PL209009B1 - Wektor ekspresyjny do otrzymywania białka IL-21, komórka prokariotycznego gospodarza i sposób otrzymywania białek - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny do otrzymywania białka lL-21, komórka prokariotycznego gospodarza i sposób otrzymywania białek.

Zwiększona dostępność i identyfikacja genów genomu ludzkiego i innych doprowadziły do zwiększonego zapotrzebowania na wydajną ekspresję i oczyszczanie zrekombinowanych białek. Ekspresja białek w bakteriach jest jak dotychczas najbardziej powszechnie stosowanym podejściem przy wytwarzaniu klonowanych genów. Z wielu powodów bardziej preferowana jest ekspresja w bakteriach, niż ekspresja w komórkach eukariotycznych. Na przykład, dużo łatwiej hoduje się bakterie niż komórki eukariotyczne. Dostępność precyzyjnych molekularnych narzędzi genetycznych i tysięcy mutantów czynią E. coli, jako gospodarza ekspresji, wyjątkowo użyteczną przy produkcji białek. Jednakże, wydajna produkcja białek funkcjonalnych w E. coli, szczególnie tych pochodzących z źródeł eukariotycznych, często była trudna.

IL-21 (uprzednio oznaczana jako Zalpha 11 Ligand) jest członkiem rodziny cytokin IL-2, która obejmuje również IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 i IL-15. Zostało wykazane, że białka tej rodziny posiadają właściwości zarówno antyrakowe, jak i antywirusowe. IL-21 jest wytwarzana przez pomocnicze komórki T, które są kluczowymi regulatorami odporności. W oparciu o wzorzec ekspresji pokrewnych jej receptorów i podawanie białka wykazano, że IL-21 aktywuje CD8⁺ cytotoksyczne komórki T i komórki naturalnych zabójców (ang. natural killer) (NK), dwa rodzaje limfocytów, które niszczą rakowe i zainfekowane wirusem komórki. IL-21 stymuluje również wybrane kategorie komórek B. (Parrish i wsp., Nature 408: 57-63, 2000).

Rekombinant IL-21 był wytwarzany w prokariotycznych komórkach, w szczególności w E. coli. Białko wytwarzane przez bakterie nie jest glikozylowane i jest wytwarzane w postaci agregatów. Wytwarzanie IL-21 w E. coli wymaga, żeby umożliwić rozpuszczenie zagregowanych białek z nierozpuszczalnych ciałek wtrętowych oraz ich renaturowanie lub powtórne zwinięcie. Bez renaturacji specyficzna aktywność zrekombinowanego białka będzie znacznie zredukowana.

Pomimo postępów w ekspresji zrekombinowanych białek w gospodarzach bakteryjnych, istnieje potrzeba znalezienia ulepszonych sposobów wytwarzania aktywnych biologicznie i oczyszczonych zrekombinowanych białek IL-21 w prokariotycznych systemach, co w rezultacie daje wyższą wydajność wytwarzania białka.

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza wektor ekspresyjny do wytwarzania białka IL-21 zawierającego połączone w sposób umożliwiający działanie: prokariotyczne źródło replikacji, element inicjacji transkrypcji DNA i sekwencję polinukleotydową jak pokazano w SEQ ID NO: 27 oraz terminator transkrypcji.

W korzystnym rozwiązaniu wektor zawiera wskaźnik umożliwiający selekcję.

Bardziej korzystnie, wspomniany wskaźnik zawiera gen oporny na kanamycynę.

Wektorem ekspresyjnym jest wektor pTAP337.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza prokariotyczne komórki gospodarza transformowane wektorami ekspresyjnymi opisanymi jako zawierające SEQ ID NO: 27, sekwencję polinukleotydową kodującą polipeptyd z SEQ ID NO: 28 lub wektor pTAP337. W innych zastosowaniach szczepem gospodarza jest szczep W3110 E. coli lub szczep zGOLD1, zdeponowany w American Type Culture Collection w Manassas, VA pod numerem dostępu PTA-4853.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza sposoby wytwarzania białek IL-21 w warunkach, w których IL-21 ulega ekspresji.

Sposób według wynalazku obejmuje hodowanie komórek gospodarza, w których zachodzi ekspresja IL-21 po transformacji wektorem pTAP337. W innym zastosowaniu sposób zawiera hodowanie komórek gospodarza transformowanych wektorem ekspresyjnym zawierającym SEQ ID NO: 27. Sposób zawiera również odzyskiwanie komórek gospodarza z pożywki hodowlanej, a następnie wyizolowanie białka IL-21 z komórek gospodarza.

W innych aspektach niniejszy wynalazek dostarcza sposoby wytwarzania IL-21 zawierające etapy opisane powyżej, w procesie półciągłej fermentacji lub w procesie fermentacji okresowej.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza sposoby wytwarzania białek IL-21 obejmujące hodowlę komórek gospodarza, jak opisano powyżej, w butelce do wytrząsania do uzyskania OD600 od 5 do 20 w pożywce hodowlanej, założenie hodowli w naczyniu fermentacyjnym poprzez pobranie z naczynia do wytrząsania 1-12% v/v pożywki zawierającej komórki gospodarza, hodowanie

PL 209 009 B1 komórek gospodarza na pożywce hodowlanej przy pH 6,2 do 7,2, w której roztwór zasilający jest dostarczany do naczynia fermentacyjnego przed 15 godziną upływu czasu fermentacji (EFT), dodawanie do naczynia fermentacyjnego czynnika indukującego w 20 do 30 godzinie EFT i zbieranie komórek gospodarza w 48 do 56 godzinie EFT. W jednym z zastosowań czynnikiem indukującym jest tiogalaktopiranozyd izopropylowy (IPTG) o stężeniu 0,5 do 2 mM. W innym zastosowaniu roztwór zasilający zawiera węglowodan wybrany z grupy zawierającej glicerol i glukozę i jest podawany w ilości 5 do 15 gramów węglowodanu na godzinę. W innym zastosowaniu glicerol w roztworze zasilającym jest w stężeniu 40 do 70% v/v glicerolu lub glukoza jest w stężeniu 40 do 70% w/v glukozy. W następnych zastosowaniach glicerolu jest około 70% v/v lub glukozy jest około 60% w/v.

W jednym z aspektów niniejszy wynalazek dostarcza sposoby wytwarzania IL-21 obejmujące posiewanie naczynia szczepionką zawierającą komórki gospodarza E. coli W3110, w których zachodzi ekspresja polipeptydu IL-21, jak pokazano w SEQ ID NO: 28 lub komórki gospodarza E. coli W3110 zawierające wektor pTAP337, w którym białko IL-21 ulega ekspresji i z pożywką hodowlaną zawierającą około 5 g/l glicerolu, hodując szczepionkę w pożywce hodowlanej przez 16 do 20 godzin przy około 30°C, transferując szczepionkę wyhodowaną w pożywce wzrostowej do fermentora okresowego przy stężeniu szczepionki 0,5 do 5% v/v, fermentując mieszaninę fermentacyjną przy około 37°C i pH około 6,8 z około 2% glicerolem, wprowadzając zasilanie glukozą przez około 8 godzin EFT, około 9,5 g glukozy/1 itr/godzinę i kontynuując aż do końca trwania fermentacji, dodając IPTG w około 24 godzinie EFT do końcowego stężenia 0,5 do 2 mM, przeprowadzając fermentację z IPTG około 28 godzin, zbierając bulion fermentacyjny z fermentora, dodając taką samą objętość wody do bulionu fermentacyjnego i homogenizując i odwirowując by zebrać osad komórkowy lub zawiesinę komórkową zawierającą materiał białkowy IL-21.

W innym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza sposoby izolowania nierozpuszczalnego białka IL-21 zawierającego sekwencję reszt aminokwasów, jak pokazano na SEQ ID NO: 28, zawierające wydzielenie z osadu komórkowego lub zawiesiny nierozpuszczalnego w wodzie białka IL-21, rozpuszczając nierozpuszczalny materiał IL-21 w rozpuszczalniku chaotropowym, rozcieńczając rozpuszczalnik chaotropowy i powtórnie zwijając białko IL-21 oraz izolując białko IL-21, gdzie wyizolowane białko IL-21 jest zdolne do biologicznej aktywności. W jednym z zastosowań wynalazku wyizolowane białko IL-21 jest czyste w co najmniej 90%. W innym zastosowaniu, wyizolowane białko IL-21 jest czyste w co najmniej 90% i ma poziom endotoksyny niższy niż 10 jednostek endotoksyny na mg białka IL-21.

Wynalazek można zastosować do dostarczenia metody izolowania nierozpuszczalnego białka IL-21 zawierającego sekwencję reszt aminokwasów, jak pokazano na SEQ ID NO: 28, zawierający wydzielenie z bulionu fermentacyjnego osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej, które zawierają nierozpuszczalny w wodzie materiał białkowy IL-21, homogenizowanie osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej, by zebrać ciałka wtrętowe, rozpuszczenie nierozpuszczalnego materiału białkowego IL-21 w rozpuszczalniku chaotropowym zawierającym sól guanidyny, rozcieńczenie rozpuszczalnika chaotropowego przez dodanie buforu zwijającego zawierającego sole argininy i mieszaninę składników redukujących i utleniających, wyizolowanie białka IL-21 poprzez usunięcie nie zwiniętych i zagregowanych białek przez filtrowanie i oczyszczanie powtórnie zwiniętych białek na kolumnie kationowymiennej, w której wyizolowana i oczyszczona IL-21 jest zdolna do aktywności biologicznej.

W innym aspekcie niniejszy wynalazek dostarcza sposób izolowania nierozpuszczalnego biał ka IL-21 zawierającego sekwencję reszt aminokwasów, jak pokazano na SEQ ID NO: 28, zawierający wydzielenie z bulionu fermentacyjnego osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej, które zawierają nierozpuszczalny w wodzie materiał IL-21, homogenizowanie osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej, by zebrać ciałka wtrętowe, rozpuszczenie nierozpuszczalnego materiału białkowego IL-21 w rozpuszczalniku chaotropowym zawierającym sól guanidyny, rozcieńczenie rozpuszczalnika chaotropowego przez dodanie buforu zwijającego zawierającego sole argininy i mieszaninę składników redukujących i utleniających, wyizolowanie białka IL-21 poprzez usunięcie nie zwiniętych i zagregowanych białek przez filtrowanie i oczyszczanie powtórnie zwiniętych białek na kolumnie kationowymiennej i oczyszczenie eluatu IL-21 na kolumnie oddziaływań hydrofobowych, na której wyizolowane i oczyszczone biał ko IL-21 jest zdolne do biologicznej aktywnoś ci.

W niniejszym wynalazku opisuje się takż e izolowanie nierozpuszczalnego biał ka IL-21, zawierającego sekwencję reszt aminokwasów, pokazanych na SEQ ID NO: 28, obejmujące wydzielenie z bulionu fermentacyjnego osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej, która zawiera nierozpuszczalny w wodzie materiał białkowy IL-21, homogenizowanie osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej, by zebrać białka wtrętowe, rozpuszczanie nierozpuszczalnego materiału białkowego IL-21 w roz4

PL 209 009 B1 puszczalniku chaotropowym zawierającym około 6M chlorowodorek guanidyny, 40 mM ditiotreitol (DTT) przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej, powtórne zwinięcie rozpuszczonych ciałek wtrętowych w roztworze przez rozcieńczenie, co najmniej, 20 razy w buforze powtórnie zwijającym zawierającym parę utleniacz reduktor około 2 mM DTT, 4 mM cystyna, doprowadzenie pH do około 5,5 20% kwasem octowym i pozostawienie roztworu do przereagowania przez co najmniej 5 godzin, rozcieńczanie roztworu około 1 + 1,4 objętościami 25 mM octanu pH 5,5, sączenie roztworu, nałożenie roztworu na kolumnę wypełnioną żywicą Tosohaas SP-550C zrównoważoną do pH 5,5 przy użyciu buforu octanu sodowego, przemycie wypełnionej żywicą kolumny około 0,4M chlorkiem sodu, przemycie kolumny wypełnionej żywicą około 0,75M chlorkiem sodu, by wyeluować związane białko IL-21, dodanie siarczanu amonu do stężenia około 1,5M do eluatu i sączenie eluatu, nałożenie eluatu na kolumnę Tosohaas butyl 650-M zrównoważoną 1,5M siarczanem amonu, 0,05 chlorkiem sodu w buforze octanu sodu, rozcieńczenie eluatu na kolumnie SP Sepharose HP zrównoważonej buforem octanu sodu, przemycie kolumny 20 objętościami kolumny liniowym gradientem chlorku sodu o stężeniu od 0,3 do 0,7M, zagęszczenie białka IL-21 i wymiana buforu na bufor formułujący używając ultrafiltracji z przepł ywem stycznym. W innych zastosowaniach powyż sze sposoby izolowania nierozpuszczalnego białka IL-21 zawierają pomiar biologicznej aktywności przy użyciu testu wiązania do receptora IL-21.

Na podstawie niniejszego wynalazku można utworzyć kompozycję zawierającą białko IL-21 zawierające polipeptyd, jak pokazano w resztach aminokwasów 2-163 z SEQ ID NO: 28 przy stężeniu białka IL-21 około 10 mg/ml w około 10 mM histydynie, 4,7% mannitolu przy pH 5,3.

Opis rysunków

Rysunek 1 przedstawia plazmid ekspresyjny pTAP337, który zawiera sekwencję nukleotydową IL-21 o zoptymalizowanych kodonach. IL-21 jest oznaczeniem ludzkiego zalphall lig. Plazmid został zdeponowany w American Type Culture Collection w Manassas, VA, pod numerem depozytowym PTA-4853.

Opis wynalazku

W celu uł atwienia zrozumienia wynalazku został y przyję te nastę pują ce definicje.

„Kwas nukleinowy” lub „cząsteczka kwasu nukleinowego” odnosi się do polinukleotydów, takich jak kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) lub kwas rybonukleinowy (RNA), oligonukleotydów, fragmentów wytworzonych w łańcuchowej reakcji polimerazy (PGR) i fragmentów wytworzonych przez jakąkolwiek ligację, rozszczepianie, działanie endonukleozy i działania egzonukleazy. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą składać się z monomerów, które są naturalnie występującymi nukleotydami (takimi jak DNA i RNA) lub analogów naturalnie występujących nukleotydów (np. α-enancjomeryczne formy naturalnie występujących nukleotydów), lub kombinacji obu. Zmodyfikowane nukleotydy mogą mieć zmiany w cząsteczkach cukru /lub cząsteczkach zasad pirymidynowych lub urynowych. Zmiany cukrowe obejmują na przykład zamianę jednej lub więcej grup hydroksylowych halogenami, grupami alkilowymi, aminami i grupami azydkowymi, lub cukry mogą mieć funkcję eterów lub estrów. Co więcej, cała cząsteczka cukru może być zastąpiona podobnymi sferycznie i elektronowo strukturami, takimi jak azacukry i karbocykliczne analogi cukrów. Przykłady modyfikacji w cząsteczce zasadowej obejmują alkilowane puryny i pirymidyny, acylowane puryny i pirymidyny lub inne dobrze znane substytuty heterocykliczne. Monomery kwasu nukleinowego mogą być połączone wiązaniem fosfodiestrowym lub analogami takich połączeń, analogi połączeń fosfodiestrowych obejmują fosforotionian, difosforotionian, selenofosforan, diselenofosforan, anilinotiofosforan, anilinofosforan, amidofosforan i podobne. Termin „cząsteczka kwasu nukleinowego” obejmuje również tak zwane „peptydowe kwasy nukleinowe”, które zawierają naturalnie występujące lub zmodyfikowane zasady kwasu nukleinowego dołączone do szkieletu poliamidowego. Kwasy nukleinowe mogą być zarówno jednoniciowe, jak i dwuniciowe.

Termin „komplementacja cząsteczki kwasu nukleinowego” odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego, która posiada komplementarną sekwencję nukleotydową i odwrotną orientację w porównaniu z referencyjną sekwencją nukleotydową.

„Enhanser” jest rodzajem elementu regulatorowego, który może zwiększyć wydajność transkrypcji, bez względu na odległość czy orientację enhansera w stosunku do miejsca początku transkrypcji.

„Heterologiczne DNA” odnosi się do cząsteczki DNA lub populacji cząsteczek DNA, które nie istnieją w naturze w danej komórce gospodarza. Cząsteczki DNA heterologiczne dla określonej komórki gospodarza mogą zawierać DNA pochodzące z gatunków komórki gospodarza (np. endogenne DNA) tak długo, jak to DNA gospodarza jest połączone z DNA nie gospodarza (np. egzogenne DNA).

PL 209 009 B1

Na przykład, cząsteczka DNA zawierająca segment DNA nie gospodarza, kodująca polipeptyd połączona w sposób umożliwiający działanie z segmentem DNA gospodarza zawierającym promotor transkrypcji, jest uważana za cząsteczkę heterologiczną DNA. Na odwrót, cząsteczka heterologiczna DNA może zawierać endogenny gen połączony w sposób umożliwiający działanie z egzogennym promotorem. Jak przedstawiono inaczej, uważa się, że cząsteczka DNA zawierająca gen pochodzący z komórki typu dzikiego, jest heterologicznym DNA, jeśli ta cząsteczka DNA jest wprowadzona do komórki mutanta nie zawierającej genu typu dzikiego.

Termin „kontig” określa cząsteczkę kwasu nukleinowego, która ma przyległy odcinek sekwencji identycznej lub komplementarnej do sekwencji cząsteczki innego kwasu nukleinowego. Przylegające sekwencje są odnoszone do zachodzenia. Mówi się, że sekwencje przyległe „nakładają się” na dany odcinek cząsteczki kwasu nukleinowego, albo w jej całości, albo wzdłuż części odcinka cząsteczki kwasu nukleinowego.

„Komplementarne DNA (cDNA)” jest cząsteczką jednoniciowego DNA, która jest utworzona na matrycy mRNA przez enzym odwrotną transkryptazę. Zazwyczaj, do zapoczątkowania odwrotnej transkrypcji jest używany starter komplementarny do cząstek mRNA. Specjaliści w tej dziedzinie używają również terminu „cDNA” w odniesieniu do cząsteczki dwuniciowego DNA składającej się z takiej jednoniciowej cząsteczki DNA i jej komplementarnej nici DNA. Termin „cDNA” odnosi się również do cząsteczki klonu cDNA syntetyzowanej na matrycy RNA.

„Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego” jest cząsteczką kwasu nukleinowego, która nie jest zintegrowana z genomowym DNA organizmu. Na przykład, izolowaną cząsteczką DNA jest cząsteczka DNA, która koduje czynnik wzrostu, który został wyizolowany z genomowego DNA komórki. Innym przykładem izolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego jest chemicznie zsyntetyzowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która nie jest zintegrowana z genomem organizmu. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która została wyizolowana z określonego gatunku, jest mniejsza niż kompletna cząsteczka DNA chromosomu tego gatunku.

„Liniowy DNA” określa nie koliste cząsteczki DNA z wolnymi końcami 5' i 3'. Liniowy DNA może być przygotowany z zamkniętej kolistej cząsteczki DNA, takiej jak plazmidy, przez enzymatyczne trawienie lub fizyczne rozerwanie.

„Promotor” jest sekwencją nukleotydową, która steruje transkrypcją genu strukturalnego. Zazwyczaj promotor jest umieszczony w nie kodującym regionie genu 5', proksymalnie do miejsca startu transkrypcji genu strukturalnego. Elementy sekwencji w promotorach, które działają podczas inicjacji transkrypcji często są charakteryzowane przez sekwencje konsensusowe nukleotydu. Te promotory obejmują na przykład, ale nie są ograniczone do, promotorów indukowanych IPTG, promotorów bakteriofaga T7 i bakteriofaga Δρι_, patrz Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. Typowy promotor będzie miał trzy elementy obejmujące sekwencje konsensusowe w pozycji -35 i -10, z sekwencją o długości pomiędzy nimi od 16 do 19 nukleotydów (Lisset, S. and Margalit, H., Nucleic Acids Res. 21: 1512, 1993). Promotory tego gatunku obejmują promotory lac, trp, trp-lac (tac) i trp-lac (trc). Jeśli promotor jest promotorem zdolnym do indukcji, wtedy szybkość transkrypcji wzrasta w odpowiedzi na czynnik indukujący. Przeciwnie, szybkość transkrypcji nie lest regulowana przez czynnik indukujący, jeśli promotor jest promotorem konstytutywnym. Znane są również promotory represywne.

„Rdzeniowy promotor” zawiera istotne dla działania promotora nukleotydowe sekwencje obejmując początek transkrypcji. Zgodnie z tą definicją rdzeniowy promotor może mieć lub może nie mieć wykrywalnej aktywności przy braku specyficznych sekwencji, które mogą wzmacniać aktywność lub sprzyjać specyficznej aktywności tkankowej.

„Element regulatorowy” jest to sekwencja nukleotydowa, która moduluje aktywność rdzeniowego promotora. Na przykład, eukariotyczny element regulatorowy może zawierać sekwencję nukleotydową, która wiąże się z czynnikami komórkowymi umożliwiając transkrypcję wyłącznie lub preferencyjnie w poszczególnych komórkach, tkankach lub organellach. Te typy elementów regulatorowych są zazwyczaj związane z genami, które ulegają ekspresji w sposób „komórkowo-specyficzny”, „tkankowospecyficzny” lub „organello-specyficzny”. Promotory bakteryjne mają elementy regulatorowe, które wiążą i modulują aktywność rdzeniowego promotora, takie jak sekwencje operatorowe, które wiążą cząsteczki aktywatora lub represora.

„Wektor do klonowania” jest to cząsteczka kwasu nukleinowego, taka jak plazmid, kosmid lub bakteriofag, która ma zdolność autonomicznego replikowania się w komórce gospodarza. Wektory do klonowania zawierają zazwyczaj jedno lub niewielką liczbę miejsc rozpoznawanych przez endonukle6

PL 209 009 B1 azę restrykcyjną, które umożliwiają wstawienie w określony sposób cząsteczki kwasu nukleinowego bez straty istotnych biologicznych funkcji wektora, jak również sekwencji nukleotydowych kodujących gen markerowy, który jest wygodny do identyfikacji i selekcji komórek transformowanych wektorem do klonowania. Zazwyczaj geny markerowe zawierają geny, które powodują odporność na antybiotyki.

„Wektor ekspresyjny” jest to cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca gen, który ulega ekspresji w komórce gospodarza. Zazwyczaj wektor ekspresyjny zawiera promotor transkrypcji, gen, początek replikacji, marker umożliwiający selekcję i terminator transkrypcji. Gen ekspresyjny jest zazwyczaj umieszczany pod kontrolą promotora i mówi się, że taki gen jest „połączony w sposób umożliwiający działanie” promotora. Podobnie, element regulatorowy i rdzeniowy promotor są połączone w sposób umożliwiający działanie, jeśli element regulatorowy moduluje aktywność rdzeniowego promotora. Wektor ekspresyjny może być również znany jako konstrukt ekspresyjny.

„Zrekombinowany gospodarz” jest to komórka, która zawiera heterologiczną cząsteczkę kwasu nukleinowego, taką jak wektor do klonowania lub wektor ekspresyjny.

Termin „ekspresja” odnosi się do biosyntezy produktu genu. Na przykład, w przypadku genu strukturalnego ekspresja obejmuje transkrypcję genu strukturalnego na mRNA i translację mRNA w jeden lub wię cej polipeptydów.

Termin „sekrecyjna sekwencja sygnałowa” określa sekwencję DNA, która koduje peptyd („peptyd sekrecyjny”), który jako składnik większego polipeptydu kieruje większy polipeptyd na drogę sekrecji komórki, w której jest on syntetyzowany. Podczas przechodzenia przez drogę sekrecji, większy polipeptyd jest zwykle cięty, by usunąć peptyd wydzielniczy „Polipeptyd” jest to polimer reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi, otrzymany naturalnie lub syntetycznie. Polipeptydy o mniej niż 10-ciu resztach aminokwasów są powszechnie zwane „peptydami”.

„Białko” jest to makrocząsteczka zawierająca jeden lub więcej łańcuchów peptydowych. Białko może również zawierać składniki nie peptydowe, takie jak grupy węglowodanowe. Do białka mogą być dodane węglowodany i inne nie peptydowe podstawniki. Białka są zdefiniowane tutaj pod względem ich szkieletowej struktury aminokwasów; podstawniki takie jak grupy węglowodanowe i grupy nie peptydowe są ogólnie nie wyszczególnione, ale mimo to mogą być obecne.

Peptyd lub polipeptyd kodowany przez cząsteczkę DNA nie gospodarza jest peptydem lub polipeptydem „heterologicznym”.

„Izolowany polipeptyd” jest to polipeptyd, który jest w zasadzie wolny od zanieczyszczających składników komórkowych, takich jak węglowodany, lipidy lub inne białkopodobne zanieczyszczenia związane w naturze z polipeptydarni. Zazwyczaj, przygotowanie izolowanego polipeptydu zawiera polipeptyd w postaci o wysokiej czystości, to jest czysty w co najmniej około 80%, czysty w co najmniej około 90%, czysty w co najmniej około 95%, czysty bardziej niż 95% lub czysty bardziej niż 99%. Jednym ze sposobów na pokazanie, że określony preparat białkowy zawiera izolowany polipeptyd, jest pojawienie się pojedynczego prążka po elektroforezie preparatu białkowego na żelu poliakrylamidowym z solą sodową siarczanu dodecylu i wybarwieniu żelu Coomasie Brilliant Blue. Jednakże, termin „izolowany” nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w alternatywnych postaciach fizycznych, takich jak dimery lub alternatywnych postaciach glikozylowanych lub derywatyzowanych.

Termin „koniec aminowy” lub „koniec-N” i „koniec karboksylowy” lub „koniec-C” są tutaj używane do określenia pozycji w polipeptydach. Tam gdzie kontekst pozwala, terminy te są używane w odniesieniu do określonej sekwencji lub części polipeptydu do określenia proksymalności lub pozycji względnej. Na przykład, pewna sekwencja umiejscowiona na końcu karboksylowym względem sekwencji odniesienia w polipeptydzie, jest umieszczona proksymalnie do końca karboksylowego sekwencji odniesienia, ale nie koniecznie na końcu karboksylowym kompletnego polipeptydu.

„Białko fuzyjne” jest to białko hybrydowe ulegające ekspresji z cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencje nukleotydowe co najmniej dwóch genów.

Termin „znacznik powinowactwa” jest tutaj używany do określenia segmentu polipeptydowego, który może być dołączony do drugiego polipeptydu w celu zapewnienia oczyszczenia lub wykrycia drugiego polipeptydu lub zapewnienia miejsca do dołączenia drugiego polipeptydu do substratu. Zasadniczo, każdy peptyd lub białko, dla którego jest dostępne przeciwciało lub inny specyficzny czynnik wiążący może być stosowany jako znacznik powinowactwa. Znaczniki powinowactwa obejmują szlak polihistydyny, białko A (Nilsson i wsp., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson i wsp., Methods Enzymol. 198: 3 (1991)), S-transferazę glutationu (Smith i Johnson, Gene 67: 31 (1988)), znacznik powinowactwa Glu Glu (Grussenmeyer i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7 952 (1985)), substancję P, peptyd

PL 209 009 B1

FLAG (Hopp i wsp., Biotechnology_6: 1204 (1988)), peptyd wiążący streptawidynę lub inny epitop antygenu lub wiążącą domenę, patrz ogólnie, Ford i wsp., Protein Expression and Purification 2: 95 (1991). Cząsteczki DNA kodujące znaczniki powinowactwa są dostępne u przedstawicieli handlowych (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Termin „izotoniczny” używany jest tutaj w jego konwencjonalnym znaczeniu, to jest, że ciśnienie osmotyczne jest równe ciśnieniu krwi, co odpowiada 0,9% roztworu NaCl. „Izotoniczna ilość” soli jest to ilość wymagana do wytworzenia i izotonicznego roztworu lub do przygotowania izotonicznego roztworu podczas odtwarzania liofilizowanego preparatu.

