggtaccg caatccgcca gcgcaat 27
<210> 59
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 59
attggaaatc aaaggtggag gtggttccat gaccctgatg ctgccg 46
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 60
cggggtaccg ttttccgctt cgttcgc 27

Claims (10)

1.以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)利用酶切方法对质粒载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；
(2)利用特异性引物分别对L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶基因进行PCR扩增，回收得到目的片段；
(3)利用DNA连接酶将所述含有L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶编码基因的目的片段与所述线性化载体进行连接、转化，得到重组表达质粒载体-TAL、质粒载体-4CL、质粒载体-STS；
(4)利用前述重组表达质粒载体-TAL、质粒载体-4CL、质粒载体-STS构建重组质粒-TAL-4CL-STS；
(5)将重组质粒-TAL-4CL-STS经酶切，线性化后利用转入解脂耶氏酵母Po1f中，培养挑取阳性转化子，获得能够产生白藜芦醇的初始工程菌。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(4)所述的构建重组质粒TAL-4CL-STS的具体步骤为：
分别使用特异性引物扩增hp4d-4CL-XPR2、hp4d-STS-XPR2表达框，并使用Overlap PCR连接，扩增得到hp4d-4CL-XPR2-hp4d-STS-XPR2双重表达框，通过无缝克隆插入线性化质粒pINA1269-TAL，最终得到重组质粒TAL-4CL-STS；
或分别使用特异性引物扩增hp4d-4CL-XPR2、hp4d-TAL-XPR2表达框，并使用OverlapPCR连接，扩增得到hp4d-4CL-XPR2-hp4d-TAL-XPR2双重表达框，通过无缝克隆插入线性化质粒pINA1269-STS，最终得到重组质粒pINA1269-TAL-4CL-STS；
或分别使用特异性引物扩增hp4d-TAL-XPR2、hp4d-STS-XPR2表达框，并使用OverlapPCR连接，扩增得到hp4d-TAL-XPR2-hp4d-STS-XPR2双重表达框，通过无缝克隆插入线性化质粒pINA1269-4CL，最终得到重组质粒pINA1269-TAL-4CL-STS。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：还包括：
(6)以人工合成的ACC基因为模板，使用特异性引物进行扩增，酶切连接后构建得到重组质粒-ACC；
或以人工合成的ACC、ACS基因为模板，使用Overlap PCR扩增得到融合基因：ACC-ACS酶切连接后构建得到重组质粒-ACC-ACS；
(7)将重组质粒质粒-ACC或-ACC-ACS用限制性内切酶酶切，线性化后转化入前述能够产生白藜芦醇的初始工程菌，培养挑取阳性转化子，获得能够生成白藜芦醇的工程菌株。
4.一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌，过表达L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶，同时过表达乙酰辅酶A羧化酶基因，或过表达乙酰辅酶A羧化酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述过表达L-酪氨酸氨解酶、对香豆酰基辅酶A连接酶和白藜芦醇合成酶的方法是将所述L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶基因全部置于表达质粒的启动子之后进行表达，所述L-酪氨酸氨解酶基因、白藜芦醇合成酶基因序列和对香豆酰基辅酶A连接酶基因通过整合型质粒在解脂耶氏酵母中进行共表达，所述L-酪氨酸氨解酶基因、香豆酰基辅酶A连接酶和藜芦醇合成酶在工程菌株中通过hp4d启动子启动转录。
6.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述L-酪氨酸氨解酶基因、对香豆酰基辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合成酶来源于异源酶，所述L-酪氨酸氨解酶基因来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(RgTAL)，核苷酸序列如SEQ ID No.1所述；铜锈菌(Cupriavidus metallidurans)(CmTAL)，核苷酸序列如SEQ ID No.4所述；白色链霉菌(Streptomyces albulus)(SaTAL)，核苷酸序列如SEQ ID No.7所述；
所述4-香豆酰辅酶A连接酶基因来源于大豆(Glycine max)(Gm4CL)，核苷酸序列如SEQID No.2所述；拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At4CL)，核苷酸序列如SEQ ID No.5所述；烟草(Nicotiana tabacum)(Nt4CL)，核苷酸序列如SEQ ID No.8所述；
所述白藜芦醇合酶基因来源于花生(Arachis hypogaea)(AhSTS)，核苷酸序列如SEQID No.3所述；葡萄(Vitis vinifera)(VvSTS)，核苷酸序列如SEQ ID No.6所述；虎杖(Polygonum cuspidatum)(PcSTS)，核苷酸序列如SEQ ID No.9所述。
7.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于：所述异源乙酰辅酶A羧化酶基因来源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(CgACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.10所述；蜜环菌(Armillaria solidipes)(AsACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.11所述；鸡油菌(Cantharellus anzutake)(CaACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.12所述；优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(CgACC)，核苷酸序列如SEQ ID No.10所述。
所述异源乙酰辅酶A合成酶基因来源于小豆(Vigna angularis)(VaACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.13所述；辣椒(Capsicum annuum)(CaACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.14所述；蓝球藻(Bathycoccus prasinos)(BpACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.15所述，优选为小豆(Vigna angularis)(VaACS)，核苷酸序列如SEQ ID No.13所述。
8.权利要求1所述的一种以L-酪氨酸为底物生物合成白藜芦醇的工程菌株在白藜芦醇生物合成中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，包括以下步骤：
(1)将工程菌在YPD培养基中培养10-15h，得到种子液，所述种子液的OD600＝5-10；
(2)将所述的种子液接入到YPD培养基中，进行发酵培养；
(3)发酵一定时间后添加诱导剂进行诱导表达，诱导至一定时间后，添加底物L-酪氨酸进行生物转化，合成白藜芦醇。
10.根据权利要求8所述的应用，所述YPD培养基(质量百分比)为20g/L葡萄糖为碳源，含酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L；所述种子液的培养条件为28-40℃，160-230rpm；所述种子液接入YPD培养基的比例为1％-2％；底物L-酪氨酸的浓度为5-30g/L。
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