KR20090034375A - 재조합 단백질을 제조하기 위한 고세포 밀도 반회분식 발효방법 - Google Patents

재조합 단백질을 제조하기 위한 고세포 밀도 반회분식 발효방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 단백질 수율을 향상시키기 위해, 역치 파라미터에 도달한 후 유도 물질을 연속적으로 첨가하고, 경우에 따라 탄소원을, 예를 들어 등속 공급으로 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 반회분식 발효를 이용하여, 단백질, 예를 들어 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질을 제조하는 방법과, 고밀도 단백질 조성물 및 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

재조합 단백질을 제조하기 위한 고세포 밀도 반회분식 발효 방법{HIGH-CELL DENSITY FED-BATCH FERMENTATION PROCESS FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEIN}
관련 출원
본 출원은 2006년 7월 27일에 출원된 미국 가특허 출원 제60/833,479호(발명의 명칭: 재조합 단백질을 제조하기 위한 고세포 밀도 반회분식 발효 방법)를 기초로 우선권을 주장하며, 상기 가특허 출원의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 출원은 일반적으로 박테리아 시스템에서의 단백질 발현을 개선시키는 신규한 반회분식 발효 방법과, 고밀도 단백질 조성물 및 상기 신규한 반회분식 발효 방법에 사용되는 조성물에 관한 것이다.
실험실, 임상적 또는 상업적 사용을 위해 충분한 양의 단백질을 제조하기 위해서 다양한 발효 방법들이 이용되어 왔다. 단순한 회분식 발효 방법으로 얻을 수 있는 것에 비해 단백질 수율을 증가시키기 위해 반회분식 발효가 이용되고 있다. 반회분식 발효는, 초기 회분 단계 후, 배양물에 1종 이상의 영양물을 공급하는 단계가 행해지는 공정이다.
일반적으로, 회분 단계 동안에는, 세포가 처음에는 원하는 농도까지 성장한다. 이 단계에서, 세포 성장은 증폭되지만, 일반적으로 프로모터에 따라 아라비노스, 락토스 또는 이소프로필베타-D-티오갈락토시드(IPTG)와 같은 유도 물질(inducer)을 첨가하거나 약간의 프로모터 누출(promoter leakage)이 있지 않다면 목적 단백질이 생산되지 않는다. 공급 단계 동안에는, 통상적으로 탄소원 및 기타 요구 물질이 비교적 농축된 액체 스트림으로서 특정 공급 속도로 발효기에 공급된다. 일단 목적 세포 밀도에 도달하게 되면, 유도 물질 또는 유도 물질과 기타 영양물의 공급이 시작된다. 이 단계에서, 성장한 세포에 의한 단백질 생산이 현저해진다. 발효기에 공급되는 기질(즉, 영양물 및 유도 물질)은 이 단계에서 일반적으로 세포 성장 및 생성물 합성에 이용된다. 세포 성장은 최적 세포 성장 및 단백질 생산을 달성할 수 있도록 공급 속도에 의해 제어된다. 단백질 생산 단계에서는, 재조합 생물체를 위해 유도 물질이 첨가되어야 한다.
글루코스와 같은 통상의 탄소원 또는 그 밖의 당계(sugar based) 탄소원 및 유도 물질을 포함하는 배지에서의 단백질 발현은 공급 단계 종반에 제한 조건이 발생하기 전까지는 만족스럽다. 제한 조건의 예로는 배양 배지 중의 산소 농도 감소, 비타민, 탄소, 질소와 같은 영양물의 감소 및 독성 화합물의 축적을 들 수 있다.
반회분식 발효 방법은 대개 영양물 공급을 제어하기 위해 간접 및 직접 피드백을 비롯한 여러 가지 형태의 피드백 제어를 이용한다. 이같은 반회분식 발효 방법 중 하나는 정해진 설정 포인트에서 공정 파라미터를 제어하기 위해 영양물을 공급함으로써 피드백 제어 알고리즘을 이용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 공급의 직접 제어는 영양물 농도의 측정에 기초할 수 있다. 그 후 피드백 제어는 발효 전반에 있어서 세포 활성과 직접적으로 관련된다. 발효의 피드백 제어에 이용되어 왔던 제어 파라미터로는 pH 값, 온라인 측정 세포 밀도 또는 용존 산소 분압(dissolved oxygen tension; DOT)을 들 수 있다.
그러나, 피드백 알고리즘의 적용에는 수많은 단점들이 수반된다. 그러한 단점 중 하나는 공급 속도가 그 당시의(current) 공정 파라미터에 좌우된다는 것이다. 공정에 가해진 임의의 교란 요인은 파라미터에 악영향을 미쳐 공급 속도 및 최종 단백질 수율을 불안정하게 한다. 이러한 단점들은 단백질 생산량을 늘리기 위해 공정 규모를 확장함에 따라 확대된다.
종래에 이용되었던 반회분식 방법의 또 다른 단점은, 피드백 제어를 이용할 때 비성장 속도를 정확히 사전 설정 또는 제어할 수 없어서, 생성물 형성이 성장에 좌우되는 공정에서 최적에 못미치는 수율이 얻어진다는 것이다.
또한, 중추 대사 경로로의 탄소 흐름(예를 들어, 고글루코스 농도)이 트리카복실산(TCA) 사이클의 최대 용량을 초과할 경우, 부산물이 축적될 수 있다. 부산물의 축적은 발효 과정에서 세포 성장 및 단백질 생산을 억제할 수 있다.
게다가, 반회분식 발효 방법의 다양한 결점들은 종종 영양 성분의 비효율적인 사용을 초래한다. 따라서, 이 방법은 특히 대규모의 상업적 단백질 생산에 있어서 경제적으로 불리할 수 있다.
전술한 바와 같이, 반회분식 발효를 통해 재조합 단백질을 발현시키는 종래의 접근법은 다양한 결점들을 가지고 있다. 다양한 목적을 위해 충분한 양의 단백 질을 비용 효율적으로 생산하는 것의 중요성을 고려할 때, 세포 성장을 증대시키고 단백질 형성을 증가시키며(즉, 단백질 수율을 높임) 부산물 축적을 감소시키는 효율적인 반회분식 발효 방법이 요구되고 있다.
[발명의 개요]
본 발명은 예상외로 고수율로 재조합 단백질을 생산하는 신규한 반회분식 발효 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태는, 재조합 박테리아 세포를 포함하는 배양물에 탄소원을 연속적으로 첨가하고 이 배양물이 역치 파라미터(threshold parameter)에 도달한 후에 이 배양물에 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는, 재조합 박테리아 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 세포 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 (a) 유도성 프로모터 제어하에 재조합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 박테리아 숙주 세포에 도입하여 재조합 박테리아 세포를 형성하는 단계; (b) 상기 재조합 박테리아 세포를 배양 배지에 도입하여 세포 배양물을 형성하는 단계; (c) 상기 세포 배양물에 탄소원을 연속 공급물로서 첨가하는 단계; (d) 역치 흡광도(OD600) 도달에 대해 상기 세포 배양물 중의 세포 성장을 모니터하는 단계; (e) 역치 흡광도(OD600)에 도달하게 되면, 상기 세포 배양물에 상기 유도성 프로모터의 유도 물질을 연속 공급물로서 첨가하는 단계; 및 (f) 상기 세포 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 재조합 박테리아 세포를 포함하는 배양물이 역치 파라미터에 도달한 후에 상기 배양물에 유도 물질을 연속적으로 첨가함으로써, 재조합 박테리아 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하며, 상기 박테리아 세포는 네이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 혈청군 B의 유전자에 해당하는 핵산 서열을 포함하는 것인 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 재조합 2086 단백질(rP2086)의 제조 방법으로서, (a) 유도성 프로모터 제어하에 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 박테리아 숙주 세포에 도입하여 재조합 박테리아 세포를 형성하는 단계; (b) 상기 재조합 박테리아 세포를 배양 배지에 첨가하여 배양물을 형성하는 단계; (c) 상기 배양물에 탄소원을 첨가하는 단계; (d) 역치 흡광도(OD) 도달에 대해 상기 배양물 중의 세포 성장을 모니터하는 단계; (e) 상기 배양물의 세포 밀도가 흡광도 약 70∼110에 도달하게 되면, 상기 배양물에 상기 유도성 프로모터의 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 단계; 및 (f) 상기 유도 물질의 연속적 첨가를 개시한 지 약 3 시간∼약 6 시간 후 상기 배양물로부터 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 박테리아 배양물의 총 부피를 기준으로 약 1.5 g/L 이상의 밀도로 재조합 2086 단백질(rP2086)을 포함하는 박테리아 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질(rP2086)을 포함하는 박테리아 배양 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
[도면의 간단한 설명]
도 1: 유도 없이 다양한 일정한 공급 속도에서의 반회분식 발효.
도 2: 유도 없이 다양한 일정한 공급 속도에서의 반회분식 발효.
도 3: 다양한 흡광도에서의 유도.
도 4: 다양한 아라비노스 농도를 이용한 유도.
도 5: 아라비노스 첨가 방법이 rLP2086 수율에 미치는 효과.
도 6: 아라비노스 공급 속도가 rLP2086 생산에 미치는 효과.
도 7: 유도 시간이 발현에 미치는 효과.
도 8: 서브패밀리 B rLP2086 생산에 대한 반회분식 발효.
도 9a 및 9b: 각각 rLP2086 서브패밀리 B 유도에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯.
도 10: 서브패밀리 A rLP2086 생산에 대한 반회분식 발효.
도 11a 및 11b: 각각 rLP2086 서브패밀리 A 유도에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯.
도 12a, 12b 및 12c: 유도 중 글루코스와 아라비노스의 이중 공급.
도 13a: 100 L 규모에서의 rLP2086 서브패밀리 B 이 콜라이(E. coli) 반회분식 발효.
도 13b: 100 L 규모에서의 rLP2086 서브패밀리 A 이 콜라이 반회분식 발효.
도 14a: 100 L 규모에서 글루코스와 아라비노스의 이중 공급을 이용한 rLP2086 서브패밀리 B 이 콜라이 반회분식 발효.
도 14b: 100 L 규모에서 글루코스와 아라비노스의 이중 공급을 이용한 rLP2086 서브패밀리 A 이 콜라이 반회분식 발효.
[상세한 설명]
본 발명의 방법은 유도시 배양 배지에 유도 물질을 연속적으로 공급하는 것을 이용한 반회분식 발효에 의해 예상외로 단백질 수율을 높일 수 있다는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 경우에 따라, 유도 물질을 연속적으로 공급하기 전 및/또는 중에 탄소원을 연속적으로 공급한다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 아라비노스에 의해 유도될 경우, 약 2∼3 g/L의 재조합 2086 지단백질(rLP2086)(이것은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B의 2086 유전자에 해당하는 서열을 갖는 미생물에 의해 발현됨)이 생산되었다. 이것은 2086 단백질의 서브패밀리 A 및 B 둘 다에 있어서 반회분식 발효에 의한 rLP2086 수율이 비교예의 회분식 발효 공정에 비해 약 2∼3배 증가한 것을 나타낸다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 단백질 및 다른 단백질의 상업적 규모의 생산에 용이하게 적용될 수 있다.
본원에 기재된 실시형태의 이해를 돕기 위한 목적으로, 다양한 실시형태가 참조될 것이고 이를 설명하는 데 특정 용어가 사용될 것이다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다. 본 명세서 전반에 걸쳐서 사용되는 단수 형태들은 문맥상 명백히 다른 의미를 나타내는 것이 아니라면 복수 표현을 포함한다. 마찬가지로, "배지"와 같은 용어의 단수 형태는 복수의 "배지들"이란 표현을 포함하며, 그 반대도 마찬가지이다. 따라서, 예를 들어, "배양 배지"라고 하는 표현은 1종의 배지뿐만 아니라 그러한 배지 복수종을 포함한다.
본원에서 사용되는 "유도 물질"이란 용어는 재조합 단백질의 발현을 유도, 증대 또는 촉진하는 임의의 물질을 말하며, 이때 유전자 발현은 유도성 프로모터 제어하에 상기 물질의 농도에 의해 직접적으로 조절될 수 있다.
본원에서 사용되는 "탄소원"이란 용어는 세포를 위한 탄소원 및 에너지를 의미한다.
본원에서 서로 교환하여 사용될 수 있는 "공급하다", "공급된", "공급하는" 또는 "연속적으로 첨가하는"이란 용어들은 물질을 한꺼번에 첨가하는 것이 아니라 일정 기간에 걸쳐 연속적으로 첨가하는 것을 의미한다. 이 용어들은 발효 과정 중에 물질을 연속적으로 첨가하는 것에 대한 단일 개시 및/또는 종료 시점 또는 다중 개시 및/또는 중단 시점을 고려한다.