Stężenia są tutaj wyrażane w jednostkach molarności lub % w/v płynnych składników. Gdy mieszanina jest w postaci liofilizowanego proszku, stężenia poszczególnych składników będą takie, by zapewnić stężenie wyszczególnione przy przywracaniu proszku do postaci płynnej.

Jest zrozumiałe, że w związku z niedokładnością standardowych metod analitycznych, ciężar cząsteczkowy i długość polimerów mają wartości przybliżone. Jeśli taka wartość jest wyrażana jako „około” X lub „w przybliżeniu” X, jest zrozumiałe, że deklarowana wartość X jest dokładna w granicach ± 10%.

Ekspresja zrekombinowanego IL-21

Niniejszy wynalazek dostarcza wektory ekspresyjne i sposoby wytwarzania zrekombinowanego białka IL-21 z prokariotycznego gospodarza. IL-21 była poprzednio oznaczona jako zalphall Ligand i jest w pełni opisana w powszechnie ustalonym US Patent 6 307 024, dołączonym tutaj jako odnośnik. W szczególności, wektory ekspresyjne i sposoby niniejszego wynalazku obejmują system ekspresji E. coli dla wytwarzania IL-21 na wielką skalę, stosując sekwencję kodującą IL-21 ze specyficznymi zmianami w nukleotydach w celu zoptymalizowania kodonów i drugorzędowej struktury mRNA do translacji w E. coli. Stosując wektory ekspresyjne i sposoby niniejszego wynalazku, gen IL-21 był wytwarzany w E. coli do poziomu wyższego niż 1 g/L w fermentacji półciągłej. Autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że zastosowanie jako wytwarzającego gospodarza szczepu UT5600 E. coli z brakiem proteazy OmpT przezwycięża problemy stabilności z IL-21met. IL-21met jest kodującą sekwencją IL-21 z kodonem kodującym N-koniec Met dodanym na końcu 5' sekwencji polinukleotydowej. Stosowanie wektorów ekspresyjnych opisanych tutaj znacznie poprawiło wydajność odzyskiwania z bakterii zrekombinowanych białek. Stosowanie tego szczepu gospodarza wytwarzającego daje wydajność ponad 50 mg/L ciałek wtrętowych IL-21met z hodowli w naczyniu hodowlanym do wytrząsania. W innym zastosowaniu, by ułatwić postęp fermentacji półciągłej z wysoką gęstością komórek, inny szczep E. coli, W3110 został wybrany jako gospodarz do wytwarzania IL-21 na wielką skalę. Ten szczep gospodarza nie jest patogenny i potrafi rosnąć dając wysoką gęstość komórek w minimalnej pożywce fermentacyjnej. Wydajność IL-21met w szczepie W3110 E. coli była porównywalna do tej otrzymanej w szczepie UT5600 E. coli wytwarzanej w butelkach do wytrząsania i fermentacji okresowej.

Niniejszy wynalazek dostarcza również sposoby na odzyskiwanie zrekombinowanego białka IL-21 z prokariotycznego gospodarza, gdy białko IL-21 ulega ekspresji u gospodarza i jest znajdowane w komórce gospodarza jako nieglikozylowane, nierozpuszczalne ciałko wtrętowe. Gdy komórka prokariotyczna jest lizowana, by wyizolować ciałka wtrętowe (zwane również ciałkami refrakcyjnymi), ciałka wtrętowe są agregatami IL-21. Tak więc, ciałka wtrętowe muszą być zdysocjowane i rozpuszczone, by wyizolować białko IL-21 i na ogół wymaga to zastosowania denaturującego rozpuszczalnika chaotropowego, co w rezultacie powoduje odzyskanie polipeptydu, który musi zostać powtórnie zwinięty, by mieć istotną aktywność biologiczną. Gdy tylko białko IL-21 zostaje powtórnie zwinięte, białko musi zostać wychwycone i oczyszczone. Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza sposoby na wyizolowanie nierozpuszczalnych białek IL-21 z komórek prokariotycznych, rozpuszczenie nierozpuszczalnego materiału białkowego IL-21 w rozpuszczalniku chaotropowym, rozcieńczanie chaotropowego rozpuszczalnika w taki sposób, że białko IL-21 zostaje powtórnie zwinięta i wyizolowana. Niniejszy wynalazek obejmuje również sposoby na wychwytywanie renaturowanej IL-21 z rozcieńczonego, zwijającego buforu przez stosowanie chromatografii kationowymiennej i oczyszczanie powtórnie zwiniętego białka IL-21 przez stosowanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Dalsze oczyszczanie osiąga się przez zastosowanie wymiany anionów w badaniu wiązania przy użyciu receptora IL-21 i podobnych.

Ludzki gen IL-21 koduje polipeptyd o 162 aminokwasach. Sekwencja o pełnej długości obejmuje peptyd sygnałowy o 29 aminokwasach jak pokazano w SEQ ID NOS: 1 i 2 i dojrzałe białko o 133 aminokwasach zawierające resztę 30 (Gin) do reszty 162 (Ser). Sekwencja IL-21 jako ulegająca ekspresji przy użyciu prokariotycznego systemu ekspresji ma metioninę na końcu-N, a sekwencję nukleotydową i odpowiadającą sekwencję amino kwasową jak pokazano w SEQ ID NOS: 27 i 28. Sekwen8

PL 209 009 B1 cja nukleotydów SEQ ID NO: 27 pokazuje zoptymalizowaną sekwencję kodonu, która podlega zakresowi niniejszego wynalazku.

Wytwarzanie zrekombinowanej ludzkiej IL-21, która wywołuje system ekspresji ssaków wytwarza w przybliżeniu 20 mg/L białka. Dlatego, pożądane było znalezienie bardziej opłacalnego systemu ekspresji do wytwarzania IL-21 na dużą skalę. Stwierdzono, że system E. coli jest lepszą alternatywą dla produkcji na dużą skalę. Jedno potencjalne miejsce glikozylacji sprzężone z Asn znajduje się, ale nie jest zajęte w białku, które ulega ekspresji, w linii komórkowej CHO, używanej w systemie ekspresji ssaków lub w komórkach owadów, stosując system ekspresji bakulwirusów. Ta strukturalna właściwość czyni IL-21 dobrą kandydatką do ekspresji w prokariotach. Ekspresja w E. coli oferuje liczne zalety w porównaniu z innymi systemami ekspresji, szczególnie niski koszt eksploatacji i wysoką wydajność wytwarzania.

Po rozpadzie komórki zrekombinowana reszta IL-21 z N-końcem (IL-21met), ulegająca ekspresji w E. coli, została wyizolowana jako nierozpuszczalne ciałka wtrętowe. Ten materiał został niewłaściwie zwinięty i nie posiadał pożądanej aktywności biologicznej. W większości przypadków istnieje potrzeba umożliwienia rozpuszczenia ciałek wtrętowych w denaturującym rozpuszczalniku chaotropowym i istnieje potrzeba powtórnego zwinięcia białka przez rozcieńczenie czynnikiem chaotropowym, a następnie przez oczyszczenie. Białka różnią się znacznie w zależ ności od ich optymalnego środowiska do powtórnego zwijania. Czynniki, które mogą wpływać na odzyskiwanie właściwie zwiniętego i biologicznie aktywnego materiału obejmują: początkową koncentrację białka, stan utlenienia, pH, zaróbki, sole, detergenty, temperaturę, sposób dodawania buforu zwijającego i podobne. Białko IL-2 z sekwencją i strukturą podobną do IL-21, uległ o ekspresji w systemie E. coli i został o z powodzeniem powtórnie zwinięte (Weir i wsp., J. Biochem. 245: 85, 1987). ALDESLEUKIN®, zrekombinowana muteina ludzkiego IL-2 uległa ekspresji jak ciałka wtrętowe w systemie E. coli i została powtórnie zwinięta in vitro.

Badanie kodonów cDNA stosowanych w ludzkiej IL-21 wykazało, że zawierają one nadmiar rzadko stosowanych w E. coli kodonów. Geny z wysoką zawartością rzadko stosowanych kodonów mają tendencję do niskiego poziomu ekspresji w E. coli (Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6 (5): 494-500, 1995). Dodatkowym problemem związanym z ekspresją ludzkiej IL-21 w E. coli była obecność 4 potencjalnych miejsc cięcia OmpT zlokalizowanych w sekwencji IL-21. OmpT jest endopeptydazą, która tnie specyficznie pomiędzy dwoma następującymi po sobie resztami zasad i enzym jest aktywny w warunkach denaturujących, takich jak 8M mocznik i 6M guanidyna-HCL (White i wsp., J. Biol. Chem. 270 (22): 12990-4, 1995; Dekker i wsp., Biochemistry, 40 (6): 1694-701, 2001). To zwiększa problemy stabilności IL-21 w wyciągu komórkowym z E. coli z powodu proteolitycznej aktywności OmpT.

Kilka laboratoriów wykazało, że poziom ekspresji białek, których geny zawierały rzadkie kodony, może być znakomicie poprawiony, gdy zostanie zwiększony w gospodarzu poziom pewnego rzadkiego tRNAs (Zdanovsky i wsp., Appl. Environ. Microbiol. 66 (8): 3166-73, 2000; Calderone i wsp., J. Mol. Biol. 262 (4): 407-12; Kleber Janke i wsp., Protein Expr. Purif. 19 (3): 419-24, 2000; You i wsp., Biotechniques 27 (5): 950-4, 1999).

Plazmid pRARE koduje geny dla tRNAs z ich natywnymi promotorami (argU, argW, leuW, proL, ileX i glyT), które występują rzadko w E. coli (Novy i wsp., Innovations, 12: 2-3, 2001). Koekspresja z pRARE zwiększa wytwarzanie IL-21met w E. coli około 5-10-ciokrotnie. Koekspresja z pRARE również zmniejsza poziom ciętej IL-21met w komórkowym lizacie E. coli, co sugeruje, że korzystna byłaby resynteza genu IL-21met z bardziej odpowiednimi kodonami.

Niniejszy wynalazek dostarcza wektor ekspresyjny obejmujący sekwencję kodującą IL-21 z kodonami zoptymalizowanymi do translacji w E. coli. Syntetyczny gen kodujący IL-21met został otrzymany przez nakładający PCR. Ostateczny produkt PCR został wprowadzony do wektora ekspresyjnego do ekspresji pod kontrolą promotora Tac. Jednakże ekspresja była niska. Przebadanie struktury drugorzędowej cDNA IL-21met ujawniło wyjątkowo stabilną strukturę szpilki do włosów. Podejrzewano, że ta pętla szpilki do włosów jest strukturalnym elementem, który zapobiega wydajnej ekspresji z w pełni zoptymalizowanej sekwencji. Gdy wyeliminowano strukturę szpilki do włosów zastępując pierwsze osiemdziesiąt zasad zoptymalizowanej sekwencji sekwencją jak ta pokazana na SEQ ID NO: 1. Hybryda IL-21 jest pokazana na SEQ ID NO: 27, a będący wynikiem gen ulegał ekspresji w E. coli do wysokiego poziomu. Poziomy ekspresji z nowym konstruktem ekspresji wzrosły do około 20% całkowitego białka komórki lub 100 mg/L.

PL 209 009 B1

Wektory ekspresyjne, które są właściwe do wytwarzania pożądanego białka w prokariotycznych komórkach zawierają zazwyczaj (1) elementy kodujące prokariotycznego DNA pochodzenia bakteryjnego początek dla zachowania wektora ekspresyjnego w gospodarzu bakteryjnym; (2) elementy DNA, takie jak promotor, które kontrolują początek transkrypcji; (3) elementy DNA, które kontrolują obróbkę transkryptów, jak terminator transkrypcyjny i (4) gen kodujący umożliwiający selekcję znacznik, jak oporność na antybiotyki. Prokariotyczna komórka gospodarza wytwarza IL-21 po wprowadzeniu wektora ekspresyjnego i dodaniu odpowiedniego induktora. Zgodnie z powyższym niniejszy wynalazek rozważa wektory ekspresyjne zawierające promotor, zoptymalizowaną sekwencję nukleotydową IL-21 i sekwencję terminatora. Przykładowa zoptymalizowana sekwencja nukleotydową jest pokazana na SEQ ID NO: 27. W innym zastosowaniu wektor ekspresyjny zawiera również zdolny do selekcji marker. W jednym zastosowaniu zdolnym do selekcji markerem jest oporność na kanamycynę.

Wektory ekspresyjne mogą również zawierać sekwencje nukleotydów, które kodują znacznik peptydowy, by pomóc w oczyszczaniu pożądanego białka. Znaczniki peptydowe, które są użyteczne do izolowania zrekombinowanych polipeptydów obejmują na przykład znaczniki polihistydynynowe (które mają powinowactwo do żywicy z chelatowanym niklem), znaczniki c-myc, białko wiążące kalmodulinę (wyizolowane z chromatografii powinowactwa do kalmoduliny), substancję P, znacznik RYIRS (który wiąże się z przeciwciałami przeciw-RYIRS), znacznik Glu-Glu i znacznik FLAG (który wiąże się z przeciwciałami przeciw-FLAG), patrz na przykład Luo i wsp., Arch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti i wsp., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996) i Zheng i wsp., Gene 186: 55 (1997). Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące taki znacznik peptydowy są dostępne na przykład w Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).

Jedną ze zwyczajnych umiejętności w tej dziedzinie jest zapoznanie się z wieloma molekularnymi technikami przygotowywania wektora ekspresyjnego. Na przykład, polinukleotyd IL-21 może być otrzymywany przez syntetyzowanie cząsteczek kwasu nukleinowego przy zastosowaniu obustronnie startujących długich oligonukleotydów i sekwencji nukleotydowych tutaj opisanych (patrz na przykład Ausubel (1995) na stronach 8-8 do 8-9). Dobrze znane techniki stosujące łańcuchową reakcję polimerazy zapewniają zdolność syntetyzowania cząsteczek DNA o długości co najmniej dwóch tysięcy zasad (Adang i wsp., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993), Bambot i wsp., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993), Dillon i wsp., „Use of Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes” w Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), strony 263-268, (Humana Press, Inc. 1993) i Holowachuk i wsp., PCR Methods Appl 4: 299 (1995)).

Inny sposób konstruowania systemu ekspresji stosuje homologiczną rekombinację stosując system drożdży, patrz US Patent No 6 207 442, Plasmid Construction by Homologous Recombination, załączony tutaj w referencjach. System dostarcza uniwersalny akceptor plazmidu, który może być użyty do klonowania DNA kodującego każdy polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, włączając fuzje polipeptydów. System dostarcza sposoby przygotowania cząsteczek dwuniciowego kolistego DNA zawierających region kodujący białko będące przedmiotem zainteresowania. Jeden lub więcej fragmentów donorów DNA kodujących białko będące przedmiotem zainteresowania, tj. IL-21, jest włączony w akceptorowy plazmid, pierwszy linker DNA i drugi linker DNA w komórkę gospodarza Saecharomyces cerevisiae, w której fragment donorowego DNA jest włączony do plazmidu akceptorowego przez homologiczną rekombinację donorowego DNA, akceptorowego plazmidu i linkerów, żeby utworzyć zamknięty kolisty plazmid.

Cząsteczki kwasu nukleinowego w niniejszym wynalazku mogą być również syntetyzowane poprzez „maszynę genową” przy zastosowaniu procedur, takich jak sposób fosforamidowy. Jeśli do zastosowania takiego jak synteza genu lub fragmentu genu wymagane jest dwuniciowe DNA syntetyzowane chemicznie, to każda komplementarna nić jest tworzona oddzielnie. Wytwarzanie krótkich genów (60 do 80 par zasad) jest proste technicznie i może być osiągnięte przez syntetyzowanie komplementarnych nici, a następnie ich przyłączanie. Do wytwarzania dłuższych genów (> 300 par zasad) może być jednakże wymagana specjalna strategia, ponieważ sprawność połączenia każdego cyklu podczas syntezy chemicznej DNA rzadko wynosi 100%. By przezwyciężyć ten problem, gromadzone są syntetyczne geny (dwuniciowe) w postaci modularnej z fragmentów jednoniciowych, które mają długość od 20 do 100 nukleotydów. By zrobić przegląd syntezy nukleotydów, patrz na przykład Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura i wsp., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984) i Climie i wsp., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 633 (1990).

PL 209 009 B1

Przykłady innych technik, które mogą być stosowane do przygotowywania genu IL-21 i wektora ekspresyjnego obejmują na przykład trawienie endonukleazą restrykcyjną i ligację i łańcuchową reakcję polimerazy, z których wszystkie są dobrze znane w tej dziedzinie.

Dostępna jest duża różnorodność umożliwiających selekcję genów markerowych (patrz na przykład Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487 (1990); Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 537 (1990)). Powszechnym jest, że wektory ekspresyjne zawierają wskaźniki pozwalające na selekcję, takie jak oporność na tetracyklinę, oporność na ampicylinę, oporność na kanamycynę, oporność na neomycynę lub oporność na chloramfenikol.

Wskaźnik pozwalający na selekcję pozwoli na selekcję i/lub wykrycie komórek, które były transformowane z wektorem ekspresyjnym z komórek, które nie były transformowane. Wektor ekspresyjny może przenosić więcej niż jeden gen oporności na antybiotyk. Jako przykładowy wskaźnik pozwalający na selekcję bez oporności na antybiotyk stosuje system hok/sok z plazmidu R1. Gen hok koduje toksyczne białko Hok o 52 aminokwasach, a gen sok koduje antysensowne RNA, które jest komplementarne do sekwencji liderowej mRNA hok. Ten wskaźnik pozwalający na selekcję jest znany każdemu specjaliście w tej dziedzinie i jest opisany bardziej szczegółowo przez Gerdes, K. i wsp., Genetic Engineering 19: 49-61, 1997.

Niniejszy wynalazek obejmuje dużą różnorodność odpowiednich zrekombinowanych komórek gospodarza i włącza, choć nie jest ograniczony do gram-ujemnych organizmów gospodarza prokariotycznego. Odpowiednie szczepy E. coli obejmują W3110, szczepy pochodne K12, MM294, TG-1, JM-107, BL-21 i UT5600. Inne odpowiednie szczepy obejmują: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH41, DH5, DH51, DH51F', DH51MCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, E. coli K12, E. coli K12 RV308, E. coli K12C600, E. coli HB101, E. coli K12C600 R.sub.k-M.sub.k-, E. coli K12RR1 (patrz na przykład Brown (ed), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Inni gramujemni prokariotyczni gospodarze mogą obejmować: Serratia, Pseudomonas, Caulobacter. Prokariotyczni gospodarze mogą obejmować organizmy gram-dodatnie, takie jak Bacillus, na przykład B. subtilis i B. thuringienesis i B thuringienesis var. israelensis, jak również Streptomyces, na przykład S. iividans, S. ambofaciens, S. fradiae i S. griseofuscus. Odpowiednie szczepy Bacillus subtilus obejmują BR151, Yb886, MI119, MI120 i B170 (patrz na przykład Hardy „Bacillus Cloning Methods”, w DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). Techniki standardowe dla wektorów propagacji w gospodarzach prokariotycznych są dobrze znane doświadczonym specjalistom w tej dziedzinie (patrz na przykład, Ausubel i wsp., (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd Edition (John Wiley & Sons 1995); Wu i wsp., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)). Dla dokonania przeglądu szczepów prokariontów z brakiem proteazy patrz Meerman i wsp., Biotechnology 12: 1107-1110, 1994. Niniejszy wynalazek stanowi przykład stosowania szczepu W3110, który został zdeponowany w American Type Culture Collection (ATCC) jako ATCC # 27325.

Techniki sterowania klonowanymi cząsteczkami DNA i wprowadzania egzogennego DNA w różne komórki gospodarza są ujawnione przez Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989, i Ausubel i wsp., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. Transformowane lub transfekowane komórki gospodarza są hodowane zgodnie z konwencjonalnymi procedurami w pożywce hodowlanej zawierającej składniki pokarmowe i inne składniki wymagane do wzrostu wybranych komórek gospodarza. W tej dziedzinie znane są różne odpowiednie pożywki, które zazwyczaj zawierają źródło węgla, źródło azotu, podstawowe aminokwasy, witaminy i minerały. Pożywki mogą także zawierać, jeśli jest wymagane, takie składniki jak czynniki wzrostu lub surowicę. Pożywka wzrostowa będzie wybierać zazwyczaj komórki zawierające egzogennie dodawany DNA, przez na przykład wybieranie lekowe lub brak istotnego składnika odżywczego, który jest uzupełniany pozwalającym na selekcję markerem przenoszonym w wektorze ekspresyjnym lub kotransfekowanym do komórek gospodarza. W płynnych hodowlach zapewnia się wystarczające napowietrzanie środkami konwencjonalnymi, takimi jak potrząsanie małymi butelkami lub zwilżanie fermentorów. Transformowane komórki mogą być selekcjonowane i namnażane, by dostarczyć zrekombinowane komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania. IL-21 może ulegać ekspresji w E. coli przez stosowanie systemu fuzyjnego MBP (białko wiążące maltozę) (New England Biolabs (NEB; Beverly, MA)). W tym systemie, cDNA IL-21 jest dołączone do końca 3' genu malE, by uformować białko fuzyjne MBP-IL-21. Ekspresja białka fuzyjnego jest sterowana promotorem tac i jest „wyłączona”, dopóki promotor nie jest indukowany dodaniem 1 mmol IPTG (Izopropylo-e-tioPL 209 009 B1 galaktopiranozyd). Konstrukty mogą być utworzone jako fuzje wewnątrz ramki odczytu z MBP zgodnie z miejscem wielokrotnego klonowania (MCS) wektora (NEB) pMAL-c2 i zgodnie ze specyfikacjami producenta.

Fermentacja

W jednym zastosowaniu niniejszego wynalazku moż e być stosowana fermentacja okresowa, szczególnie, gdy jest wymagane wytwarzanie IL-21 na wielką skalę przy stosowaniu systemu ekspresji niniejszego wynalazku. Zazwyczaj fermentacja okresowa obejmuje przygotowywanie naczynia hodowlanego pierwszego etapu przez hodowanie na odpowiedniej pożywce, w butelce hodowlanej do wstrząsania szczepów E. coli, w których zachodzi ekspresja IL-21, tak, żeby doprowadzić do wzrostu do optycznej gęstości (OD) od 5 do 20 przy 600 nm. Odpowiednia pożywka będzie zawierała azot ze źródła(deł), takiego jak siarczan amonu, fosforan amonu, chlorek amonu, wyciąg drożdży, hydrolizowane białka zwierzęce, hydrolizowane białka roślinne lub hydrolizowane kazeiny. Fosforan będzie dostarczany z fosforanu potasowego, fosforanu amonowego, kwasu fosforowego lub fosforanu sodu. Innymi składnikami będą chlorek magnezu lub siarczan magnezu, siarczan żelaza lub chlorek żelaza i inne pierwiastki śladowe. By polepszyć wzrost pożywka hodowlana może być uzupełniana węglowodanami takimi jak fruktoza, glukoza, galaktoza, laktoza i glicerol. W pewnych zastosowaniach węglowodanowymi dodatkami będą glicerol lub glukoza dodawana od 1 do 20 g/L pożywki. W pewnych zastosowaniach zawartość glicerolu lub glukozy wynosi 5-10 g/L. Hodowlę zapoczątkowuje się szczepieniem butelki do wytrząsania (naczynie do zmieszania od 500 ml do 2000 ml) zawierającej preferowaną pożywkę hodowlaną, E. coli z pożywki agarowej zawierającej antybiotyk, na przykład o właściwym stężeniu kanamycynę o 10-50 μg/ml lub hodowlę zapoczątkowuje się z zamrożonej hodowli podstawowej. Hodowlę w butelkach do wytrząsania prowadzi się w temperaturze pomiędzy 28 a 40°C. W pewnych zastosowaniach hodowlę prowadzi się w butelkach do wytrząsania przy 30 do 37°C. Butelki są inkubowane przy wytrząsaniu ustawionym na 200 do 300 rpm.

Naczynia fermentacyjne są przygotowane z odpowiednią pożywką hodowlaną i wysterylizowane. pH pożywki jest doprowadzone do pH 6,5 do 7,5. W pewnych zastosowaniach pH wynosi 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 lub 7,2. Naczynia mają właściwe ustawione poziomy napowietrzania i wytrząsania i są szczepione hodowlą z naczynia pierwszego etapu, hodowaną 20 godzin i mającą OD od 5 do 20 przy 600 nm. Szczepionka jest pomiędzy 1% i 12% objętość/objętość (v/v). W pewnych zastosowaniach szczepionka wynosi 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% lub 10% v/v. Poziom rozpuszczonego tlenu jest utrzymywany powyżej 20% nasycenia poprzez wzrastającą prędkość wytrząsania, wzrastający stopień napowietrzania, natlenianie lub różne kombinacje. Hodowla jest poddawana wzrostowi, aż OD600 osiągnie 2 do 20 jednostek OD przy 600 nm. Następnie do hodowli jest dodawany izopropylotiogalaktopiranozyd (IPTG) do stężenia 0,1 do 2,0 mM. IPTG indukuje promotor tac do ekspresji IL-21. Alternatywnie, w celu indukcji, może być dodawana laktoza 10 g/l w 30% roztworze w 24 godzinie. Następnie pozostawia się hodowlę do wzrostu przez dodatkowy czas między 2 a 8 godzinami. W pewnych zastosowaniach hodowla rośnie przez 3-4 godziny.

W innym zastosowaniu do otrzymania wysokiej wydajności białka IL-21 stosuje się hodowlę okresową z zasilaniem. Szczepy E. coli wytwarzające IL-21 rosną w odpowiedniej pożywce w butelce hodowlanej z wytrząsaniem tak, by umożliwić hodowli wzrost do OD od 5 do 20 przy 600 nm. Odpowiednia pożywka będzie zawierała azot ze źródła(eł) takiego jak siarczan amonu, fosforan amonu, chlorek amonu, wyciąg drożdży, hydrolizowane białka zwierzęce, hydrolizowane białka roślinne lub hydrolizowane kazeiny. Fosforan będzie dostarczany z fosforanu potasowego, fosforanu amonowego, kwasu fosforowego lub fosforanu sodu. Innymi składnikami będą chlorek magnezu lub siarczan magnezu, siarczan żelaza lub chlorek żelaza i inne pierwiastki śladowe. By polepszyć wzrost, pożywka hodowlana może być uzupełniana węglowodanami takimi jak fruktoza, glukoza, galaktoza, laktoza i glicerol. W pewnych zastosowaniach dodatkami węglowodanowymi będzie glicerol lub glukoza dodawana od 1 do 40 g/L pożywki. W pewnym zastosowaniu zawartość glicerolu lub glukozy wynosi 5-10 g/L. Hodowlę zapoczątkowuje się szczepieniem naczynia do wytrząsania (naczynie do zmieszania od 500 ml do 2000 ml) zawierającego preferowaną pożywkę hodowlaną, E. coli z pożywki agarowej zawierającej kanamycynę (10-50 μg/ml) lub z zamrożonej hodowli podstawowej. Hodowlę w butelkach do wytrząsania prowadzi się w temperaturze pomiędzy 28 a 40°C. W pewnych zastosowaniach temperatura wzrostu wynosi 30 do 37°C. Naczynia są inkubowane przy wytrząsaniu ustawionym na 200 do 300 rpm.

