NO334561B1

NO334561B1 - Ekspresjonsvektor for fremstilling av IL-21-protein, prokaryot vertcelle for IL-21-produksjon og fremgangsmåte for fremstilling av IL-21-proteiner.

Info

Publication number: NO334561B1
Application number: NO20053385A
Authority: NO
Inventors: Susan D Holderman; Chung Chan; Bruce L Zamost; Douglas C Covert; Hong Y Liu; Karen S De Jongh; Jeffrey D Meyer
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2005-07-12
Publication date: 2014-04-07
Also published as: ES2334127T3; AU2003302250A1; JP2006509525A; EP1573006A2; CA2507817C; IL168697A; WO2004055168A2; US20070048842A1; US7745176B2; PL209009B1; WO2004055168A3; US20070048798A1; JP4664684B2; MXPA05006117A; BR0317243A; KR20050090393A; EP1573006B1; RU2005117338A; US20060134754A1; DE60330044D1

Abstract

Ekspresjonsvektorene og fremgangsmåtene som benytter et E.coli-uttrykkingssystem for storskalaproduksjon av IL-21 er beskrevet. Vektorene benytter den IL-21-kodende sekvensen med spesifikke endringer i nukleotider for å optimalisere kodons og mRNA-sekundærstrukturfortranslateringi E.coli. Ved å benytte ekspresjonsvektorene ble IL-21-genet produsert i E.coli til et nivå på større enn I g/l i tilsatt ladningsfermentering. Også inkludert er OmpTmanglende E.coli-stamme fransformert med en IL-21 -ekspresj onsvektor.

Description

Beskrivelse

[0001] Den økte tilgjengeligheten og identifiseringen av gener fra humane og andre

genomer har ført til et økt behov for effektiv ekspresjon og rensing av rekombinante proteiner. Ekspresjonen av proteiner i bakterier er den mest benyttede tilnærmingen for produksjonen av klonede gener. Av mange grunner er ekspresjon i bakterier foretrukket i forhold til ekspresjon i eukaryote celler. For eksempel er det mye enklere å dyrke bakterier enn eukaryote celler. Mer spesifikt gjør tilgjengeligheten av en stor mengde sofistikerte molekylærgenetiske verktøy og tusenvis av mutante E. coli, som en ekspresj onsvert, ekstremt nyttig for proteinproduksjon. Likevel har høynivåproduksjonen av funksjonelle proteiner i E. coli, spesielt de som stammer fira eukaryote kilder, ofte vært vanskelige.

[0002] IL-21 (tidligere betegnet zalphall 1-ligand) er et medlem av IL-2-familien av cytokiner som også inkluderer IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 og IL-15. Proteiner i denne familien har blitt vist å ha både antikrefteffekter og antivirale effekter. IL-21 blir produsert av hjelper-T-celler, som er nøkkelregulatorer av immunitet. Basert på ekspresj onsmønstre av dens tilhørende reseptor og administrering av proteinet, har det blitt vist at IL-21 aktiverer CD8<+->dreper-T-celler og naturlige dreper(NK)celler, som er to klasser av lymfocytter som utrydder tumorer og virusinfiserte celler. IL-21 stimulerer også utvalgte klasser av B-celler (Parrish et al., Nature 408:57-63, 2000).

[0003] Rekombinant IL-21 har blitt produsert i prokaryote celler, spesielt i E. coli. Det resulterende bakterielt produserte proteinet er ikke glykosylert og blir produsert i en aggregert tilstand. Produksjon av IL-21 fira E. coli krever at de aggregerte proteinene blir løseliggjort fira de uløselige inklusjons legemene og renaturert eller refoldet. Uten renaturering vil den spesifikke aktiviteten til det rekombinante proteinet være signifikant redusert.

[0004] På tross av fremganger i ekspresjonen av rekombinante proteiner i bakterielle verter, foreligger det et behov for forbedrede fremgangsmåter for å produsere biologisk aktive og rensede rekombinante IL-21-proteiner i prokaryote systemer som fører til høyere utbytter for proteinproduksjon. Disse og andre aspekter ifølge oppfinnelsen vil være åpenbare ved referanse til den følgende detaljerte beskrivelsen.

[0005] US 6.307.024 beskriver zalphal 1 ligand polynukleotid og polypeptidmolekyler, og relaterte metoder og bruksområder.

[0006] Kane J. F., Current Opinion in Biotechnology, Vol. 6, Nr. 5, oktober 1995, side 494-500, beskriver virkningene av sjeldne kodon-klynger på høyt nivå for ekspresjon av heterologe proteiner i E. coli.

[0007] Weir M. P. et al., Biochemical Journal, Vol. 245, Nr. 1, 1. juli 1987, side 85-91, beskriver rensing og renaturering av rekombinant humant IL-2.

[0008] Asano R. et al., FEBS Letters, Vol. 528, Nr. 1-3,25. september 2002, side 70-76, beskriver anti-tumor aktiviteten av IL-21 framstilt ved en re-foldingsprosedyre fra inklusjonslegemer uttrykt i E. coli.

[0009] Foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en ekspresjonsvektor for fremstilling av IL-21-protein omfattende de følgende opererbart bundne elementer:

(a) et prokaryot replikasjonsorigo,

(b) et transkripsjonsinitierings-DNA-element,

(c) en polynukleotidsekvens som vist i SEKV. ID. NR.: 27, og (d) en transkripsjonsterminator.

[00010] Oppfinnelsen tilveiebringer en metode for å produsere IL-2 protein som definert i kravene.