본원에서 사용되는 "재조합 단백질"이란 용어는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 올리고단백질 및/또는 융합 단백질을 비롯하여, 아미노산을 코딩하는 재조합 유전 물질로부터 발현되는 리포터 또는 마커 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질)이 아닌 임의의 단백질 또는 그 생물학적 활성 부분(예를 들어, 전체 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 부분)을 의미한다. 재조합 단백질 생성물은 치료용, 예방용 또는 진단용 생성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법:
본 발명의 방법은, 배양물이 역치 파라미터에 도달한 후에 아라비노스와 같은 유도 물질을 배양 배지에 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 신규한 반회분식 발효 방법을 통해 예상외로 단백질을 고수율로 제공한다. 글루코스와 같은 탄소원은 일반적으로 재조합 박테리아 세포를 포함하는 배양물에 유도 단계 전에 첨가된다. 상기 탄소원은 유도 물질과 함께 공급될 수도 있다. 상기 유도 물질은 부탄소원으로서 사용될 수도 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 글루코스와 같은 탄소원은 유도 물질을 배양 배지에 연속적으로 공급하기 전 및/또는 중에 배양 배지에 연속적으로 첨가된다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에 따르면 탄소원의 연속 공급은 유도 물질의 연속 공급과 겹친다. 탄소원의 연속 공급은 유도 물질의 연속 공급 기간 전체 동안 또는 그 기간의 일부 동안에만 지속될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 탄소원의 연속 공급은 유도 물질의 연속 공급과 겹치지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 유도 물질 및/또는 탄소원은 상기 배양물에 등속(constant rate)으로 공급될 수 있다.
상기 반회분식 발효 방법은 본 발명의 일 실시형태에 따라 목적 단백질이 생산되도록 하는 몇 개의 단계를 포함한다. 초기 단계에서, 유도성 프로모터 제어하에 재조합 단백질을 생성물을 코딩하는 발현 벡터를 제조하고 그 후 이것을 박테리아 숙주 세포에 도입한다. 이 박테리아 숙주 세포를 배양 배지에 첨가한다. 상기 배양물에 유도성 프로모터의 유도 물질을 공급한다(즉, 상기 유도 물질은 일정 시간 동안 연속적으로 상기 배양물에 첨가된다). 상기 유도 물질은 상기 배양물에 등속으로 공급될 수 있다. 그 후, 상기 배양물로부터 상기 재조합 단백질 생성물을 회수한다. 그 후, 이러한 방식으로 제조된 재조합 단백질을 필요에 따라 정제하고/하거나 임의의 적절한 방식으로, 예컨대 예방용, 치료용 또는 진단용 제제에 사용할 수 있다.
유도 물질의 등속 공급을 이용한 반회분식 발효에 의하면 예상외로 고세포 밀도 및 단백질 수율 증대가 달성되었으며, 이 방법은 이하에 제시된 실시예에서 예시된 바와 같이 회분식 발효에 비해 재조합 단백질 생성물의 수율을 약 2∼3배 증가시킨다. 본 발명의 방법은 소규모 발효뿐 아니라 대규모 발효에도 적용이 가능하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "대규모" 발효란 체적 용량, 즉 헤드스페이스를 위해 적정 공간을 남겨 둔 유효 용적이 약 1,000 L 이상인 발효기에서의 발효를 의미한다. "소규모" 발효란 일반적으로 체적 용량이 약 100 L 이하, 예컨대 5 L, 10 L, 50 L 또는 100 L인 발효기에서의 발효를 의미한다. 본 발명의 반회분식 발효 공정의 입증된 장점은 이 공정이 5∼10 L 발효기 규모로 재조합 단백질을 생산하는 데 이용될 수 있으며, 임의의 용적, 예를 들어 100 L, 150 L, 250 L, 500 L, 1,000 L 또는 그 이상(이에 한정되지 않음)으로 확장될 수 있다는 것이다.
유도 물질:
본원에 기재된 방법은 재조합 단백질의 발현이 유도성 프로모터의 전사 제어하에 이루어지는 재조합 단백질의 생산에 관한 것이며, 이때 상기 유도성 프로모터 제어하에서의 유전자 발현은 배양 배지 중에 존재하는 유도 물질의 농도에 의해 직접적으로 조절될 수 있다. 상기 유도 물질은 배양 배지에 연속적으로, 경우에 따라 등속으로 공급된다. 상기 유도 물질은 역치 파라미터에 도달한 후에 상기 배양 배지에 첨가된다. 예를 들어, 재조합 단백질은 araB 프로모터(예를 들어, ParaB) 제어하에 있을 수 있으며, 상기 프로모터는 배양 배지에 등속으로 첨가되는 아라비노스 농도에 의해 직접적으로 조절될 수 있다. 본 발명과 함께 이용하기에 적합한 유도 물질은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 유도 물질의 예로는 이하에 제시된 것들이 있으나 이들에 한정되지 않는다.
프로모터 유도 물질
아라비노스 프로모터, 예컨대 ParaB 아라비노스
인간 플라스미노겐 활성화제 억제제 1형, Hpai-1 종양 괴사 인자 TNF
사이토크롬 P-450 독소
CYP1A1 금속 반응성 요소, MRE 중금속
마우스 유선 종양 바이러스 글루코코티코이드
콜라게나제 포볼 에스테르
스트로몰리신 포볼 에스테르
SV40 포볼 에스테르
프로리페린 포볼 에스테르
α-2 매크로글로불린 IL-6
쥐과 MX 유전자 인터페론, 뉴캐슬병 바이러스
비멕틴 혈청
갑상선 자극 호르몬 α 유전자 갑상선 호르몬
항원 종양 괴사 인자 HSP70 Ela, SV40 대형 T FMA
인터페론 바이러스 감염, dsRNA
소마토스타틴 환형 AMP
피브로넥틴 환형 AMP
lac 프로모터/오퍼레이터 IPTG
탄소원:
당업자가 이해하는 바와 같이 임의의 적절한 탄소원, 예를 들어 글리세롤, 숙시네이트, 락테이트 또는 당계 탄소원, 예를 들어 글루코스, 락토스, 수크로스 및 프럭토스가 본 발명에서의 사용에 고려된다. 예를 들어, 본 발명에 사용될 수 있는 당계 탄소원은 동종 다당류 및 이종 다당류를 비롯하여, 당류 단량체 D-만노스, D- 및 L-갈락토스, 푸코스, 프럭토스, D-크실로스, L-아라비노스, D-글루쿠론산, 시알산, D-갈락투론산, D-만누론산(예를 들어, 폴리만누론산 또는 알긴산), D-글루코사민, D-갈락토사민, D-글루코스 및 뉴라민산을 포함하는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예를 들어 락토스, 아밀로펙틴, 전분, 히드록시에틸 전분, 아밀로스, 덱스트란 설페이트, 덱스트란, 덱스트린, 글리코겐, 또는 산성 뮤코다당류, 예를 들어 히알루론산의 다당류 서브유닛; 폴리솔비톨 및 폴리만니톨과 같은 당 알코올의 중합체; 헤파린 또는 헤파란; 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 글루코스가 주탄소원이다. 아라비노스가 유도 물질로서 사용될 경우, 이것은 주탄소원으로도 사용될 수 있지만 부탄소원으로서도 사용될 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 탄소원은 D-글루코스, L-아라비노스, 수크로스, I-이노시톨, D-만니톨, β-D-프럭토스, β-L-람노스, D-크실로스, 셀룰로스 중 어느 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명에는 1종 또는 1종 이상의 탄소원이 사용될 수 있다.
박테리아 발현 시스템 및 플라스미드:
본 발명은 또한 프로모터 서열 및 개시 서열을 갖는 발현 제어 서열과, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(이 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열과 개시 서열의 3'쪽에 위치함)을 포함하는 플라스미드와 같은 발현 벡터를 포함하는 재조합 박테리아 세포를 제공한다. 본원에 제공된 개시 내용에 기초하여 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 임의의 적절한 발현 제어 서열 및 숙주 세포/클로닝 비이클의 사용이 고려된다.
적절한 발현 제어 서열 및 숙주 세포/클로닝 비이클 조합은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재되어 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술은 관심있는 재조합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 합성 또는 단리를 통해 얻는 단계 및 이것을, 이것이 바람직하게는 아라비노스 유도성 프로모터 제어하에 발현되는 적절한 벡터/숙주 세포 발현 시스템으로 도입하는 단계를 포함한다. DNA를 발현 벡터로 삽입하는 것과 관련하여 기술된 방법 중 임의의 방법을 이용하여 프로모터와 다른 조절 제어 요소를 선택된 재조합 벡터 내의 특정 부위로 결찰시킬 수 있다. 그 후, 적절한 숙주 세포를 통상의 기법을 통해 상기와 같은 벡터 또는 플라스미드로 형질전환, 감염, 형질도입 또는 형질감염시킨다.
관심있는 재조합 단백질을 발현시키는 데에는 다양한 숙주 세포-벡터(플라스미드) 시스템이 이용될 수 있다. 벡터 시스템, 예를 들어 아라비노스 유도성 프로모터를 포함하는 시스템은 사용되는 숙주 세포와 상용성이다. 관심있는 재조합 단백질 생성물을 코딩하는 DNA를 발현 시스템에 삽입하고, 프로모터(바람직하게는 아라비노스 유도성 프로모터)와 기타 제어 요소를 상기 벡터 내의 특정 부위로 결찰시켜, 벡터가 숙주 세포로 삽입될 경우(사용되는 숙주 세포-벡터 시스템에 따라 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해) 관심있는 재조합 단백질 생성물을 코딩하는 DNA가 숙주 세포에 의해 발현된다.
상기 벡터는 전술한 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터 중 하나로부터 선택될 수 있으나 사용되는 숙주 세포와 상용성이어야 한다. 상기 재조합 DNA 벡터는 (벡터/숙주 세포 시스템에 따라) 형질전환, 형질도입 또는 형질감염 등에 의해 적절한 숙주 세포(박테리아, 바이러스, 효모, 포유동물 세포 등)로 도입될 수 있다. 숙주-벡터 시스템으로는 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
관심있는 재조합 단백질 생성물의 원핵생물에서의 발현은, 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 유도하는 항시성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터를 포함하는 벡터에 의해, 임의의 적당한 박테리아 종 또는 균주, 예컨대 이 콜라이에서 이루어질 수 있다.
융합 벡터는 이것에 의해 코딩되는 재조합 단백질의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 다수의 아미노산을 추가한다. 이러한 융합 벡터는 일반적으로 3 가지 목적으로, 즉, 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키기 위해; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키기 위해; 3) 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 촉진하기 위해 사용된다. 흔히 융합 발현 벡터의 경우, 융합 부분과 재조합 단백질의 연결부에 단백질 분해성 절단 부위를 도입하여, 융합 단백질의 정제 후 융합 부분으로부터 재조합 단백질이 분리될 수 있도록 한다. 그러한 효소들과 이들의 동족체(cognate) 인식 서열에는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제가 포함된다.
전형적인 융합 발현 벡터는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시키는 Pgex(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988), Pmal(New England Biolabs, Beverly; Mass.) 및 Prit5(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
적절한 유도성 비융합 이 콜라이 발현 벡터의 예로는 pTrc[Amann et al. (1988) Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli, Gene, 69, 301-315] 및 Pet lid[Studier et al. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods in Enzymology, 185, 60-89]를 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 의존한다. Pet lid 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 동시 발현되는 바이러스 RNA 폴리머라제 J7 gn1에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이 바이러스 폴리머라제는, 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS I 74(DE3)에 의해, lacUV 5 프로모터의 전사 제어하에 T7 gn1 유전자를 보유하는 내재성(resident) 프로파지로부터 공급된다.
일 실시형태에 따르면 벡터 구성체의 조절 서열은 유도성 프로모터이다. 유도성 프로모터의 사용은 통상적인 배양 및 증식 과정에서 세포에 의해 생산되는 활성화된 단백질의 낮은 기저 수준이 증가되도록 한다. 그 후, 그 세포는 생산 또는 스크리닝 과정에서 다량의 목적 단백질이 발현되도록 유도될 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 세포 또는 바이러스 게놈으로부터 단리될 수 있다.
외생적으로 공급되는 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터로는 아라비노스 프로모터, 아연 유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex) 유도성 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(No et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351), 테트라사이클린 억제성 시스템(Gossen et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551), 테트라사이클린 유도성 시스템(Gossen et al., 1995 Science, 268:1766-1769 및 Harvey et al., 1998 Curr. Opin. Chem Biol, 2:512-518), RU486 유도성 시스템(Wang et al., 1997 Nat. Biotech., 15:239-243 및 Wang et al., 1997 Gene Ther., 4:432-441) 및 라파마이신 유도성 시스템(Magari et al., 1997 J. Clin. Invest., 100: 2865-2872)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 프로모터는 아라비노스 유도성 프로모터이다.