Naczynie drugiego etapu zostaje przygotowane z odpowiednią pożywką hodowlaną i wysterylizowane. Odpowiednią pożywką byłby na przykład Super Broth II (Beckton Dickenson, Franklin Lakes,

PL 209 009 B1

NJ), APS-Super Broth, Luria Broth lub ZSM (patrz tabele 1-4) i kanamycyna. Pożywka hodowlana może być uzupełniona węglowodanami w celu polepszenia hodowli. W pewnych zastosowaniach dostarczane są dodatki węglowodanów, w których glicerol lub glukoza są dodawane od 1 do 40 g/L pożywki. W pewnym zastosowaniu zawartość glicerolu lub glukozy wynosi 5-10 g/L. pH pożywki jest doprowadzone do pH 6,5 do 7,5. W pewnych zastosowaniach pH wynosi 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 lub 7,2. Naczynia mają ustawione właściwe poziomy napowietrzania i wytrząsania. Wzrost jest zapoczątkowany przez zaszczepienie naczynia hodowlą, która była prowadzona w butelce hodowlanej etapu pierwszego, 10 do 20 godzin i ma OD od 5 do 20 przy 600 nm. Szczepionka wynosi od 1% i 12% v/v. W pewnych zastosowaniach szczepionka wynosi 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% lub 10% v/v. Poziom rozpuszczonego tlenu jest utrzymywany powyżej 20% nasycenia poprzez wzrastającą prędkość wytrząsania, wzrastający stopień napowietrzania, natlenianie lub różne kombinacje uprzednio wymienionych.

Naczynia fermentacyjne są przygotowane z odpowiednią pożywką hodowlaną (jak opisano powyżej) i wysterylizowane. pH pożywki jest doprowadzone do pH pomiędzy 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 lub 7,2. W pewnym zastosowaniu pH pożywki jest doprowadzone do 6,8. Pożywka hodowlana może być uzupełniona węglowodanami w celu polepszenia hodowli. W pewnych zastosowaniach dodatkami węglowodanów są glicerol lub glukoza, które są dodawane od 5 do 40 g/L pożywki, z pewnymi zastosowaniami mającymi glicerol lub glukozę na poziomie 15-20 g/L. Naczynia mają ustawione odpowiednie poziomy napowietrzania i wytrząsania i są szczepione hodowlą z butelek hodowlanych pierwszego etapu lub hodowlą z naczyń hodowlanych drugiego etapu, która była prowadzona 10 do 20 godzin i ma OD od 5 do 20 dla 600 nm. Szczepienie jest pomiędzy 1% a 12% v/v. W pewnych zastosowaniach szczepienie wynosi 5%, 6%, 7%, 8%, 9% lub 10% v/v. Poziom rozpuszczonego tlenu jest utrzymywany powyżej 20% nasycenia poprzez wzrastającą prędkość wytrząsania, wzrastający stopień napowietrzania, natlenianie lub różne kombinacje uprzednio wymienionych.

Fermentor jest zaopatrywany w roztwór węglowodanów ze z góry określoną prędkością od początku fermentacji, ale zazwyczaj po 6 godzinach upływającego czasu fermentacji (EFT) i nie dłużej niż po 12 godzinach EFT. Zasilanie jest kontynuowane do końca fermentacji. Roztworem zasilającym może być glicerol przygotowany jako 40-70% v/v lub glukoza przygotowana jako 40-70% waga/objętość (w/v). W pewnych zastosowaniach glicerol lub glukoza są przygotowane jako 70% glicerol v/v i glukoza 60% w/v. Prędkość zasilania może być zróżnicowana pomiędzy 5-15 gramów glukozy lub glicerolu na litr na godzinę. W jednym zastosowaniu prędkość zasilania wynosi 8, 9 lub 10 g/L/godz. W czasie od 20 do 30 godziny EFT, na przykład w 24 godzinie, do hodowli jest dodawany IPTG do stężenia od 0,5 do 2 mM. Alternatywnie, dla indukcji w 24 godzinie może być dodany 30% roztwór laktozy w ilości 10 g/l. W czasie od 48 do 56 godziny mieszanina fermentacyjna jest zbierana. Alternatywnie, do fermentora hodowli jest dodawane od 0,5 do 2 mmol/L IPTG. Następnie, mieszanina fermentacyjna jest zbierana od 52 do 56 godziny EFT.

Na koniec przebiegu fermentacji temperatura jest obniżana do od 4 do 20°C, a pH jest utrzymywane lub doprowadzane do od 5,0 do 9,0. W pewnych zastosowaniach, zakres pH wynosi 6,0 do 8,0 jednostek. Bulion fermentacyjny jest zbierany przez utworzenie nadciśnienia w naczyniu i zbieranie bulionu przez otwory rewizyjne. Alternatywnie, bulion może być wypompowany przez jeden z otworów rewizyjnych. Bulion fermentacyjny może zawierać 10% do 30% części stałych.

Odzyskiwanie IL-21

Po fermentacji komórki są zbierane przez odwirowywanie, powtórnie zawieszane w buforze do homogenizowania i homogenizowane, na przykład w homogenizator ze APV-Gaulin (Invensys APV, Tonawanda, New York) lub innym rodzaju wyposażenia do rozbijania komórek, takim jak młynki kulowe i sonifikatory. Alternatywnie, komórki są bezpośrednio zabierane z fermentora i homogenizowane w homogenizatorze APV-Gaulin. Alternatywnie, przed homogenizacją bulion fermentacyjny może być rozcieńczony wodą lub buforem.

W jednym zastosowaniu, komórki są homogenizowane bezpośrednio w bulionie fermentacyjnym. Na przykład, homogenizator APV-Gaulin 1000 lub APV-Gaulin 2000 jest schładzany do 4-15°C, przez co najmniej 30 minut. Bulion fermentacyjny jest przepuszczany przez homogenizator i zbierana jest zawiesina komórkowa. Dla maksymalnego rozbicia komórek, ciśnienie homogenizatora powinno być ustawione od 6000 do 14000 psi. W jednym zastosowaniu, ciśnienie jest ustawione na 10000 psi., zawiesina jest przepuszczana przez homogenizator 1-5 razy, na przykład 3 przepuszczenia. W innym zastosowaniu, przed homogenizacją, bulion jest rozcieńczany taką samą ilością wody. Ilość DNA może być zmniejszona poprzez dodanie PEI, sperminy lub benzoazy podczas lub po fazie homogenizowania.

PL 209 009 B1

Homogenat jest odwirowywany i po dekantowaniu supernatantu otrzymuje się osad zawierający ciałka wtrętowe. Osad ciałek wtrętowych jest przemywany wodą lub buforami Tris z lub bez różnych poziomów następujących składników: chlorku sodu, mocznika, Tritonu X-100, chlorku cynku, siarczanu sodowego laurylu, sacharozy.

W innym zastosowaniu, komórki są zbierane przez przeniesienie bulionu fermentacyjnego do butelek wirówkowych i odwirowywane w 2-8°C przez 20-60 minut. Na przykład, do zbierania komórek może być użyta wirówka Beckman J6MI z wirnikiem KompSpin KAJ7.100 (Beckman Coulter, Fulerton, CA) przy 7500 x G. Może być użyta również wirówka Beckman Avanti JHC z wirnikiem o stałym kącie (8000-15800 x G) lub z rotorem Aries JS 5.0 Swinging Bucket z butelkami 2,25 L przy 7500 x G. Mogą być również używane wirówki o pracy ciągłej, takie jak dostarczane przez Carr Separations, Inc. (Franklin, MA) lub Westfalia Separator, Inc. (Northvale, NJ).

Bulion hodowlany lub supernatant są usuwane z butelek wirówkowych. Osady komórkowe są ponownie zawieszane w buforze do homogenizowania (100 mM Tris, 5 mM ZnCl2, pH 7,5) z 10-30% w/v części stałych. Bulion fermentacyjny jest przepuszczany przez homogenizator APV-Gaulin i zbierana zostaje zawiesina komórkowa. Dla maksymalnego rozbicia komórek, ciśnienie w homogenizator ze powinno być ustawione na 6000-14000 psi. W jednym zastosowaniu, ciśnienie wynosi 10000 psi. Zawiesina jest przepuszczana 1-5 razy, na przykład 3 razy.

Dodatkowo, sposoby odzyskiwania IL-21 mogą zawierać kolejne etapy: wytrącania, przemywania i powtórnego rozpuszczania IL-21. Przemyte ciałka wtrętowe są rozpuszczane w 6M guanidynie lub 8M moczniku, rozcieńczonym 6-10-krotnie w wodzie lub buforze, inkubowane 30 minut i odwirowywane lub filtrowane. Alternatywnie, po homogenizacji, może być zastosowana podczas przemywania ultrafiltracja lub makrofiltracja. Powstający w rezultacie osad jest przemywany w 2-6M moczniku i zawiera białka IL-21. Następnie, przed rozpuszczeniem, osad jest przemywany wodą. Do wytrącenia resztek komórkowych, rozpuszczalnych białek, DNA, RNA i węglowodanów dodatkowo mogą być dodane: Al³⁺ lub Fe³⁺ lub polimery anionowe i kationowe lub czynniki takie jak spermina, PEI i benzonaza.

Rozpuszczalność ciałek wtrętowych

Przemyty preparat ciałek wtrętowych może być rozpuszczony przez zastosowanie chlorowodorku guanidyny (5-8M), tiocyjanianu guanidyny (5-6M) lub mocznika (7-8M) zawierające czynnik redukujący, taki jak beta merkaptoetanol (10-100 mM) lub ditiotreitol (5-50 mM). Roztwory mogą być przygotowane w Tris, fosforanie, HEPES-sie lub innych odpowiednich buforach. Ciałka wtrętowe mogą być również rozpuszczane mocznikiem (2-4M) zawierającym siarczan sodowy laurylu (0,1-2%). Ciałka wtrętowe z jednego litra bulionu fermentacyjnego mogą być rozpuszczone przy użyciu 50-200 ml opisanych roztworów. Jeden sposób zapewnia rozpuszczenie osadu ciałek wtrętowych z 1 litra bulionu fermentacyjnego w 150 ml 6M GuHCL przygotowanego w 100 mM Tris, pH 8,0, zawierającego 40 mM DTT. W innym zastosowaniu zawiesina ciałek wtrętowych jest zmieszana z 50-100 ml 8M GuHCL. Zawiesina jest powtórnie zawieszana przez wymieszanie szpatułką, a następnie homogenizowanie w homogenizatorze Omni EZ (Omni International, Warrenton, VA) lub wymieszanie w urządzeniu mechanicznym. Zawiesina jest mieszana przez 30-120 minut w 3-37°C. W jednym zastosowaniu, żeby zakończyć proces rozpuszczania, zawiesina jest mieszana w 15-25°C. Próbka jest następnie odwirowywana w odpowiedniej wirówce przy 7500-16000 x G w 4°C przez 10-30 minut. Próbka supernatantu zawierająca rozpuszczoną IL-21 jest dekantowana i zachowywana.

Stężenie IL-21 w frakcji rozpuszczalnej jest określone przez HPLC z fazą odwróconą. Jako ruchoma faza jest stosowana kolumna Jupiter C5 (Phenomenex, Torrance, CA) z kwasem acetonitrylowym/trifluorooctowym. Standard IL-21 jest rozcieńczany w buforze zawierającym guanidynę/DTT/Tris i różne ilości są wstrzykiwane na kolumnę. Powierzchnia pod pikiem IL-21 jest używana do wyznaczenia krzywej standardowej. Aby usunąć cząstki, przed wstrzyknięciem na kolumnę HPLC, rozpuszczana próbka IL-21 zostaje odwirowana w mikrowirówce. Określenie powierzchni pod pikiem IL-21 pozwala na ilościowe wyznaczenie stężenia IL-21 z krzywej standardowej.

Dodatkowo rozpuszczana IL-21 może być oczyszczona w tym etapie przez zastosowanie filtracji z przepływem stycznym, HPLC z fazą odwróconą, chromatografii metalopowinowactwa.

Powtórne zwijanie

W jednym aspekcie wynalazku, proces odzyskiwania oczyszczonej IL-21 z transformowanych szczepów gospodarza E. coli, w których IL-21 ulega ekspresji jako refrakcyjne ciałka wtrętowe, komórki są rozrywane, a ciałka wtrętowe odzyskuje się przez odwirowywanie.

Ciałka wtrętowe są następnie rozpuszczane i denaturowane w 6M chlorowodorku guanidyny zawierającym czynnik redukujący. Zredukowana IL-21 jest następnie utleniana w etapie kontrolowanej

PL 209 009 B1 renaturacji. Ten etap obejmuje rozcieńczanie w powtórnie zwijającym buforze składającym się z chlorowodorku argininy, soli i system Oxidoshuffling jest stosowany do zapoczątkowania tworzenia się mostków dwusiarczkowych w cząsteczce IL-21 i działa w oparciu o mieszaninę zredukowanych i utlenionych cząsteczek, takich jak cysteina i cystyna, DTT i cystyna, zredukowany glutation i utleniony glutation i DTT i utleniony glutation. Stosunek glutationu zredukowanego do utlenionego może mieścić się w zakresie od 1:1 do 6:1 przy zakresie stężenia od 0,5 do 8 mM. W jednym zastosowaniu optymalne stężenie wynosi 4 mM zredukowanego glutationu: 2 mM utlenionego glutationu. Stosunek cysteiny do cystyny może mieć zakres od 2:1 do 1:1 przy zakresie stężenia od 4 mM do 1 mM każdego odczynnika. W jednym zastosowaniu, optymalnym stężeniem jest 4 mM cysteina z 2 mM cystyną. Optymalne powtórnie zwijanie można również osiągnąć stosując 4 mM cystynę i 2 mM DTT, które tworzą 4 mM cysteinę i 2 mM cystynę. Powtórne zwijanie może być również przeprowadzone przez sulfitolizę w obecności takich odczynników jak siarczyn sodowy i tetra siarczek sodu. Zrenaturowana IL-21 zostaje wychwycona z rozcieńczonego powtórnie zwijającego buforu przez zastosowanie chromatografii kationowymiennej i jest oczyszczona przy zastosowaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych i wysokosprawnej chromatografii kationowymiennej.

Rozpuszczona substancja zawierająca IL-21 jest dodawana szybko (1-5 minut) lub wolno (0,5-5 godzin), w trakcie mieszania do powtórnie zwijającego buforu. Powtórnie zwijający bufor zawiera argininę (0,5 do 1,25M), PEG i sole. Może on także zawierać glicerol, guanidynę HCL, mocznik, EDTA, inhibitory proteazy i białka opiekuńcze, alkohol, detergenty, glicerol i siarczan miedzi. IL-21 może być dodana jako jednorazowy dodatek, wielokrotny dodatek lub może być dodana nadprogramowo. IL-21 jest dodawana do powtórnie zwijającej mieszaniny do osiągnięcia końcowego stężenia 0,05 do 1,2 mg/ml. Zakres temperatury wynosi 4-30°C. pH wynosi 7,3 do 8,5. Naczynie zawierające powtórnie zwiniętą mieszaninę pozostawia się wystawione na działanie atmosfery lub może być zraszane powietrzem lub azotem podczas renaturacji. Dopuszcza się by powtórne zwijanie miało miejsce i do 2 6 godzin.

Powtórne zwijanie może być również przeprowadzone w obecności EDTA, by zmniejszyć utlenianie metioniny lub na kolumnie wykluczania lub stosując filtrację z przepływem stycznym lub elektrodializę.

Klarowanie i zagęszczanie powtórnie zwiniętej IL-21

Powtórnie zwinięta IL-21 jest doprowadzana do pH 5,5 i następnie przepuszczana przez filtr 1,2 μm w celu wyklarowania i usunięcia nierozpuszczalnych białek. Filtrowany roztwór jest zagęszczany 10-30-krotnie przez zastosowanie filtracji z przepływem stycznym w systemie ramowo-płytowym lub przez zastosowania pojemników z kapilarami. Koncentrat jest następnie rozcieńczany buforem lub wodą 3-10-krotnie, by umożliwić osadzenie się rozwiniętym i zagregowanym białkom. Następnie, roztwór jest przepuszczany przez filtr dla wyklarowania i usunięcia nierozpuszczalnych białek.

Alternatywnie, powtórnie zwinięta IL-21 zostaje rozcieńczona 2-krotnie do 10-krotnie wodą lub 25 mM octanem sodu pH 5,5. Tworzy się osad lub flokulant i po w przybliżeniu 30 minutach do pięciu godzin jest usuwany przez filtrowanie. Do usunięcia flokulantu można zastosować filtr z nominalną wartością odcięcia 1,2 μm, a po nim filtr z nominalną wartością odcięcia 0,45 μm lub filtr wgłębny z pozytywnym potencjałem. Byłoby możliwe zastosowanie innych filtrów takich jak filtr z gradientem gęstości. Do usunięcia flokulantu jest również możliwe zastosowanie odwirowywania i mikrofiltracji.

Wychwytywanie IL-21

W innym aspekcie niniejszego wynalazku, po powtórnym zwinięciu i zagęszczeniu białka IL-21, sposoby niniejszego wynalazku zawierają wychwycenie powtórnie zwiniętego białka IL-21, które jest wychwytywane z rozcieńczonego buforu na kolumnie kationowymiennej i oczyszczenie białka IL-21 przy zastosowaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych i wysokosprawnej chromatografii kationowymiennej.

Etap wychwytu jest przewidziany jako etap do wychwycenia rozcieńczonej zwiniętej IL-21 i przeprowadzenia wstępnego oczyszczania. Najpierw przeprowadza się rozcieńczanie, w celu umożliwienia związania IL-21 na kolumnie. Wyklarowana rozcieńczona IL-21 jest wychwytywana na kolumnie kationowymiennej przy pH 5,5. Zazwyczaj używa się SP Sepharose XL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) lub TOYOPEARL SP 550C (Tosoh Biosep, Montgomery, PA). Buforem równoważącym jest 25 mM octan sodu, 0,2M do 0,45M chlorek sodu, pH 5,5 i związana IL-25 jest eluowana z wzrastającym gradientem soli. IL-21 eluuje z SP Sepharose XL przy w przybliżeniu 0,6M chlorku sodu i z TOYOPEARL SP 550C przy w przybliżeniu 0,8M chlorku sodu.

PL 209 009 B1

Chromatografia przy stosowaniu rozprzestrzeniającego się wypełnienia może być również stosowana do wychwytywania IL-21, które następuje po powtórnym zwinięciu. W takim przypadku etap rozcieńczania jest przeprowadzany kolejno podczas nakładania IL-21 na kolumnę. Żywica Streamline SP XL (Amersham Biosciences) jest równoważona 25 mM octanem sodu, 0,2M NaCl, pH 5,5. Następnie, IL-21 jest nakładana przy przepływie od dołu do góry na zrównoważoną żywicę Streamline SP XL, która jest utrzymywana w podwójnej wysokości w stosunku do osadzonego złoża, podczas rozcieńczania kolejno wodą do 1:3. Po przemywaniu zarówno przepływem od dołu do góry, jak i przepływem od góry do dołu, IL-21 jest eluowana przepływem od góry do dołu 0,6M NaCl lub gradientowym NaCl.

Na tym etapie sposoby niniejszego wynalazku dostarczają zastosowanie wielu różnych żywic kationowymiennych, obejmując słabe wymienniki kationów, jak karboksymetyl, różne rodzaje podłoży stałych, takich jak agaroza, czy celuloza i różne wielkości cząstek. Sposoby niniejszego wynalazku mogą również zapewnić działanie kolumn przy różnym pH w zakresie od 5,0 do 7,0 i z różnymi buforami i solami. Alternatywnie, inne metody chromatograficzne, takie jak oddziaływania hydrofobowe, wymiana anionowa, chelatowanie metali, mogą być stosowane do wychwycenia powtórnie zwiniętej IL-21.

Oczyszczanie

W jednym aspekcie niniejszego wynalazku występuje pośrednie oczyszczanie białka IL-21. Ten etap jest przeznaczony do osiągnięcia dalszego oczyszczania IL-21 przy zastosowaniu chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Zazwyczaj żywicami stosowanymi w tym etapie są Butyl Sepharose FF (Amersham Biosciences) lub TOYOPEARL butyl 650M (Tosoh Biosep). Żywica jest równoważona 25 mM octanem sodu, 50 mM NaCl, 1,5M (NH4)2SO4, pH 5,5. IL-21, która została oczyszczona chromatografią kationowymienną jest doprowadzana do stężenia 1,5M (NH4)2SO4 i następnie przepuszczona przez filtr z nominalną wartością odcięcia 0,45 μm. Doprowadzona i przefiltrowana IL-21 jest następnie nakładana na zrównoważoną żywicę, która jest następnie przemywana buforem równoważącym w celu usunięcia nie związanego materiału. IL-21 jest stopniowo eluowana w gradiencie do 25 mM octanu sodu, 50 mM NaCl, pH 5,5. IL-21 eluuje się z kolumny przy stężeniu w przybliżeniu 0,75M (NH4)2SO4 do 0,3 M (NH4)2SO4.

Inne żywice chromatografii oddziaływań hydrofobowych, które mogą być użyte w tym etapie obejmują, na przykład, różne rodzaje podłoży stałych, tych z podstawieniami fenylu i heksylu, takich jak agaroza lub celuloza i różnymi wielkościami cząsteczek. Niniejszy wynalazek zapewnia działanie kolumn przy różnym pH w zakresie od 5,0 do 9,0 i z różnymi buforami i solami. Niniejszy wynalazek zapewnia działanie kolumny w taki sposób, że IL-21 nie wiąże się.

IL-21 jest dalej czyszczona wysokosprawną kationowymienną chromatografią. Zazwyczaj IL-21 jest rozcieńczana do przewodności 30 ms/cm, pH jest doprowadzane 0,5M dwuzasadowym fosforanem do 6,0 i IL-21 jest nakładana na kolumnę Sepharose SP HP (Amersham Biosciences). Kolumna jest równoważona 25 mM fosforanem sodu, 0,3M chlorkiem sodu, pH 6,0. Jest to przemywane buforem równoważącym, a następnie IL-21 jest eluowana gradientowo chlorkiem sodu. Niniejszy wynalazek zapewnia również stosowanie innych wysokosprawnych kationowymiennych żywic. Kolumny mogą działać przy różnych wartościach pH z zakresu od 5,0 do 7,5 z różnymi buforami, takimi jak fosforanowe. Materiał, który będzie nakładany może być rozcieńczany wodą lub buforem do wartości przewodności z zakresu od 5 do 35 ms/cm.

Sposoby oczyszczania IL-21 mogą obejmować zagęszczanie i przeprowadzenie buforowej wymiany białka. Ten etap jest przewidziany do zagęszczenia eluatu z wysokosprawnej kationowymiennej kolumny i jego zamianę na bufor formulacyjny. Zebrany eluat ostatniej kolumny jest zatężany w przybliżeniu 10-krotnie przez zastosowanie płytki filtracji przepływu stycznego z wartością graniczną dla ciężaru cząsteczkowego 5 kDa i ramki membrany, diafiltrowany względem buforu fosforanowego o pH 6,0 lub względem 10 mM histydyny, 4,72% (w/v) manitolu o pH 5,0; 5,1; 5,2 lub 5,3, a następnie zatężany drugi raz, by uzyskać dalszy wzrost stężenia IL-21.

Mogą być stosowane inne membrany, takie jak membrana z wartością graniczną ciężaru cząsteczkowego 3 kDa lub 8 kDa, lub zespół włókien kapilarnych z wartością graniczną ciężaru cząsteczkowego 10 kDa. Czystość IL-21 po wysokosprawnej chromatografii kationowymiennej wynosi co najmniej 95%, a dzięki elektroforezie na żelu poliakrylamidowym z dodatkiem sodowego siarczanu dodecylu, czystość wynosi zazwyczaj więcej niż 98%. Poziom endotoksyny w przygotowywaniu IL-21 po wychwycie przy użyciu kationowymiennej chromatografii, oczyszczaniu przy pomocy chromatografii oddziaływań hydrofobowych i wymianie buforowej jest na ogół < 10 jednostek endotoksyn na mg biał16

PL 209 009 B1 ka IL-21 i zazwyczaj < 2 jednostek endotoksyn na mg białka IL-21. Poziom endotoksyn po wysokosprawnej kationowymiennej chromatografii jest ogół < 1 jednostki endotoksyn na mg białka IL-21.

Analiza materiału wytworzonego przy użyciu Streamline SP XL i butyl Sepharose FF (bez 20-krotnego zagęszczenia przed kationowymienną chromatografią) przy zastosowaniu HPLC wykluczania wykazała, że agregaty stanowią mniej niż 0,2%, a niejednorodność ładunku, przy zastosowaniu jonowymiennej HPLC wynosi w przybliżeniu 10%, a miara czystości przy zastosowaniu HPLC z fazą odwróconą wynosi w przybliżeniu 90%. Analiza materiału wytworzonego przy zastosowaniu Toyopearl SP 550C, Toyopearl butyl 650 M i Sepharose SP HP wykazała, że przy zastosowaniu HPLC wykluczania, agregaty stanowią mniej niż 2%, miara czystości przy zastosowaniu HPLC z fazą odwróconą wynosi w przybliżeniu 90%, a niejednorodność ładunku, przy zastosowaniu kationowymiennej HPLC wynosi w przybliżeniu 4%.

Aby usunąć pozostałe zanieczyszczenia i skażenia, może być pożądane dalsze oczyszczanie IL-21. Na przykład, do zredukowania poziomu endotoksyn, może być użyta anionowymienna kolumna. IL-21 zostaje rozcieńczana do poziomu przewodności < 10 mS/cm, a pH zostaje doprowadzone do 8,0. Jest ona nałożona na kolumnę Q Sepharose FF (Amersham Biosciences), która została zrównoważona do 20 mM Tris, pH 8,0. IL-21 przechodzi przez kolumnę i poziom endotoksyn jest zredukowany w przybliżeniu o 80% w porównaniu do tego, co zostało nałożone. By zredukować poziom endotoksyn, mogą być również stosowane membrany Q lub Mustang E (Pall, Port Washington, NY) przy pH pomiędzy pH 5,0 i 9,0.

Inne etapy oczyszczania, które mogłyby być potencjalnie zastosowane do dalszego oczyszczania IL-21 obejmują chromatografię z chelatowanym metalem, chromatografię anionowymienną lub chromatografię oddziaływań hydrofobowych na kolumnie fenylowej. Jest również możliwe przeprowadzenie oczyszczania przed powtórnym zwinięciem IL-21 stosując na przykład HPLC z fazą odwróconą, chromatografię jonowymienną lub chromatografię z chelatowanym metalem. Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza dalej sposoby zawierające dodatkowe etapy oczyszczania tutaj opisane.

Charakterystyka oczyszczonej IL-21

BaF3 jest interleukiną-3 (IL-3) zależną od prelimfoidalnej linii komórkowej pochodzącej z mysiego szpiku kostnego (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot i wsp., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Komórki BaF3, w których zachodzi ekspresja pełnej długości receptora IL21 zostały skonstruowane jak w pełni opisano w patencie US Patent No 6 307 024. Ta linia komórkowa, która żeby przeżyć jest zależna od drogi metabolicznej związanej z receptorem IL-21, a hodowanie linii komórkowej pod nieobecność innych czynników wzrostu może być stosowane w teście na biologicznie aktywną IL-21. Proliferacja komórek BaF3/IL-2lR może być oszacowana przez stosowanie różnych rozcieńczeń oczyszczonego białka IL-21, które są dodawane do komórek i porównanie wzrostu komórek, do których dodano białko ze wzrostem komórek hodowanych bez białka IL-21.