[00011] I ett aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor for å produsere IL-21-proteiner som omfatter de opererbart bundne elementene av et prokaryot replikasjonsorigo, et transkripsjonsinitierings-DNA-element og polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 27 og en transkripsjonsterminator. I et annet aspekt er ekspresjonsvektoren vektoren pTAP337. Ytterligere utførelsesformer tilveiebringer ekspresjonsvektoren som kan inkludere en selekterbar markør.

[00012] I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse prokaryote vertsceller transformert med ekspresjonsvektorene beskrevet som å omfatte SEQ ID NO: 27 eller vektor pTAP337.1 andre utførelsesformer er vertsstammen E. co/z-stamme W3110 eller stammen zGOLDl, deponert hos the American Type Culture Collection i Manassas, VA.

[00013] I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter (som definert i kravene) for å fremstille IL-21-proteiner ved betingelser der IL-21-proteiner blir uttrykt. I en utførelsesform omfatter fremgangsmåten å dyrke en vertscelle som uttrykker IL-21 etter å ha blitt transformert med pTAP337. Fremgangsmåten omfatter å dyrke en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter SEQ ID NO: 27. Fremgangsmåten omfatter også å gjenvinne vertscellene fra vekstmediet, og deretter isolere IL-21-proteinet fra vertscellene.

[00014] I andre aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter (som definert i kravene) for å fremstille IL-21 som omfatter trinnene som beskrevet ovenfor, i en påfylt ladningsfermenteringsprosess eller en ladningsfermenteringsprosess.

[00015] I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter (som definert i kravene) for å fremstille et IL-21-protein som omfatter å dyrke en vertscelle som beskrevet ovenfor i en risteflaske til en OD600 på 5 til 20 i et vekstmedium, inokulere en fermenteringsbeholder med 1 til 12 volum% med risteflaskemedium inneholdende vertsceller, dyrke vertscellene i et vekstmedium ved en pH på 6,2 til 7,2, der en tilsetningsløsning blir tilsatt til fermenteringsbeholderen før 15 timer er passert av fermenteringstiden (EFT), tilsette et induserende middel til fermenteringsbeholderen ved 20 til 30 timer EFT og dyrke vertscellene ved 48 til 56 timer EFT. I en utførelsesform er det induserende midlet isopropyltiogalaktopyranosid (IPTG) ved 0,5 til 2 mM. I en annen utførelsesform omfatter tilsetnings- løsningen et karbohydrat som er valgt fra gruppen som består av glyserol og glukose og tilsetningen er 5 til 15 gram karbohydrat per time. I en annen utførelsesform er glyserolen i tilsetningsløsningen 40 til 70 volum% glyserol eller glukosen er 40 til 70 % vekt/vol glukose. I ytterligere utførelsesformer er glyserolen omtrent 70 volum% eller glukosen er omtrent 60 % vekt/vol.

[00016] I ett aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å fremstille IL-21 omfattende å tilsette en flaske et inokulum som omfatter E. coli W3110 vertscelle som omfatter en ekspresjonsvektor som definert i kravene (f. eks. E. co/z-W3110-vertsceller som omfatter pTAP337-vektor), der et IL-21-polypeptid blir uttrykt og med vekstmedium som omfatter omtrent 5 g/liter glyserol, dyrke inokulumet i et vekstmedium i 16 til 20 timer ved omtrent 30°C, overføre det dyrkede inokulum i vekstmedium til en ladningsfermentor ved en konsentrasjon på 0,5 til 5 volum% inokulum, fermentere ladningsfermenteringen ved omtrent 37°C og omtrent pH 6,8 med omtrent 2 % glyserol, innføre en glukosetilsetning ved omtrent 8 timer EFT på omtrent 9,5 g glukose/liter/time og fortsette inntil slutten på en fermenterings-runde, tilsette IPTG ved omtrent 24 timer EFT til sluttkonsentrasjonen på 0,5 til 2 mM, fermentere omtrent 28 timer med IPTG, høste fermenteringsbuljong fra fermentoren, tilsette et likt volum med vann til fermenteringsbuljongen og homogenisere og sentrifugere for å samle en cellepellett eller cellevelling som omfatter IL-21-proteinmateriale.

[00017] I én utførelsesform omfatter IL-21-proteinet en sekvens av aminosyrerester som vist i SEQ ID NO: 28 og isoleringstrinnet omfatter ytterligere å separere vann-uløselig IL-21-protein fra en cellepellet eller cellevelling, løse det uløselige IL-21-materiale i et kaotropisk løsningsmiddel, fortynne det kaotropiske løsningsmidlet og refolde IL-21-proteinet og isolere IL-21-proteinet, der det isolerte IL-21-proteinet er i stand til å være biologisk aktivt. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er det isolerte IL-21-proteinet minst 90 % rent. I en annen utførelsesform er det isolerte IL-21-proteinet minst 90 % rent og har et endotoksinnivå på mindre enn 10 endotoksinenheter per mg IL-21-protein.

[00018] I én utførelsesform omfatter metoden å separere en cellepellet eller cellevelling fira fermenteringsbuljong som omfatter vannuløselig IL-21-proteinmateriale, homogenisere cellepelletten eller cellevellingen for å samle inklusjonslegemer, løse det uløselige IL-21-proteinmateriale i et kaotropisk løsningsmiddel som omfatter et guanidinsalt, fortynne det kaotropiske løsningsmidlet ved tilsetning av en refoldingsbuffer som omfatter argininsalter og en blanding av reduserende og oksiderende komponenter, isolere IL-21-proteinet ved å fjerne ufoldete og aggregerte proteiner ved hjelp av filtrering og rense det refoldede IL-21-proteinet på en kationbytterkolonne, der det isolerte og rensede IL-21 er i stand til å være biologisk aktivt.