본원에 제공된 개시 내용을 기초로 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 임의의 적절한 박테리아 숙주 세포가 본 발명에서의 사용에 고려된다. 예를 들어, 이 목적에 적절한 박테리아는 에쉐리키아(Escherichia), 엔테로박터(Enterobacter), 아조토박터(Azotobacter), 에르위니아(Erwinia), 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 리조비아(Rhizobia), 비트레오실라(Vitreoscilla), 파라코쿠스(Paracoccus) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 임의의 이같은 적절한 박테리아의 임의의 적절한 균주 역시 본 발명에서 고려된다. 또한, 당업자가 이해하는 바와 같이, 적절한 돌연변이 세포의 사용 역시 본 발명에서 고려된다. 당업자라면 본원에 제공된 지침에 기초하여 특수 상황하에 사용하기 위한 적절한 숙주 세포를 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
적절한 유도성 이 콜라이 발현 벡터의 예로는 pTrc(Amann et al., 1988 Gene, 69:301-315), 아라비노스 발현 벡터(예를 들어, Pbad18, Guzman et al., 1995 J. Bacteriol., 177:4121-4130) 및 pETIId(Studier et al., 1990 Methods in Enzymology, 185:60-89)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 의존한다. pETIId 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 동시 발현되는 바이러스 RNA 폴리머라제 T7 gn1에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이 바이러스 폴리머라제는, 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS I 74(DE3)에 의해, lacUV5 프로모터의 전사 제어하에 T7 gn1 유전자를 보유하는 내재성 프로파지로부터 공급된다. PBAD 시스템은 araC 유전자에 의해 조절되는 유도성 아라비노스 프로모터에 의존한다. 상기 프로모터는 아라비노스 존재하에 유도된다.
본 발명의 다른 실시형태는 아라비노스에 의해 조절되는 발현 벡터, 또는 관심있는 재조합 단백질의 발현이 아라비노스 프로모터(예를 들어, 이 콜라이 아라비노스 오페론에 대한 프로모터, PBAD 또는 PARA) 제어하에 이루어지는 벡터를 이용하나 이에 한정되지 않는다.
임의의 목적 단백질을 코딩하는 핵산(뉴클레오티드) 서열이 본 발명에서 고려된다. 뉴클레오티드 서열은 전부 또는 일부가 자연 발생 뉴클레오티드 서열이거나, 전부 또는 일부가 변경된 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 엄격한 조건하에 상기 서열에 하이브리드화하는 임의의 서열일 수 있다. 본원에서 어떤 유전자에 해당하는 핵산 서열이라 함은 목적 단백질로서 발현될 수 있는 임의의 핵산 서열을 의미한다.
예를 들어, 그러한 변경된 핵산 서열은 1 뉴클레오티드 결실, 치환(전위 및 변위를 포함함), 또는 삽입을 포함하며, 이때 상기 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 부위에서, 또는 기준 서열의 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹들에 산재된 말단 위치들 사이의 어디에서나 발생할 수 있다. 뉴클레오티드 변경수는 임의의 서열의 뉴클레오티드 총수를 각각의 퍼센트 동일성의 퍼센트 수치(100으로 나눔)로 곱하고 상기 서열의 상기 뉴클레오티드 총수로부터 그 곱을 뺌으로써 결정한다.
예를 들어, 본 발명은 특정 핵산 서열에 대해 70% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 이의 축퇴성 변이체 또는 그 단편을 사용하는 것을 고려하며, 이때 상기 서열은 상기 핵산 서열의 전체 폴리뉴클레오티드 영역에 대하여 최대 nn개의 핵산 변경을 포함할 수 있고, 여기서 nn은 최대 변경수로서 하기 식에 의해 계산된다:
nn = xn-(xnㆍy)
상기 식에서, xn은 임의의 서열의 핵산 총수이고 y의 값은 0.70이며, 이때 xn과 y의 정수가 아닌 임의의 곱은 xn으로터 그 곱을 빼기 전에 가장 가까운 정수로 반내림한다. 물론, y는 또한 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 94%의 경우 0.94, 95%의 경우 0.95, 96%의 경우 0.96, 97%의 경우 0.97, 98%의 경우 0.98, 또는 99%의 경우 0.99 등의 값을 가질 수 있다. 서열의 변경은 이러한 코딩 서열에 넌센스, 미스센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이를 유발하여 그러한 변경이 일어난 후 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 변경시킬 수 있다.
본 발명은 축퇴성 변이체 또는 그 단편의 사용을 고려한다. 본원에서 정의된 바와 같이, "축퇴성 변이체"는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 뉴클레오티드 서열이 다르나 여전히 동일한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(및 그 단편)이다.
상기 핵산은 DNA, 염색체 DNA, cDNA 및 RNA를 포함할 수 있으며, 이종성 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에 따르면, 상기 핵산은 고엄격도 하이브리드화 조건하에 특정 핵산, 이의 상보체, 이의 축퇴성 변이체 또는 이의 단편에 하이브리드화한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 중간 엄격도 하이브리드화 조건하에 하이브리드화한다.
상기 핵산은 천연 공급원, 합성 공급원 또는 반합성 공급원으로부터 얻을 수 있으며; 또한, 상기 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 서열일 수 있거나, 또는 이 서열은 그러한 자연 발생 서열에 대한 단일 또는 다중 염기 치환, 결실, 삽입 및 변위를 포함하는 돌연변이에 의해 관련된 서열일 수 있다. 상기 핵산 분자는 RNA, DNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태, 선형 또는 공유적으로 폐쇄된 원형의 형태일 수 있다.
엄격도 조건의 예는 하기 엄격도 조건 표에 제시되어 있다: 고엄격도 조건은 적어도, 예를 들어 조건 A∼F만큼 엄격한 조건이고; 중간 엄격도 조건은 적어도, 예를 들어 조건 G∼L만큼 엄격한 조건이며; 저엄격도 조건은 적어도, 예를 들어 조건 M∼R만큼 엄격한 조건이다.
엄격도 조건
엄격도 조건 폴리뉴클레오티드하이브리드 하이브리드 길이(bp)I 하이브리드화 온도 및 완충제H 세척 온도 및 완충제H
A DNA:DNA > 50 65℃; 1xSSC -또는- 42℃; 1xSSC, 50% 포름아미드 65℃; 0.3xSSC
B DNA:DNA < 50 TB; 1xSSC TB; 1xSSC
C DNA:RNA > 50 67℃; 1xSSC -또는- 45℃; 1xSSC, 50% 포름아미드 67℃; 0.3xSSC
D DNA:RNA < 50 TD; 1xSSC TD; 1xSSC
E RNA:RNA > 50 70℃; 1xSSC -또는- 50℃; 1xSSC, 50% 포름아미드 70℃; 0.3xSSC
F RNA:RNA < 50 TF; 1xSSC Tf; 1xSSC
G DNA:DNA > 50 65℃; 4xSSC -또는- 42℃; 4xSSC, 50% 포름아미드 65℃; 1xSSC
H DNA:DNA < 50 TH; 4xSSC TH; 4xSSC
I DNA:RNA > 50 67℃; 4xSSC -또는- 45℃; 4xSSC, 50% 포름아미드 67℃; 1xSSC
J DNA:RNA < 50 TJ; 4xSSC TJ; 4xSSC
K RNA:RNA > 50 70℃; 4xSSC -또는- 50℃; 4xSSC, 50% 포름아미드 67℃; 1xSSC
L RNA:RNA < 50 TL; 2xSSC TL; 2xSSC
M DNA:DNA > 50 50℃; 4xSSC -또는- 40℃; 6xSSC, 50% 포름아미드 50℃; 2xSSC
N DNA:DNA < 50 TN; 6xSSC TN; 6xSSC
O DNA:RNA > 50 55℃; 4xSSC -또는- 42℃; 6xSSC, 50% 포름아미드 55℃; 2xSSC
P DNA:RNA < 50 TP; 6xSSC TP; 6xSSC
Q RNA:RNA > 50 60℃; 4xSSC -또는- 45℃; 6xSSC, 50% 포름아미드 60℃; 2xSSC
R RNA:RNA < 50 TR; 4xSSC TR; 4xSSC
bpI: 상기 하이브리드 길이는 하이브리드화 폴리뉴클레오티드의 하이브리드화 영역(들)에 대해 예상되는 길이이다. 폴리뉴클레오티드를 미지 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 때, 그 하이브리드 길이는 하이브리드화 폴리뉴클레오티드의 길이일 것으로 추정된다. 기지 서열의 폴리뉴클레오티드가 하이브리드화될 때, 그 하이브리드 길이는 상기 폴리뉴클레오티드의 서열을 정렬하고 최적의 서열 상보성 영역 또는 영역들을 확인하여 결정할 수 있다.
완충제H: 하이브리드화 및 세척 완충제에서 SSPE(1xSSPE는 0.15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4 및 1.25 mM EDTA, pH 7.4임)가 SSC(1xSSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트르산나트륨임) 대신에 사용될 수 있으며; 세척은 하이브리드화 완료 후 15분 동안 행해진다.
TB∼TR: 길이가 50 염기쌍 미만일 것으로 예상되는 하이브리드에 대한 하이브리드화 온도는 하이브리드의 용융 온도(Tm)보다 5∼10℃ 낮아야 하며, 이때 Tm은 하기 식에 따라 결정된다. 길이가 18 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우, Tm(℃) = 2(A 염기 + T 염기의 수) + 4(G 염기 + C 염기의 수). 길이가 18∼49 염기쌍인 하이브리드의 경우, Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N)[여기서, N은 하이브리드 내 염기의 수이고, [Na+]는 하이브리드화 완충제 중의 나트륨 이온의 농도이다(1xSSC의 경우 [Na+] = 0.165 M)].
폴리뉴클레오티드 하이브리드화에 대한 엄격도 조건의 또 다른 예는 문헌[Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 9장 및 11장] 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., 섹션 2.10 및 6.3-6.4]을 참조할 수 있으며, 상기 문헌들은 본원에서 참고 문헌으로 포함한다.
본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드뿐 아니라 안티센스 서열에도 완전히 상보성인 폴리뉴클레오티드의 사용을 고려한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로도 언급되는 안티센스 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 차단하는 내부적으로 생성된 서열과 외부에서 투여되는 서열을 둘 다 포함한다. 본 발명의 안티센스 서열은, 예를 들어 약 15∼20 염기쌍을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 안티센스 서열은, 예를 들어, 상류 비번역 서열에 프로모터가 결합하는 것을 막거나, 리보솜이 결합하는 것을 막음으로써 본 발명 폴리펩티드를 코딩하는 전사체의 번역을 막아서 전사를 억제하도록 설계될 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이 폴리뉴클레오티드는 임의의 적절한 방식으로(예를 들어, 화학적 합성에 의해, DNA 라이브러리로부터, 생물체 자체로부터) 제조하거나 얻을 수 있으며, 다양한 형태(예컨대, 단일 가닥, 이중 가닥, 벡터, 프로브, 프라이머)를 가질 수 있다. "폴리뉴클레오티드"란 용어는 또한 DNA 및 RNA와 이들의 유사체, 예컨대 변경된 골격을 포함하는 것들을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 라이브러리, 예컨대 cDNA 라이브러리를 포함한다.
2086 단백질 발현 시스템:
본 발명의 일 실시형태에 따르면 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B 2086 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 미생물이 제공된다. 상기 재조합 미생물은 프로모터 서열 및 개시 서열을 갖는 발현 조절 서열과, 2086 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열 및 개시 서열의 3'쪽에 위치한다. 또 다른 양태에 있어서, 본원에 기재되어 있고 본원에서 그 전체를 참고로 포함하는 WO 03/063766 및 WO 04/094596에 기재되어 있는 재조합 2086 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어 WO 03/063766 및 WO 04/094596에 기재된 것과 같은 재조합 2086 단백질을 제조하는 방법을 제공하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 목적 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를, 해당 2086 폴리뉴클레오티드 함유 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시킴으로써 구성한 후, 이 숙주 세포를 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건하에 본 발명의 방법에 따라 배양한다. 그 후, 당업자에게 잘 알려져 있는 기법으로 상기 폴리펩티드로부터 숙주 세포 성분 오염물을 실질적으로 제거하여 단리할 수 있다.