Testy mierzące proliferację komórek lub ich różnicowanie są dobrze znane w tej dziedzinie. Na przykład, testy mierzące proliferację obejmują takie testy, jak chemowrażliwość na neutralny barwnik czerwony (Cavanaugh i wsp., Investigational New Drugs 8: 34 7-354, 1990, włączony tutaj jako odnośnik), włączanie znakowanych radioaktywnie nukleotydów (Cook i wsp., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989, włączony tutaj jako odnośnik), włączanie 5-bromo-2'-dezoksyurydyny (BrdU) do DNA proliferujących komórek (Porstmann i wsp., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985, włączony tutaj jako odnośnik) i zastosowanie soli tetrazolowych (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55- 63, 1983; Alley I wsp., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall i wsp., Growth reg. 5: 69-84, 1995; i Scudiero i wsp., Cancer Res. 8: 4827-4833, 1988; wszystko włączone tutaj jako odnośniki). Testy mierzące różnicowanie się obejmują, na przykład, pomiary markerów powierzchniowych komórki, związanych ze specyficzną ekspresją dla stadium rozwoju tkanki, aktywność enzymatyczną, aktywność funkcjonalną lub zmiany morfologiczne (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; wszystko włączone tutaj jako odnośniki). IL-21 wytworzona sposobami opisanymi tutaj jest zdolna do pobudzenia wzrostu komórek BaF3/IL-21R.

Oczyszczona IL-21 może być charakteryzowana wieloma sposobami fizycznymi. Optymalnie, analizy aminokwasów wykazują kompozycję wszystkich reszt aminokwasów mieszczącą się w granicach 10% oczekiwanej wartości. Sekwencjonowanie końca-N daje pojedynczą sekwencję zaczynającą się metioniną i odpowiadającą przewidywanej sekwencji wektora ekspresyjnego IL-21. Całkowita analiza masowa przy stosowaniu spektrometrii masowej daje wartości w granicach 0,01% przewidywanej masy IL-21 (15593,84 Da). Trawienie endoproteinazą Lys C, po którym następuje chromatograPL 209 009 B1 fia cieczowa połączona ze spektrometrią masową może być zastosowane do utworzenia mapy peptydowej, na której wszystkie piki odpowiadają, jeśli chodzi o masę, przewidywanym trypsynowanym peptydom w IL-21, w których wszystkie przewidywane trypsynowane peptydy z IL-21 są zidentyfikowane. Mapowanie peptydów wykazuje również wiązania dwusiarczkowe zgodne z przewidywanym dla białka, które jest członkiem rodziny IL-21, jak również brak utleniania metioniny.

Tworzenie preparatów

Wartość pH została dobrana tak, żeby zminimalizować degradację zauważoną przy SE-HPLC (formowanie rozpuszczalnych dimerów, utrata zawartości), CIE-HPLC (oczywista deamidacja) i RP-HPLC (utlenianie i degradacja na drodze jeszcze nie zidentyfikowanej). W pewnych zastosowaniach, przy stosowaniu buforu histydyny, bazując na pojemności buforu, stabilności i nadawaniu się do podawania pozajelitowego zakres pH wynosi 5,0-5,6. Alternatywnie, mogą być stosowane bufory cytrynianowy lub bursztynianowy.

W jednym zastosowaniu jako regulator toniczności roztworu (roztwór izotoniczny) został wybrany mannitol, w oparciu o stabilność i nadawanie się do liofilizacji. W innych zastosowaniach mogą być stosowane sorbitol lub glicyna. Można stosować NaCl, ale toniczność może być mniej stabilna. Trehaloza lub sacharoza mogą być stosowane, lecz potencjalnie mogą hydrolizować w tych lekko kwasowych warunkach. Jednakże preparaty mogą zawierać od 1 mg/ml do 100 mg/ml IL-21 w preparacie. W jednym zastosowaniu, preparaty są tworzone przy stężeniu białka IL-21 10 mg/mL IL-21 w 10 mM histydynie, 4,7% w/v mannitolu, pH 5,3. Produkt był magazynowany i zamrożony w -20°C. Określenie, czy roztwór produktu jest żywotny zależy od ograniczeń specyfikacji, które są uznawane za możliwe do zaakceptowania i doświadczeni w tej dziedzinie określą ograniczenia maksymalizujące odzyskiwanie produktu, minimalizujące agregację, minimalizujące heterogenność ładunku, minimalizujące zanieczyszczenia i zachowujące akceptowalną aktywność biologiczną. Gdy ustalono ograniczenia dimeru < 3% (wysoka masa cząsteczkowa), czystość przy CIE- i RP-HPLC > 90% i oznaczono zastrzeżenie zawartości > 90%, schłodzony roztwór produktu był stabilny i uznany za racjonalny wybór. Dawki IL-21 między 0,1 do 3 mg/kg na ogół nie będą przekraczały 30 ml dla podawania w postaci bolusa IV.

Można również przygotować produkt liofilizowany, który będzie wchodził w zakres niniejszego wynalazku. Kompozycje niniejszego wynalazku mogą obejmować również inne zarobki Na przykład, akceptowalne zarobki jako stabilizatory obejmują dwucukry takie jak trehaloza i sacharoza od 0,5% do 10%; glikol polietylenowy od 0,001% do 0,1% jako stabilizator lub czynnik zwilżający; surfaktanty, jak tween 20, tween 30 lub triton-X-100 od 0,001% do 0,1% jako stabilizator lub czynnik zwilżający; lub inne środki wypełniające takie jak glicyna, skrobia hydroksyetanolowa w zakresie stężeń od 0,5% do 5%.

Badanie stabilności może być przeprowadzone w warunkach przyspieszonych, takich jak przechowywanie w podwyższonej temperaturze od 25°C do 45°C lub wytrząsanie. Na przykład, podczas przeprowadzania wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, preparat IL-21 okazał się stabilny przy stężeniach 20 mg/ml W jednym zastosowaniu, pH 5,25 było stosowane do zredukowania stopnia degradacji. Jednakże, optymalnym zakresem pH dla liofilizowanego produktu jest 4,75 do 7,5, a dla nie liofilizowanych produktów zakres pH wynosi od 5 do 5,6.

Kompozycje niniejszego wynalazku mogą zawierać jeden lub więcej konserwantów, szczególnie te kompozycje, które są pakowane do wielokrotnego użytku. Konserwanty mogą być także stosowane, w obejmowanych niniejszym wynalazkiem, powszechnie stosowanych preparatach farmaceutycznych takich jak metylparaben, propylparaben, alkohol benzylowy, m-krezol, etylortęciowy tiosalcylan, fenol, timerozal i temu podobne.

Kompozycje IL-21 przeznaczone do zastosowań farmaceutycznych będą sterylne i bez pyrogenu i będą wytwarzane i pakowane zgodnie z zaakceptowanymi procedurami farmaceutycznymi. Opakowania kompozycji mogą być pakowane w dawkach pojedynczych, bądź jako dawki wielokrotne. Kompozycje zazwyczaj są pakowane w zatopione szklane fiolki z korkami obłożonymi politetrafluoroetylenem i z właściwymi etykietami. Kompozycje liofilizowane mogą być pakowane jako zestaw, który zawiera właściwą ilość odpowiedniego rozcieńczalnika, takiego jak woda do zastrzyków (WFI) lub 5% dekstroza w WFI.

Dalej wynalazek jest zilustrowany przez następujące, nieograniczające przykłady.

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Konstruowanie wektora ekspresyjnego, pTAP237

Plazmid pTAP237 był wytwarzany przez wstawienie rekombinacją homologiczną wytworzonego podczas PCR linkera w miejsce Smal pTAP186. Plazmid pTAP186 został wyprowadzony z plazmidów pRS316 (wektor wahadłowy Saccharomyces cerevisiae) i pMAL-c2, plazmid ekspresyjny E. coli po18

PL 209 009 B1 chodzi z KK223-3 i zawiera promotor tac i terminator rrnB. Plazmid pTAP186 zawiera gen oporności na kanamycynę, w którym miejsce Smal zostało zniszczone, a ma miejsca Notl i Sfil flankujące sekwencje drożdży ARS-CEN6 i URA3, ułatwiające ich usunięcie z plazmidu przez trawienie Notl. Linker wytworzony podczas PCR zastępuje ekspresyjną sekwencję łącznikową w pTAP186 syntetyczną sekwencją RBSII. Została ona przygotowana ze 100 pmoli każdego z oligonukleotydów zc29,740 i zc29,741, jak pokazano odpowiednio na SEQ ID NOS: 3 i 4 i w przybliżeniu 5 pmoli każdego z oligonukleotydów zc29,736 i zc29,738, jak pokazano odpowiednio na SEQ ID NOS: 5 i 6. Te oligonukieotydy były wiązane w reakcji PCR prowadzonej: 10 cykli w 94°C przez 30 sek, 50°C przez 30 sek i 72°C przez 30 sek, a następnie nasycane w 4°C. Otrzymywane w rezultacie produkty PCR były zagęszczane przez wytrącanie dwukrotną objętością 100% etanolu. Osad był powtórnie zawieszany w 10 μl wody, żeby zastosować go do rekombinacji do wektora biorcy pTAP186, trawiony Smal do wytworzenia konstruktu zawierającego syntetyczną sekwencję RBSII. W przybliżeniu 1 μg linkera wytworzonego w reakcji PCR i 100 ng pTAP186 trawionego Smal, zostały razem zmieszane i transformowane do kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae). Drożdże zostały następnie umieszczone na płytki -URA D i pozostawione w temperaturze pokojowej na około 72 godziny. Następnie, transformanty Ura+ z pojedynczej płytki zostały powtórnie zawieszone w 1 mL H2O i krótko odwirowane, by osadzić komórki drożdży. Osad komórkowy został powtórnie zawieszony w 0,5 mL buforu lizującego. Odzyskano DNA i transformowano nim MC1061 E. coli. Klony były przetestowane PCR kolonijnym, jak opisano powyżej, przy zastosowaniu 20 pmoli każdego z oligonukleotydów zc29,740 i zc29,741, jak pokazano odpowiednio na SEQ ID NOS: 3 i 4. Klony wykazujące prawidłowy rozmiar prążka na żelu agarozowym były poddane analizie sekwencji. Właściwy plazmid został oznaczony jako pTAP237.

P r z y k ł a d 2. Konstruowanie pTAP252

Sekwencja kodująca dla ludzkiej IL-21 (jak pokazano na SEQ ID NO: 1) została wytworzona przez powielanie w reakcji PCR stosując jako wzorzec CD3+ z puli biblioteki cDNA i startery oligonukleotydowe zc29,084 i zc22,127 (SEQ ID NOS: 7 i 8, odpowiednio). Żeby zoptymalizować proces translacji w E. coli, dodany został poprzez starter zc29,084 (SEQ ID NO: 7) kodon inicjacji ATG do końca 5' sekwencji kodującej IL-21. Powstała w rezultacie sekwencja genów kodowała dojrzałą IL-21 z jedną dodatkową metionina na N-końcu (IL-21met). Ostateczny produkt PCR został włączony do wektora ekspresyjnego pTAP237 (opisany w przykładzie 1) przez homologiczną rekombinację drożdży (Raymond i wsp., Biotechniques 26 (1): 134-8, 140-1, 1999; US Patent 6 027 442 włączonym tutaj jako odnośnik). Konstrukt ekspresyjny pTAP252 został wyekstrahowany z drożdży i transformowany do kompetentnego MC1061 E. coli. Klony oporne na kanamycynę zostały zidentyfikowane w reakcji PCR kolonijnego. Klon pozytywny został zweryfikowany przez sekwencjonowanie i w konsekwencji transformowany albo do wytwarzającego szczepu gospodarza E104 albo UT5600.

P r z y k ł a d 3. Optymalizacja kodonów

Indukcja ekspresji ludzkiej IL-21met w pTAP252 spowodowała wytworzenie w szczepie E104 E. coli około 2-5% całkowitego białka komórkowego. Badanie kodonów stosowanych w kodującej sekwencji IL-21 wykazuje, że zawiera ona nadmiar najrzadziej używanych kodonów w E. coli o wartości CAI wynoszącej 0,181. CAI jest statystyczną miarą równoznacznych tendencji kodonu i może być stosowana do przewidywania poziomu wytwarzania białka (Sharp i wsp., Nucleic Acids Res. 15 (3): 1281-95, 1987). Geny kodujące dla białek o wysokiej ekspresji mają tendencję do posiadania wysokich wartości CAI (> 0,6), podczas gdy białka kodowane przez geny o niskich wartościach CAI (< 0,2) mają na ogół nieefektywną ekspresję. To wskazywało na powód niskiego poziomu wytwarzania IL-21 w E. coli. Dodatkowo, rzadkie kodony są gromadzone w drugiej połowie informacji, co prowadzi do wyższego prawdopodobieństwa translacyjnego opóźnienia, przedwczesnego zakończenia translacji i błędnego włączenia aminokwasu (Kane JF., Curr. Opin. Biotechnol. 6 (5): 494-500, 1995). Wykazano, że poziom ekspresji białek, których geny zawierają rzadkie kodony może poprawić się w imponujący sposób, gdy u gospodarza zostanie zwiększony poziom pewnych rzadkich tRNAs (Zdanovsky i wsp., ibid., 2000; Calderone i wsp., ibid., 1996; Kleber-Janke i wsp., ibid., 2000; You i wsp., ibid., 1999). Plazmidy pRARE niosą geny kodujące tRNAs dla kilku kodonów, które są rzadko używane w E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX i glyT).Geny znajdują się pod kontrolą ich natywnych promotorów (Novy, ibid.).

Koekspresja z pRARE poprawia wytwarzanie IL-21met w E. coli około 5-10-krotnie. Koekspresja z pRARE zmniejsza również poziom ciętej IL-21met lizacie E. coli. Te dane sugerują, że powtórne resyntetyzowanie genu kodującego dla IL-21met z bardziej odpowiednim zastosowaniem kodonu,

PL 209 009 B1 dostarcza ulepszony wektor dla ekspresji wielkich ilości IL-21. Sekwencja kodująca IL-21met, zoptymalizowana kodonami została skonstruowana z szesnastu zachodzących na siebie o 1 i ogonukleotydów: zc22,913 (SEQ ID NO: 9), zc22,914 (SEQ ID NO: 10), zc22,915 (SEQ ID NO: 11), zc22,916 (SEQ ID NO: 12), zc22,961 (SEQ ID NO: 13), zc22,962 (SEQ ID NO: 14), zc22,963 (SEQ ID NO: 15), zc22,964 (SEQ ID NO: 16), zc22,965 (SEQ ID NO: 17), zc22,966 (SEQ ID NO: 18), zc22,968 (SEQ ID NO: 20), zc22,969 (SEQ ID N0: 21), zc22,967 (SEQ ID NO: 19), zc22,970 (SEQ ID NO: 22), zc22,971 (SEQ ID NO: 23) i zc22,972 (SEQ ID NO: 24).

Wydłużenie starterami tych zachodzących na siebie oligonukleotydów następujące po powielaniu w reakcji PCR wytworzyło gen IL-21 pełnej długości z kodonem zoptymalizowanym dla ekspresji w E. coli. Ostateczny produkt PCR został włączony do wektora ekspresyjnego pTAP168 przez rekombinację homologiczną drożdży. Konstrukt ekspresyjny został wyekstrahowany z drożdży i transformowany do kompetentnego MC1061 E. coli. Oporność klonów na kanamycynę została zidentyfikowana przez reakcję kolonijnego PCR.

Pozytywny klon został zweryfikowany przez sekwencjonowanie i w konsekwencji transformowany albo do wytwarzającego szczepu gospodarza E104 albo UT5600. Wektor ekspresyjny ze zoptymalizowaną sekwencją IL-21met został nazwany pTAP196. Końcowy produkt PCR został włączony do wektora pTAP168 dla ekspresji pod kontrolą promotora Tac. Jednakże ekspresja była bardzo niska i produkt mógł być wykryty jedynie przez analizę Westerna przy zastosowaniu monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw IL-21 jako sondzie. Badanie informacji o drugorzędowej strukturze IL-21met ujawniło wyjątkowo stabilną strukturę typu szpilki do włosów w rejonie pomiędzy zasadami 36 i 64 (SEQ ID NO: 1). Podejrzewano, że ten element strukturalny zapobiegał wydajnej translacji z informacji w IL-21met. Dlatego też hybrydowa sekwencja kodująca IL-21met została wytworzona przez nakładającą się reakcję PCR. Fragment zawierający pierwsze osiemdziesiąt zasad nie zoptymalizowanej sekwencji IL-21met został wyprodukowany przez powielenie w reakcji PCR stosując jako matrycę pTAP252 oraz oligonukleotydowe startery zc29,740 (SEQ ID NO: 3) i zc4 0,133 (SEQ ID NO: 25). Region IL-21met zoptymalizowany od zasady 81 do 450 (SEQ ID NO: 27) został wytworzony przez powielenie w reakcji PCR stosując jako matrycę pTAP196 i oligonukleotydowe startery zc22,971 (SEQ ID NO: 23) i zc40,107 (SEQ ID NO: 26). Te dwa produkty PCR zostały połączone i powielone przez zastosowanie starterów oligonukleotydowych zc22,971 (SEQ ID NO: 23) i zc29,740 (SEQ ID NO: 3) do wytworzenia IL-21met pełnej długości w nakładającej się reakcji PCR.

Ostateczny produkt PCR został włączony do wektora ekspresyjnego pTAP237 przez rekombinację homologiczną w drożdżach. Konstrukt ekspresyjny został wyekstrahowany z drożdży i transformowany do kompetentnego MC1061 E. coli. Klony oporne na kanamycynę zostały zidentyfikowane przez PCR kolonijny. Klon pozytywny został zweryfikowany przez sekwencjonowanie i w konsekwencji transformowany albo do wytwarzającego szczepu gospodarza E104 albo UT5600. Wektor ekspresyjny z hybrydową sekwencją kodującą IL-21met został nazwany pTAP337. Skoro tylko struktura typu szpilki do włosów została wyeliminowana przez zastąpienie pierwszych osiemdziesięciu zasad zoptymalizowanej sekwencji przez pierwsze osiemdziesiąt zasad nie zoptymalizowanej sekwencji IL-21met (pokazanej na SEQ ID NO: 1), powstały w wyniku tego gen bardzo dobrze ulegał ekspresji w E. coli. Z nowym konstruktem poziomy ekspresji wzrosły do około 20% całkowitego białka komórkowego.

P r z y k ł a d 4. Ekspresja IL-21met

E. coli została zaszczepiona w 100 mL pożywki Superbroth II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) zawierającej 0,01% Antifoam 289 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 30 μg/ml kanamycyny i hodowana przez noc w 37°C. 10 mL szczepionki zostało dodane do 500 mL tej samej pożywki do 2 L butelki hodowlanej, która była wytrząsana przy 275 rpm w 37°C, aż hodowla osiągnęła wartość 4 przy OD600. Następnie dodane zostało ITPG do końcowego stężenia 1 mM i wytrząsanie było kontynuowane przez następne 2,5 godziny. Komórki były odwirowywane przy 4000 x g przez 10 min w 4°C. Osady komórkowe zostały zamrożone w -80°C, do zastosowania w późniejszym czasie. Ekspresja IL-21met została przeprowadzona na większą skalę w 25 mL hodowli w 37°C. Jeden mL hodowli został pobrany 2 godziny po wprowadzeniu IPTG. Komórki E. coli zostały powtórnie zawieszone w równej objętości BugBuster^© Protein Extraction Reagent (Novagen, Madison, WI) w 4°C i inkubowane przez 20 min. Frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne zostały oddzielone przez odwirowywanie przy 16000 x g przez 10 min w 4°C.

Zrekombinowaną IL-21met zgromadzono jako nierozpuszczalne ciałka wtrętowe. Wynik odzyskiwania IL-21met z większości szczepów E. coli był uważany za niski. Około 80 do 90% IL-21met w ciałkach wtrętowych było tracone w ciągu 20 min po lizie komórek i inkubacji w 4°C. Lizowanie bak20

PL 209 009 B1 terii 8M mocznikiem nie poprawiło odzyskiwania. Jednakże włączenie inhibitorów proteazy, takich jak 5 mM ZnCl2 i 0,5 mM benzamidyny do buforu lizującego komórki, zapobiegało utracie IL-21met ze szczepu E104 (W3110 arabinoza). Wskazuje to, że bakteryjna proteaza zdolna do cięcia IL-21met w denaturujących warunkach, była współczyszcząca z ciałkami wtrętowymi. Zostało zaobserwowane, że IL-21met była stabilna w lizatach komórkowych ze szczepu UT5600, ale nie w lizatach komórkowych E104. Sugeruje to, że proteaza była obecna w E104, ale nie w UT5600. Porównanie genotypów tych szczepów ujawniło, że OmpT, który tnie między dwuzasadowymi resztami, obecny był w E104, ale nie w UT5600. OmpT jest stabilny termicznie i aktywny nawet w środowisku denaturującym (White i wsp., ibid. 1995).

Badanie sekwencji aminokwasów IL-21 wykazało, że posiada ona co najmniej cztery potencjalne miejsca cięcia OmpT. IL-21met wykazywała również doskonałą stabilność w BL21, kolejnym szczepie E. coli wykazującym brak OmpT. Te dane sugerują, że aktywność proteazy OmpT była krytyczna dla stabilności i odzyskiwania IL-21. Zastosowanie szczepu UT5600 E. coli jako gospodarza wytwarzania znacząco poprawia odzyskiwanie IL-21met. Ogólna wydajność IL-21met wzrosła z 2 mg/L do 50-100 mg/L wraz z poprawieniem kombinacji konstrukt szczepu gospodarza.

P r z y k ł a d 5. Charakterystyka IL-21

Do analizy Westerna próbki białka zostały rozdzielone na 4-20% żelu MES-SDS NuPAGE (Invitrogen) w środowisku redukującym i przeniesione na błonę nitrocelulozową (Invitrogen) przy 30 V na 1 godzinę. Błona została zablokowana 5% mlekiem bez tłuszczu w buforze TTBS (20 mM Tris pH 7,4, 160 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Przeciwciało poliklonalne specyficzne dla ludzkiej IL-21 zostało dodane do buforu TTBS z 5% mlekiem bez tłuszczu i inkubowane przez 1 godzinę. Po przemyciu TTBS biot był traktowana HRP sprzężonym z króliczym antykozim IgG (Bio-Rad) przez 1 godzinę. Plama została następnie przemyta trzy razy TTBS przed detekcją chemiluminescencyjną odczynnikiem ECL z Pierce.

P r z y k ł a d 6. Analiza stabilności plazmidu

E. coli została zaszczepiona do 25 mL pożywki Superbroth II (Becton Dickinson) zawierającej 0,01% Antifoam 289 (Sigma) i 30 μg/ml kanamycyny i hodowana przez noc w 37°C. 25 μl materiału do szczepienia zostało dodane do 25 mL tej samej pożywki bez kanamycyny w 25 mL butelce hodowlanej, która była wytrząsana przy 275 rpm w 37°C. Zostało zebrane 100 μl hodowli w czterech różnych momentach czasu (gdy hodowla osiągnęła wartości 2, 4, 6 i 8 przy OD600). Próbki zostały rozcieńczone i wysiane na agarowych płytkach LB bez żadnych dodatków. Po całonocnej inkubacji w 37°C, 100 kolonii E. coli było replikowane na płytce agarowej LB i płytce agarowej LB zawierającej 30 μg/ml kanamycyny. Po całonocnej inkubacji w 37°C, liczba kolonii, która się wytworzyła na każdej płytce była liczona i porównywana. Liczba kolonii, które wyrosły na LB plus kanamycyna, w stosunku do liczby rosnącej na płytce bez antybiotyku, odzwierciedlała odsetek komórek nadal zawierających wektor ekspresyjny.

Gdy klony W 3110 niosące wektor ekspresyjny pTAP337 były hodowane przez 12 godzin w pożywce, która nie zawierała kanamycyny, ponad 90% utrzymało plazmid. Klony niosące wektor ekspresyjny bez genu IL-21 wykazywały podobną zdolność utrzymywania plazmidu. Te dane dowodzą, że wektor ekspresyjny pTAP337 zawierający IL-21 jest stabilny w W3110. Szczepy E. coli TGl i MM294 nie były wyselekcjonowane na gospodarzy do wytwarzania ze względu na niską produktywność IL-21 i istotną niestabilność plazmidu.

Najbardziej zachęcające rezultaty wynikły z badań stosujących szczep W 3110 (ATCC # 27325) E. coli do wytworzenia IL-21. Zdolność do wytwarzania w W3110 była porównywalna ze zdolnością do wytwarzania w UT5600. Badania stabilności plazmidu wykazały, że wektor ekspresyjny pTAP337 również był utrzymywany w W3110. UT5600 jest szczepem auksotroficznym i trudniejszym do hodowania na wielką skalę. Te względy prowadziły do wybrania W3110 jako zalecany szczep gospodarza do wytwarzania IL-2 1.

P r z y k ł a d 7. Fermentacja okresowa

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z Difco APS Super Broth (Difco Laboratories, Detroit, MI), uzupełniona 5 g/L glicerolu i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki do wytrząsania ezą pełną W3110 E. coli, która zawierała wektor ekspresyjny pTAP337 (EE410) z płytki agarowej (Luria agar (Difco Laboratories) zawierający 25 μg/ml kanamycyny) z 24 godzinną hodowlą. Wzrost odbywał się w butelce do wytrząsania w temperaturze 30°C. Butelka była inkubowana z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

PL 209 009 B1

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 3,0 L Difco APS Super Broth i wysterylizowanie. Pożywka wzrostowa została uzupełniona 10 g/L glicerolu i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 7,2. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na vvm i wytrząsanie zostało ustawione na 350 rpm.

Temperatura została ustawiona na 37°C. Fermentor był szczepiony hodowlą prowadzoną w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącą 16 godzin do gęstości optycznej (OD) 16 przy 600 nm. Szczepionka była 5% v/v.

Rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia poprzez wzrastającą prędkość wytrząsania. Hodowla była prowadzona do chwili, gdy OD600 osiągnęła 2,5 (w przybl. 2,5 godziny). Tiogalaktopiranozyd izopropylowy (IPTG) został dodany do hodowli do stężenia 1,0 mM. Potem pozostawiono hodowlę do wzrostu przez dodatkowe 3 godziny.

P r z y k ł a d 8

A. Fermentacja półciągła

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z Difco APS Super Broth, uzupełniona 5 g/L glicerolu i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki do wytrząsania ezą pełną W3110 E. coli, która zawierała wektor ekspresyjny pTAP337 (opisany powyżej) z płytki agarowej (Luria agar zawierający 25 μg/ml kanamycyny) z 24 godzinną hodowlą. Butelka była inkubowana w 30°C z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 3,0 L pożywki wzrostowej ZymoM i wysterylizowanie. Pożywka wzrostowa została uzupełniona 20 g/L glicerolu i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,4. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 32°C.

Fermentor był zaszczepiony hodowlą prowadzoną w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącą 16 godzin do OD600 wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v i rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Roztwór węglowodanu był dostarczany do fermentora zaczynając od 10 godziny EFT.

Zasilanie było kontynuowane do końca fermentacji. Roztworem zasilającym był glicerol przygotowany jako 70% v/v. Stopień zasilania wynosił 6 gramów glicerolu na litr na godzinę w oparciu o objętość początkową. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 2 mM. Po 48 godzinach produkt fermentacji został zebrany.