[00019] I én utførelsesform omfatter metoden å separere en cellepellett eller cellevelling fra en fermenteringsbuljong som omfatter vannuløselig IL-21-materiale, homogenisere cellepelletten eller cellevellingen for å samle inklusjonslegemer, løse det uløselige IL-21-proteinmateriale i et kaotropisk løsningsmiddel som omfatter et guanidinsalt, fortynne det kaotropiske løsningsmiddel ved tilsetning av en refoldingsbuffer som omfatter argininsalter og en blanding av reduserende og oksiderende komponenter, isolere IL-21-proteinet ved å fjerne ufoldede og aggregerte proteiner ved hjelp av filtrering, rense det refoldede IL-21-proteinet på en kationbytterkolonne og rense IL-21-eluatet på en hydrofob interaksjons-kolonne, der det isolerte og rensede IL-21-proteinet er i stand til å være biologisk aktivt.

[00020] I én utførelsesform omfatter metoden å separere en cellepellett eller cellevelling fira en fermenteringsbuljong som omfatter vannuløselig IL-21-proteinmateriale, homogenisere cellepelletten eller cellevellingen for å samle inklusjonslegemer, løse det uløselige IL-21-proteinmaterialet i et kaotropisk løsningsmiddel som omfatter omtrent 6 M guanidinhydroklorid, 40 mM ditiotreitol (DTT) i omtrent én time ved romtemperatur, refolde de Laste inklusjonslegemene i en løsning ved å fortynne i refoldingsbuffer som omfatter omtrent 2 mM DTT, 4 mM cystin-oksidasjons-reduksjonspar minst 20 ganger, justere pH til omtrent 5,5 med omtrent 20 % eddiksyre og tillate løsningen å reagere i minst fem timer, fortynne løsningen med omtrent 1 + 1,4 volumer 25 mM acetat, pH 5,5, filtrere løsningen, sette løsningen på en Tosohaas-SP-550C-resinkolonne balansert til pH 5,5 ved å benytte natriumacetatbuffer, vaske resinkolonnen med omtrent 0,4 M natriumklorid, vaske resinkolonnen med omtrent 0,75 M natriumklorid for å eluere bundet IL-21-protein, tilsette ammoniumsulfat til en konsentrasjon på omtrent 1,5 M for å eluere og filtrere eluatløsning, sette eluatløsning på en Tosohaas-butyl-650-M-kolonne balansert til 1,5 M ammoniumsulfat, 0,05 natriumklorid i natriumacetatbuffer, fortynne eluat på en SP-Sepharose-HP-kolonne balansert med natriumacetatbuffer, vaske kolonne med 20 kolonnevolumer lineærgradient fra 0,3 til 0,7 M natriumklorid, konsentrere IL-21-proteinet og bytte buffer til formuleringsbuffer ved å benytte tangentiell-strøm-ultrafiltrering. I andre utførelsesformer omfatter fremgangsmåtene ovenfor for å isolere uløselig IL-21-protein og måle biologisk aktivitet ved å benytte en IL-21-reseptorbindingsanalyse.

[00021] Foreliggende spesifikasjon beskriver et preparat som omfatter et IL-21-protein som omfatter et polypeptid som vist i aminosyreresidier 2-163 i SEQ ID NO: 28 ved konsentrasjon på omtrent 10 mg/ml IL-21-protein i omtrent 10 mM histidin, 4,7 % mannitol ved pH 5,3.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

[00022] Figur 1 er en illustrasjon av ekspresjonsplasmidpTAP337 som inneholder den kodonoptimaliserte nukleotidsekvensen for IL-21. Betegnelsen for human zalphal 1-lig. er IL-21. Plasmidet har blitt deponert hos the American Type Culture Collection i Manassas, VA. under patentdeponeringsbetegnelse PTA-4853.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

[00023] De følgende definisjonene er tilveiebrakt for å fremme forståelsen av oppfinnelsen.

[00024] Som benyttet her refererer "nukleinsyre" eller "nukleinsyremolekyl" til poly-nukleotider, slik som deoksyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA), oligonukleotider, fragmenter som er generert av polymerasekjedereaksjonen (PCR) og fragmenter som er generert ved enhver av ligering, splitting, endonukleasevirkning og eksonuklease-virkning. Nukleinsyremolekyler kan være sammensatt av monomerer som er naturlig forekommende nukleotider (slik som DNA og RNA) eller analoger av naturlig forekommende nukleotider (f eks. a-enantiomere former av naturlig forekommende nukleotider) eller en kombinasjon av begge. Modifiserte nukleotider kan ha endringer i sukkerenheter og/eller i pyrimidin- eller purinbaseenheter. Sukkermodifiseringer inkluderer for eksempel erstatning av én eller flere hydroksylgrupper med halogener, alkylgrupper, aminer og azidogrupper eller sukkere kan bli funksjonalisert som etere eller estere. Videre kan hele sukkerenheten bli erstattet med steriske og elektroniske tilsvarende strukturer slik som aza-sukkere og karbo-sykliske sukkeranaloger. Eksempler på modifikasjoner i en baseenhet inkluderer alkylerte puriner og pyrimidiner, acylerte puriner eller pyrimidiner eller andre velkjente heterosykliske substitusjoner. Nukleinsyremonomerer kan bli bundet sammen med fosfodiesterbindinger eller analoger av slike bindinger. Analoger av fosfodiesterbindinger inkluderer fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforanilidat, fosfor-amidat og lignende. Uttrykket "nukleinsyremolekyl" inkluderer såkalte peptidnukleinsyrer, som omfatter naturlig forekommende eller modifiserte nukleinsyrebaser bundet til et poly-amidskjelett. Nukleinsyrer kan enten være enkelttrådede eller dobbelttrådede.