역치 파라미터:
세포 성장 및 재조합 단백질 발현의 측면에서 배양의 진행을 모니터하고 제어하기 위해 몇 가지의 파라미터를 이용할 수 있다. 이러한 파라미터에는 흡광도(OD), 용존 산소(DO), pH, 영양물/에너지 소비(예컨대 탄소원), 대사 부산물(예를 들어, 아세트산)의 축적, 회수 시점 및 온도가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본원에 제공된 지침에 기초하여 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 임의의 적절한 파라미터 또는 파라미터의 조합이 본 발명에서의 사용에 고려된다.
역치 파라미터는 유도 물질이 배양물에 연속적으로 첨가되는(즉, 경시적으로 배양물에 공급되는) 시점을 결정하도록 수립된다. 상기 역치 파라미터는 선결정된 파라미터이다. 적절한 역치 파라미터, 예컨대 선결정된 흡광도는 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 본원에 제공된 지침에 기초하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 한 가지 역치 파라미터 또는 역치 파라미터의 조합이 이용될 수 있다.
파라미터 또는 파라미터의 조합은 배양물에서 임의의 적절한 시간 간격으로 모니터될 수 있다. 예를 들어, OD600 및 글루코스 농도는 1 시간, 1/2 시간 또는 1/4 시간 간격으로 모니터될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 흡광도는 본 발명의 일 실시형태에 따라 유도 물질의 연속 공급의 개시를 위해 역치 파라미터로서 이용된다. 배양물의 세포 밀도가 선결정된 역치 파라미터, 예컨대 흡광도 약 70∼약 110에 도달하게 되면, 본원에 기재된 바와 같이 유도 물질을 배양물에 공급한다. 역치 파라미터에 대해 더 좁은 범위를 설정할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 실시형태에 따라 배양물의 세포 밀도가 흡광도 약 70∼약 105, 약 75∼약 100, 약 75∼약 95, 약 75∼약 85, 약 76∼약 84, 약 78∼약 82, 또는 약 80에 도달할 때 상기 배양물에의 상기 유도 물질의 연속적 첨가를 개시할 수 있는 것을 고려한다.
본 발명은 또한 탄소원 공급의 개시 및/또는 종료를 신호하는 역치 파라미터의 사용을 고려한다.
당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 역치 파라미터(들)를 모니터하는 데 사용하기 위한 것으로 임의의 적합한 장치 또는 장치의 조합이 고려된다. 예를 들어, 발효 장치("발효기") 상에 역치 파라미터를 측정하기 위한 탐침 또는 탐침의 조합을 임의의 적절한 방식으로 장착할 수 있으나, 이러한 것에 한정되지 않는다.
일정한 공급 속도:
일정한 공급 속도(constant feed rate)란 유도 물질(들) 및/또는 탄소원(들)이 배양물에 첨가되는 속도를 말한다. 유도 물질은 역치 파라미터에 도달한 후에 배양물에 공급된다. 상기 탄소원 역시 역치 파라미터에 도달한 후에 배양물에 첨가될 수 있다(또한, 역치 파라미터에 도달하면 탄소원의 첨가가 종결될 수도 있다). 이러한 역치 파라미터로는 흡광도(OD), 용존 산소(DO), pH, 배양 배지 중 영양물의 농도, 배양 배지에 첨가되는 1차 탄소원의 총 농도 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본원에 제공된 지침에 기초하여 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이 배양물에 유도 물질 및/또는 탄소원을 연속적으로 첨가하는 데 임의의 적절한 등속이 이용된다. 본 발명의 다양한 실시형태에 따르면, 적절한 등속은 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 DO 유지(DO-stat)에 의해 결정된다. 예를 들어, 농도가 15∼24 g/L/h까지 되도록 하기에 충분한 글루코스를 첨가함으로써 DO 유지 제어기와 동등한 공급 속도를 선택할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 상기 유도 물질 및/또는 탄소원은 배양물의 총 부피를 기준으로 특정량의 유도 물질 및/또는 탄소원, 예컨대 약 4 g/L∼약 40 g/L, 예컨대, 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 9.5 g/L, 9.75 g/L, 10 g/L, 10.25 g/L, 10.5 g/L, 11 g/L, 12 g/L, 13 g/L, 14 g/L, 15 g/L, 16 g/L, 17 g/L, 18 g/L, 19 g/L, 20 g/L, 21 g/L, 22 g/L, 23 g/L, 24 g/L, 25 g/L, 26 g/L, 27 g/L, 28 g/L, 29 g/L, 30 g/L, 31 g/L, 32 g/L, 33 g/L, 34 g/L, 35 g/L, 36 g/L, 37 g/L, 38 g/L, 39 g/L, 40 g/L의 유도 물질 및/또는 탄소원이 상기 배양물에 첨가될 때까지 등속으로 상기 배양물에 첨가될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시형태에 따르면, 상기 배양물에 공급되는 유도 물질 및/또는 탄소원의 총량은 약 5 g/L∼약 20 g/L, 7 g/L∼약 15 g/L, 8 g/L∼약 14 g/L, 9 g/L∼약 11 g/L, 또는 약 10 g/L이다.
상기 배양물에 첨가되는 유도 물질의 총량은 배양물에 첨가되는 탄소원의 총량에 의해 상쇄될 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소원이 글루코스이고 상기 유도 물질이 아라비노스인 경우, 첨가되는 유도 물질의 양은 글루코스의 첨가에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, 총 10 g/L의 유도 물질(즉, 예컨대 아라비노스)이 배양물에 첨가되고, 11 g/L의 탄소원, 예컨대 글루코스가 첨가된다. 이러한 방식으로 얻은 단백질 수율은 총량 20 g/L의 아라비노스(즉, 1,000 L의 배양물 중 아라비노스 총 20,000 g 또는 20 kg)를 사용하고 글루코스를 사용하지 않을 때의 수율과 거의 같다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 이러한 상쇄는 글루코스에 비해 아라비노스의 단가가 높다는 점에서 유익하다.
본 발명의 다양한 실시형태에 따르면, 유도 물질 및/또는 탄소원이 배양물에 첨가되는 등속은 약 1.5 g/L/h∼약 24 g/L/h의 범위로 설정될 수 있다. 예를 들어, 탄소원이 글루코스인 경우, 글루코스 첨가를 위한 등속은 1.8 g 글루코스/L/h, 3.3 g 글루코스/L/h, 6.7 g 글루코스/L/h, 15 g 글루코스/L/h, 16.4 g 글루코스/L/h, 18 g 글루코스/L/h, 24 g 글루코스/L/h 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시형태에 따르면, 아라비노스와 같은 유도 물질은 약 1.5 g/L/h∼약 16 g/L/h의 등속으로 첨가된다.
다양한 실시형태에 따르면, 역치 파라미터에 도달하게 되면, 탄소원의 공급을 지속하거나 중단하거나 일시적으로 중단할 수 있다. 탄소원의 공급은 중단될 수 있으며, 이 경우 공급을 개시하기 위한 역치에 도달하게 되면, 등속으로 공급이 재개될 것이다. 따라서, 일 실시형태에 따르면, 탄소원의 배양물로의 공급을 조절하기 위해 개시 역치 및 중단 역치를 이용할 수 있다. 또 다른 실시형태에 따르면, 공급을 중단 또는 재개하지 않고서 역치 파라미터에 기초하여 글루코스와 아라비노스 둘 다를 등속으로 공급한다.
임의의 특정 배양물에 첨가되는 탄소원의 적정 총량은 본원에 제공된 지침에 기초하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 배양물에 첨가되는 탄소원의 총량은 약 1 g/L∼약 100 g/L(배양물의 총 부피(L) 기준)의 범위일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에 따르면, 배지 중 10 g/L로 시작하여, 글루코스 농도가 0에 도달할 때 등속 글루코스 공급을 개시하고, OD 80에 도달할 때까지(이때, 초기 10 g/L의 글루코스에 더하여 약 40 g/L의 글루코스가 공급됨) 등속 글루코스 공급을 지속함으로써 성장 단계 중에 50 g/L의 글루코스를 첨가한다. 일 실시형태에 따르면, 규모 확장의 용이를 위해 탄소원 총량이 농축된 형태로 공급된다. 이러한 양은 특정 상황에서 사용되어야 하는 탄소원의 총 질량으로 쉽게 전환된다. 예를 들어, 10 g/L의 탄소원이 1,000 L의 배양물에 첨가되어야 하는 경우, 첨가되어야 하는 탄소원의 총량은 10 g/L × 1,000 L = 10,000 그램(또는 10 kg)의 총 탄소원으로서 쉽게 결정된다. 본원에 제시된 다양한 실시형태에 따르면, 첨가되는 탄소원의 총량은 역치 파라미터로서 이용될 수 있다.
임의의 특정 배양물에 첨가하기 위한 유도 물질의 적정 총량은 본원에 제공된 지침에 기초하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 다양한 실시형태에 따르면 배양물에 첨가되는 유도 물질의 총량은 약 4 g/L∼약 40 g/L(배양물의 총 부피(L) 기준) 범위일 수 있다. 다양한 실시형태에 따르면, 배양물에 첨가되는 탄소원의 총량은 배양물의 총 부피를 기준으로 약 5 g/L∼약 20 g/L, 7 g/L∼약 15 g/L, 8 g/L∼약 14 g/L, 9 g/L∼약 11 g/L, 또는 약 10 g/L이다. 일 실시형태에 따르면, 규모 확장의 용이를 위해 유도 물질의 총량이 농축된 형태로 제공된다. 이러한 양은 특정 상황에서 사용되어야 하는 유도 물질의 총 질량으로 쉽게 전환된다. 예를 들어, 10 g/L의 유도 물질이 1,000 L의 배양물에 첨가되어야 하는 경우, 첨가되어야 하는 유도 물질의 총량은 10 g/L × 1,000 L = 10,000 그램(또는 10 kg)의 총 유도 물질로서 쉽게 결정된다.
새로운 배양 배지는 일반적으로 숙주 세포 접종시 초기 분량의 1차 탄소원을 함유하여 배양물을 형성한다. 이러한 초기 농도를 모니터하여 1차 탄소원의 농도를 역치 파라미터로서 이용할 수 있다.
탄소원 이외의 임의의 적절한 보충물 또는 영양물 역시 적정량 배양물에 공급될 수 있다. 다른 영양물 또는 보충물도 모니터하여 그에 따라 역치를 설정할 수 있다. 질소 또는 무기 인산염 공급원과 같은 보충물의 사용도 본 발명에서 고려된다. 본 발명 방법에서의 사용에 고려되는 화합물의 비한정적인 예로서는 KH2PO4, K2HPO4, 시트르산나트륨(이수화물), (NH4)2SO4, MgSO4, (Na)2SO4, CaCl2, FeSO4, 클로람페니콜 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있다. 추가의 탄소원 또는 탄소원들의 사용 역시 고려된다.
흡광도 및 대수 성장 단계:
새로운 배양 배지에 박테리아 숙주 세포를 첨가하게 되면, 일반적으로 (i) 유도기(lag phase), (ii) 대수 성장기(대수기 또는 지수기), (iii) 정체기 및 (iv) 쇠퇴기(사멸기)의 다소 상이한 4 단계를 거치게 되는 배양물이 생성된다. 대수 성장기 자체도 여러 단계, 예컨대 초기 대수 성장기, 중기 대수 성장기 및 후기 대수 성장기로 더 분류될 수 있다. 흡광도는 대수 성장기와 관련이 있다. 대수 성장기와 흡광도는 또한 탄소원 및/또는 유도 물질의 등속 공급의 개시 및/또는 중단을 신호하는 역치 파라미터로서 이용될 수 있다.
예를 들어, 유도, 또는 유도 물질의 연속 첨가는 초기 대수 성장기, 중기 대수 성장기 및 후기 대수 성장기에서 개시될 수 있다. 후기 대수 성장기는 OD 약 70∼약 110에서 발생할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 유도 물질의 등속 공급은 다양한 실시형태에 따라 배양 배지의 후기 대수 성장기에서 또는 OD 약 70∼약 110, 약 70∼약 105, 약 75∼약 85, 또는 약 80에서 착수될 것이다.
OD는 당업자가 통상적으로 이용하는 다양한 파장에서 측정될 수 있다. 일반적으로, OD600이 배양물에서의 세포 성장 및 세포 밀도의 척도로서 이용된다. 달리 명시하지 않는다면, 본원에서 사용된 "OD"는 OD600을 의미한다.