W alternatywnym procesie półciągłym butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z ZSM uzupełnionym 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki do wytrząsania 300 μl W3110 E. coli zamrożonej w 20% glicerolu i zawierającej wektor ekspresyjny pTAP337. Hodowla była inkubowana w 30°C z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 3,0 L pożywki wzrostowej ZymoM i wysterylizowanie. Pożywka wzrostowa została uzupełniona 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C.

Fermentor był zaszczepiony z hodowli prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 wynoszącej 16. Szczepionka była 5% objętości/objętość i poziom rozpuszczonego tlenu był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Roztwór węglowodanu był dostarczany do fermentora zaczynając od 10 godziny EFT. Zasilanie było kontynuowane do końca fermentacji.

Roztworem zasilającym była glukoza przygotowana jako 60% v/v, a stopień zasilania wynosił 9,5 gramów glukozy na litr na godzinę w oparciu o objętość początkową. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 2 nM. Po 48 godzinach EFT do hodowli zostały dodane mmol/l IPTG doprowadzając stężenie IPTG do 4 mM. Produkt fermentacji został zebrany po 56 godzinach.

PL 209 009 B1

T a b e l a 1

Pożywka ZSM (butelka do wytrząsania i fermentator do posiewu)

Składnik	Ilość g/L lub ml/L
Wyciąg drożdży	5,0
Dwuzasadowy siarczan sodowy	2,0
Dwuzasadowy siarczan amonu	2,5
Chlorek amonu	0,5
Dwuzasadowy fosforan potasu	14,6
Jednozasadowy fosforan potasu	3,6
Woda dejonizowana	1,0 L
Po autoklawowaniu dodać:
60% glukoza	20 g/L (33 mL)
Roztwór związków śladowych „D”	3 mL
1M MgSO4	3 mL
Kanamycyna (25 mg/ml stężenie podstawowe)	1,0 mL

T a b e l a 2

60% roztwór glukozy dla fermentacji okresowej

Składnik	Ilość g/L
H2O	800 mL
Glukoza	1200 g
Dopełnij objętość H2O do:	2,0 L
Po autoklawowaniu dodać:
1M MgSO4 (30 mL/L)	60 mL

T a b e l a 3

ZymoM - (pożywka dla fermentacji półciągłej)

Składnik	Ilość g/L lub ml/L
(NH4)2SO4	14,0
KH2PO4	2,0
K2HPO4	16,5
Wyciąg drożdży	5,5
Glicerol	20,0
Środek przeciwpienny AF208	0,1 mL
Konc. H3PO4	1,5
Woda dejonizowana	1,0 L
Po autoklawowaniu dodać:
1M MgSO4	10 mL
Roztwór związków śladowych „D”*	17,0 mL
Kanamycyna (25 mg/mL stężenie podstawowe)	1 mL

PL 209 009 B1

T a b e l a 4

Roztwór związków śladowych „D” (dla pożywek ZymoM i ZSM)

Składnik	Ilość g/L
FeCla · 6H2O	6,48
ZnSO4 ·7H2O	1,68
MnCl2 · 4H2O	1,20
Na2MoO4 · 2H2O	0,50
CuSO4 ·5H2O	0,24
H3BO3	0,72
Konc. H3PO4	48,0 mL
dH2O	1,0 L

B. Fermentacja półciągła z pożywką PCOL22

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z pożywką ZSM, uzupełnioną 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 300 μl materiału z rozmrożonej, uprzednio zamrożonej fiolki zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Butelka do wytrząsania była inkubowana w 32CC z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 2,7 L pożywki PCOL22 i wysterylizowanie. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa została uzupełniona 20 g/L glukozy, siarczanem magnezowym, chlorkiem wapniowym i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzenie zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był zaszczepiony z hodowli EE410 prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 nm wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Wartość pH wynosząca 6,8 była kontrolowana dodawaniem 5N NH4OH. Roztwór glukozy (60% w/v) był dostarczany do fermentora zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach EFT produkt fermentacji został zebrany.

C. Fermentacja półciągła z pożywką PCOL22 bez kanamycyny

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z pożywką ZSM, uzupełnioną 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 300 μl materiału z rozmrożonej, uprzednio zamrożonej fiolki zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W 3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Butelka do wytrząsania była inkubowana w 32°C wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 2,7 L pożywki PCOL22 i wysterylizowanie. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa została uzupełniona 20 g/L glukozy siarczanem magnezowym i chlorkiem wapniowym. Nie dodano kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był zaszczepiony z hodowli EE410, prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 nm wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Wartość pH wynosząca 6,8 była kontrolowana dodawaniem 5N NH4OH. Roztwór glukozy (60% w/v) był dostarczany do fermentora zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania

PL 209 009 B1 fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach produkt fermentacji został zebrany.

D. Fermentacja półciągła z pożywką PCOL22-L

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z pożywką ZSM, uzupełnioną 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 300 μl materiału z rozmrożonej, uprzednio zamrożonej fiolki zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Butelka do wytrząsania była inkubowana w 32°C z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 2,7 L pożywki PCOL22-L i wysterylizowanie. Ta pożywka zawiera kwas cytrynowy jedną trzecią mniej soli, by zapobiec wytrącaniu. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa była uzupełniana 20 g/L glukozy, siarczanem magnezowym, chlorkiem wapniowym i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był szczepiony z hodowli EE410 prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 nm wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Wartość pH wynosząca 6,8 była kontrolowana dodawaniem 5N NH4OH. Roztwór glukozy (60% w/v) bez siarczanu magnezowego był dostarczany do fermentora zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach EFT produkt fermentacji został zebrany.

E. Fermentacja półciągła z pożywką PCOL12-L

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z pożywką ZSM, uzupełnioną 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 300 μl materiału z rozmrożonej, uprzednio zamrożonej fiolki zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Butelka do wytrząsania była inkubowana w 32°C z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 2,7 L pożywki PCOL22-L i wysterylizowanie. Ta pożywka zawiera o jedną czwartą mniej soli, by zapobiec wytrącaniu. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa była uzupełniana 20 g/L glukozy, siarczanem magnezowym, chlorkiem wapniowym i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był szczepiony z hodowli EE410 prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 nm wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Wartość pH wynosząca 6,8 była kontrolowana dodawaniem 5N NH4OH. Roztwór glukozy (60% w/v) bez siarczanu magnezowego był dostarczany do fermentera zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach EFT produkt fermentacji został zebrany.

F. Fermentacja półciągła z pożywką PCOL12-R

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka baffled z 100 ml pożywki) została przygotowana z pożywką ZSM, uzupełnioną 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. 6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 2,7 L pożywki PCOL22-R i wysterylizowanie. Ta pożywka zawiera podwyższony poziom glukozy i ekstraktu drożdży, żeby zwiększyć wzrost szczepu gospodarza przed rozpoczęciem zasilania glukozą. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa była uzupełniana 40 g/L glukozy, siarczanem magnezowym, chlorkiem wapniowym i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był szczepiony z hodowli EE410 prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 nm wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Roztwór glukozy (60% w/v) był dostarczany do fermentora zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach EFT produkt fermentacji został zebrany.

PL 209 009 B1

G. Fermentacja półciągła w 20-litrowym naczyniu

W alternatywnym procesie półciągłym naczynie hodowlane pierwszego etapu (6 l) zostało przygotowane z 3,0 L pożywki ZSM, uzupełnionej 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 3,0 ml materiału z rozmrożonej, uprzednio zamrożonej fiolki zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Napowietrzenie butelki zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 32°C.

20-to litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 10,8 L pożywki PCOL22 i wysterylizowanie. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa była uzupełniana 20 g/L glukozy, siarczanem magnezowym, chlorkiem wapniowym i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był szczepiony z hodowli EE410 prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 nm wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Wartość pH wynosząca 6,8 była kontrolowana dodawaniem 5N wodorotlenku amonu. Roztwór glukozy (60% w/v) był dostarczany do fermentora zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach EFT produkt fermentacji został zebrany.

H. Fermentacja półciągła z dwuetapowym posiewem

Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z pożywką ZSM, uzupełnioną 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 300 μl materiału z rozmrożonej, uprzednio zamrożonej fiolki zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Butelka do wytrząsania była inkubowana w 32°C z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

Butelka hodowlana drugiego etapu (6 l) została przygotowana z 3,0 l pożywki ZSM, uzupełnionej 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 100 ml materiału z butelki hodowlanej pierwszego etapu zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Napowietrzenie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 32°C.

20-to litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 10,8 L pożywki PCOL22 i wysterylizowanie. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa była uzupełniana 20 g/L glukozy, siarczanem magnezowym, chlorkiem wapniowym i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzanie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był szczepiony z naczynia hodowlanego drugiego etapu, w którym wzrost trwał 12 godzin do osiągnięcia OD600 wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Wartość pH wynosząca 6,8 była kontrolowana dodawaniem 5N NH4OH. Roztwór glukozy (60% w/v) był dostarczany do fermentora zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach EFT produkt fermentacji został zebrany.

I. Fermentacja półciągła z ZGOLD1

Konstruowanie wektora ekspresyjnego zGOLD1 jest opisane w przykładzie 19. Butelka hodowlana pierwszego etapu (500 ml butelka z przegrodami z 100 ml pożywki) została przygotowana z pożywką ZSM, uzupełnioną 20 g/L glukozy i 25 μg/ml kanamycyny. Wzrost został zapoczątkowany zaszczepieniem butelki 300 μl materiału z rozmrożonej, uprzednio zamrożonej fiolki zawierającej szczep wytwarzający EE410 (W3110 E. coli zawierający wektor ekspresyjny pTAP337). Butelka do wytrząsania była inkubowana w 32°C z wytrząsaniem ustawionym na 250 rpm.

6-cio litrowe naczynie fermentacyjne zostało przygotowane przez dodanie 2,7 L pożywki PCOL22 i wysterylizowanie. Po ochłodzeniu pożywka wzrostowa była uzupełniana 20 g/L glukozy, siarczanem magnezowym, chlorkiem wapniowym i 25 μg/ml kanamycyny. pH pożywki zostało doprowadzone do 6,8 5N wodorotlenkiem amonu. Napowietrzanie naczynia zostało ustawione na 1 vvm, wytrząsanie na 350 rpm i temperatura na 37°C. Fermentor był szczepiony z hodowli EE410 prowadzonej w butelce hodowlanej pierwszego etapu, rosnącej 16 godzin do OD600 wynoszącej 16. Szczepionka była 5% v/v, a rozpuszczony tlen był utrzymywany powyżej 20% nasycenia przez wzrastającą prędkość wytrząsania. Wartość pH wynosząca 6,8 była kontrolowana dodawaniem 5N wodorotlenku

PL 209 009 B1 amonu. Roztwór glukozy (60% w/v) był dostarczany do fermentora zaczynając od 8 godziny EFT. Stała prędkość zasilania 9,5 g glukozy/L objętości początkowej na godzinę, była utrzymywana w czasie trwania fermentacji. W 24 godzinie EFT do hodowli został dodany IPTG do stężenia 0,5 mM. Po 48 godzinach EFT produkt fermentacji został zebrany.

T a b e l a 5

Pożywka do wytwarzania PCOL22

Składnik	Ilość g/L lub ml/L
(NH4)2SO4	14,0
KH2PO4	2,0
K2HPO4	16,5
Przeciwpienne AF208	0,1 mL
Woda dejonizowana	0,920 L
Po autoklawowaniu dodać:
1M MgSO4	10 mL
Roztwór związków śladowych „D”	34,0 mL
Kanamycyna (25 mg/mL stężenie podstawowe)	1 mL
1M CaCl2 - 2H2O	2 mL
Glukoza (60% w/v)	33,0 ml

T a b e l a 6 Pożywka PCOL22-L

Składnik	Ilość g/L lub ml/L
(NH4)2SO4	9,25
KH2PO4	1,32
K2HPO4	10,90
Kwas cytrynowy	1,0 g
Przeciwpienne AF204	0,1 mL
Woda dejonizowana	0,920 L
Po autoklawowaniu dodać:
1M MgSO4	10 mL
Roztwór związków śladowych „D”	34,0 mL
Kanamycyna (25 mg/mL stężenie podstawowe)	1 mL
1M CaCl2 - 2H2O	2 mL
Glukoza (60% w/v)	33,0 ml

T a b e l a 7

60% glukoza w procesie półciągłym do stosowania w pożywce PCOL22-L i PCOL12-L

Składnik	Ilość g/L
H2O	800 ml
Glukoza (60% w/v)	1200 g
Dopełnić objętość H2O do:	2,0 L
Autoklawować

PL 209 009 B1

T a b e l a 8 Pożywka PCOL12-R

Składnik	Ilość g/L lub ml/L
(NH4)2SO4	14,0
KH2PO4	2,0
K2HPO4	16,5
Wyciąg drożdży	20,0
Przeciwpienne AF204	0,1 mL
Woda dejonizowana	0,920 L
Po autoklawowaniu dodać:
1M MgSO4	10 mL
Roztwór związków śladowych „D”*	34,0 mL
Kanamycyna (25 mg/mL stężenie podstawowe)	1 mL
1M CaCl2 - 2H2O	2 mL
Glukoza (60% w/v)	66,0 ml

T a b e l a 9 Pożywka POL12-L

Składnik	Ilość g/L lub ml/L
(NH4)2SO4	10,5
KH2PO4	1,50
K2HPO4	12,4
Wyciąg drożdży	5,0
Przeciwpienne AF204	0,1 mL
Woda dejonizowana	0,920 L
Po autoklawowaniu dodać:
1M MgSO4	10 mL
Roztwór związków śladowych „D”*	34,0 mL
Kanamycyna (25 mg/mL stężenie podstawowe)	1 mL
1M CaCl2 - 2H2O	2 mL
Glukoza (60% w/v)	33,0 ml

P r z y k ł a d 9. Odzyskiwanie IL-21

A. Rozerwanie zebranych komórek

Osad zebranej E. coli został wytworzony podczas półciągłej fermentacji i zawierał w przybliżeniu 5-6 g/L IL-21met w postaci ciałek wtrętowych. Bulion fermentacyjny (1L) został odwirowany przy 8000 x g przez 30 minut. Osad został powtórnie zawieszony w 850 ml buforu rozdrabniającego (100 mM Tris, pH 7,2, 5 mM ZnCl2) i schłodzony w lodzie. Bulion został trzykrotnie przepuszczony przez homogenizator APV przy 10000 psi. Następnie bulion został odwirowany przy 8000 x g przez 30 minut. Supernatant został odrzucony, przy zachowaniu ostrożności, by zachować luźny osad. Osad został przemyty dwukrotnie przez powtórne zawieszanie w 800 ml wody DI i odwirowanie przy 8000 x g przez 40 minut. Supernatant został odrzucony, przy zachowaniu ostrożności by zachować luźny osad. Osad ciałek wtrętowych był przechowywany w - 80°C lub powtórnie zwinięty bez zamrażania.

PL 209 009 B1

B. Bezpośrednie rozerwanie zebranego bulionu

Zebrany bulion z E. coli został wytworzony fermentacją półciągłą i zawierał w przybliżeniu 6-7 g/L IL-21met w postaci ciałek wtrętowych. Bulion fermentacyjny (0,5 L) został rozcieńczony do 1,0 L wodą dejonizowaną i został trzykrotnie przepuszczony przez homogenizator APV przy 10000 psi. Następnie, bulion był odwirowany przy 15000 x g przez 30 minut. Supernatant został odrzucony, przy zachowaniu ostrożności, by zachować luźny osad. Osad został powtórnie zawieszony w 500 ml wody DI i odwirowany przy 15000 x g przez 30 minut. Supernatant został odrzucony, przy zachowaniu ostrożności, by zachować luźny osad. Etap przemywania został powtórzony i osad ciałek wtrętowych był przechowywany w - 80°C lub powtórnie zwinięty bez zamrażania.

C. Rozpuszczanie i wytrącanie

1. Rozpuszczanie osiągnięto przez zawieszenie przemytego osadu ciałek wtrętowych w 200 mL 100 mM Tris, 6M chlorowodorku guanidyny 5 mM ZnCb, pH 7,2 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie zawiesina była odwirowywana przy 12000 g przez 30 minut. Supernatant był przechowywany w 4°C. Supernatant został rozcieńczony 1:8 (v/v) w 100 mM Tris, 5 mM ZnCl2 pH 7,2. Zawiesina była odwirowywana przy 12000 g przez 10 minut. Supernatant został odrzucony. Osad został powtórnie zawieszony w 200 mL 100 mM Tris, 8M mocznika, pH 7,2. Zawiesina była odwirowywana przy 12000 g przez 30 minut. Supernatant został odrzucony. Procedura przemywania była powtórzona jeszcze dwa razy. Powtórne rozpuszczanie było osiągnięte przez zawieszenie przemytego osadu w 200 mL 100 mM Tris, 6M chlorowodorku guanidyny 10 mM DTT, pH 7,2. Zawiesina była odwirowywana przy 12000 g przez 30 minut. Stężenie białka w supernatancie mierzone testem HPLC wynosiło 10 mg/mL. Następnie próbka IL-21 była przechowywana w 4°C.

2. Rozpuszczalność IL-21 została osiągnięta przez zawieszenie przemytego osadu ciałek wtrętowych w 6M chlorowodorku guanidyny, 40 mM ditiotreitolu (DTT) przygotowanego w 100 mM Tris, pH 8,0 (GDT40). W przybliżeniu na litr oryginalnego bulionu fermentacyjnego stosowano 150 ml GDT40. Rozpuszczanie zostało przeprowadzone w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie, zawiesina była odwirowana. Supernatant z rozpuszczonych ciałek wtrętowych został powtórnie zwinięty przez rozcieńczenie (20-30 x) w buforze zwijającym zawierającym 0,75M argininy plus parę utleniająco-redukującą DTT/cystynę. Powtórne zwijanie zachodziło przez 5-16 godzin po doprowadzeniu pH mieszaniny do 5,5 i przefiltrowaniu przed dostarczeniem do oczyszczania.

D. Bezpośrednie rozerwanie zebranego bulionu z ZGOLD1

Zebrany bulion ZGOLD1 E. coli został wytworzony w drodze fermentacji półciągłej w pożywce PCOL22 (opisanej powyżej) i zawierał w przybliżeniu 9-10 g/L IL-21met w postaci ciałek wtrętowych. Bulion fermentacyjny (0,5 L) został rozcieńczony do 1,0 L wodą dejonizowaną i przepuszczony trzy razy przez hornogenizator APV przy 10000 psi. Następnie bulion był odwirowywany przy 15000 x g przez 30 minut. Supernatant został odrzucony, przy zachowaniu ostrożności, by zachować luźny osad. Osad został powtórnie zawieszony w 500 ml wody DI i odwirowywany przy 15000 x g przez 30 minut. Supernatant został odrzucony, przy zachowaniu ostrożności, by zachować luźny osad. Osad został powtórnie zawieszony w 500 ml wody DI i odwirowywany przy 15000 x g przez 30 minut. Supernatant został odrzucony, przy zachowaniu ostrożności, by zachować luźny osad. Osad ciałek wtrętowych był przechowywany w - 80°C lub powtórnie zwinięty bez zamrażania.

P r z y k ł a d 10

A. Rozpuszczanie przemytych ciałek wtrętowych

Rozpuszczanie zostało osiągnięte przez zawieszenie osadu przemytych ciałek wtrętowych w 150 mL 100 mM Tris, 6M chlorowodorku guanidyny, 20 mM ditiotreitolu, pH 7,5 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie, zawiesina była odwirowywana przy 12000 g przez 30 minut. Stężenie białka w supernatancie mierzone testem HPLC wynosiło 21 mg/mL. Następnie, próbka IL-21 była przechowywana w 4°C.

B. Rozpuszczanie przemytych ciałek wtrętowych z ZGOLD1

Rozpuszczanie zostało zawieszenie osadu przemytych litra bulionu fermentacyjnego osiągnięte przez ciałek wtrętowych z 1 w 150 mL 100 mM Tris, 6M chlorowodorku guanidyny, 40 mM ditiotreitolu, pH 8,0 w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Zawiesina była odwirowywana przy 15000 x g przez 30 minut. Stężenie białka w supernatancie mierzone testem HPLC wynosiło 29 mg/mL. Następnie, próbka IL-21 była przechowywana w 4°C.

PL 209 009 B1

C. Klarowanie rozpuszczonych ciałek wtrętowych

Do klarowania rozpuszczonych osadów ciałek wtrętowych IL-21 stosowana była żywica chromatografii metalopowinowactwa (IMAC). W pewnym przykładzie osad przemytych ciałek wtrętowych był rozpuszczany przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 6M chlorowodorku guanidyny zawierającym 10 mM imidazol, pH 7,5. 1,0 ml kolumny (His-trap) (Amersham Biosciences) były pakowane 0,5 ml 0,1 M NiSO4. Po pakowaniu i przemyciu wodą, do zrównoważenia kolumny zostało zastosowane 5,0 ml buforu wiążącego składającego się z 6M GuHCl, 20 mM imidazolu, 0,5M NaCl i 20 mM fosforanu. Próbka rozpuszczonej substancji (1,0 ml) została nałożona na kolumnę i kolumna została przemyta 5,0 ml buforu wiążącego. IL-21 była eluowana przez nałożenie na kolumnę 2,5 ml buforu do elucji (6M GuHCl, 0,5M imidazolu, 0,5M NaCl i 20 mM fosforanu). Etap elucji został powtórzony i próbki pod względem czystości i klarowności zostały przeanalizowane na żelach SDS-Page.

P r z y k ł a d 11. Powtórne zwijanie

A. Renaturacja z GSH i GSSG

Oznaczono, przy użyciu HPLC z odwróconą fazą, że stężenie IL-21 we frakcji rozpuszczalnej wynosi 21 mg/ml. Określenia objętości buforu zwijającego dokonano w oparciu o ilość substancji rozpuszczonej i stężenie IL-21 obecnej w substancji rozpuszczonej. Bufor zwijający (50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05% (w/v) PEG3350, 1,1M L-argininy, 2 mM GSH, mM GSSG, pH 7,5) został schłodzony do temperatury pokojowej (21°C). GSH i GSSG zostały rozpuszczone bezpośrednio przed użyciem. Substancja rozpuszczona zawierająca IL-21 (175 ml) była dodawana do buforu zwijającego (11L) powoli (1,5 godziny), mieszając. IL-21 dodawana była do mieszaniny powtórnie zwijającej do końcowego stężenia 0,30 mg/ml. Zakres temperatur wynosił pomiędzy 20-22°C. Naczynie zawierające mieszaninę powtórnie zwijającą pozostawiono odkryte na działanie atmosfery. Powtórne zwijanie trwało 16 godzin. Stężenie powtórnie zwiniętej IL-21 zostało określone jako 0,165 mg/ml, co stanowi 55% wydajności renaturacji.

B. Renaturacja z DTT i GSSG

Stężenie IL21 we frakcji rozpuszczalnej zostało określone podczas HPLC z odwróconą fazą jako 15,02 mg/ml. Określenia objętości buforu zwijającego dokonano w oparciu o ilość substancji rozpuszczonej i stężenie IL-21 obecnej w substancji rozpuszczonej. Bufor zwijający (50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05% (w/v) PEG3350, 1,1M L-argininy, 2 mM DTT, 4 mM GSSG, pH 7,5) został schłodzony do temperatury pokojowej (21°C). DTT i GSSG zostały rozpuszczone bezpośrednio przed użyciem. Substancja rozpuszczona zawierająca IL-21 (88 ml) była dodawana powoli (1 godzinę) mieszając do buforu zwijającego (1,0 L). IL-21 dodawana była do mieszaniny powtórnie zwijającej do stężenia końcowego 0,50 mg/ml. Zakres temperatur wynosił pomiędzy 20-22°C. Naczynie zawierające mieszaninę powtórnie zwijającą pozostawiono odkryte na działanie atmosfery. Powtórne zwijanie przeprowadzano 16 godzin. Stężenie powtórnie zwiniętej IL-21 zostało określone jako 0,27 mg/ml, co stanowi 59,5% wydajności renaturacji.

C. Renaturacja cysteiną i dichlorowodorkiem cystyny

Stężenie IL21 we frakcji rozpuszczalnej zostało określone podczas HPLC z odwróconą fazą jako 18,6 mg/ml. Określenia objętości buforu zwijającego dokonano w oparciu o ilość substancji rozpuszczonej i stężenie IL-21 obecnej w substancji rozpuszczonej. Bufor zwijający (50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05% (w/v) PEG3350, 1,0M L-argininy, 4 mM cysteiny, mM cystyny HCL, pH 7,5) został schłodzony do temperatury pokojowej (21°C). Cysteina i dichlorowodorek cystyny zostały rozpuszczone bezpośrednio przed użyciem. Substancja rozpuszczona zawierająca IL-21 (20,5 ml) była dodawana powoli (0,5 godziny), mieszając do buforu zwijającego (0,78 L). IL-21 dodawana była do mieszaniny powtórnie zwijającej do końcowego stężenia 0,49 mg/ml. Zakres temperatur wynosił pomiędzy 20-22°C. Naczynie zawierające mieszaninę powtórnie zwijającą pozostawiono odkryte na działanie atmosfery. Powtórne zwijanie trwało 21 godzin. Stężenie powtórnie zwiniętej IL-21 zostało określone jako 0,29 mg/ml, co stanowi 58% wydajności renaturacji.

D. Renaturacja DTT i dichlorowodorkiem cystyny

Stężenie IL21 we frakcji rozpuszczalnej zostało określone podczas HPLC z odwróconą fazą jako 18,6 mg/ml. Określenia objętości buforu zwijającego dokonano w oparciu o ilość substancji rozpuszczonej i stężenie IL-21 obecnej w substancji rozpuszczonej. Bufor zwijający (50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05% (w/v) PEG3350, 1,1M L-argininy, 2 mM DTT, 4 mM dichlorowodorku cystyny, pH 7,5) został schłodzony do temperatury pokojowej (21°C). DTT i GSSG zostały rozpuszczone bezpośrednio przed użyciem. Substancja rozpuszczona zawierająca IL30

PL 209 009 B1

-21 (20,5 ml) była dodawana powoli (0,5 godziny) mieszając do buforu zwijającego (0,78 L). IL-21 była dodawana do mieszaniny powtórnie zwijającej do końcowego stężenia 0,49 mg/ml. Zakres temperatur wynosił pomiędzy 20-22°C. Naczynie zawierające mieszaninę powtórnie zwijającą pozostawiono odkryte na działanie atmosfery. Powtórne zwijanie trwało 16 godzin. Stężenie powtórnie zwiniętej IL-21 zostało określone jako 0,28 mg/ml, co stanowi 58% wydajności renaturacji.