[00025] Uttrykket "komplement av et nukleinsyremolekyl" refererer til et nukleinsyremolekyl som har en komplementær nukleotidsekvens og revers orientering sammenlignet med en referansenukleotidsekvens.

[00026] En "enhancer" er en type regulatorisk element som kan øke effektiviteten av transkripsjon uavhengig av avstanden eller orienteringen til enhanceren relativt i forhold til startstedet for transkripsjon.

[00027] "Heterologt DNA" refererer til et DNA-molekyl eller en populasjon av DNA-molekyler som ikke eksisterer naturlig i en gitt vertscelle. DNA-molekyler som er heterologe for en spesiell vertscelle kan inneholde DNA som er avledet fira vertscelleartene (dvs. endogent DNA) så lenge dette verts-DNA er kombinert med ikke-verts-DNA (dvs. eksogent DNA). For eksempel er et DNA-molekyl som inneholder et ikke-verts-DNA-segment som koder for et polypeptid opererbart bundet til et verts-DNA-segment som omfatter en transkripsjonspromotor ansett å være et heterologt DNA-molekyl. Tilsvarende kan et heterologt DNA-molekyl omfatte et endogent gen opererbart bundet til en eksogen promotor. Som en annen illustrasjon er et DNA-molekyl som omfatter et gen som er avledet fra en villtypecelle ansett å være heterologt DNA hvis dette DNA-molekylet blir introdusert inn i en mutant celle som mangler villtypegenet.

[00028] Uttrykket "kontig" betegner et nukleinsyremolekyl som har en sammenhengende strekning av en identisk eller komplementær sekvens med et annet nukleinsyremolekyl. Sammenhengende sekvenser er sagt å "overlappe" med en gitt strekning av et nukleinsyremolekyl enten i sin helhet eller langs en spesiell strekning på nukleinsyremolekylet.

[00029] "Komplementært DNA (cDNA)" er et enkelttrådet DNA-molekyl som er dannet fra et mRNA-templat ved hjelp av enzymet reverstranskriptase. Typisk blir en primer som er komplementær til deler av mRNA benyttet til initieringen av reverstranskripsjon. Fagfolk på området benytter også uttrykket "cDNA" for å referere til et dobbelttrådet DNA-molekyl som består av et slikt enkelttrådet DNA-molekyl og dens komplementære DNA-tråd. Uttrykket "cDNA" refererer også til en klon av et cDNA-molekyl som er syntetisert fra et RNA-templat.

[00030] Et "isolert nukleinsyremolekyl" er et nukleinsyremolekyl som ikke er integrert i det genomiske DNA til en organisme. For eksempel er et DNA-molekyl som koder for en vekstfaktor som har blitt separert fra det genomiske DNA i en celle et isolert DNA-molekyl. Et annet eksempel på et isolert nukleinsyremolekyl er et kjemisk syntetisert nukleinsyremolekyl som ikke er integrert i genomet til en organisme. Et nukleinsyremolekyl som har blitt isolert fra en spesiell art er mindre enn det fullstendige DNA-molekylet fira et kromosom fra denne arten.

[00031] "Lineært DNA" betegner ikke-sirkulære DNA-molekyler med frie 5' og 3' ender. Lineært DNA kan bli fremstilt fra lukkede sirkulære DNA-molekyler, slik som plasmider, ved hjelp av enzymatisk fordøying eller fysisk ødelegging.

[00032] En "promotor" er en nukleotidsekvens som styrer transkripsjonen til et strukturelt gen. Typisk er en promotor lokalisert i den 5' ikke-kodende regionen til et gen, proksimalt i forhold til det transkripsjonene startsetet til et strukturelt gen. Sekvenselementer som ligger innenfor promotorer som virker ved initieringen av transkripsjon blir oftekarakterisert vedkonsensusnukleotidsekvenser. Disse promotorene inkluderer for eksempel, men er ikke begrenset til, IPTG-induserbare promotorer, bakteriofag-T7-promotorer og bakteriofag A,pL. Se Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001. En typisk promotor vil bestå av tre komponenter som består av konsensussekvenser ved -35 og -10 med en sekvens på mellom 16 og 19 nukleotider mellom dem (Lisset, S. og Margalit, FL, Nucleic Acids Res. 21: 1512, 1993). Promotorer av denne type inkluderer lac-, trp-, trp-lac (tac) og trp-lac(trc)-promotorer. Hvis en promotor er en induserbar promotor, øker transkripsjonshastigheten som en respons på et induserende middel. I motsetning til dette er ikke transkripsjonshastigheten regulert av et induserende middel hvis promotoren er en konstitutiv promotor. Promotorer som kan undertrykkes er også kjent.

[00033] En "kjernepromotor" inneholder essensielle nukleotidsekvenser for promotor-funksjon, inkludert starten for transkripsjon. Etter denne definisjonen kan en kjernepromotor ha påvisbar aktivitet, men må ikke ha påvisbar aktivitet i fravær av spesifikke sekvenser som kan øke aktiviteten eller overføre vevspesifikk aktivitet.