용존 산소:
공급 제어기의 개시 및/또는 중단을 위한 트리거 역할을 할 수 있는 또 다른 파라미터는 용존 산소(DO)이다(즉, DO 유지 반회분식 발효). DO는 배양 배지를 함유하는 용기에서 진탕, 공기 흐름, 산소 보충 및 압력을 조정하는 것에 의해 제어될 수 있다. DO의 역치는 5%∼80% DO 범위로, 예컨대, 20%, 40% 또는 80%로 설정될 수 있다. 역치에 도달하게 되면, 제어 공급 중단을 신호하는 역치에 도달할 때까지 탄소원 또는 유도 물질의 공급 제어기가 작동될 수 있다. 중단 역치는 제2의 DO 역치 또는 제2의 파라미터, 예컨대 탄소원 또는 유도 물질의 양일 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 중의 DO가 30% 또는 40% 이상으로 상승할 경우, 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 DO가 20%로 떨어지는 시점까지, 또는 대안으로, 0.5 g/L 또는 1 g/L의 탄소원 또는 유도 물질이 새로 첨가될 때까지 공급 제어기가 가동될 수 있다.
pH:
공급 제어기의 가동 및/또는 중단을 위한 트리거 역할을 할 수 있는 또 다른 파라미터는 pH이다[즉, pH 유지(pH-stat) 반회분식 발효]. pH는 배양 배지에 염기 또는 산을 첨가하여 조절할 수 있다. pH의 역치는 6.8∼7.2 범위로, 예컨대 7.0으로 설정될 수 있다. 역치에 도달하게 되면, 제어 공급 중단을 신호하는 역치에 도달할 때까지 탄소원 또는 유도 물질의 공급 제어기가 가동될 수 있다. 중단 역치는 제2의 pH 역치 또는 제2의 파라미터, 예컨대 탄소원 또는 유도 물질의 양일 수 있다. 예를 들어, 배양 배지의 pH가 6.97까지 상승할 때에는 언제나, 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 pH가 6.95로 떨어지는 시점까지, 또는 대안으로, 1 g/L의 탄소원 또는 유도 물질이 새로 첨가될 때까지 공급 제어기가 가동될 수 있다.
회수 시점:
회수 시점(harvest time)은 초기 유도 또는 유도 물질의 첨가 후에 경과하는 시간의 양에 해당한다. 본 발명에서는 임의의 적절한 회수 시점이 고려된다. 회수 시점은 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 약 2 시간∼약 10 시간, 약 2 시간∼약 8 시간, 약 2.5 시간∼약 7 시간, 약 3 시간∼약 6 시간 등일 수 있다. 당업자라면, 일정한 공급 속도, 회수 시점 및 유도 물질의 총량을 이용하여, 원하는 결과를 얻기 위해 각각의 파라미터를 어떻게 조절할지를 알 것이다. 당업자라면 공급 속도 및 시간의 기간에 기초하여 공급량을 쉽게 결정할 수 있기 때문에 공급된 아라비노스의 양에 기초하여 회수 시점을 알 수 있을 것이다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 3 시간 후에 유도 물질의 최종 농도 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L 및 40 g/L에 도달할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
유도 물질의 농도:
본 발명에서는 임의의 적절한 농도의 유도 물질이 고려된다. 숙주 세포를 유도하는 데 유용한 유도 물질의 농도는 약 0.00001%∼약 20%(v/v)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
온도:
본 발명의 실시형태의 배양물은 세포의 성장을 가능케 하는 임의의 온도에서 배양될 수 있다. 충분한 성장이 이루어지도록 배양물을 배양하는 다양한 온도로는 22℃, 28℃, 37℃ 또는 이의 임의의 조합을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
발효 장치:
당업자가 알고 있는 바와 같이, 임의의 적절한 발효 장치(즉, "발효기")가 본 발명에서의 사용에 고려된다. 예를 들어, 발효기는 임의의 수의 임펠러[예컨대 러쉬톤(Rushton) 임펠러], 주입구 및/또는 측정 탐침을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 따르면, 발효기는 3개의 러쉬톤 임펠러와 발효기로 공기를 공급하기 위한 고리 또는 튜브 스파저(sparger)를 포함하도록 구성된다. 본 발명은 수동식 및/또는 컴퓨터 기반 시스템의 사용을 고려한다. 따라서, 발효 시스템은 발효의 모니터 및 제어를 위한 전산화된 시스템과 인터페이스로 접속할 수 있다. 이러한 방식으로, 이 시스템은 본 발명의 실시형태에 따라 완전 또는 부분 자동화될 수 있다.
본 발명의 조성물:
본원에서는 본 발명의 실시형태에 따라 본 발명의 방법에 따라서 제조한 것과 같은 재조합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물은 배양물 중에 고밀도로 재조합 단백질, 예컨대 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 단백질을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 배양물의 총 부피를 기준으로 약 1.5 g/L 이상의 밀도로 재조합 단백질을 함유하는 배양물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면 상기 재조합 단백질의 밀도는 배양물의 총 부피를 기준으로 약 1.7 g/L 이상이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 재조합 단백질의 밀도는 배양물의 총 부피를 기준으로 약 2.0 g/L 이상이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 재조합 단백질의 밀도는 상기 배양물의 총 부피를 기준으로 약 3.0 g/L 이상이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 재조합 2086 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 본원에서 언급된 것과 같은 2086 단백질은 네이세리아 메닝기티디스 혈청군 B의 2086 유전자에 해당하는 폴리뉴클레오티드에 의해 발현되는 단백질(이의 임의의 단편, 유도체 또는 돌연변이를 포함함)이다. 2086 단백질 및 폴리뉴클레오티드의 비한정적인 예는 WO 03/063766 및 WO 04/094596에 기재되어 있다.
상기 재조합 2086 단백질 조성물은 배양물 중에 재조합 2086 단백질을 포함하는데, 이때 상기 재조합 2086 단백질의 밀도는 배양물의 총 부피를 기준으로 약 1.5 g/L 이상이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 재조합 2086 단백질의 밀도는 배양물의 총 부피를 기준으로 약 1.7 g/L 이상이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 재조합 2086 단백질의 밀도는 배양물의 총 부피를 기준으로 약 2.0 g/L 이상이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 재조합 2086 단백질의 밀도는 배양물의 총 부피를 기준으로 약 3.0 g/L 이상이다.
본 발명의 조성물은 임의의 단백질, 예컨대 본 발명의 방법에 따라 제조된 단백질을 포함할 수 있다. 상기 재조합 단백질은 지질화 또는 비지질화 단백질일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 재조합 단백질은 지질화 또는 비지질화된 재조합 2086 단백질이다. 상기 재조합 2086 단백질은 2086 서브패밀리 A 또는 서브패밀리 B 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 조성물은 1종의 단백질 또는 1종 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 상기 단백질은 관련된 또는 관련이 없는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 서브패밀리 A의 1종 이상의 균주 및/또는 서브패밀리 B의 1종 이상의 균주에 해당하는 2086 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하는 데 사용하기 위한 물질을 포함하는 조성물 역시 본원에서 제공된다. 그러한 조성물은 본 발명의 실시형태에 따라 재조합 세포 및 영양물을 비롯하여 배양에 필요한 성분들을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면 다양한 조성물들이 함께 키트로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 배양물을 형성하기 위한 성분들을 편의상 실험실용 또는 산업용 세팅에서의 사용이 용이하도록 필요량만큼 사전 포장할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 키트는 또한 본 발명의 다양한 실시형태에 따라 각 성분의 사용을 용이하게 하는 라벨, 표식(indicia) 및 설명서와, 성분들의 배합 방식을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 입증해 보이기 위해 포함시킨 것이다. 당업자라면, 후술하는 실시예에 개시된 기법들이 본 발명자들이 발견한 기법들로서 본 발명의 실시에서 충분한 역할을 하는 기법들이며, 따라서 그 실시를 위한 다양한 양태를 구성하는 것으로 고려될 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 당업자면 본 발명의 개시 내용에 비추어, 개시된 특정 실시형태에 다양한 변경들이 가해질 수 있고 이러한 변경들은 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고서 여전히 동등한 또는 유사한 결과를 달성할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1: 등속 공급을 이용한 반회분식 발효
이 콜라이(pPW62) 서브패밀리 B를 반회분식 발효 공정의 모델 균주로서 사용하였다. 결과에 기초할 때, 이 공정은 서브패밀리 A 이 콜라이(pPW102)에도 적용될 것이다.
하기 표에 열거된 성분들을 이용하여 반회분식 발효를 위한 배지 및 공급액을 제조하였다.
배지 및 공급액:
[표 1]
기본 배지
성분 리터당 함량
덱스트로스, 무수물 10 g
KH2PO4 3 g
K2HPO4 7 g
(NH4)2SO4 1 g
시트르산나트륨, 이수화물 1 g
MgSO4ㆍ7H2O 1 g
(Na)2SO4 0.58 g
CaCl2ㆍ2H2O 0.075 g
FeSO4ㆍ7H2O 0.09 g
1000x 미량 금속 저장 용액(표 6) 1 mL
클로람페니콜 15 mg
[표 2]
1000x 미량 금속 저장 용액
성분 리터당 함량
ZnSO4ㆍ7H2O 30 g
CuSO4ㆍ5H2O 9 g
MnSO4ㆍH2O 4.2 g
CoCl2ㆍ6H2O 0.6 g
몰리브덴산, 암모늄염, 사수화물 1.5 g
[표 3]
글루코스 농축물 공급액
성분 리터당 함량
글루코스 500/700 g
KH2PO4 3 g
K2HPO4 5 g
(NH4)2SO4 2 g
[표 4]
아라비노스 농축물 공급액
성분 리터당 함량
아라비노스 KH2PO4 250/500 g 및 실험에 따라 가변 3 g
K2HPO4 5 g
(NH4)2SO4 2 g
방법:
이 콜라이 발효로 고세포 밀도를 얻기 위해 등속 공급을 이용한 반회분식 발효를 이용하였다. 배지 중 초기 글루코스 농도는 10 g/L였다. (NH4)2SO4 농도는 발효 배지 중에서는 3 g/L까지 증가시키되, 시드 배양 배지 중에서는 1 g/L로 유지시켰다. 공급 속도를 결정하기 위해, 먼저 DO 유지 반회분식 공정을 수행하였다. 진탕 속도를 최대로 증가시키고 그 후 산소 보충을 이용하는 단계적 제어기로 DO 수치를 20%로 제어하였다. 글루코스가 고갈되었을 때, DO는 급격히 상승하였고(40% 이상), 글루코스 농축물은 발효기 중 최종 농도가 1 g/L가 되도록 첨가하였다. 매회 글루코스 첨가 후, 다음 첨가를 행하기 전에, 설정 시간 동안 펌프 가동을 중단시켰다. DO 유지 반회분식 발효를 수행하였을 때 최대 OD가 약 160이 되었다. 그 후, 농도가 18 g/L/h 또는 24 g/L/h까지 되도록 충분한 글루코스를 첨가함으로써 DO 유지 제어기와 동등하도록 등속을 선택하였다. 등속 공급을 이용한 반회분식 발효 중에, DO가 40%로 급격히 상승하였을 때 소정의 등속으로 글루코스 공급을 시작하였다.
2,800 mL의 페른바흐(Fernbach) 플라스크에서 기본 배지 1 리터당 이 콜라이(pPW62) 1 바이알 및 15 ㎍/mL의 클로람페니콜을 이용하여 시드 배양을 시작하였다. 이 플라스크를 32℃에서 150 rpm으로 밤새(약 16 시간) 배양하였다. 최종 OD600은 보통 약 3이었다. 각각의 발효기에 접종하는 데 10% 접종물 분량을 이용하였다. 각각의 발효기는 3개의 러쉬톤 임펠러 및 고리 스파저를 이용하였다. 초기 설정 포인트: 온도 36℃, pH 7.00±0.05(7.4 N의 NH4OH를 이용하여 조절함), 공기 흐름: 약 1 vvm, DO: 20%. 단계적 진탕(최소: 150 rpm, 최대: 1,000 rpm) 및 기체 혼합 유닛을 통한 O2 첨가에 의해 DO를 제어하였다. 필요에 따라, PPG-2000을 수작업으로 첨가하여 발포를 억제하였다. 멸균 전에 배지에 0.35 mL/L의 AF를 첨가하였다. 발효 도중에, 매시간 샘플을 채취하여 글루코스, pH 및 OD60O 오프 라인을 모니터하였다. 1 mL의 샘플로부터 상청액을 조제하여 HPLC에 의한 유기산의 후속 분석을 위해 저장해 두었다.
결과:
등속 공급을 이용한 반회분식 발효:
도 1은 일정한 공급 속도에서의 OD, 글루코스 소비량 및 아세트산 축적량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 최대 OD 158 및 150은 각각 24 g 글루코스/L/h 및 18 g 글루코스/L/h의 일정한 공급 속도에서 얻어졌다. 24 g/L/h의 공급 속도를 이용하였을 때 발효 중에 28 g/L의 다량의 글루코스가 축적되었다. 18 g/L/h의 공급 속도를 이용하였을 때 글루코스는 12 g/L까지 축적된다. 두 경우 모두에서 아세트산은 거의 생성되지 않았다(즉, 1.5 g/L 미만). 지수 성장기는 OD 100 가까이에서 종료되었다. 두 경우 모두에서 비성장 속도는 약 0.60(hr-1)이었다.