E. Powtórne zwijanie czasowo-impulsowe (ang. time-pulse)

Powtórne zwijanie czasowo-impulsowe dostarcza sposób na powtórne zwijanie ludzkiej IL-21met do końcowego stężenia 0,3-0,9 mg/mL. W partii powtórnie zwijanej końcowe stężenie białka IL-21 w buforze zwijającym zostało zoptymalizowane pomiędzy 0,2-0,3 mg/ml. Wymagane było wysokie stężenie argininy (1M) i wydajność etapu powtórnego zwijania wynosiła 40% do 50%. Podczas gdy według konwencjonalnych kryteriów powtórnego zwijania białka wynik ten jest zadawalający, byłoby wysoce pożądane powtórne zwinięcie IL-21met w nawet wyższym stężeniu. Przygotowanie rozpuszczonych ciałek wtrętowych zostało opisane w przykładzie 4, za wyjątkiem końcowego stężenia białka wynoszącego 15 mg/ml. Jak opisano, rozcieńczenie 1:50 substancji rozpuszczonej zostało osiągnięte przy zastosowaniu buforu zwijającego. Następnie, roztwór był mieszany przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Próbka została pobrana na końcu 3 godzinnego okresu i odwirowana. Supernatant został poddany analizie HPLC. Następnie proces został powtórzony jeszcze cztery razy. Wydajność procentowa prawidłowo powtórnie zwiniętej IL-21met pozostawała stała podczas trzech pierwszych powtórzeń, ale spadła po czwartym powtórzeniu. Najwyższe końcowe stężenie białka osiągnięte bez zmniejszania wydajności wynosiło 0,9 mg/ml. Wysokie stężenie białka (> 0,3 mg/ml) podczas wczesnej fazy zwijania (< 3 godzin) dało w wyniku niższą wydajność, co było spowodowane agregacją. Gdy tylko powtórne zwijanie zostało zakończone (> 3 godzin), można było rozpocząć dodawanie podstawowego roztworu powtórnie zwijającego, bez utraty wydajności. Maksymalne stężenie chlorowodorku guanidyny w końcowym buforze zwijającym wynosiło 0,3 do 0,6M.

F. Powtórne zwijanie z DTT i cystyną w zmniejszonych stężeniach argininy IL-21

Stężenie IL-2 1 we frakcji rozpuszczalnej zostało określone podczas HPLC z odwróconą fazą jako 14,53 mg/ml. Bufor zwijający (50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05% (w/v) PEG3350, 0,75M L-argininy, 2 mM DTT, 4 mM cystyny, pH 8,0) został schłodzony do temperatury pokojowej 21°C. Cystyna została rozpuszczona w 0,25M NaOH do stężenia 80 mM dodawana równocześnie z DTT bezpośrednio przed użyciem. Substancja rozpuszczona zawierająca IL--21 (96 ml) była dodawana powoli (1,0 godzinę) mieszając do buforu powtórnie zwijającego (1,0 L). IL--21 była dodawana do powtórnie zwijającej mieszaniny do końcowego stężenia 0,61 mg/ml. Zakres temperatury wynosił pomiędzy 14-16°C. Naczynie zawierające powtórnie zwiniętą mieszaninę pozostawiono odkryte na działanie atmosfery. Powtórne zwijanie trwało przez 16 godzin. Stężenie powtórnie zwiniętej IL-21 zostało określone jako 0,40 mg/ml, co stanowi 66% wydajności renaturacji.

G. Objętościowe powtórne zwijanie z DTT i cystyną

Objętościowe powtórne zwijanie jest oparte na objętości substancji rozpuszczonej IL-21, a nie na stężeniu IL-21 w substancji rozpuszczonej. Stężenie IL-21 we frakcji rozpuszczalnej zostało określone podczas HPLC z odwróconą fazą jako 26,1 mg/ml. Bufor zwijający (50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05% (w/v) PEG3350, 0,75 M L-argininy, 2 mM DTT, 4 mM cystyny, pH 8,0) został schłodzony do 15°C. Cystyna została rozpuszczona w 0,25M NaOH do stężenia 80 mM i dodawana równocześnie z DTT bezpośrednio przed użyciem. Substancja rozpuszczona zawierająca IL-21 (935 ml) była dodawana powoli (2,0 godziny) mieszając do buforu zwijającego (28,0 L). IL-21 była dodawana do powtórnie zwijającej mieszaniny do końcowego stężenia 0,83 mg/ml. Zakres temperatury wynosił pomiędzy 14-16°C. Naczynie zawierające powtórnie zwiniętą mieszaninę pozostawiono odkryte na działanie atmosfery. Powtórne zwijanie trwało 16 godzin. Stężenie powtórnie zwiniętej IL-21 zostało określone jako 0,51 mg/ml, co stanowi 61% wydajności renaturacji.

H. Wolumetryczne powtórne zwijanie WIB's ze ZGOLD1

Stężenie IL-21 we frakcji rozpuszczalnej zostało określone przy pomocy HPLC z fazą odwróconą jako 29,9 mg/ml. Bufor powtórnie zwijający (50 mM Tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, mM CaCl2, 0,05% (w/v) PEG3350, 0,75M L-argimny, 2 mM DTT, 4 mM cystyny, pH 8,0) został schłodzony do 15°C. Cystyna została rozpuszczona w 0,25M NaOH do stężenia 80 mM i dodawana równocześnie z DTT bezpośrednio przed użyciem. Substancja rozpuszczona zawierająca IL-21 (935 ml) była dodawana powoli (2,0 godziny) mieszając do buforu zwijającego (27,3 L). IL-21 była dodawana do powtórnie zwijającej mieszaniny do końcowego stężenia 0,96 mg/ml. Zakres temperatury wynosił

PL 209 009 B1 pomiędzy 14-16°C. Naczynie zawierające powtórnie zwiniętą mieszaninę pozostawiono odkryte na działanie atmosfery. Powtórne zwijanie trwało 16 godzin. Stężenie powtórnie zwiniętej IL-21 zostało określone jako 0,60 mg/ml, co stanowi 62,3% wydajności renaturacji.

P r z y k ł a d 12

A. Klarowanie powtórnie zwiniętej IL-21

Ten etap ma zatrzymać reakcję powtórnego zwijania i usunąć cząsteczki stałe z powtórnie zwiniętego roztworu IL-21. Powtórnie zwinięta IL-21 jest zazwyczaj doprowadzana do pH 5,5, a następnie przepuszczana przez filtr z nominalną wartością odcięcia 1,2 μτη. W pewnych przypadkach nie doprowadza się pH przed filtracją, a w innych przypadkach mógłby być zastosowany filtr innego rozmiaru (0,45-2,0 μ^ι) lub innego typu. Jest możliwe usunięcie cząsteczek stałych przez odwirowanie przy użyciu wirówki pracy ciągłej Carr powerfuge (Carr Separations, Inc., Franklin, MA) lub przez odwirowanie w butelkach. Po powtórnym zwijaniu istnieje potrzeba zredukowania przewodności roztworu buforu w celu nałożenia na żywicę wychwytującą SP550C. Istnieje również potrzeba przefiltrowania mętnego roztworu w celu usunięcia nie zwiniętej IL-21 i wytrąconych białek E. coli. W jednym przykładzie 29,5 L buforu zwijającego zawierającego powtórnie zwiniętą IL-21 było rozcieńczone 1,4 częściami (42,0 L) 25 mM buforu octowego pH 5,5. Roztwór został pozostawiony do wytrącania w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie roztwór został przefi1trowany przez filtr głęboki 1,2-0,8 μτη Cuno Zeta Plus.

B. Rozcieńczanie i klarowanie powtórnie zwiniętej IL-21

Ten etap ma zatrzymać reakcję powtórnego zwijania, rozcieńczyć powtórnie zwinięty materiał, by umożliwić wiązanie w trakcie chromatografii kationowymiennej i usunąć cząsteczki stałe z roztworu powtórnie zwiniętej IL-21. Powtórnie zwinięta IL-21 jest zazwyczaj doprowadzana do pH 5,5, a następnie rozcieńczana 1,4 krotnie 25 mM octanu sodu, pH 5,5. Roztwór ten jest pozostawiany do osadzania się na w przybliżeniu cztery godziny w temperaturze pokojowej z zamiarem poprawienia fizycznego rozdziału rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek obecnych w rozcieńczonym powtórnie zwiniętym roztworze. Osadzony i rozcieńczony, powtórnie zwijający roztwór pozbawiony większości cząsteczek stałych jest następnie zazwyczaj przepuszczany przez filtr wgłębny 1,2 0,8 μτη (Cuno Zeta Plus A30M03).

P r z y k ł a d 13. Zagęszczanie wyklarowanej powtórnie zwiniętej IL-21

Wyklarowana powtórnie zwinięta IL-21 jest zagęszczana 10-ciokrotnie do 30-tokrotnie przez filtrację z przepływem stycznym. Urządzenie i membrany filtracji z przepływem stycznym (płytka Millipore Pellicon Biomax o wartości odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącej 5 kDa (Millipore, Bedford, MA) i system szkieletowy lub system odcinających włókien kapilarnych Amersham Biosciences o wartości odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącej 10 kDa) są odkażane przez użycie 0,5M NaOH i przemywane wodą. Dla powtórnie zwiniętej IL-21 z 1 L bulionu fermentacyjnego używa się 0,2 m² do 0,3 m² obszaru membrany z prędkością krzyżowego przepływu wynoszącą w przybliżeniu 48 L/godz i ciśnieniem transbłonowym od 20 psi do 30 psi.

P r z y k ł a d 14. Wychwyt powtórnie zwiniętej IL-21

A. Wymiana kationowa z zastosowaniem żywicy TOYOPEARL SP 550

W następstwie zagęszczenia, IL-21 zostaje wychwycona na kolumnie kationowymiennej. W jednym przykładzie zagęszczona IL-21 jest rozcieńczona 3-krotnie wodą lub 25 mM octanem sodu pH 5,5. Zostaje uformowany osad, który zostaje usunięty filtracją po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej. Stosowane są filtr Millipore 1,2 μm Polysep II (Millipore) lub membrana 1,2-0,8 μm Cuno Zeta Plus A30M03 (Cuno, Meriden, CN). Na kolumnę z żywicą TOYOPEARL SP 550C (Tosoh Biosep) zrównoważoną buforem równoważącym (25 mM octanu sodu, 0,2 M NaCl, pH 5,5) jest nakładana przefiltrowana IL-21. Kolumna jest nakładana z wydajnością 6-10 g IL-21 na L żywicy, wysokość złoża wynosi 15 cm, monitorowana jest absorbancja UV przy 280 nm i 215 nm, a stosowana prędkość przepływu wynosi 150 cm/godz. Po nałożeniu kolumna jest przemywana buforem równoważącym, dopóki absorbancja UV nie osiągnie linii zerowej. Następnie, kolumna jest przemywana 4 objętościami kolumny 50% buforu równoważącego, 50% buforu elucji (25 mM octanu sodu, 1,0M NaCl, pH 5,5). IL-21 jest eluowana z kolumny 25% buforu równoważącego, 75% buforu elucji. Alternatywnie, po nałożeniu IL-21 na kolumnę i przemyciu buforem równoważącym, IL-21 jest eluowana z kolumny 10 objętościami kolumny o liniowym gradiencie od 100% buforu równoważącego do 100% buforu elucji. Alternatywnie, po doprowadzeniu pH, rozcieńczeniu, etapie wstrzymania, filtracji z zastosowaniem filtracji wgłębnej, IL-21 zostaje wychwycona przy zastosowaniu chromatografii kationowymiennej.

PL 209 009 B1

Na kolumnę z żywicą TOYOPEARL SP 550C (Tosoh Biosep) zrównoważoną buforem równoważącym (25 mM octanu sodu, pH 5,5, 0,4 M NaCl) jest nałożony przefiltrowany roztwór. Kolumna jest nakładana z wydajnością 6 do 15 g IL-21 na L żywicy. Monitorowana jest absorbancja UV przy 280 nm i 215 nm, a stosowana prędkość przepływu wynosi 150 cm/godz. Po nałożeniu kolumna jest przemywana buforem równoważącym, dopóki absorbancja UV nie osiągnie ponownie linii zerowej. IL-21 jest eluowana z kolumny przy zastosowaniu stopniowego gradientu do 100% buforu elucji (25 mM octanu sodu, pH 5,5, 0,75M NaCl).

B. Chromatografia kationowymienna z zastosowaniem żywicy SP Sepharose XL

Zagęszczona IL-21 zostaje rozcieńczona 10-krotnie 25 mM octanem sodu pH 5,5. Zostaje uformowany osad, który zostaje usunięty filtracją po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej. Po filtrze Millipore 1,2 μσι Polypro XL (Millpore) następuje filtr 0,45 μm Whatman Polycap 75 AS (Maidstone, Kent, UK). Na kolumnę z żywicą SP Sepharose XL Amersham Biosciences zrównoważoną buforem równoważącym (25 mM octanu sodu, 0,2 M NaCl, pH 5,5) jest nakładana przefiltrowana IL-21. Kolumna jest nakładana z wydajnością 3-6 g IL-21 na L żywicy, wysokość złoża wynosi 15 cm, monitorowana jest absorbancja UV przy 280 nm i 215 nm, a stosowana prędkość przepływu wynosi 150 cm/godz. Po nałożeniu kolumna jest przemywana buforem równoważącym, dopóki absorbancja UV nie wróci do linii zerowej. Następnie, kolumna jest przemywana 4 objętościami kolumny 25% buforu równoważącego, 75% buforu elucji (25 mM octanu sodu, 1,0M NaCl, pH 5,5). IL-21 jest eluowana z kolumny 50% buforu równoważącego, 50% buforu elucji.

C. Chromatografia kationowymienna żywicy Streamline SP XL z zastosowaniem żywicy Streamline SP XL

W innym przykładzie IL-21 nie jest zagęszczana filtracją z przepływem stycznym przed wychwyceniem przy zastosowaniu chromatografii kationowymiennej. Po powtórnym zwinięciu pH zostaje doprowadzone do 5,5 i materiał zostaje przefiltrowany przez filtr z nominalną wartością odcięcia 1,2 μσι. Kolumna Amersham Biosciences Streamline wypełniona Amersham Biosciences Streamline SP XL zostaje zrównoważona buforem równoważącym (25 mM octanu sodu, 0,2 M NaCl, pH 5,5). Po zrównoważeniu, przefiltrowana, z doprowadzonym pH, powtórnie zwinięta IL-21 jest nakładana na kolumnę z zastosowaniem rozcieńczania in-line, tzn. 30% przefiltrowanej, powtórnie zwiniętej, doprowadzonej do p IL-21 i 70% wody jest nakładane przy użyciu systemu chromatograficznego do wytwarzania prawidłowych proporcji. IL-21 jest nakładana na kolumnę z dołu do góry przy stosowaniu prędkości przepływu, która powoduje dwukrotne rozszerzenie żywicy w porównaniu do stałej wysokości złoża. Jak tylko powtórnie zwinięta, przefiltrowana IL-21 z doprowadzonym pH zostanie nałożona, zostaje zastąpiona buforem równoważącym. Następnie, kontynuowane jest pompowanie roztworu zawierającego 30% buforu równoważącego i 70% wody, aż rejestrowana przy wlocie kolumny przewodność wyniesie < 10 mS/cm. Kolejno kolumna zostaje przemywana buforem równoważącym w kierunku z dołu do góry z dwukrotnym rozszerzeniem wysokości osiadłego złoża, aż absorbancja UV nie powróci do linii zerowej. Następnie, przepływ zostaje zatrzymany, by umożliwić osadzenie się złoża. Tłok kolumny Streamline zostaje obniżony do wysokości osiadłego złoża i kolumna zostaje przemyta buforem równoważącym w kierunku z góry na dół 2 objętościami kolumny z prędkością przepływu 150 cm/godz. IL-21 zostaje następnie eluowana w kierunku z góry na dół z prędkością przepływu 150 cm/godz 50% buforu elucji (25 mM octanu sodu, 1,0 M NaCl, pH 5,5) i 50% buforu równoważącego.

P r z y k ł a d 15. Pośrednie oczyszczanie IL-21 chromatografią oddziaływań hydrofobowych

A. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) z zastosowaniem żywicy butyl Sepharose

IL-21 jest doprowadzana do 1M stężenia siarczanu amonu dodaniem 198 gm stałego siarczanu amonu na litr roztworu IL-21. Roztwór jest mieszany aż do rozpuszczenia siarczanu amonu, a następnie stały materiał zostaje usunięty filtracją przez filtr o nominalnej wartości odcięcia wynoszącej 0,45 μσι. W pewnym przykładzie kolumna Amersham Biosciences Butyl Sepharose 4FF o wysokości 15 cm zostaje zrównoważona buforem równoważącym (25 mM octanu sodu, 50 mM chlorku sodu, 1,5M siarczanu amonu, pH 5,5). Ustalony, przefiltrowany roztwór IL-21 jest nakładany na kolumnę z wydajnością 1,0-2,5 g IL-21 na L żywicy przy prędkości przepływu 150 cm/godz. Monitorowana jest absorbancja UV przy 280 nm i 215 nm. Po nałożeniu kolumna jest przemywana buforem równoważącym, dopóki absorbancja UV nie wróci do linii zerowej. IL-21 jest eluowana z kolumny 50% buforu równoważącego, 50% buforu elucji (25 mM octanu sodu, 50 mM chlorku sodu, pH 5,5). Alternatywnie, po nałożeniu IL-21 na kolumnę i przemyciu buforem równoważącym IL-21 jest eluowana z kolumny 10 objętościami kolumny o linearnym gradiencie od 100% buforu równoważącego do 100% buforu elucji.

PL 209 009 B1

B. HIC z zastosowaniem żywicy TOYOPEARL 650M

W innym przykładzie do oczyszczania IL-21 stosowana jest inna żywica Tosoh Biosep TOYOPEARL butyl 650M. Sposób jest taki sam, jak stosowany dla żywicy butyl Sepharose FE z następującymi wyjątkami: eluat wymiany kationowej jest doprowadzany do 1,5 M (NH4)2SO4 przy użyciu roztworu podstawowego 3,5M (NH4)2SO4; doprowadzony, przefiltrowany roztwór IL-21 jest nakładany na kolumnę z wydajnością 10-12 g IL-21 na L żywicy; po nałożeniu kolumna jest przemywana buforem równoważącym, dopóki absorbancja UV nie wróci do linii zerowej. IL-21 jest eluowana z kolumny 100% buforem elucji (25 mM octanu sodu, pH 5,5, 0,05 M NaCl, 0,15 M (NH4)2SO4).

P r z y k ł a d 16

A. Zagęszczanie i wymiana buforowa oczyszczonej IL-21 na bufor fosforanowy

Po oczyszczeniu, IL-21 jest poddawana ultrafiltracji i diafiltracji w celu zagęszczenia i wymiany buforu na bufor odpowiedni do przechowywania. Urządzenie i membrany filtracji z przepływem stycznym (płytka Millipore Pellicon Biomax o wartości odcięcia masy cząsteczkowej 5 kDa i system szkieletowy) są odkażane przy użyciu 0,5 M NaOH i przemywane wodą. Dla oczyszczonej IL-21 z 1 L bulionu fermentacyjnego używa się 0,1 m² lub mniej obszaru membrany z prędkością krzyżowego przepływu wynoszącą w przybliżeniu 20-25 L/godz i ciśnienia transbłonowego od 10 psi do 15 psi. IL-21 jest zagęszczana do w przybliżeniu 15-20 mg/ml, a następnie diafilterowana wobec w przybliżeniu 5-10 diavolumes buforu fosforowego pH 6,0. Zagęszczona, z wymienionym buforem IL-21 jest przechowywana w 80°C.

B. Zagęszczanie i wymiana buforu oczyszczonej IL-21

Po oczyszczeniu na SP HP Sepharose IL-21 jest poddana ultrafiltracji i diafiltracji w celu zagęszczenia oczyszczonej IL-21 i wymiany na bufor odpowiedni do przechowywania. Urządzenie i membrany filtracji z przepływem stycznym (płytka Millipore Pellicon Biomax o wartości odcięcia masy cząsteczkowej wynoszącą 5 kDa i system szkieletowy) są odkażane przy użyciu 0,5M NaOH i przemywane wodą. Dla oczyszczonej IL-21 z 1 L bulionu fermentacyjnego używa się membrany o powierzchni 0,1 m² lub mniejszej z prędkością krzyżowego przepływu wynoszącą w przybliżeniu 30 L/godzinę i ciśnienia transbłonowego 25. IL-21 jest zagęszczana do w przybliżeniu 10-15 mg/mL, a następnie diafilterowana wobec w przybliżeniu 5-10 diavolumes (ang.) 10 mM histydyny, 4,72% (w/v mannitolu, pH 5,0-5,3. Otrzymany roztwór jest sterylnie filtrowany.

P r z y k ł a d 17. Dodatkowe oczyszczanie IL-21

A. Chromatografia kationowymienna z zastosowaniem żywicy SP HP Sepharose do polerowania

Dla dalszego polepszenia ogólnej czystości wykonywane jest dalsze oczyszczanie z zastosowaniem SP HP Sepharose. Eluat TOYOPEARL butyl 650M jest rozcieńczany wodą do 30 mS/cm, a następnie stosując podstawowy roztwór dwuzasadowego fosforanu sodu, eluat doprowadzany jest do pH 6,0. Doprowadzony roztwór jest następnie filtrowany z zastosowaniem filtru 0,22 μm. Przefiltrowany materiał jest nakładany w ilości 10-15 g IL-21 na L żywicy na kolumnę zrównoważoną 50 mM fosforanem, pH 6,0, 0,3M NaCl. Do monitorowania chromatografii stosuje się UV 280 i UV 215. Po nałożeniu kolumna jest przemywana buforem równoważącym dopóki UV nie osiągnie linii zerowej. IL-21 jest eluowana gradientowo z kolumny 20 objętościami kolumny do osiągnięcia 100% buforu elucji (50 mM fosforanu, pH 6,0, 0,7M NaCl).

B. Chromatografia anionowymienna

W celu usunięcia endotoksyn IL-21 przepuszcza się przez kolumnę anionowymienna. Kolumna Amersham Biosciences Q Sepharose FF została zrównoważona buforem równoważącym (20 mM Tris, pH 8,0). Roztwór IL-21 jest doprowadzony buforem równoważącym do przewodności < 10 mS/cm. Doprowadzony roztwór IL-21 jest nakładany na kolumnę z prędkością przepływu 150 cm/godz. IL-21 nie wiąże się do kolumny i jest zbierana w trakcie przepływu. W innych przykładach do oczyszczenia IL-21 zamiast Q Sepharose FF może być użyta żywica Amersham Biosciences DEAE Sepharose FF lub membrany Pall Mustang Q. W jeszcze innych przykładach zostało wykazane, że wartości pH z zakresu od 5,0 do 9,0 powodują, że IL-21 przechodzi przez środki anionowymienne.

C. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych

W innych przykładach do oczyszczenia IL-21 stosowana była chromatografia oddziaływań hydrofobowych z zastosowaniem innych warunków niż te opisane powyżej z żywicą butylową. W obu sposobach wiązania i przepływu jako żywica mogą być stosowane Amersham Biosciences Phenyl Sepharose FF High Sub, Amersham Biosciences Phenyl Sepharose HP i Amersham Biosciences Butyl Sepharose 4FF. Żeby związać IL-21 kolumny są równoważone 25 mM octanem sodu, 50 mM

PL 209 009 B1 chlorkiem sodu, 1,5 M siarczanem amonu, pH 5,5. IL-21 jest doprowadzana do stężenia 1,5 M siarczanu amonu dodaniem stałego siarczanu amonu i mieszania dopóki się on nie rozpuści. Doprowadzony roztwór IL-21 jest nakładany na zrównoważoną kolumnę z prędkością przepływu 150 cm/godz. Monitorowana jest absorbancja UV przy 280 nm i 215 nm. Po przemywaniu, IL-21 jest eluowana z kolumny 10 objętościami kolumny o liniowym gradiencie od 100% buforu równoważącego do 100% buforu elucji (25 mM octanu sodu, 50 mM NaCl, pH 5,5). W sposobie ze zbieraniem wycieku roztwór zawierający IL-21 jest doprowadzany do 1,0M lub mniej siarczanu amonu i jest nakładany na kolumnę zrównoważoną 25 mM octanem sodu, 50 mM NaCl, 1,0M siarczanem amonu, pH 5,5. Wyciek jest zbierany. W innych przykładach do oczyszczania, IL-21 była stosowana chromatografia oddziaływań hydrofobowych stosująca jako sól raczej siarczan sodu niż siarczan amonu. Jako żywica mogą być stosowane Amersham Biosciences Phenyl Sepharose FF high sub, Amersham Biosciences Phenyl Sepharose HP i Amersham Biosciences Butyl Sepharose 4FF. Kolumny są równoważone 25 mM octanem sodu, 50 mM chlorkiem sodu, 1,5M siarczanem sodu, pH 5,5. IL-21 jest doprowadzana do stężenia 1,5M siarczanu sodu dodaniem stałego siarczanu sodu i mieszaniem dopóki się on nie rozpuści. Doprowadzony roztwór IL-21 jest nakładany na zrównoważoną kolumnę z prędkością przepływu 150 cm/godz. Monitorowana jest absorbancja UV przy 280 nm i 215 nm. Po przemywaniu, IL-21 jest eluowana z kolumny 10 objętościami kolumny o liniowym gradiencie od 100% buforu równoważącego do 100% buforu elucji (25 mM octanu sodu, 50 mM NaCl, pH 5,5). W innym przykładzie, przepływ przez HIC FPLC był przeprowadzany w systemie BIOCAD 700E FPLC (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) wyposażonym w kolumnę Butyl Sepharose 4 FF (Amersham Biosciences). Kolumna była kondycjonowana 25 mM NaOAc, 600 mM NaCl, 1M (NH4)2SO4, pH 5,5. Do eluatu z kolumny kationowymiennej dodano stały (NH4)2SO4 do końcowego stężenia 1M. Roztwór został nałożony na kolumnę i IL-21 była zbierana w wycieku.

D. IMAC z zastosowaniem Sepharose z chelatowanym metalem

Amersham Biosciences Chelating Sepharose (Amersham) jest stosowana do dalszego oczyszczania IL-21. Wychwycony eluat IL-21 CIE jest nakładany na kolumnę naładowaną jonami miedzi, cynku lub niklu a następnie zrównoważoną 25 mM octanem sodu, pH 5,5; 0,8M NaCl. Do monitorowania chromatografii stosowane są UV 280 nm i 215 nm. Następnie, kolumna jest przemywana buforem równoważącym do linii zerowej i eluowana 10 CV gradientem do 100% buforu elucji (25 mM octanu sodu, pH 5,5, 0,8 M NaCl, 0,5M imidizolu).

P r z y k ł a d 18

A. Analiza IL-21 rozpuszczonej w buforze acetonitrylowym przy zastosowaniu HPLC z fazą odwróconą

Sposób opisany tutaj jest stosowany do ilościowego oznaczania IL-21 w próbkach ciałek wtrętowych i próbkach oczyszczonych. W systemie Adilent Technologies 1100 series HPLC jest stosowana kolumna Jupiter C5 4,6 x 50 mm (300 A, 5 μ^ι Phenomenex) z regulowanym termostatowanym autosamplerem i termostawaną komorą kolumny. Przed kolumną jest umieszczony filtr przedkolumnowy 0,2 μm. Fazą ruchomą A jest 0,1% TFA w wodzie, o stopniu jakości do HPLC, a fazą ruchomą B jest 0,1% T FA w acetonitrylu.

Gradient elucji/rozkład w czasie dla oczyszczonych próbek jest jak następuje.

T a b e l a 10

Czas	% B
0	5
3,5	5
4	41
14	48
14,5	95
17	95
17,5	5
20	5

PL 209 009 B1

Gradient elucji /rozkład w czasie dla rozpuszczonych próbek ciałek wtrętowych jest:

T a b e l a 11

Czas	% B
0,0	5
4,0	5
5,5	40
20,0	50
21,0	95
22,0	95
23,0	5
30,0	5

Kolumna jest równoważona do początkowych warunków gradient elucji/rozkład w czasie, aż nie zostanie osiągnięta stabilna linia zerowa.