[00034] Et "regulatorisk element" er en nukleotidsekvens som modulerer aktiviteten til en kjernepromotor. For eksempel kan et eukaryot regulatorisk element inneholde en nukleotidsekvens som binder til cellulære faktorer og som muliggjør transkripsjon eksklusivt eller foretrukket i spesielle celler, vev eller organeller. Disse typene av regulatoriske elementer er normalt assosiert med gener som blir uttrykt på en "cellespesifikk", "vevspesifikk" eller "organellespesifikk" måte. Bakterielle promotorer har regulatoriske elementer som binder og modulerer aktiviteten til kjernepromotoren, slik som operatorsekvenser som binder aktivator-eller repressormolekyler.

[00035] En "kloningsvektor" er et nukleinsyremolekyl slik som et plasmid, kosmid eller bakteriofag, som har evnen til å replikere autonomt i en vertscelle. Kloningsvektorer inneholder typisk ett eller et lite antall av restriksjonsendonukleasegjenkjenningsseter som muliggjør innsetningen av et nukleinsyremolekyl på en forhåndsbestemt måte uten tap av en essensiell biologisk funksjon for vektoren, i tillegg til nukleotidsekvenser som koder for et markørgen som er hensiktsmessig for anvendelse ved identifisering og seleksjon av celler som er transformert med kloningsvektoren. Markørgener inkluderer typisk gener som tilveiebringer resistens for antibiotika.

[00036] En "ekspresjonsvektor" er et nukleinsyremolekyl som koder for et gen som blir uttrykt i en vertscelle. Typisk omfatter en ekspresjonsvektor en transkripsjonen promotor, et gen, et replikasjonsorigo, en selekterbar markør og en transkripsjonen terminator. Genekspresjon blir vanligvis satt under kontrollen av en promotor og et slikt gen er sagt å være "opererbart bundet" til promotoren. Likeledes er et regulatorisk element og en kjernepromotor opererbart bundet hvis det regulatoriske elementet modulerer aktiviteten til kjernepromotoren. En ekspresjonsvektor kan også være kjent som en ekspresjonskonstruksjon.

[00037] En "rekombinant vert" er en celle som inneholder et heterologt nukleinsyremolekyl, slik som en kloningsvektor eller ekspresjonsvektor.

[00038] Uttrykket "ekspresjon" refererer til biosyntesen av et genprodukt. For eksempel, i tilfellet med et strukturelt gen, involverer ekspresjon transkripsjon av det strukturelle genet til mRNA og translasjonen av mRNA til ett eller flere polypeptider.

[00039] Uttrykket "sekretorisk signalsekvens" betegner en DNA-sekvens som koder for et peptid (et "sekretorisk peptid") som, som en komponent av et større polypeptid, styrer det større polypeptidet gjennom en sekretorisk rute i en celle i hvilken den blir syntetisert. Det større polypeptidet blir vanligvis kløyvd for å fjerne det sekretoriske peptidet i løpet av forflytningen gjennom den sekretoriske ruten.

[00040] Et "polypeptid" er en polymer av aminosyreresidier som er bundet sammen ved hjelp av polypeptidbindinger, og som enten er produsert naturlig eller syntetisk. Polypeptider på mindre enn omtrent 10 aminosyreresidier blir vanligvis referert til som peptider.

[00041] Et "protein" er et makromolekyl som omfatter én eller flere polypeptidkjeder. Et protein kan også omfatte ikke-peptidkomponenter slik som karbohydratgrupper. Karbohydrater og andre ikke-peptidsubstituenter kan bli tilsatt til et protein. Proteinet blir her definert i egenskap av deres aminosyreryggradstrukturer, substituenter slik som karbohydratgrupper og ikke-peptidgrupper blir generelt ikke spesifisert, men kan være til stede likevel.

[00042] Et peptid eller polypeptid som er kodet for av et DNA-molekyl som ikke stammer fra verten er et "heterologt peptid" eller polypeptid.

[00043] Et "isolert polypeptid" er et polypeptid som er vesentlig fritt for forurensende cellulære komponenter, slik som karbohydrat, lipid eller andre proteinholdige urenheter som er assosiert med polypeptid i naturen. Typisk inneholder et preparat av et isolert polypeptid polypeptidet i en godt renset form, dvs. minst omtrent 80 % rent, minst omtrent 90 % rent, minst omtrent 95 % rent, mer enn 95 % rent eller mer enn 99 % rent. Én måte å vise at et spesielt proteinpreparat inneholder et isolert polypeptid er ved fremkomsten av et enkelt bånd som en følge av natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgelelektroforese av protein-preparatet og Coomassie Brilliant Blue farging av gelen. Likevel ekskluderer ikke uttrykket isolert tilstedeværelse av det samme polypeptidet i alternative fysiske former, slik som dimerer eller alternativt glykosylerte eller derivatiserte former.

[00044] Uttrykkene "aminoterminal" eller "N-terminal" og "karboksylterminal" eller "C-terminal" blir benyttet her for å betegne posisjoner på polypeptider. Der konteksten tillater det, blir disse uttrykkene benyttet med referanse til en spesiell sekvens eller del av et polypeptid for å betegne nærliggenhet eller relativ posisjon. For eksempel er en viss sekvens som er posisjonert karboksylterminalt i forhold til en referansesekvens på et polypeptid lokalisert proksimalt i forhold til karboksylterminalen til referansesekvensen, men er ikke nødvendigvis på karboksylterminalen til det fullstendige polypeptidet.

[00045] Et "fusjonsprotein" er et hybridprotein som blir uttrykt av et nukleinsyremolekyl som omfatter nukleotidsekvenser med minst to gener.