글루코스 축적량을 줄이기 위해, 16.4 g/L/h 및 15 g/L/h의 저속의 일정한 공급 속도를 조사하였다. 도 2는 상기 일정한 공급 속도에서의 OD, 글루코스 소비 량 및 아세트산 축적량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 최대 OD는 각각 142 및 147이었다. 이전 실시에서와 같이, 글루코스의 축적량이 이전의 실험들에서보다 훨씬 더 적긴 했지만, 더 빠른 공급 속도를 이용한 배양에서 더 많은 글루코스가 축적되었다. 16.4 g/L/h의 발효시에는 약 8 g/L의 글루코스가 축적되었고 15 g/L/h의 발효시에는 5.4 g/L의 글루코스가 축적되었다. 두 경우 모두에서 아세트산은 거의 생성되지 않았다(예컨대 1.5 g/L 미만)(도 2 참조). 두 경우 모두에서 비성장 속도는 약 0.60(hr-1)이었다. 따라서, 비성장 속도는 15 g/L/h∼24 g/L/h의 공급 속도에 의해 영향을 받지 않았다.
다양한 성장 OD에서의 유도:
아라비노스 유도에 15 g 글루코스/L/h의 일정한 공급 속도를 이용하였는데, 그 이유는 이것이 세포 밀도를 증가시키고 글루코스 및 아세트산 축적량을 감소시키기 때문이었다. 이 실험에서는, 중기 대수 성장기(OD 약 55)에서의 유도와 후기 대수 성장기(OD 약 80)에서의 유도를 비교하였다. 단순히 글루코스 공급을 아라비노스 공급으로 대체하고 13.4 g/L/h의 등속으로 아라비노스를 공급함으로써 배양물을 유도하였다. 3 시간에 걸쳐 각각의 배양물에 총 40 g/L의 아라비노스를 첨가하였다. 유도 후, SDS-PAGE에 의한 rLP2086 분석, HPLC에 의한 유기산 및 아라비노스 분석을 위해 매시간마다 샘플을 채취하였다.
도 3은 OD 약 55 및 약 88에서 유도되었을 때의 OD 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 최대 OD 및 rLP2086 수율 둘 다 세포가 OD 약 80에서 유도되었을 때 더 높았다(최대 OD: 101 대 84; 최대 수율: 1.8 g/L 대 1.2 g/L).
다양한 아라비노스 농도에서의 유도:
본 실험의 목적은 배양물에 공급된 아라비노스의 총량을 평가하고 배양물에 공급된 아라비노스의 총량의 감소가 여전히 rLP2086 발현을 증가시키는지를 조사하기 위한 것이었다. 3 시간에 걸쳐 각각 서로 다른 공급 속도로 4종의 상이한 배양물에 아라비노스 농축물을 공급하여, 최종 아라비노스 농도가 10 g/L, 20 g/L, 30 g/L 및 40 g/L가 되도록 하였다. 모든 배양물은 OD600 약 80에서 유도되었다. 도 4는 OD 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 표 5에는 4 가지 조건 각각에 대한 OD 및 rLP2086 수율이 요약되어 있다. 이것은 아라비노스 총 첨가량 10 g/L에 대한 최대 rLP2086 수율이 1.2 g/L; 아라비노스 총 첨가량 20 g/L에 대한 최대 rLP2086 수율이 1.6 g/L; 아라비노스 총 첨가량 30 g/L에 대한 최대 rLP2086 수율이 1.7 g/L; 아라비노스 총 첨가량 40 g/L에 대한 최대 rLP2086 수율이 2.0 g/L임을 보여준다. 20 g/L∼40 g/L의 아라비노스 공급은 유사한 rLP2086 수율을 산출하였으나, 10 g/L의 아라비노스는 훨씬 더 적은 양의 rLP2086(즉, 1.2 g/L)을 생성하였다. 이러한 결과들은 rLP2086의 생산성을 저하시키지 않으면서 유도를 위해 첨가되는 아라비노스의 총량을 40 g/L에서 20 g/L로 줄일 수 있음을 시사한다. 따라서, 아라비노스 사용량의 감축은, 특히 아라비노스의 높은 단가(약 $500/kg US)를 고려할 때 비용 효율이 더 크다.
[표 5]
다양한 아라비노스 농도를 이용한 유도
로트 아라비노스 총 공급량(g/L) 최대 rLP2086(g/L)
X-BRN05-027 10 1.2
X-BRN05-024 20 1.6
X-BRN05-025 30 1.7
X-BRN10-114 40 2.0
아라비노스 첨가 방법 비교:
본 실험은 유도를 위해 아라비노스에 적용될 때 연속식 공급 방법이 단순한 회분식 첨가 방법에 비해 우수한지를 조사하기 위해 수행되었다. 실시 X-BRN05-039에서는, OD가 약 80일 때 20 g/L의 아라비노스를 경시적으로 공급하는 것이 아니라 한꺼번에 발효기에 첨가하였다. 도 5는 OD, 글루코스 및 아라비노스 소비량 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 최대 1.3 g/L의 rLP2086이 얻어졌다. 조작이 더 단순하긴 하지만 아라비노스의 회분식 첨가는 연속식 공급보다 더 적은 양의 rLP2086을 생산하였다. 따라서, 연속식 아라비노스 공급 방법이 단순한 회분식 첨가에 비해 우수하다.
아라비노스 공급 속도를 줄이는 것에 의해 아라비노스가 더 효율적으로 사용될 수 있는지를 조사하기 위해, 3.3 g 아라비노스/L/h의 공급 속도와 6.7 g 아라비노스/L/h의 공급 속도를 비교하였다. 도 6은 OD 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 3 시간에 걸쳐 6.7 g/L/h의 공급 속도로 제1 배양물에 아라비노스 농축물을 공급하고, 6 시간에 걸쳐 3.3 g/L/h의 공급 속도로 제2 배양물에 아라비노스 농축물을 공급하였다. 두 배양물에 있어서, 아라비노스의 총 첨가량은 20 g/L였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 두 조건은 동일한 양의 최대 rLP2086(즉, 2.2 g/L)을 생산하였으나, 생산 역학에 있어서는 차이가 있었다. 공급 속도가 빠를수록 생산 속도가 빨라졌다. 각각 6.7 g/L/h의 공급 속도와 3.3 g/L/h의 공급 속도로 유도한 후 3 시간째와 6 시간째 최대 rLP2086에 도달하였다. 더 고속의 공급 속도(즉, 6.7 g/L/h)를 이용하는 것의 장점은, 생산 단가(예를 들어, 효용 비용)가 더 저속의 공급 속도를 이용하는 경우보다 더 고속의 공급 속도를 이용할 때 더 저감된다는 것이다.
유도 시간이 rLP2086 발현 수율에 미치는 효과:
최적 회수 시점을 결정하기 위해, 정상 공급 프로필(3 시간에 걸친 20 g/L의 아라비노스 공급)을 6 시간에 걸친 40 g/L의 공급으로 연장하였다. 실시 X-BRN05-028 및 X-BRN05-029에서, 세포를 각각 OD 약 55 및 약 OD 80에서 유도하였다. 도 7은 OD 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 아라비노스 공급이 3 시간에서 6 시간으로 연장되었지만, 흥미롭게도, 여전히 유도 후 약 3 시간째 최고 역가가 얻어졌다. 생성물 역가는 더 높은 OD에서 유도된 배양물에서 약간 더 높았다. OD 약 55에서의 유도시 최대 rLP2086 수율은 2.0 g/L(X-BRN05-028)인 반면, OD 약 80에서의 유도시 최대 rLP2086 수율은 2.4 g/L(X-BRN05-029)였다. 이러한 결과는 유도 후 3 시간째 세포를 회수해야 함을 시사한다.
염 함유 공급액과 염 비함유 공급액의 비교:
글루코스 공급액 및 아라비노스 공급액에서 첨가된 염이 필수적인지를 조사하기 위해, 염 비함유 글루코스 공급액 및 아라비노스 공급액을 표준 글루코스 + 염(즉, K2HPO4/KH2PO4 + (NH4)2SO4) 공급액 및 아라비노스 + 염 공급액과 비교하였다. 두 배양물 모두에 있어서, 20 g/L의 아라비노스를 3 시간에 걸쳐 공급하였다. 성장 및 rLP2086 생산 프로필은 매우 유사하였다. 최대 rLP2086 수율은 공급액에 염을 첨가하였을 때 1.8 g/L였고, 염 없이 글루코스 및 아라비노스 공급액을 제조하였을 때 2.0 g/L였다. 이러한 결과는 글루코스 및 아라비노스 공급액에 염을 첨가할 필요가 없음을 시사한다.
서브패밀리 B 균주에 대해 등속 공급을 이용한 반회분식 발효:
15 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 기본 배지 1 L에 해동시킨 활성 시드 1 mL를 접종하여 시드 배양을 시작하였다. 이 배양물을 2.8 L의 페른바흐 플라스크에서 배양하여 32℃ 및 150 rpm에서 약 16 시간 동안 항온처리하였다. 최종 OD600은 약 3.0이었다. 350 mL 시드 배양물을 클로람페니콜을 함유하지 않고 3 g/L의 (NH4)2SO4를 함유하는 3.15 L의 기본 배지로 무균 상태에서 옮겼다. 발효액은 pH 7.0±0.05(7.4 N의 NH4OH로 조절), 온도 36℃, DO 20% 및 공기 흐름 1 vvm으로 제어하였다. DO는 단계적 진탕(최소: 150 rpm, 최대: 1,000 rpm) 및 산소 첨가로 제어하였다. 발포를 억제하기 위해 소포제 PPG-2000을 자동적으로 첨가하였다. 발효 중에, 매시간마다 샘플을 채취하여 글루코스와 OD 오프 라인을 모니터하였다. 접종 후, DO가 약 100%에서 20%로 떨어졌으며, 그 후 20%에서 유지되었다. DO가 20%에서 40%를 초과하여 급격히 상승하였을 때[일반적으로 6 시간의 경과 발효 시간(Elapsed Fermentation Time; EFT)], 글루코스(염 비함유) 공급 펌프가 15 g/L/h 의 공급 속도로 가동되었다. 도 8에 도시된 바와 같이, 글루코스는 6 시간 EFT에서 완전히 고갈되었으며, 이로 인해 DO가 급격히 상승하였다. OD가 약 40에 도달하였을 때 30분마다 샘플을 채취하였다. OD 90에서 글루코스 공급을 중단하고 13.4 g/L/h의 속도로 아라비노스 공급을 시작하였다. 아라비노스(염 비함유) 공급(즉, 총 20 g/L의 아라비노스 첨가) 3 시간 후, 아라비노스 공급을 중단하고 1 시간 동안 더 발효를 지속하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, OD 102에 도달하였으며 SDS-PAGE에 기초할 때 2.0 g/L의 MnB rLP2086이 발현되었다(도 9 참조). 피크는 유도 3 시간 후에(즉, 약 12 시간 EFT) 나타났다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯은 발현된 단백질이 확실히 서브패밀리 B rLP2086임을 보여주었다.
MnB rLP2086 서브패밀리 A 균주에 대한 반회분식 발효 공정의 적용:
rLP2086 서브패밀리 B에 이용된 반회분식 발효 공정이 rLP2086 서브패밀리 A에 적용될 수 있는지를 조사하기 위해, 서브패밀리 B 균주에 대해 확립된 절차를 이용하여 공정을 수행하였다. 도 10은 OD, 글루코스 및 아라비노스 소비량 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 서브패밀리 A에 대한 성장 및 rLP2086 생산 프로필은 서브패밀리 B에 대해 얻어진 것과 유사하였다(도 8과 비교). SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯은 발현된 단백질이 확실히 서브패밀리 A rLP2086임을 보여주었다(도 11 참조). 표 6은 6 가지의 상이한 서브패밀리 A 실시에 대한 최대 OD 및 rLP2086 발현 수율을 제시한다. 최대 rLP2086 발현 수율의 범위는 1.5∼2.1 g/L(평균 최대 수율: 1.8±0.2 g/L)였으며, 이는 rLP2086 서브패밀리 B를 생산하는 데 이용되었던 반회분식 발효로부터의 결과와 유사하였다. 따라서, 서브패밀리 B 균주에 대해 개발되었던 반회분식 발효는 서브패밀리 A 균주에도 적합하다.