Parametry sposobu są jak następuje:

1. Prędkość przepływu: 1 ml/min.

2. Całkowity czas przebiegu: 20 minut

3. Temperatura kolumny: 40°C

4. Temperatura autosamp1era: 8°C

5. Maksymalne ciśnienie kolumny: 240 bar

6. Prędkość zasysania iniektora: 100 μL/minutę

7. Prędkość wyrzucania iniektora: 100 μL/minutę

8. Długość fali odbierającego dane diodowego zestawu detekcyjnego: sygnał A: 280 nm, szerokość pasma 25 nm

9. Długość fali monitorującego diodowego zestawu detekcyjnego: sygnał B: 215 nm, szerokość pasma 10 nm

10. Długość fali odniesienia diodowego zestawu detekcyjnego: sygnał A: 350 nm, szerokość pasma 25 nm; sygnał B: 350 nm, szerokość pasma 25 nm

11. Autokalibracja diodowego zestawu detekcyjnego: tryb przed/po

12. Szczytowa szerokość czasu odpowiedzi: > 0,1 min.

13. Szerokość szczeliny: 4 nm

14. Funkcja mycia igły: zaprogramowana dla zredukowania gromadzenia się guanidyny na igle i w gnieździe igły

Dla przeprowadzenia analizy ilościowej nie zwiniętej IL-21, standard IL-21 jest rozcieńczany do 0,5 mg/mL 50 mM Tris, pH 7,5, 6M guanidyną HCl, 10 mM DTT i ogrzewany w 40°C przez 20 minut. Rozcieńczony standard jest wstrzykiwany na co najmniej pięć poziomów kolumny pomiędzy 10 μg i 50 μg (na przykład wstrzyknięcia 10, 20, 30, 40 i 50). Przed wstrzyknięciem 25 μl próbki, rozpuszczone próbki IL-21 są odwirowywane w mikrowirówce i rozcieńczane 1:10 w 50 mM Tris, pH 7,5, 6M guanidyny HCl.

Dla przeprowadzenia analizy ilościowej zwiniętej IL-21, standard IL-21 jest rozcieńczany do 1,0 mg/ml buforem fosforanowym, pH 6,0. Próbki zwiniętej IL-21 są wstrzykiwane na HPLC bez jakiejkolwiek obróbki. W wyniku chromatografii powierzchnia pod pikiem IL-21 jest integrowana. Konstruuje się krzywą standardową i stężenie IL-21 w próbkach jest odczytywane z krzywej standardowej.

B. Zastosowanie RP-HPLC opartej na metanolu do analizy ilościowego oznaczania IL-21

Do oceny preparatów IL-21 w zakresie od rozpuszczonych ciałek wtrętowych do końcowego produktu może być również stosowany piętnastominutowy sposób RP HPLC opartej na metanolu.

Parametry analizy IL-21 sposobem RP HPLC opartej na metanolu są następujące:

PL 209 009 B1

Kolumna: Zorbax 300SB-CN (4,6 x 50 mm), 3,5 mikrona Ruchoma faza A: 0,154% TFA, woda o stopniu jakości do HPLC Ruchoma faza B: 0,154% TFA, metanol

Gradient elucji/rozkład w czasie

T a b e l a 12

Czas	% B	Prędkość przepływu (mL/minutę)
0	50	1,0
1,0	50	1,0
11,0	100	1,0
12,0	100	1,0
12,5	50	1,5
15,0	50	1,5

Całkowity czas wykonania: 15 minut

Temperatura kolumny: 40°C

Temperatura autosamplera: 5°C

Prędkość zasysania iniektora: 90 uL/min.

Prędkość wyrzucania iniektora: 90 uL/min.

Długość fali monitorującego DAD:

Sygnał A: 280, pasmo 8 nm Sygnał B: 215, pasmo 8 nm

Sygnał C: 280, pasmo 6 nm (długość fali odniesienia wył.)

Długość fali odbierającego dane DAD:

Sygnał A: 280 nm, pasmo 8 nm

Długości fal odniesienia DAD:

Sygnały A i B, 360 nm pasmo 16 nm

Autokalibracja DAD: tryb przed/po

Szczytowa szerokość czasu odpowiedzi: > 0,1 min.

Szerokość szczeliny: 4 nm

Margines negatywnej absorbancji: 100 mAu

Krzywa standardowa zakresu wartości nakładania: 1-20

Minimalna objętość wstrzyknięcia: 5 μL

Maksymalna objętość wstrzyknięcia: 100 μL

Ograniczenie ciśnienia: 350 bar

Normalne ciśnienie robocze: 130-200 bar

P r z y k ł a d 19. Szczep z brakiem OmpT stosowany do ekspresji IL-21

A. Konstrukcja szczepu nowego gospodarza stosowanego do wytwarzania IL-21

Obecny proces wytwarzania IL-21 obejmuje ekspresję w W3110 gospodarza E. coli [F-mcrA mcrB IN (rrnD-rrnE) 1 λ-]. Podczas gdy W3110 jest silnym gospodarzem do wytwarzania IL-21, nie jest idealny do przetwarzania z prądem. Po lizie komórki, IL-21 jest cięta w pozycji 74 lizyny (jak pokazano na SEQ ID NO: 28) przez proteazę OmpT obecną w zewnętrznej błonie. Jest znane, że ta proteaza tnie inne zrekombinowane białka heterologiczne łącznie z FGF-18. Proteoliza IL-21 nie zachodzi w szczepach z brakiem OmpT, takich jak BL21 [F-ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm lon]. Podczas gdy aktywność OmpT może być podczas lizy komórki zminimalizowana dodatkiem ZnSO4 lub CuSO4, należy zaprojektować schemat oczyszczania w celu oczyszczenia końcowego produktu z ciętej IL-21. W celu uproszczenia procesu wytwarzania IL-21, proteaza OmpT została usunięta z W3110 by utworzyć nowy szczep wytwarzający. Konstruowanie tego nowego szczepu gospodarza E. coli jest opisane poniżej.

B. Konstruowanie plazmidu pCHAN1 dla ekspresji operonu czerwonej rekombinazy

Aby usunąć proteazę OmpT z W3110 zastosowana została strategia oparta o rekombinację homologiczną. W celu wydajnego usunięcia genów homologiczną rekombinacją z chromosomu

E. coli, muszą być obecne w komórkach pewne enzymy posiadające aktywność rekombinazy. By tego

PL 209 009 B1 dokonać, skonstruowany został plazmid z bakteriofaga λ posiadający operon czerwonej rekombinazy. Fragment zawierający geny czerwonej rekombinazy był zsyntetyzowany na DNA bakteriofaga λ (New England Biolab) przez PCR z zastosowaniem starterów specyficznych do rekombinacji ZC43,586 (SEQ ID NO: 29) i ZC43,587 (SEQ ID NO: 30). Mieszanina reakcyjna zawierała 100 pmol każdego ze starterów ZC43,586 i ZC43,587, 10 μl buforu 10 x PCR (Boehringer Mannheim), 1 μl Polimerazy Pwo (Boehringer Mannheim), 10 μl 0,25 mM mieszaniny trójfosforanów nukleotydów (Perkin Elmer) i dH₂O w końcowej objętości 100 pl. Reakcja PCR składała się z pojedynczego 5 minutowego cyklu w 94°C, następujących 30 cykli 1 minutowych w 94°C, 1 minutowych w 50°C i 1 minutowych w 72°C. Po ostatnim z 30 cykli nastąpiło wydłużenie przez 5 minut w 72°C i zakończono reakcję przetrzymaniem przez noc w 4°C. Otrzymany w rezultacie fragment 1964 par zasad (bp) zawierał operon czerwonej rekombinazy (SEQ ID NO: 31). Sekwencja nukleotydów jak pokazano w SEQ ID NO: 31 koduje trzy geny, Gam (γ), jak pokazano z nukleotydów 41-454, Bet (β), jak pokazano z nukleotydów 463-1245 i Exo, jak pokazano z nukleotydów 1245-1922.

Operon czerwonej rekombinazy został włączony do plazmidu przez homologiczną rekombinację w drożdżach. Kompetentne komórki drożdży (100 pl S. cerevisiae SF838-9Da) zostały zmieszane z 100 ng pTAP399 trawionego Smal (zdeponowane w American Type Culture Collection w Manassas, VA (nieokreślony w czasie wypełniania)), wektorem akceptorowym i 1 pg fragmentu po PCR opisanego powyżej. Mieszanina drożdże/DNA została przeniesiona do 0,2 cm elektroporacyjnej kuwety i wytrząsana miarowo przy 0,75 kV (5 kV/cm), nieskończonej Ω, 25 pF kondensatorze. Transformowana mieszanina została następnie dodana do 1 ml 1,2M sorbitolu i inkubowana w 30°C przez 1 godzinę. Komórki zostały umieszczone w 500 pl podwielokrotnościach jednakowej objętości na dwóch płytkach URA DS (2% dekstrozy, 2% sorbitolu) i inkubowane w 30°C przez 2 dni. Po około 48 godzinach transformanty drożdży Ura⁺ z płytek, zostały zawieszone w 2 ml H2O i osadzone przez odwirowanie. Osad komórkowy został powtórnie zawieszony w 1 ml buforu lizującego Qiagen PI (Qiagen) i przeniesiony do świeżej probówki zawierającej 1 ml 0,5 mM paciorków cyrkoniowych/krzemionkowych (Biospec Products Inc.). Komórki były lizowane, próbki były pozostawione, by mogły osiąść, 250 pl lizatu zostało przeniesione do świeżej probówki i DNA plazmidowe zostało izolowane przez zastosowanie zestawu Qiagen Spin Miniprep zgodnie z instrukcją producenta.

Elektrokompetentne komórki Dh10B E. coli (Invitrogen) były transformowane 1 pl preparatu DNA drożdży. Komórki były wytrząsane miarowo w kuwetach 0,1 cm przy 2,0 kV, 25 pF i 100 Ω. Po elektroporacji do każdej próbki zostało dodane 250 pl SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% ekstraktu drożdży (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukozy). Komórki pozostawiono w 37°C na 2 godziny. Cała próbka 250 pl została umieszczona w jednej podwielokrotności na płytce LB (bulion LB (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco)) zawierający 25 mg/L kanamycyny (Sigma). Płytki były inkubowane w 37°C przez noc. Pojedyncze klony zawierające operon czerwonej rekombinazy zostały zidentyfikowane przez enzymy restrykcyjne, żeby zweryfikować obecność wstawki. Wstawki dodatnich klonów zostały poddane analizie sekwencyjnej. Plazmid zawierający właściwą wstawkę został oznaczony jako pCHAN1.

Sekwencja drożdży została następnie usunięta ze szkieletu wektora włączonego do plazmidu pCHAN1. 3,0 pl plazmidowego DNA było inkubowane przez noc z 24,3 pl H2O, 2,7 pl buforu H (Roche) i 2,0 pl Notl (New England Biolabs) w 37°C. 5 pl mieszaniny trawionej przez noc zostało wymieszane z 1 pl 6 x próbka barwnika DNA (25% Fikoll Typ 400 (Sigma), 0,25% błękitem bromofenolu (EM Science), 0,25% cyjanolu ksylenu (Kodak Biomedicals Inc.)) i 4 pl tego roztworu zostało puszczone na 1% żelu agarozowym (EM Science), żeby sprawdzić czy trawienie było kompletne. Żeby ponownie utworzyć kolisty plazmid, 14 pl trawionego przez noc Notl zostało zmieszane z 4 pl 5 x buforu do ligacji (Invitrogen) i 2 pl ligazy (Invitrogen). Mieszanina ligacyjna była inkubowana przez noc w 25°C.

Powtórnie ligowane pCHAN1 było transformowane do W3110. Elektrokompetentne komórki W3110 (50 pl) były transformowane 1 pl DNA pCHAN1 przez zastosowanie opisanego powyżej protokołu elektroportacji dla E. coli. Po odzyskaniu, całe 250 pl transformowanej mieszaniny zostało umieszczone w jednej podwielokrotności na płytce LB zawierającej 25 mg/L kanamycyny. Płytki były inkubowane w 37°C przez noc i dziesięć z otrzymanych klonów zostało wybranych do dalszych analiz. Rosły one przez noc w 37°C w 2,0 ml Superbroth II (Beckton Dickinson) zawierającego 25 pg/ml kanamycyny. Następnego dnia 1,0 ml z nocnego zbioru został użyte do potwierdzenia obecności pCHAN1. Do utworzenia plazmidu DNA został użyty zestaw Qiagen Spin Miniprep, zgodnie z instrukcją producenta. Tożsamość plazmidu została potwierdzona trawieniem enzymami restrykcyjnymi

PL 209 009 B1 z zastosowaniem EcoRI (Gibco BRL) i Notl (New England Biolabs). Izolat # 3, nazwany EE670, został wyselekcjonowany do dalszych doświadczeń.

Wytwarzanie fragmentu tetracykliny do zastąpienia genu w W3110

Gen tetracykliny został wybrany jako odpowiedni marker dla homologicznej rekombinacji w locus OmpT, odtwarzając nieaktywny gen OmpT. Fragment promotor tetracykliny: :tetracyklina (tet^p: :tet) był wytworzony w reakcji PCR z DNA pBR322 (New England Biolabs) przy zastosowaniu specyficznych dla rekombinacji starterów ZG45,112 (SEQ ID NO: 32) i ZG45,171 (SEQ ID NO: 33). Mieszanina reakcyjna zawierała 100 pmol każdego ze starterów ZG45,112 i ZG45,171, 10 μl 10 x buforu PCR (Boehringer Mannheim), 1 μl polimerazy Pwo (Boehringer Mannheim), 10 μl 0,25 mM mieszaniny trójfosforanów nukleotydów (Perkin Elmer) i dH₂O w końcowej objętości 100 pl. Warunkami dla reakcji PCR był 1 cykl przez 2 minuty w 94°C, po którym nastąpiło 30 cykli 30-sekundowych w 94°C, 1-minutowych w 50°C i 2-minutowych w 72°C. Po tym nastąpiło 7-minutowe wydłużenie w 72°C i całonocne przetrzymanie w 4°C. Otrzymany fragment wielkości 1590 bp przenosi tet^p: :tet (SEQ ID NO: 34).

W celu oczyszczenia fragmentu tet^p: :tet, produkt PCR był nakładany na 1% przygotowany żel agarozowy. Fragment tet^p: :tet został wycięty z żelu i umieszczony w 0,5 ml probówce Eppendorfa z małym otworem w dnie, który został wyłożony filtrem akwariowym z włókniny (Finny Products, Inc., Cincinnati, OH). Probówka została włożona do 1,5 ml probówki Eppendorfa i odwirowana w wirówce na stole przy 14000 rpm przez 10 minut w 25°C. Płyn z dna 1,5 ml probówki został zmieszany z 10% (vol/vol) 3M NaOAc i 2 objętościami 100% etanolu. Próbka była inkubowana w -20°C przez 10 minut i odwirowywana przez 10 minut w 4°C w wirówce na stole, żeby osadzić fragment utworzony podczas PCR. Supernatant został odessany, a osad powtórnie zawieszony w 50 pl H₂O. Stężenie robocze fragmentu tet^p: :tet wynosiło 50 ng/pl.

_®

Fragment powstały podczas PCR był ligowany w wektor pCR 4,0-BLUNT TOPO^® (Invitrogen) do zastosowania jako kontrola pozytywna doświadczeń zamiany genów. Ligacja była przeprowadzona zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki DH10B E. coli (Invitrogen) były transformowane fragmentem DNA tet^p: :tet przez zastosowanie protokółu elektropolacji dla E. coli opisanej powyżej. Po odzyskaniu, całość 250 pl mieszaniny po transformacji została umieszczona na płytce LB zawierającej 100 mg/L ampicyliny (Sigma). Płytki były inkubowane przez noc w 37°C.

Dziesięć klonów zostało wybranych do dalszych analiz. Hodowane były przez noc w 37°C w 2,0 ml Superbroth II (Beckton Dickinson) zawierającym 100 pg/ml ampicyliny. Następnego dnia 1,0 ml z nocnej hodowli został użyty do potwierdzenia obecności DNA plazmidowego. Zestaw Qiagen Spin Miniprep został użyty do utworzenia DNA plazmidowego zgodnie z instrukcją producenta. Dla zweryfikowania tożsamości plazmidu i orientacji, plazmidowe DNA zostało poddane analizie restrykcyjnej przy użyciu z zastosowaniem SalI (New England Biolabs) i Pstl (New England Biolabs). Izolat # 1 został wybrany do następnych doświadczeń. Plazmid został nazwany pSDH185, a klon EE686.

Zastąpienie genu w W3110: delecja genu OmpT

500 ml hodowla W3110/pCHAN1 była hodowana w 37°C w pożywce SOB [20 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdży, 0,5 g/L NaCl, 10 ml/L 2 50 mM KCl, 5 ml/L 2M MgCl2, pH 7,0] do OD600 0,6. Hodowla została podzielona na cztery hodowle po 125 ml. Jedną hodowlę pozostawiono jako nie indukowaną kontrolę, podczas gdy trzy pozostałe były indukowane 1 mM IPTG przez 15 minut, 30 minut lub 60 minut. Na koniec ich odpowiednich inkubacji, dla czterech hodowli zostały utworzone kompetentne komórki w następujący sposób. Komórki były osadzane przez odwirowywanie przy 5000 rpm przez 10 minut. Supernatanty zostały wysuszone i każdy osad został powtórnie zawieszony w 62,5 ml lodowato zimnej H2O. Hodowle znowu zostały osadzone, supernatant został wysuszony i każdy osad został powtórnie zawieszony w 31,5 ml zimnego 10% glicerolu. Hodowle zostały następnie odwirowane przy 8000 rpm przez 5 min. Osady zostały dobrze wysuszone i powtórnie zawieszone w pozostałym 10% glicerolu.

Wszystkie cztery hodowle zostały podzielone na sześć 50 pl podwielokrotności, które były transformowane w następujące sposoby: 1) bez negatywnej kontroli DNA, 2) kontrola pozytywna 1 pl (1 pg/pl) pBR322 (New England Biolabs), 3) kontrola pozytywna 1 pl (1 pg/pl) pTAP279, 4) kontrola pozytywna 1 pl pSDH185, 5) 2 pl (50 ng/pl) fragmentu (tet^p: :tet) i 6) 4 ul (50 ng/ul) fragmentu (tet^p: :tet). Komórki były transformowane przez elektropolację, jak opisano wyżej dla E. coli. Całość mieszanin transformacyjnych została umieszczona na płytkach LB zawierających 10 mg/L tetracykliny (Sigma) z wyjątkiem kontroli dla pTAP279, które były umieszczone na płytkach LB zawierających 35 mg/L chloramfenikolu (Sigma). Płytki były inkubowane przez noc w 37°C. Dodatkowo, na płytkach LB zostaPL 209 009 B1 ły umieszczone rozcieńczenia 10^-6 i 10^-7 (w H2O) z każdej z czterech hodowli, w celu oszacowania całkowitej wydajności procesu rekombinacji określeniem liczby komórek.

Następnego dnia, płytki kontrolne zostały wyjęte z inkubatora i oszacowane. Próbki transformowane fragmentami tet^p: :tet były pozostawione do inkubacji przez dodatkowe 24 godziny, przed testami. Dwadzieścia sześć największych klonów zostało oznaczone do dalszych analiz.

Charakterystyka klonów z brakiem OmpT

Każdy z 26 wybranych klonów był hodowany przez noc w 37°C w 1 ml LB z 5 μg/ml tetracykliny. Następnego dnia z wszystkich 26 klonów zostało wytworzone genomowe DNA przy zastosowaniu Genomie Prep DNA Isolation Kit (Amersham Pharmacia) zgodnie z instrukcjami producenta. Genomowe DNA z każdego klonu, zostało rozcieńczone 1:100 dH2O do zastosowania jako matryca do analizy PCR. Każda rozcieńczona próbka była badana z użyciem trzech różnych zestawów starterów do PCR (trzy reakcje PCR na klon). Każda z reakcji zawierała 100 pmol zestawu starterów # 1: ZG45,357 (SEQ ID NO: 35) i ZG45,350 (SEQ ID NO: 36) lub zestawu starterów # 2: ZG45,353 (SEQ ID NO: 37) i ZG4 5, 355 (SEQ ID NO: 38), lub zestawu starterów # 3 ZG45,354 (SEQ ID NO: 39) i ZG45,359 (SEQ ID NO:4 0). Pozostałość 100 μl objętości końcowej była zrobiona z 10 μl 10 x buforu do PCR (Boehringer Mannheim), 1 μl polimerazy Pwo (Boehringer Mannheim), 10 μl 25 mM mieszaniny trójfosforanów nukleotydów (Perkin Elmer) i dH2O.

Warunkami dla reakcji były: 1 cykl przez 5 minut w 94°C, po którym nastąpiło 30 cykli 30-sekundowych w 94°C, 1-minutowych w 50°C i 2-minutowych w 72°C. PCR zakończyło się 7-minutowym wydłużeniem w 72°C i całonocnym przetrzymaniem w 4°C. Jeśli w W3110 gen OmtP został z sukcesem zastąpiony genem tetracykliny, zestaw starterów # 1 powinien powielić prążek 1584 bp (SEQ ID NO: 41), zestaw starterów # 2 powinien powielić prążek 1190 bp (SEQ ID NO: 42). Wyniki wykazały, że 25 z 26 przejrzanych klonów były ompT. Klony W3110 ompT # 1 i # 3 zostały wybrane do dalszych badań.

IL-21 była inkubowana z lizatem komórek pochodzących z nowo otrzymanych szczepów ompT i rodzicielskiego W3110, żeby potwierdzić utratę proteolitycznej aktywności. Lizat ze szczepu ompT, BL21 był włączony jako pozytywna kontrola. Komórki zostały zaszczepione w Superbroth II i hodowane przez noc w 37°C. Z każdej nocnej hodowli cztery 1 ml podwielokrotności zostały osadzone w temperaturze pokojowej i komórki były lizowane z zastosowaniem BugBuster^© (Novagen), zgodnie z instrukcjami producenta.

Lizaty komórek były inkubowane w 25°C przez 4 godziny z jednym z: 1) 0,332 mg/ml IL-21 lub 2) 0,332 mg/ml IL-21 w obecności 5 mM ZnCl2. Każda próbka została wymieszana z równą objętością NuPage 4x Sample Buffer (Invitrogen) zawierającym 2% β-merkaptoetanolu (Sigma). Zredukowane próbki były ogrzewane przez 5 min. w 100°C i 10 μL zostało nałożone na 10% NuPAGE żel poliakrylamidowy (Invitrogen). Elektroforeza została przeprowadzona w warunkach denaturacji (SDS-PAGE), przy 130 v, przy zastosowaniu 1 x MES buforu, w którym przebiega elektroforeza (Invitrogen). Żele były barwione Simply Blue Safestain (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki wykazały, że przez zastąpienie genu, proteaza OmpT została inaktywowana. IL-21 była całkowicie nienaruszona po 4-godzinnej inkubacji w lizacie z BL21, W3110 ompT # 1 i W3110 ompt # 3, ale została kompletnie zdegradowana w lizacie z rodzicielskiego W3110. Aktywność proteazy OmpT była hamowana przez cynk. W inkubacjach zawierających 5 mM ZnCl2 IL-21 pozostała nietknięta podtrzymując tezę, że za degradację było odpowiedzialne OmpT. Niedawno skonstruowane szczepy ompT W3110 zostały nazwane ZGOLD1 (W3110 ompT # 1; (zdeponowane w American Type Culture Collection w Manassas, VA (nieokreślony w czasie wypełniania)) i ZGOLD3 (W3110 ompT # 3).

Charakterystyka ZGOLD1 i ZGOLD3

Dla oceny wzrostu ZGPOLD1 i ZGOLD3 były hodowane równocześnie z rodzicielskim W3110. Hodowle wszystkich trzech szczepów rosły w 37°C w LB do OD600 1,0. Gęstość komórek była mierzona co godzinę, by ocenić ich wzrost. Żeby określić liczbę komórek, rozcieńczenia (10^-6, 10^-7 i 10^-8 w H2O) z każdej hodowli, zostały umieszczone na płytkach LB z kanamycyną (patrz wyżej). Wyniki wykazują, że wzrost szczepów ZGOLD jest zrównany do wzrostu szczepu rodzicielskiego W3110.

Żeby ocenić wydajność transformacji, komórki zostały zebrane i zrobione kompetentnymi do transformacji, jak opisano powyżej. Podwielokrotności każdego szczepu były transformowane do albo 1) 1 μl pTAP337 (plazmid ekspresyjny IL-21; ATCC No PA-4853) lub 2) bez DNA (kontrola negatywna). Elektroporacja została przeprowadzona jak opisano powyżej. Po odzyskaniu, każda transformowana mieszanina została umieszczona na płytce LB zawierającej 25 mg/ml kanamycyny i inkubowana przez noc w 37°C. Dane wykazują, że usunięcie ompT nie miało wpływu na wydajność transformacji W3110.

PL 209 009 B1

Do oceny wytwarzania białka wybrane zostało dziesięć klonów z każdego szczepu ZGOLD transformowanych wektorem ekspresyjnym IL-21. Klony były hodowane przez noc w 37°C w Superbroth II (zawierającym 25 μg/ml kanamycyny). Nocne hodowle były używane do zaszczepienia rolerów zawierających Superbroth II z 25 μg/ml kanamycyny. Komórki były hodowane w 37°C. Prowadzona była druga hodowla jednego z klonów i służyła jako nie indukowana kontrola. Gdy OD600 każdej hodowli wynosiło 1,5-2,0, były one indukowane 1 mM IPTG (ICN Biomedicals Inc.). Inkubację hodowli kontynuowano przez kolejne 5 godzin. Próbki każdej hodowli były analizowane przez SDS-PAGE na 4-12% gradiencie żelu NuPAGE (Invitrogen) w warunkach redukcji jak opisano powyżej. Wyniki wykazują, że wytwarzanie IL-21 przez ZG0LD1 i ZGOLD3 jest ekwiwalentne do wytwarzanej przez rodzicielski szczep W3110. ZGOLD1/pTAP337 # 1 (zdeponowane w American Type Culture Collection w Manassas, VA (nieokreślony w czasie wypełniania)) został wybrany dla dalszego rozwijania procesu wytwarzania IL-21.

PL 209 009 B1

USTA SEKWENCJI <110> ZymoGenetics. Inc.