[00046] Uttrykket "affinitetsmerke" blir her benyttet til å betegne et polypeptidsegment som kan bli koplet til et annet polypeptid for å tilveiebringe rensing eller påvisning av det andre polypeptidet eller tilveiebringe seter for påkopling av det andre polypeptidet til et substrat. I prinsippet kan ethvert peptid eller protein for hvilke et antistoff eller andre spesifikke bindingsmidler er tilgjengelige blir benyttet som affinitetsmerker. Affinitetsmerker inkluderer en polyhistidinenhet, protein-A (Nilsson et al, EMBO J. 4:1075 (1985), Nilsson et al, Methods Enzymol. 198:3 (1991)) glutation-S-transferase (Smith og Johnson, Gene 67:31

(1988)), Glu-Glu-affinitetsmerke (Grussenmeyer et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:7952

(1985)), substans-P, FLAG-peptid (Hopp et al, Biotechnology 6:1204 (1988)), streptavidinbindende peptid eller andre antigene epitop- eller bindingsdomener. Se generelt Ford et al, Protein Expression and Purification 2:95 (1991). DNA-molekyler som koder for affinitetsmerker er tilgjengelige fra kommersielle kilder (f. eks. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

[00047] Uttrykket "isoton" blir her benyttet i sin konvensjonelle betydning, det betyr en tonisitet som er lik den for blod, ekvivalent med en 0,9 % løsning av NaCl. En isoton mengde av et salt er den mengden som er nødvendig for å gjøre en løsning isoton eller for å lage en isoton løsning ved rekonstitusjon av et lyofilisert preparat.

[00048] Konsentrasjoner blir her spesifisert i enheter av molaritet eller % vekt/vol. av flytende preparater. Når preparatet foreligger i formen av et lyofilisert pulver vil konsentrasjonene av de respektive komponentene være slik at de tilveiebringer den spesifiserte konsentrasjonen ved rekonstitusjon av pulveret.

[00049] På grunn av unøyaktigheten til analytiske standardfremgangsmåter er det slik at molekylærvekter og lengder av polymerer skal forstås å være omtrentlige verdier. Når en slik verdi blir uttrykt som "omtrent" X eller "ca." X skal den gitte verdien av X bli forstått å være nøyaktig til ± 10%.

EKSPRESJON AV REKOMBINANT IL-21

[00050] Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer ekspresjonsvektorer og fremgangsmåter for fremstilling av rekombinant IL-21-protein fra en prokaryot vert. IL-21 ble tidligere betegnet zalphal 1-ligand og er fullt ut beskrevet i US patentskrift nr. 6 307 024. Spesielt omfatter ekspresjonsvektorene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse et is. co/z-ekspresjonssystem for storskalafremstillingen av IL-21 ved å benytte den IL-21-kodende sekvensen med spesifikke endringer i nukleotider for å optimalisere kodoner og mRNA-sekundærstruktur for translasjon i E. coli. Ved å benytte ekspresjonsvektorene og fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse ble IL-21-genet fremstilt i E. coli til et nivå større enn 1 g per liter i påfylt ladningsfermentering. Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse fant at anvendelsen av den OmpT-proteasemanglende E. co/z-stammen UT5600 som en produksjons-vert overvant stabilitetsproblemer med IL-2 Imet. IL-2 Imet er den IL-21-kodende sekvensen med et kodon som koder for en N-terminal Met tilsatt på den 5' enden av polynukelotid-sekvensen. Anvendelsen av ekspresjonsvektorene som er beskrevet her forbedret signifikant utbytte av rekombinant protein som ble gjenvunnet fra bakterier. Anvendelse av denne produksjonsvertsstammen ga over 50 mg per liter IL-2 Imet-inklusjonslegemer fra risteflaskekultur. I en annen utførelsesform, for å fremme utviklingen av tilført ladningsfermentering med høy celletetthet ble en annen E. co/z-stamme, W3110, valgt som en vert for storskalaproduksjon av IL-21. Denne vertsstammen er ikke-patogen og kan vokse til høy celletetthet i minimalt definert fermenteringsmedium. Produktiviteten av IL-2 Imet i E. co/z-stamme W3110 var sammenlignbar med den som ble oppnådd i E. co/z-stamme UT5600 når den ble dyrket i risteflaske- og ladningsfermenteringer.

[00051] Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å gjenvinne rekombinant IL-21-protein fra en prokaryot vert når IL-21-proteinet ble uttrykt av verten og funnet i vertscellen som et ikke-glykosylert, uløselig inklusjonslegeme. Når den prokaryote cellen blir lysert for å isolere inklusjonslegemene (også kalt refraktile legemer) er inklusjonslegemene aggregater av IL-21. Derfor må inklusjonslegemene bli disassosiert og løst for å isolere IL-21-proteinet, og generelt fordrer dette anvendelsen av et denaturerende kaotropisk løsningsmiddel, noe som fører til gjenvinning av et polypeptid som må bli refoldet for å få signifikant biologisk aktivitet. Med en gang IL-21-proteinet er refoldet må proteinet bli innfanget og renset. Dermed tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å isolere uløselig IL-21-protein fra prokaryote celler, løse det uløselige IL-21-proteinmateriale i et kaotropisk løsningsmiddel, fortynne det kaotropiske løsningsmidlet på en slik måte at IL-21-proteinet blir refoldet og isolert. Foreliggende oppfinnelse inkluderer også fremgangsmåter for innfanging av det renaturerte IL-21 fra den fortynnede refoldingsbufferen ved å benytte kationbytterkromatografi og rense det refoldete IL-21-proteinet ved å benytte hydrofob interaksjonskromatografi. Ytterligere rensing ble oppnådd ved å benytte anionbytter i bindings analyser ved å benytte en IL-21-reseptor og lignende.