[표 6]
서브패밀리 A rLP2086의 최대 발현 수율 및 OD
로트 최대 rLP2086(g/L) 최대 OD
X-BRN10-118 1.9 104
X-BRN10-119 1.9 104
X-BRN10-120 1.6 100
X-BRN05-042 1.5 100
X-BRN05-043 2.0 77
X-BRN10-121 2.1 92
아라비노스 유도 중 글루코스와 아라비노스의 이중 공급:
rLP2086 생산량을 감소시키지 않은 채 아라비노스 필요량을 줄이기 위해, 유도 기간 동안의 글루코스와 아라비노스의 이중 공급을 조사하였다. 이 방법은 3 시간에 걸쳐 10 g/L의 아라비노스(통상적인 양의 절반)를 공급하는 한편, 유도 단계 중에 글루코스 공급을 표준 글루코스 공급 속도의 25%(3.75 g/L/h), 50%(7.5 g/L/h) 및 100%(15 g/L/h)로 계속하였다. 모든 공급액에 있어서, 글루코스와 아라비노스는 첨가제 없이 제조하였다.
도 12a, 12b 및 12c는 서브패밀리 B 세포 성장, 글루코스, 아라비노스, 아세트산 농도 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 3 가지의 실시 모두 OD 약 80에서 유도되었다. 도 12a에 도시된 바와 같이, 100% 글루코스 공급 실시의 OD는 유도 후 계속 상승하여 117에서 최고점에 도달한 반면, 50% 실시는 유도 후 106에서 최고점에 도달하였고(도 12b), 25% 실시는 유도 후 약 100에서 유지되었다(도 12c). 상기 100% 글루코스 공급은 유도 후 3 시간 경에 글루코스 및 아라비노스를 축적하기 시작하였다. 상기 50% 글루코스 실시는 단지 마지막 샘플에서 소 량의 글루코스만을 나타내었다(기록 = 0.21 g/L). 상기 25% 글루코스 실시에서는 글루코스가 축적되지 않았다. 3 가지의 실시 중 어느 것도 아라비노스를 축적시키지 않았다. 상기 100%(도 12a) 및 50%(도 12b) 글루코스 공급 실시는 각각 약 1.5 g/L 및 1.7 g/L의 rLP2086을 생산한 반면, 상기 25%(도 12c) 실시는 2.1 g/L 이상의 rLP2086을 생산하였다. 상기 100% 실시의 생산량은 아라비노스가 고갈되기 전에 최고점에 도달하였는데, 이는 rLP2086 발현이 글루코스 및 아세트산의 축적에 의해 억제되었을지도 모른다는 것을 시사한다. 상기 50% 실시의 생산량은 대략 아라비노스가 고갈되는 시점에 최고점에 도달하였으며, 상기 25% 실시의 생산량은 아라비노스가 고갈된 후에 최고점에 도달하였는데, 이는, 글루코스 농도가 최소 수준으로 제어되는 한 2086 발현이 억제되지 않을 수 있음을 시사한다(도 12b 및 12c에서는 글루코스가 축적되지 않았음). 상기 배양물들에 단지 10 g/L의 아라비노스를 공급하였음에도 불구하고, 이들의 rLP2086 생산량은 20 g/L를 공급하였을 때와 유사하였다. 글루코스와 아라비노스의 동시 공급은 아라비노스 소비량을 50% 감소시킬 수 있으며, 여전히, 유도 중에 글루코스 농도를 낮은 수준으로 제어한 경우와 동일한 rLP2086 수율을 달성한다. 따라서, 화학 물질의 비용이 현저히 저감될 수 있다.
아라비노스 소비량을 추가로 줄이고 rLP2086 수율을 추가로 높일 수 있는지를 조사하기 위해, 다양한 글루코스 공급 속도, 아라비노스의 총 공급량 및 유도 OD를 조사하였다. 표 7은 이러한 조건들의 여러 가지 조합을 제시한다. 2.25∼7.5 g/L/h의 글루코스 공급 속도와 1.7∼6.7 g/L/h의 아라비노스 공급 속도는 rLP2086 수율에 유의적으로 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 80∼105의 OD에서의 유도는 유사한 rLP2086 수율을 산출한다.
[표 7]
상이한 글루코스 공급 속도, 상이한 아라비노스 첨가량 및 다양한 OD에서의 유도를 이용하였을 때의 최대 OD 및 rLP2086
로트 번호 글루코스 공급 속도 (g/L/h) 아라비노스 공급 속도 (g/L/h) 아라비노스 공급량 유도 OD 최대 OD 최대 rLP2086 (g/L)
X-BRN10-127 3.75 1.7 3 시간 동안 5 g/L 74 86 1.6
X-BRN05-056 3.75 3.3 3 시간 동안 20 g/L 79 122 2.8
X-BRN05-058 3.75 1.7 6 시간 동안 10 g/L 94 122 3.0
X-BRN10-129 3.75 6.7 3 시간 동안 20 g/L 110 124 2.7
X-BRN05-059 3.75 3.3 6 시간 동안 20 g/L 105 126 2.9
X-BRN05-061 5.25 3.3 6 시간 동안 20 g/L 102 112 2.6
X-BRN10-130 2.25 3.3 6 시간 동안 20 g/L 93 108 2.4
실시예 3: 반회분식 발효의 100 L 규모로의 확장
15 ㎍/mL의 클로람페니콜을 함유하는 2×1 L의 기본 배지에 해동시킨 활성 시드 1 mL(즉, 1 바이알)를 접종하여 시드 배양을 시작하였다. 2.8 L의 페른바흐 플라스크의 배양물을 회전식 진탕기에서 32℃ 및 150 rpm으로 약 16 시간 동안 배양하였다.
밤새 배양한 2개의 1 L 페른바흐 시드 배양물을, 클로람페니콜 비함유의 70 L의 기본 배지를 함유하는 150 L의 발효기로 무균 상태에서 옮겼다. 150 L의 기본 배지 중 발효액은 pH 7.0±0.05(7.4 N의 NH4OH로 조절), 온도 36℃, DO 20% 및 공기 흐름 1 vvm으로 제어하였다. DO는 단계적 진탕 및 산소 첨가로 제어하였다. 발포를 억제하기 위해 소포제 PPG-2000을 자동적으로 첨가하였다. 발효 중에, DO는 약 100%에서 20%로 떨어졌으며, 20%에서 유지되었다. 글루코스가 고갈되었음을 신호하는, OD가 20%에서 40%를 초과하여 급격히 상승하였을 때(일반적으로 OD 약 20), 공급 펌프가 가동되어 글루코스 농축물(즉, 500 g/L)을 15 g 글루코스/L(브로스)/h의 속도로 공급하였다. 발효 중에, 매시간마다 샘플을 채취하여 글루코스 및 OD 오프 라인을 모니터하였다. OD가 약 40에 도달하였을 때 30분마다 샘플을 채취하였다. OD가 약 80에 도달하자, 글루코스 공급을 중단하고 아라비노스 공급을 시작하여(예를 들어, 500 g/L의 아라비노스 농축물) 6.7 g 아라비노스/L(브로스)/h의 속도로 3 시간 동안 지속하였다.
도 13a는 100 L 규모에서의 서브패밀리 B 세포 성장, 글루코스 소비량, 아세트산 축적량 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 100 L 규모에서의 발효 프로필은 소규모에서 관찰되는 것과 유사하였다. 최대 OD 99 및 최대 수율 1.9 g/L의 rLP2086이 얻어졌다. 이러한 결과들은 반회분식 발효가 규모 확장성이 있음을 입증한다.
도 13b는 100 L 규모에서의 서브패밀리 A 세포 성장, 글루코스 소비량, 아세트산 축적량 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 100 L 규모에서의 발효 프로필은 소규모에서 관찰되는 것과 유사하였다. 최대 OD 96 및 최대 수율 2.0 g/L의 rLP2086이 얻어졌다. 이러한 결과들은 반회분식 발효가 규모 확장성 및 신뢰성(robust)이 있음을 입증한다.
도 14a는 100 L 규모에서의 글루코스와 아라비노스의 이중 공급을 이용한 서 브패밀리 B 세포 밀도, 글루코스, 아라비노스, 아세트산 농도 및 rLP2086 수율의 시간에 따른 추이를 보여준다. 유도 중에, 글루코스 공급과 아라비노스 공급 각각에 대해 공급 속도를 3.75 g/L/h 및 1.67 g/L/h로 제어하였다. 아라비노스와 글루코스의 이중 공급은 5 시간 동안 행하였다. 최대 OD 90 및 최대 수율 1.8 g/L의 rLP2086이 얻어졌다. 최대 rLP2086 수율은 4 시간 유도시 나타났다. 서브패밀리 B에 대한 평균 최대 OD 및 평균 최대 rLP2086 수율은 각각 84.8±6.8 g/L 및 1.6±0.3 g/L였다. 이러한 결과들은 유도 단계 중 글루코스와 아라비노스의 이중 공급을 이용한 반회분식 발효가 규모 확장성이 있음을 입증한다.
도 14b는 100 L 규모에서의 서브패밀리 A 세포 성장, 글루코스 소비량, 아세트산 축적량 및 rLP2086 생산량의 시간에 따른 추이를 보여준다. 발효는 바로 앞 단락에서와 동일한 조건에서 행하였으며, 세포는 6 시간 동안 유도되었다. 최대 OD 89 및 최대 수율 1.8 g/L의 rLP2086이 얻어졌다. 최대 rLP2086 수율은 4 시간 유도시 나타났다. 서브패밀리 A에 대한 평균 최대 OD는 87.9±10.5였고 평균 최대 rLP2086 수율은 1.8±0.2 g/L였다. 이러한 결과들은 반회분식 발효가 규모 확장성 및 신뢰성이 있음을 입증한다.
본 발명을 다양한 실시형태 및 실시예와 관련하여 기술하였지만, 당업자라면 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않도록 본 발명에 다양한 변형이 가해질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (86)

  1. 재조합 박테리아 세포를 포함하는 배양물에 탄소원을 연속적으로 첨가하고 이 배양물이 역치 파라미터에 도달한 후에 이 배양물에 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는, 재조합 박테리아 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 역치 파라미터가 흡광도(OD), 용존 산소(DO), 배양 배지 중 영양물의 농도, 배양 배지에 첨가되는 탄소원의 총 농도, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 역치 파라미터가 상기 배양물의 흡광도(OD)인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 70∼약 110에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 70∼약 105에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 75∼약 85에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 80에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 유도 물질을 등속으로 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 DO 유지 공급(DO-stat feed)에 의해 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 pH 유지 공급(pH-stat feed)에 의해 상기 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유도 물질을 약 3.35 g/L/h∼약 16 g/L/h의 등속으로 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 DO 유지 공급에 의해 또는 pH 유지 공급에 의해 상기 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 4 g/L∼약 40 g/L인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 유도 물질 공급 중에 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 5 g/L∼약 20 g/L인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 유도 물질 공급 중에 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 7 g/L∼약 15 g/L인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 유도 물질 공급 중에 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 10 g/L인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 방법 개시 후 약 2 시간∼약 8 시간 동안 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법 개시 후 약 3 시간∼약 6 시간 동안 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 배양물에 상기 유도 물질을 첨가하기 시작한 후 약 2 시간∼약 8 시간째 상기 재조합 단백질을 단리하는 것을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 배양물에 상기 유도 물질을 첨가하기 시작한 후 약 3 시간∼약 6 시간째 상기 재조합 단백질을 단리하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 유도 물질이 아라비노스인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 유도 전에 상기 배양물에 상기 탄소원을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 유도 전과 중에 상기 배양물에 상기 탄소원을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하면서 상기 배양물에 상기 탄소원을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 70∼약 110에 도달할 때까지 상기 배양물에 상기 탄소원을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 탄소원이 당계 탄소원인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 당계 탄소원이 글루코스인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 유도 물질이 아라비노스인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 배양 배지에 상기 아라비노스를 연속적으로 첨가하면서 상기 배양 배지에 상기 글루코스를 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 80에 도달할 때까지 상기 글루코스를 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  28. (a) 유도성 프로모터 제어하에 재조합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 박테리아 숙주 세포에 도입하여 재조합 박테리아 세포를 형성하는 단계;
    (b) 상기 재조합 박테리아 세포를 배양 배지에 도입하여 세포 배양물을 형성하는 단계;
    (c) 상기 세포 배양물에 탄소원을 연속 공급물로서 첨가하는 단계;
    (d) 역치 흡광도(OD600) 도달에 대해 상기 세포 배양물 중의 세포 성장을 모니터하는 단계;
    (e) 역치 흡광도(OD600)에 도달하게 되면, 상기 세포 배양물에 상기 유도성 프로모터의 유도 물질을 연속 공급물로서 첨가하는 단계; 및
    (f) 상기 세포 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 단리하는 단계
    를 포함하는, 재조합 단백질의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 70∼약 110에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 70∼약 105에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 75∼약 85에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 80에 도달할 때 상기 배양물에 상기 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 유도 물질을 등속으로 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 DO 유지 공급에 의해 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 pH 유지 공급에 의해 상기 배양물에 첨가하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 유도 물질을 약 3.35 g/L/h∼약 16 g/L/h의 등속으로 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 DO 유지 공급에 의해 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 pH 유지 공급에 의해 상기 배양물에 첨가하는 것인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 4 g/L∼약 40 g/L인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 5 g/L∼약 20 g/L인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 7 g/L∼약 15 g/L인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 배양물에 첨가되는 상기 유도 물질의 총량이 약 10 g/L인 방법.