<120> WYTWARZANIE IL-21 WGOSPODARZACH TOKAROTYCTNYCH <130> 02-12PC <160> 42 <170> FastSEO dla Windows Wersja 4.0 <210> 1 <211> 642 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (47)...(535) <400> 1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc 55 Met Arg Ser

agt cct Ser Pro 5	ggc aac atg Gly Asn Met	gag agg att gtc atc tgt ctg atg	gtc atc ttc Val Ile Phe	103
G1 u	Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
10	15
ttg ggg	aca	ctg gtc	cac	aaa	tca	agc tcc caa ggt	caa	gat	cgc	cac	151
Leu Gly	Thr	Leu Val	His	Lys	Ser	Ser Ser Gin Gly	Gin	Asp Arg	His
20			25			30				35
atg att	aga	atg cgt	caa	ctt	ata	gat att gtt gat	cag	ctg	aaa	aat	199
Met Ile	Arg	Met Arg	Gin	Leu	Ile Asp Ile Val Asp	Gin	Leu Lys	Asn

45 50

PL 209 009 B1

tat gtg aat gac ttg gtc cct

gaa ttt ctg cca get cca gaa gat gta

247

Tyr Val Asn Asp

Leu

Val

Pro

Glu

Phe 60

Leu

Pro

Ala

Pro Glu 65

Asp

Val

55

gag

aca

aac

tgt

gag

tgg

tea

get

ttt

tcc

tgt

ttt

cag

aag

gee

c^a

295

Glu

Thr

Asn

Cys

Glu

Trp

Ser

Ala

Phe

Ser

Cys

Phe

Gin

Lys

Al a

Gin

70

75

80

eta

aag

tea

gca

aat

aca

gga

aac

aat

gaa

agg

ata

atc

aat

gta

tea

343

Leu

Lys

Ser

Al a

Asn

Thr

Gly

Asn

Asn

Glu

Arg

Ile

Ile

Asn

Val

Ser

85

90

95

att

aaa

aag

ctg

aag. agg

aaa

cca

cct

tcc

aca

aat

gca

ggg

aga

aga

391

Ile

Lys

Lys

Leu

.Lys Arg

Lys

Pro

Pro

Ser

Thr

Asn

Ala

Gly

Arg

Arg

100

105

110

115

cag

aaa

cac

aga

eta

aca

tgc

cct

tea

tgt gat

tet

tat

gag

aaa

aaa

439

Gin

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

Ser

Cys Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Lys

120

125

130

cca

ccc

aaa

gaa

ttc

eta

gaa

aga

ttc

aaa

tea

ctt

ctc

caa

aag

a tg

487

Pro

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

Phe

Lys

Ser

Leu

Leu

Gin

Lys

Met

135

140

145'

att

cat

cag

cat

ctg

tcc

tet

aga

aca

cac

gga

agt

gaa

gat

tcc

tg a

535

Ile

His

Gin

His

Leu

Ser

Ser

Arg

Thr

His

Gly

Ser

Glu

Asp

Ser

*

150

155

160

ggatctaact tgcagttgga cactatgtta catactctaa tatagtagtg aaagtcattt 595 ctttgtattc caagtggagg agccctatta aattatataa agaaata 642 <210> 2 <2L1> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met

Arg

Ser

Ser

Pro

Gly

Asn

Met

Glu

Arg

Ile

Val

Ile

Cys

Leu

Met

1

5

10

15

Val

Ile

Phe

Leu

Gly

Thr

Leu

Val

His

Lys

Ser

Ser

Ser

Gin

Gly

Gin

20

25

30

Asp

Arg

His

Met

Ile

Arg

Met

Arg

Gin

Leu

Ile

Asp

Ile

Val

Asp

Gin

35

40

45

PL 209 009 B1

Leu Lys 50

Asn Tyr

Val Asn Asp Leu Val Pro

Glu Phe Leu 60 Ala Phe Ser

Pro Cys

Al a Phe

Pro Gin

Val

Glu

55

Ser

Glu

Asp

Thr Asn Cys

Glu

Trp

65

70

75

80

Lys

Ala

Gin

Leu

(Lys;

Ser

Al a

Asn

Thr

Gly

Asn

Asn

Glu

Arg

Ile

Ile

85

90

95

Asn

Val

Ser

Ile

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg Lys

Pro

Pro

Ser

Thr

Asn

Ala

100

105

110

Gly Arg Arg

G1 n

-Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyn

115

120

125

Glu

Lys

Lys

Pro

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

Phe

Lys

Ser

Leu

Leu

130

135

140

Gin

Lys

Met

Ile

His

•Gin

His

Leu

Ser

Ser

Arg

Thr

His

Gly

Sen

Glu

145

150

155

160

Asp Ser <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> oiigonukleotyd ZC29740 Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> oiigonukleotyd <400> 3 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 50 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oiigonukleotyd <40 0> 4 tctgatttaa tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cg 42 <210> 5 <211> 62 <212> DNA

PL 209 009 B1 <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> · oligonukleotyd ZC29736 <40O> 5 gtggaattgt gagcggataa caatttcaca cagaattcat taaagaggag aaattaactc 60 cc 62 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC29738 <400> 6 gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca cccgggagtt astttctcct ctttaatgaa 60 ttc 63 <210> 7 <211> 62 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC29084 <400> 7 atcaacacca acatcagcac cataaggagg agtagcatat gcaaggtcaa gatcgccaca 60 tg 62 <210> 8 <211> 68 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22127 <400> 8 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcaggaatct tcacttccgt 60

PL 209 009 B1 gtgttcta 68 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> · <223> oligonukleotyd ZC22913 <400> 9 ggaaccaggt cgttcacata gtttttcagc tgatcaacaa 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220 <223> oligonukleotyd ZC22914 <400> 10 ttgttgatca gctgaaaaac tatgtgaacg acctggttcc 40 <210 11 <211> 40 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22915 <400 11 tgtttctgac gacgacctgc gttggtggac ggcggtttac 40 <210 12 <211> 40 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22916

PL 209 009 B1 <400> 12 gtaaaccgcc gtccaccaac gcaggtcgtc gtcagaaaca <210> 13 .

<211> 40 <212> DNA .

<213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22961 <400> 13 gttttcacga gcacttcacc aacaaggacc atagattatg <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22962 <400> 14 aacaaggacc atagattatg caggatcgcc acatgattcg tatgcgtcag <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220><223> oligonukleotyd ZC22963 <400> 15 gtttttcagc tgatcaacaa tatcgatcag ctgacgcata cgaatcatgt <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22964

PL 209 009 B1 <400> 16 tatgtgaacg acctggttcc ggaatccctg ccggctccgg aagatgttga gaccaactgt 60 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22965 <400> 17 tcagctggg·: tttctggaaa caggaęaaag cggaccactc acagttggtc'tcaacatctt 60 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <22 0>

<223> oligonukleotyd ZC22966 <400> 18 tttccagaaa gcccagctga aatccgcaaa caccggtaac aacgaaęgta tcatcaacgt 60 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22967 <400> 19 gttggtggac ggcggtttac gtttcagttt tttaatggaa acgttgatga tacgttcgtt 60 <210> 20 <211> 60

PL 209 009 B1 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220<223> oligonukleotyd ZC22968 <400> 20 gcaggtcgtc gtcagaaaca ccgtctgacc tgcccgtcct gtgattctta tgagaaaaaa 60 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22969 <400> 21 gcagcaggga tttgaaacgt tccaggaatt ctttcggcgg ttttttctca taagaatcac 60 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22970 <400> 22 acgtttcaaa tccctgctgc agaaaatgat tcaccagcac ctgtcctctc gtacccacgg 60 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22971 <400> 23

PL 209 009 B1 aatcttatct catccgccaa aacatcagga atcttcggaa ccgtgggtac gagaggacag 60 <210> 24 <211> 40 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC22972 <400 24 ttaatctgta tcaggctgaa aatcttatct catccgccaa 40 <210 25 <211> 63 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC40133 <400> 25 ctcaacatct tccggagccg gcaggaattc cggaaccagg tcattcacat aatttttcag 60 ^ct9 63 <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC40107 <400 26 ttatagatat tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cctggttccg gaattcctgc 60 cggc 54 <210> 27 <211> 405 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja

PL 209 009 B1 <220>

<223> optymalizowana IL-21 <221> CDS <222> (1)...(405) <400> 27

atg Met 1

caa ggt caa

gat Asp 5

cgc cac atg att aga atg cgt caa ctt ata gat

48

Gin

Gly Gin

Arg

Hi s

Met Ile

Arg 10

Met

Arg

Gin

Leu

Ile 15

Asp

att

gtt gat

cag

ctg

aaa

aat

tat

gtg

aat

gac

ctg

gtt

ccg

gaa

ttc

96

Ile

Vdl

Asp

Gin

Leu

Lys

Asn

Tyr

Val

Asn

Asp

Leu

Val

Pro

Glu

Phe

20

25

30

ctg

ccg

gct

ccg

gaa

gat

gtt gag

acc

aac

tgt

gag

tgg

tcc

gct

ttc

144

Leu

Pro

Ala

Pro

Glu

Asp

Va1

Glu

Thr

Asn

Cys

Glu

Trp

Ser

Ala

Phe

35

40

45

tcc

tgt

ttc

cag

aaa

gcc

cag

ctg

aaa

tcc

gca

aac

acc

ggt

aac

aac

192

Ser

Cys

Phe

Gin

Lys

Ala

Gin

Leu

Lys

Ser

Ala

Asn

Thr

Gly

Asn

Asn

50

55

60

gaa

cgt

atc

atc

aac

gtt

tcc

att

aaa

aaa

ctg

aaa

cgt

aaa

ccg

ccg

240

Glu

Arg

Ile

Ile

Asn

Val

Ser

Ile

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg

Lys

Pro

Pro

65

7D

75

80

tcc

acc

aac

gca

ggt

cgt

cgt

cag

aaa

cac

cgt ctg

acc

tgc

ccg

tcc

288

Ser

Thr

Asn

Ala

Gly Arg Arg

Gin

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

Ser

85

90

95

tgt

gat

tct

tat

gag

aaa

aaa

ccg

ccg

aaa

gaa

ttc

ctg

gaa

cgt

ttc

336

Cys Asp Ser

Tyr

Glu

Lys

Lys

Pro

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

Phe

100

105

110

aaa

tcc

ctg ctg

cag

aaa

atg

att

cac

cag

cac

ctg

tcc

tct

cgt

acc

384

Lys

Ser

Leu

Leu

Gin

Lys

Met

Ile

His

Gin

Hi s

Leu

Ser

Ser

Arg

Thr

115 120 125 cac ggt tcc gaa gat tcc tga 405

His Gly Ser Glu Asp Ser *

130

PL 209 009 B1 <210> 28 <211> 134 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> optymalizowana IL-21 <400 28

Met

Gir

Gly

Gin

Asp

Arg

Hi s

Met

Ile

Arg

Met

Arg

Gin

Leu

Ile

Asp

1

5

10

15

Ile

Val

Asp

Gin

Leu

Lys

Asn

Tyr

Val

Asn

Asp

Leu

Val

Pro

Glu

Phe

20.

25

30

Leu

Pro

Ala

Pro'

Glu

Asp

Val

Glu

Thr

Asn

Cys,

Glu

Trp

Ser

Ala

Phe

35

40

45

Ser

Cys

Phe

Gin

Lys

Al a

Gin

Leu

Lys

Ser

Ala

Asn

Thr

Gly

Asn

Asn

50

55

60

Glu

Arg

Ile

Ile

Asn

Val

Ser

Ile

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg

Lys

Pro

Pro

65

70

75

80

Ser

Thr

Asn

Ala

Gly

Arg

Arg

Gin

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

Ser

85

90

95

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Lys

Pro

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

Phe

100

105

110

Lys

Ser

Leu

Leu

Gin

Lys

Met

Ile

His

Gin

His

Leu

Ser

Ser

Arg

Thr

115

120

125

His

Gly

Ser

Glu

Asp

Ser

130

<210> 29 <211> 64 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC43.586 <400> 29 acaatttcac acagaattca ttaaagagga gaaattaact atggatatta atactgaaac 60 tgag 64 <210> 30

PL 209 009 B1 <211> 64 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC43.587 <400> 30 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca tcatcgccat tgctccccaa 60 atac 64 <210> 31 <211> 1965 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja DNA operonu czerwonej rekombinazy powielona przy użyciu ZC43.586 i ZC43.587 <400> 31 acaatttcac acagaattca ttaaagagga gaaattaact atggatatta atactgaaac 60 tgagatcaag caaaagcatt cactaacccc ctttcctgtt ttcctaatca gcccggcatt 120 tcgcgggcga tattttcaca gctatttcag gagttcagcc atgaacgctt attacattca 180 ggatcgtctt gaggctcaga gctgggcgcg tcactaccag cagctcgccc gtgaagagaa 240 agaggcagaa ctggcagacg acatggaaaa aggcctgccc cagcacctgt ttgaatcgct 300 atgcatcgat catttgcaac gccacggggc cagcaaaaaa tccattaccc gtgcgtttga 360 tgacgatgtt gagtttcagg agcgcatggc agaacacatc cggtacatgg ttgaaaccat 420 tgctcaccac caggttgata ttgattcaga ggtataaaac gaatgagtac tgcactcgca 480 acgctggctg ggaagctggc tgaacgtgtc ggcatggatt ctgtcgaccc acaggaactg 540 atcaecactc ttcgccagac ggcatttaaa ggtgatgcca gcgatgcgca gttcatcgca 600 ttactgatcg ttgccaacca gtacggcctt aatccgtgga cgaaagaaat ttacgccttt 660 cctgataagc agaatggcat cgttccggtg gtgggcgttg atggctggtc ccgcatcatc 720 aatgaaaacc agcagtttga tggcatggac tttgagcagg acaatgaatc ctgtacatgc 780 cggatttacc gcaaggaccg taatcatccg atctgcgtta ccgaatggat ggatgaatgc 840 cgccgcgaac cattcaaaac tcgcgaaggc agagaaatca cggggccgtg gcagtcgcat 900 cccaaacgga-tgttacgtca taaagccatg attcagtgtg cccgtctggc cttcggattt 960 gctggtatct atgacaagga tgaagccgag cgcattgtcg aaaatactgc atacactgca 1020 gaacgtcagc cggaacgcga catcactccg gttaacgatg aaaccatgca ggagattaac 1080 actctgctga tcgccctgga taaaacatgg gatgacgact tattgccgct ctgttcccag 1140 atatttcgcc gcgacattcg tgcatcgtca gaactgacac aggccgaagc agtaaaagct 1200 cttggattcc tgaaacagaa agccgcagag cagaaggtgg cagcatgaca ccggacatta 1260 tcctgcagcg taccgggatc gatgtgagag ctgtcgaaca gggggatgat gcgtggcaca 1320

PL 209 009 B1 aattacggct cggcgtcatc accgcttcag aagttcacaa cgtgatagca aaaccccgct 1380 ccggaaagaa gtggcctgac atgaaaatgt cctacttcca caccctgctt gctgaggttt 1440 gcaccggtgt ggctccggaa gttaacgcta aagcactggc ctggggaaaa cagtacgaga 1500 acgatgccag aaccctgttt gaattcactt ccggcgtgaą tgttactgaa tócccgatca 1560 tctatcgcga icgaaagtatg cgtaccgcct gctctcccga tggtttatgc ajgtgacggca 1620 acggccttga ktgaaatgc ccgtttacct cccgggattt catgaagttc cggctcggtg 1680 gtttcgaggc cataaagtca gcttacatgg cccaggtgca gtacagcatg tgggtgacgc 1740 gaaaaaatgc ctggtacttt gccaactatg acccgcgtat gaagcgtgaa ggcctgcatt 1800 atgtcgtgat tgagcgggat gaaaagtaca tggcgagttt tgacgagatc gtgccggagt 1860 tcatcgaaaa aatggacgag gcactggctg aaattggttt tgtatttggg gagcaatggc 1920 gatgatgttt tggcggatga gataagattt tcagcctgat acaga 1965 <210> 32 <211> 92 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC45.112 <4Q0> 32 attgttacat tgaaatggct agttattccc cggggcgatt ttcacctcgg ggaaatttta 60 gttggcgttc tcaggtcgag gtggcccggc tc 92 <210> 33 <211> 99 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC45.171 <400> 33 taattgactc attaagttag atataaaaaa tacatattca atcattaaaa cgattgaatg 60 gagaactttt attattgaag catttatcag ggttattgt 99 <210> 34 <211> 1591 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> promotor tetracyklinyagen tetracykliny

PL 209 009 B1 fragment (tetpctet) powielony PCR przy użyciu ZC45,1 12 i ZC45.17 1 <400 34 ' taattgactc atiaagttag atataaaaaa tacatattca atcattaiaaa cgattgaatg 60 gagaactttt attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagegg ataóatattt 120 gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 180 cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 240 aggccttctc atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag tttatcacag 300 ttaaattgct aacgcagtca ggcaccgtgt atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc 360 ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc 420 ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg 480 ctatatgcgt. tgatgcaatt tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtę .cgaccgcttt ,540 ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg 600 gcgaccacac·, ccgtcctgtg gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg\catcacćggc 660 gccacaggtg cggttgćtgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 720 cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 780 gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 840 ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 900 ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact 960 atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca 1020 gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg 1080 tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc 1140 accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc 1200 tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc 1260 gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac 1320 gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact 1380 ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca 1440 tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg 1500 agccgggcca cctcgacctg agaacgccaa ctaaaatttc cccgaggtga aaatcgcccc 1560 ggggaataac tagccatttc aatgtaacaa t 1591 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC45.357 <400> 35 tcattaagtt agatataaaa aatacatatt ca 32

PL 209 009 B1 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> sztuczna .sekwencja <220> .

<223> oiigonukleotyd ZC45.350 <400> 36 taattgttac attgaaatgg ctagttatt . 29 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oiigonukleotyd ZC45.353 <400> 37 atgaaatcta acaatgcgct catcgtc 27 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oiigonukleotyd ZC45.355 <400 38 tcaggtcgag gtggcccggc tc 22 <210 39 <211> 27 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oiigonukleotyd ZC45.354 <400 39 tctaccgaga ctttatcgtt tactcct 27

PL 209 009 B1 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> oligonukleotyd ZC45.359 <400> 40 ttaaaatgtg tacttaagac cagcagta 23 <210> 41 <211> 1585 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja fragmentu 1584bp powielona PCR przy użyciu zestawu starterów # I (ZC45.357 i ZC,45,350) <400> 41 tcattaagtt agatataaaa aatacatatt caatcattaa aacgattgaa tggagaactt 60 ttattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 120 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 180 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccttc 240 tcatgtttga cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg 300 ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac 360 cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg 420 ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc 480 gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg 540 cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac 600 acccgtcctg tggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg 660 tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt 720 cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact 780 gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa 840 cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc 900 cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 950 cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 1020 ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 1080 ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 1140 tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt 1200 gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg 1260

PL 209 009 B1 cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca 1320 gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct 1380 gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt 1440 aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgęggtgcat. ggagccgggc l500 pacctcgacc tgagaacgcc aactaaaatt tccccgaggt gaaaatcgcc ccggggaata 1560 actagccatt tcaatgtaac aatta 1585 <210> 42 <211> 1191 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> sekwencja fragmentu I 190bp powielona PCR przy użyciu zestawu starterów #2 (ZC45.353 i ZC,45,355.

<4O0> 42 atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60 ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc 120 atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca 180 cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta 240 cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac 300 gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 360 gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420 ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480 gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540 atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600 agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660 atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720 tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780 ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840 atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900 tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960 caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020 gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080 gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140 tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg a 1191

Claims (24)

1. Wektor ekspresyjny do otrzymywania białka IL-21 zawierający połączone w sposób umożliwiający działanie następujące elementy:

(a) prokariotyczne źródło replikacji;

(b) element inicjacji transkrypcji DNA;

(c) sekwencję polinukleotydową jak pokazano w SEQ ID NO: 27; i (d) terminator transkrypcji.

2. Wektor ekspresyjny według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto wskaźnik umożliwiający selekcję.

3. Wektor ekspresyjny według zastrz. 2, znamienny tym, że wspomniany wskaźnik umożliwiający selekcję zawiera gen oporny na kanamycynę.

4. Komórki prokariotycznego gospodarza transformowane wektorem ekspresyjnym, jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 3.

5. Komórka gospodarza według zastrz. 4, w której komórką gospodarza jest szczep W3110

E. coli.

6. Komórka gospodarza według zastrz. 5, zdeponowana w American Type Culture Collection pod numerem dostępu PTA 4853.

7. Komórka gospodarza według zastrz. 4, znamienna tym, że komórka gospodarza jest szczepem pozbawionym proteazy OmpT.

8. Komórka gospodarza według zastrz. 7, znamienna tym, że komórka gospodarza jest szczepem E. coli W3110 pozbawionym proteazy OmpT.

9. Sposób otrzymywania białek IL-21, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

(a) hodowanie komórek gospodarza zdefiniowanych w zastrz. 4 do 8 w pożywce hodowlanej w warunkach, w których IL-21 ulega ekspresji;

(b) odzyskiwanie komórek gospodarza z pożywki hodowlanej; i (c) izolowanie białka IL-21 z komórek gospodarza.

10. Sposób według zastrz., 9, znamienny tym, że wspomniane komórki gospodarza są hodowane w fermentacji okresowej z zasilaniem.

11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że etap hodowania obejmuje:

(a) hodowanie komórek gospodarza w butelce do wytrząsania do OD600 z 5 do 20 w pożywce hodowlanej;

(b) szczepienie naczynia fermentacyjnego 1 do 12% v/v pożywki w butelce do wytrząsania zawierającej komórki gospodarza;

(c) hodowanie komórek gospodarza w pożywce hodowlanej przy pH od 6,2 do 7,2, w której roztwór zasilający jest dostarczany do naczynia fermentacyjnego przed 15 godziną upływającego czasu fermentacji (EFT);

(d) dodanie czynnika indukującego do naczynia fermentacyjnego w 20 do 30 godzinie EFT; i przy czym wspomniany etap odzyskiwania obejmuje zebranie komórek gospodarza w 48 do 56 godzinie EFT.

12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że czynnikiem indukującym jest tiogalaktopiranozyd izopropylowy (IPTG) od 0,5 do 2 mM.

13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że roztwór zasilający zawiera węglowodan wybrany z grupy składającej się z glicerolu i glukozy przy stężeniu pożywki hodowlanej i prędkości podawania 5-15 gramów węglowodanu na godzinę.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że glicerol jest 40 do 70% v/v glicerolem lub glukoza jest 40 do 70% w/v glukozą.

15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że glicerol jest około 70% v/v lub glukoza jest około 60% w/v.

16. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniany etap hodowania obejmuje:

(a) dokonanie, w butelce z pożywkę hodowlaną zawierającą 5 g/L glicerolu, posiewu szczepionką zawierającą komórki gospodarza W3110 E. coli zawierającej wektor ekspresji zdefiniowany w zastrz. 1-3, przy czym zachodzi ekspresja polipeptydu IL-21, i;

(b) hodowanie szczepionki w pożywce hodowlanej przez 16-20 godzin w około 30°C;

(c) przeniesienie szczepionki hodowanej w pożywce hodowlanej do okresowego fermentora ze stężeniem 0,5-5% v/v szczepionki;

PL 209 009 B1 (d) przeprowadzanie fermentacji okresowej w około 37°C i pH około 6,8; z około 2% glicerolu;

(e) wprowadzenie zasilania glukozą w 8 godzinie upływającego czasu fermentacji (EFT), w ilości około 9,5 g glukozy/litr/godzinę i kontynuowanie do końca przebiegu fermentacji;

(f) dodanie IPTG w około 24 godzinie EFT do końcowego stężenia 0,5 do 2 mM;

(g) przeprowadzanie fermentacji przez około 28 godzin po dodaniu IPTG; przy czym wspomniany etap odzyskiwania obejmuje zbieranie bulionu fermentacyjnego z fermentora; i przy czym etap izolowania obejmuje dodanie takiej samej ilości wody do bulionu fermentacyjnego i homogenizowanie i odwirowywanie bulionu fermentacyjnego w celu zebrania osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej zawierającej materiał białkowy IL-21.

17. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 9-16, znamienny tym, że wspomniane białko IL-21 zawiera sekwencję reszt aminokwasów jak pokazano w SEQ ID NO: 28 i przy czym wspomniany etap izolowania obejmuje:

(a) oddzielenie nierozpuszczalnego w wodzie materiału białkowego IL-21 z osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej;

(b) rozpuszczenie nierozpuszczalnego materiału białkowego IL-21 w rozpuszczalniku chaotropowym;

(c) rozcieńczenie rozpuszczalnika chaotropowego i powtórnego pofałdowania białka IL-21; i (d) izolowanie białka IL-21, przy czym izolowane białko IL-21 jest zdolne do aktywności biologicznej.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że etap izolowania białka obejmuje ponadto usuwanie nie sfałdowanych i zagregowanych białek z wspomnianego powtórnie sfałdowanego białka IL-21 przez filtrację i przy czym wspomniany sposób obejmuje:

d) oczyszczanie ponownie pofałdowanego białka IL-21 na kolumnie kationowymiennej.

19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że izolowane białko IL-21 jest czyste w przynajmniej 90%.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że izolowane białko IL-21 ma poziom endotoksyny niższy niż 10 jednostek endotoksyny na mg białka IL-21.

21. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że obejmuje początkowy etap oddzielania z bulionu fermentacyjnego osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej zawierającej nierozpuszczalny w wodzie materiał białkowy IL-21;

przy czym wspomniany w zastrz. 17 etap (a) obejmuje homogenizowanie osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej, by zebrać ciałka wtrętowe;

przy czym rozpuszczalnik chaotropowy zawiera sól guanidyny; i przy czym rozpuszczalnik chaotropowy jest rozcieńczony przez dodanie buforu fałdującego zawierającego sole argininy i mieszaninę składników redukujących i utleniających;

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap:

(e) oczyszczania eluatu IL-21 z kolumny kationowymiennej na kolumnie interakcji hydrofobowych, gdzie izolowane i oczyszczone białko IL-21 jest zdolne do aktywności biologicznej.

23. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że wspomniany etap (a) oddzielania z zastrz. 17 obejmuje homogenizowanie osadu komórkowego lub zawiesiny komórkowej dla zebrania ciał wtrętowych; wspomniany etap (b) rozpuszczania z zastrz. 17 obejmuje rozpuszczanie nierozpuszczalnego białka IL-21 w rozpuszczalniku chaotropowym zawierającym 6M chlorowodorek guanidyny, 40 mM ditiotreitol (DTT) przez jedna godzinę w temperaturze pokojowej; wspomniane rozcieńczanie i etap ponownego fałdowania w etapie (c) z zastrz. 17 obejmuje:

a) powtórne co najmniej 20-krotne ponowne pofałdowanie, rozpuszczonych w roztworze ciałek wtrętowych przez rozcieńczenie w buforze fałdującym zawierającym około 0,75M argininy, pary utleniająco-redukującej 2 mM DTT/4 mM cystyny;

(b) doprowadzenie pH do około 5,5 20% octanem i dopuszczenie roztworu do reagowania przez co najmniej 5 godzin;

(c) rozcieńczenie roztworu około 1 + 1,4 objętościami 25 mM octanu, 5,5 pH;

(g) filtrowania roztworu; i przy czym wspomniane etapy filtrowana i oczyszczania z zastrz. 18 obejmują:

(a) filtrowanie roztworu;

(b) nałożenie roztworu na kolumnę z żywicą zrównoważoną do pH 5,5 przez zastosowanie buforu octanu sodowego;

(c) przemycie kolumny z żywicą około 0,4M chlorku sodu;

PL 209 009 B1 (d) przemycie kolumny z żywicą około 0,75M chlorku sodu, by eluować związane białka IL-21;

(e) dodanie siarczanu amonu o stężeniu około 1,5M, by wyeluować i przefiltrować eluowany roztwór;

(f) nałożenie eluatu na kolumnę Tosohaas Butyl 650-M zrównoważoną do stężenia 1,5M siarczanu amonu, 0,05M chlorku sodu w buforze octanu sodu;

(g) przemycie kolumny około 0,15M siarczanem amonu, 0,05 chlorkiem sodu w buforze octanu sodu;

(h) rozcieńczenie eluatu wodą do przewodności około 30 m S/cm;

(i) nałożenie eluatu na kolumnę SP Sepharose HP zrównoważoną buforem octanu sodu;

(j) przemycie kolumny chlorkiem sodu o liniowym gradiencie stężenia od 0,3 do 0,7M, objętością 20 kolumn, (k) zagęszczenie białka IL-21; i (l) wymiany buforu na bufor formułujący z zastosowaniem ultrafiltracji z przepływem stycznym.

24. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 17-20, znamienny tym, że biologiczna aktywność jest mierzona przy użyciu testu komórkowego wiązania IL-21 przez receptor.