[00052] Det humane IL-21-genet koder for et polypeptid på 162 aminosyrer. Fullengde-sekvensen inkluderer et signalpeptid på 29 aminosyrer, som vist i SEQ ID NO: 1 og 2, og et modent protein på 133 aminosyrer som omfatter residiet 30 (Gin) til residiet 162 (Ser). IL-21-sekvensen, som uttrykt ved å benytte et prokaryot ekspresjonssystem, har en N-terminal Met og nukleotidet og tilsvarende aminosyresekvenser er vist i SEQ ID NO: 27 og 28. Nukleotidsekvensen i SEQ ID NO: 27 viser en kodonoptimalisert sekvens som faller innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

[00053] Fremstilling av rekombinant human IL-21 ved hjelp av et pattedyrekspresjonssystem ga omtrent 20 mg pr. liter protein. Derfor var et mer kostnadseffektivt ekspresjonssystem ønskelig for storskalaproduksjon av IL-21. E. co/z-systemet ble funnet å være et bedre alternativ for storskalaproduksjon. Ett potensielt Asn-bundet glykosyleringssete foreligger men er ikke okkupert i protein som er uttrykt i en CHO-cellelinje ved å benytte et pattedyrekspresjonssystem eller i insektceller ved å benytte et bakuloviralt ekspresjonssystem. Denne strukturelle egenskapen gjør IL-21 til en god kandidat for en prokaryot ekspresjon. Ekspresjon i E. coli gir mange fordeler i forhold til andre ekspresjonssystemer, spesielt lave utviklingskostnader og høye produksjonsutbytter.

[00054] Rekombinant IL-21 med en N-terminal residie (IL-2Imet) uttrykt i E. coli ble isolert som uløselige inklusjonslegemer etter celleknusing. Dette materialet var ukorrekt foldet og hadde ikke den ønskelige biologiske aktiviteten. I de fleste tilfeller måtte inklusjonslegemer bli løseliggjort i denaturerende kaotropisk løsningsmiddel og proteinet refoldet ved fortynning av det kaotropiske midlet etterfulgt av rensing. Proteinet varierer en stor del med hensyn til deres optimale refoldingsmiljø. Faktorer som kan påvirke gjenvinningen av riktig foldet og biologisk aktivt materiale inkluderer: utgangsproteinkonsentrasjon, oksidativ tilstand, pH, eksipienser, salter, detergenter, temperatur, måten refoldingsbufferen blir tilsatt og lignende. Et protein med sekvens- og struktursimilaritet med IL-21, IL-2, har blitt uttrykt i E. coli-systemet og refoldet vellykket (Weir et al., J. Biochem. 245:85, 1987). Aldesleukin, som er et rekombinant mutein av human IL-2 har blitt uttrykt som inklusjonslegemer i E. co/z-systemet og har blitt refoldet in vitro.

[00055] Undersøkelse av kodonet benyttet i det humane IL-21 cDNA indikerte at det inneholdt et overskudd av de minst vanlig benyttede kodoner i E. coli. Gener som har et høyt innhold av sjeldent benyttede kodoner har en tendens til å bli uttrykt i et lavt nivå i E. coli

(Kane, Curr Opin Biotechnol. 6(5):494-500, 1995). En ytterligere bekymring i forhold til ekspresjonen av human IL-21 i E. coli var forekomsten av fire potensielle OmpT-kløyvings-seter lokalisert i IL-21-sekvensen. OmpT er en endopeptidase som spesifikt kløyer mellom to påfølgende basiske residier og enzymet er aktivt ved denaturerende betingelser slik som 8 M urea og 6 M guanidin-HCl (White et al., J Biol Chem. 270(22): 12990-4,1995, Dekker et al., Biochemistry, 40(6): 1694-601,2001). Dette vekker bekymring for stabiliteten av IL-21 i et celleekstrakt fira E. coli som skyldes den proteolytiske aktiviteten til OmpT.

[00056] Flere laboratorier har vist at ekspresj onsnivået av proteiner hvis gener inneholder sjeldne kodoner kan bli dramatisk forbedret når nivået av visse sjeldne tRNA-er blir økt i verten (Zdanosky et al., Appl Environ Microbiol. 66(8): 3166-73, 2000, Calderone et al., J Mol Biol. 262(4):407-12, Kleber-Janke et al., Protein Expr Purif. 19(3):419-24, 2000, You et al., Biotechniques. 27(5):950-4, 1999). pRARE-plasmidet koder for gener for tRNA-er som er sjeldne i E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX og GlyT) med deres native promotorer (Novy et al., InNovations, 12:2-3, 2001). Ekspresjon sammen medpRARE forbedret IL-21met-produksjonen i E. coli med omtrent 5 til 10 ganger. Ekspresjon sammen med pRARE økte også nivået av trunkert IL-2 Imet i E. co/z-cellelysat, noe som tyder på at resyntetisering av IL-21met-genet med mer hensiktsmessige kodoner kan være fordelaktig.