  39. 제28항에 있어서, 유도 물질 공급 개시 후 약 2 시간∼약 8 시간째 상기 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 단리하는 것을 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 유도 물질 공급 개시 후 약 3 시간∼약 6 시간째 상기 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 단리하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제28항에 있어서, 상기 탄소원과 상기 유도 물질 둘 다를 등속 공급하면서, 또는 상기 탄소원과 상기 유도 물질 둘 다를 DO 유지 공급에 의해 공급하면서, 또는 상기 탄소원과 상기 유도 물질 둘 다를 pH 유지 공급에 의해 공급하면서 상기 세포 배양물에 상기 탄소원을 첨가하는 것인 방법.
  42. 제28항에 있어서, 상기 유도 물질이 아라비노스인 방법.
  43. 제28항에 있어서, 상기 탄소원이 당계 탄소원인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 당계 탄소원이 글루코스인 방법.
  45. 제28항에 있어서, 상기 탄소원이 글루코스이고 상기 유도 물질이 아라비노스인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 세포 배양물에 상기 아라비노스를 연속적으로 첨가하면서 상기 세포 배양물에 글루코스를 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 세포 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 80에 도달할 때 까지 상기 세포 배양물에 글루코스를 연속적으로 첨가하는 것을 포함하는 방법.
  48. 재조합 박테리아 세포를 포함하는 배양물이 역치 파라미터에 도달한 후에 상기 배양물에 유도 물질을 연속적으로 첨가함으로써, 재조합 박테리아 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하며, 상기 박테리아 세포는 네이세리아 메닝기티디스(N. meningitidis) 혈청군 B의 유전자에 해당하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 재조합 단백질의 제조 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 역치 파라미터가 흡광도(OD), 용존 산소(DO), pH, 배양 배지 중 영양물의 농도, 배양 배지에 첨가되는 탄소원의 총 농도, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 역치 파라미터가 상기 배양물의 흡광도(OD)인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 유도 물질의 연속 공급은 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 70∼약 110에 도달할 때 개시하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 유도 물질의 연속 공급은 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 70∼약 105에 도달할 때 개시하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 유도 물질의 연속 공급은 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 75∼약 85에 도달할 때 개시하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 유도 물질의 연속 공급은 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 80에 도달할 때 개시하는 것인 방법.
  55. 제48항에 있어서, 상기 유도 물질을 약 3.35 g/L/h∼약 16 g/L/h의 등속으로 상기 배양물에 첨가하거나, 상기 유도 물질을 DO 유지 공급에 의해 첨가하거나, 상기 유도 물질을 pH 유지 공급에 의해 첨가하는 것인 방법.
  56. 제48항에 있어서, 유도 중에 상기 배양물에 첨가되는 유도 물질의 총량이 약 4 g/L∼약 40 g/L인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 유도 중에 상기 배양물에 첨가되는 유도 물질의 총량이 약 5 g/L∼약 20 g/L인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 유도 중에 상기 배양 배지에 첨가되는 유도 물질의 총량이 약 7 g/L∼약 15 g/L인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 유도 중에 상기 배양물에 첨가되는 유도 물질의 총량이 약 10 g/L인 방법.
  60. 제48항에 있어서, 상기 유도 물질 공급은 상기 방법 개시 후 약 2 시간∼약 8 시간 동안 지속하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 유도 물질 공급은 상기 방법 개시 후 약 3 시간∼약 6 시간 동안 지속하는 것인 방법.
  62. 제48항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 유도 물질 공급 개시 후 약 2 시간∼약 8 시간째 회수하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 재조합 단백질 생성물은 유도 물질 공급 개시 후 약 3 시간∼약 6 시간째 단리하는 것인 방법.
  64. 제48항에 있어서, 상기 배양 배지에의 상기 탄소원 공급은 상기 배양물에 유도 물질을 공급하는 동안 지속하는 것인 방법.
  65. 제48항에 있어서, 상기 유도 물질이 아라비노스인 방법.
  66. 제48항에 있어서, 상기 탄소원이 당계 탄소원인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 당계 탄소원이 글루코스인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 유도 물질이 아라비노스인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 배양물에 아라비노스를 등속 공급하면서 등속 공급으로, 또는 상기 글루코스와 상기 유도 물질 둘 다의 DO 유지 공급에 의해, 또는 상기 글루코스와 상기 유도 물질 둘 다의 pH 유지 공급에 의해 상기 배양물에 글루코스를 공급하는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 배양물에 아라비노스를 등속 공급하면서 등속 공급으로, 또는 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 80에 도달할 때까지 상기 글루코스와 상기 유도 물질 둘 다의 DO 유지 공급에 의해, 또는 상기 배양물의 세포 밀도가 OD600 약 80에 도달할 때까지 상기 글루코스와 상기 유도 물질 둘 다의 pH 유지 공급에 의해 상기 배양물에 글루코스를 공급하는 것인 방법.
  71. 제68항에 있어서, 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질이 지단백 질(rLP2086)을 포함하는 것인 방법.
  72. 제68항에 있어서, 상기 단백질이 비지질화 단백질을 포함하는 것인 방법.
  73. 제68항에 있어서, 상기 단백질이 메닝고코쿠스 2086 서브패밀리 A 단백질을 포함하는 것인 방법.
  74. 제68항에 있어서, 상기 단백질이 메닝고코쿠스 2086 서브패밀리 B 단백질을 포함하는 것인 방법.
  75. (a) 유도성 프로모터 제어하에 재조합 2086 단백질(P2086)을 코딩하는 발현 벡터를 박테리아 숙주 세포에 도입하여 재조합 박테리아 세포를 형성하는 단계;
    (b) 상기 재조합 박테리아 세포를 배양 배지에 도입하여 배양물을 형성하는 단계;
    (c) 상기 배양물에 탄소원을 첨가하는 단계;
    (d) 역치 흡광도(OD) 도달에 대해 상기 배양물 중의 세포 성장을 모니터하는 단계;
    (e) 상기 배양물의 세포 밀도가 흡광도 약 70∼110에 도달하게 되면, 상기 배양물에 상기 유도성 프로모터의 유도 물질을 연속적으로 첨가하는 단계; 및
    (f) 상기 유도 물질의 연속적 첨가를 개시한 지 약 3 시간∼약 6 시간 후 상 기 배양물로부터 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질을 단리하는 단계
    를 포함하는, 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질(P2086)의 제조 방법.
  76. 박테리아 배양물의 총 부피를 기준으로 약 1.5 g/L 이상의 밀도로 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질을 포함하는 박테리아 배양물을 포함하는 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질이 지질화 단백질인 조성물.
  78. 제76항에 있어서, 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질이 비지질화 단백질인 조성물.
  79. 제76항에 있어서, 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질이 2086 서브패밀리 A 단백질인 조성물.
  80. 제76항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 2086 서브패밀리 B 단백질인 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 배양물이 제2의 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 상기 제2의 2086 재조합 메닝고코쿠스 단백질이 2086 서브패밀리 A 단백질인 조성물.
  83. 제76항에 있어서, 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질의 밀도가 상기 박테리아 배양물의 총 부피를 기준으로 약 1.7 g/L 이상인 조성물.
  84. 제76항에 있어서, 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질의 밀도가 상기 박테리아 배양물의 총 부피를 기준으로 약 2.0 g/L 이상인 조성물.
  85. 제76항에 있어서, 상기 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질의 밀도가 상기 박테리아 배양물의 총 부피를 기준으로 약 3.0 g/L 이상인 조성물.
  86. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 재조합 메닝고코쿠스 2086 단백질을 포함하는 박테리아 배양물을 포함하는 조성물.
KR1020097002713A 2006-07-27 2007-07-21 재조합 단백질을 제조하기 위한 고세포 밀도 반회분식 발효방법 KR101419958B1 (ko)

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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
CN101535493A (zh) * 2006-07-27 2009-09-16 惠氏公司 用于生产重组蛋白质的高细胞密度补料-分批发酵方法
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
AU2011294776B2 (en) 2010-08-23 2016-02-04 Wyeth Llc Stable formulations of Neisseria meningitidis rLP2086 antigens
CA2809758C (en) 2010-09-10 2021-07-13 Wyeth Llc Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens
US9347080B2 (en) * 2011-01-31 2016-05-24 Novozymes A/S Use of browned glucose as a feed substrate
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
EP4043029A1 (en) 2012-03-09 2022-08-17 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
ES2728169T3 (es) * 2012-03-12 2019-10-22 Hanmi Science Co Ltd Procedimiento de cultivo de células de E. coli para alta densidad
ES2685894T3 (es) 2013-03-08 2018-10-15 Pfizer Inc. Polipéptidos de fusión inmunogénicos
MX369534B (es) 2013-09-08 2019-11-11 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y sus metodos.
RU2561467C1 (ru) * 2014-04-24 2015-08-27 Сергей Михайлович Юдин Способ получения препарата для повышения мясной и молочной продуктивности сельскохозяйственных животных (варианты) и препарат, полученный на его основе
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10322304B2 (en) * 2015-01-29 2019-06-18 Sandy Kronenberg Nasal air filter
RU2723045C2 (ru) 2015-02-19 2020-06-08 Пфайзер Инк. Композиции neisseria meningitidis и способы их получения
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
MX2019009011A (es) 2017-01-31 2019-09-26 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos.
US11991994B2 (en) 2019-10-30 2024-05-28 Future Fields Cellular Agriculture and Research LTD. Method for producing recombinant proteins in insects
CN117510596A (zh) * 2023-11-13 2024-02-06 中山迈托姆生物技术有限公司 一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺及其应用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4414329A (en) * 1980-01-15 1983-11-08 Phillips Petroleum Company Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities
US5672502A (en) 1985-06-28 1997-09-30 Celltech Therapeutics Limited Animal cell culture
GB8516415D0 (en) * 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
RU2111246C1 (ru) * 1992-06-03 1998-05-20 Дербышев Виктор Викторович Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов
AUPM772494A0 (en) 1994-08-30 1994-09-22 Austin Research Institute, The Improvements in production of proteins in host cells
AR005035A1 (es) * 1995-12-11 1999-04-07 Merck Patent Ges Mit Beschränkter Haftung Procedimiento para preparar proteinas recombinantes en e. coli, mediante fermentacion con gran concentracion de celulas.
AU722624B2 (en) 1996-09-06 2000-08-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
US6692961B1 (en) 1996-10-11 2004-02-17 Invitrogen Corporation Defined systems for epithelial cell culture and use thereof
RU2002114044A (ru) * 1999-10-29 2004-03-27 БАСФ Акциенгезельшафт (DE) L-пантолактон-гидролаза и способ получения d-пантолактона
AU2002219818B2 (en) * 2000-11-20 2007-08-16 Cargill, Incorporated 3-hydroxypropionic acid and other organic compounds
FI120310B (fi) 2001-02-13 2009-09-15 Valtion Teknillinen Parannettu menetelmä erittyvien proteiinien tuottamiseksi sienissä
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
CN1504575A (zh) * 2002-12-03 2004-06-16 怀德生技化学股份有限公司 以左旋阿拉伯糖诱导t7表达系统的控制方法
PL209009B1 (pl) * 2002-12-13 2011-07-29 Zymogenetics Inc Wektor ekspresyjny do otrzymywania białka IL-21, komórka prokariotycznego gospodarza i sposób otrzymywania białek
DE10305774A1 (de) * 2003-02-06 2004-08-26 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Methionin
US20070253964A1 (en) * 2003-04-16 2007-11-01 Zlotnick Gary W Novel Immunogenic Compositions for the Prevention and Treatment of Meningococcal Disease
CN100384998C (zh) * 2003-11-11 2008-04-30 浙江大学 重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法及其用途
US8227241B2 (en) * 2004-03-12 2012-07-24 Unigene Laboratories, Inc. Bacterial host cell for the direct expression of peptides
CN101535493A (zh) 2006-07-27 2009-09-16 惠氏公司 用于生产重组蛋白质的高细胞密度补料-分批发酵方法

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