[00057] Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ekspresjonsvektor som omfatter den kodende sekvensen til IL-21 med kodoner som er optimalisert for translasjon i E. coli. Det syntetiske genet som koder for IL-2 Imet ble fremskaffet ved hjelp av overlappende PCR. Det endelige PCR-produktet ble introdusert inn i en ekspresjonsvektor for ekspresjon under kontrollen av Tac-promotoren. Likevel var ekspresjonen lav. En undersøkelse av den sekundære strukturen til IL-21met-cDNA avslørte en eksepsjonell stabil hårnålstruktur. Det ble mistenkt at denne hårnålsløkken var det strukturelle elementet som hindret effektiv ekspresjon fra den fullt optimaliserte sekvensen. Når hårnålstrukturen ble eliminert ved å erstatte de første 80 basene i den optimaliserte sekvensen med sekvensen som er vist i SEQ ID NO: 1. Den hybride IL-21 er vist i SEQ ID NO: 27 og det resulterende genet ble uttrykt i E. coli ved høye nivåer. Ekspresj onsnivåer med den nye ekspresj onskonstruksjonen økte til omtrent 20 % av totalt celleprotein eller 100 mg per liter.

[00058] Ekspresjonsvektorer som er passende for produksjon av et ønskelig protein i prokaryote celler omfatter typisk (1) prokaryote DNA-elementer som koder for en bakteriell origo for opprettholdelsen av ekspresjonsvektoren i en bakterievert, (2) DNA-elementer som kontrollerer initiering av transkripsjon, slik som en promotor, (3) DNA-elementer som kontrollerer prosesseringen av transkriptet, slik som en transkripsjonen terminator og (4) et gen som koder for en selekterbar markør, slik som antibiotikaresistens. Den prokaryote vertscellen produserer IL-21 ved introduksjon av en ekspresjonsvektor og tilsetning av en hensiktsmessig inducer. I overensstemmelse med dette gjelder foreliggende oppfinnelse ekspresjonsvektorer som omfatter en promotor, den IL-21-optimaliserte nukleotidsekvensen og en terminatorsekvens. Eksempler på en optimalisert IL-21-nukleotidsekvens er vist i SEQ ID NO: 27.1 en annen utførelsesform omfatter ekspresjonsvektoren ytterligere en selekterbar markør. I én utførelsesform er den selekterbare markøren kanamycinresistens.

[00059] Ekspresjonsvektorer kan også omfatte nukleotidsekvenser som koder for et peptid-merke for å hjelpe til i rensing av det ønskede proteinet. Peptidmerker som er nyttige for å isolere rekombinante polypeptider inkluderer f. eks. polyHistidinmerker (som har en affinitet for nikkelchelaterende resin), c.myc-merker, kalmodulinbindende protein (isolert med kalmodulinaffinitetskromatografi), substans-P, RYIRS-merke (som binder med anti-RYIRS-antistoffer), Glu-Glu-merke og FLAG-merke (som binder med anti-FLAG-antistoffer). Se for eksempel Luo et al, Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti et al, Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996) og Zheng et al, Gene 186:55 (1997). Nukleinsyremolekyler som koder for slike peptidmerker er tilgjengelige, for eksempel fra Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO).

[00060] En fagperson på området vil være kjent med en mengde molekylære teknikker for fremstillingen av ekspresjonsvektoren. For eksempel kan IL-21-polynukelotidet bli fremstilt ved å syntetisere nukleinsyremolekyler ved å benytte lange oligonukleotidprimere og nukleotidsekvensene som er beskrevet her (se f. eks. Ausubel (1995) på sidene 8-8 til 8-9). Etablerte teknikker som benytter polymerasekjedereaksjonen tilveiebringer evnen til å syntetisere DNA-molekyler som er minst to kilobaser i lengde (Adang et al, Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al, PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al, Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes, in Methods in Molecular Biology, Vol. 15. PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (utg.) sidene 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), og Holowachuk et al, PCR Methods Appl. 4:299 (1995)).

[00061] En annen fremgangsmåte for å konstruere ekspresjonssystemer benytter homolog rekombinasjon ved å benytte et gjærsystem. Se US patentskrift nr. 6 207 442, Plasmid Construction by Homologous Recombination. Systemet tilveiebringer et universelt akseptorplasmid som kan bli benyttet for å klone et DNA som koder for ethvert polypeptid av interesse, inkludert polypeptidfusjoner. Systemet tilveiebringer fremgangsmåter for å fremstille dobbelttrådede, sirkulære DNA-molekyler som omfatter en region som koder for et protein av interesse. Ett eller flere donor-DNA-fragmenter som koder for proteinet av interesse, dvs. IL-21, blir kombinert med et akseptorplasmid, en første DNA-linker og en andre DNA-linker i en Saccharomyces cerevisiae- vertscelle, hvorved donor-DNA-fragmentet blir sammenføyd med akseptorplasmidet ved hjelp av homolog rekombinasjon av donor-DNA, akseptorplasmidet og linkerne for å danne det lukkede sirkulære plasmidet.

[00062] Nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli syntetisert ved hjelp av genmaskiner ved å benytte protokoller slik som fosforoamidittfremgangsmåten. Hvis kjemisk syntetisert dobbelttrådet DNA er nødvendig for en applikasjon, slik som syntesen av et gen eller et genfragment, da blir hver komplementære tråd fremstilt separat. Fremstillingen av korte gener (60 til 80 basepar) er teknisk rett fram og kan bli oppnådd ved å syntetisere de komplementære trådene og deretter anneale dem. For fremstilling av lengre gener (> 300 basepar) er likevel spesielle strategier å foretrekke, fordi koplingseffektiviteten i hver syklus i løpet av kjemisk DNA-syntese sjelden er 100 %. For å overvinne dette problemet blir syntetiske gener (dobbeltrådete) satt sammen i modulær form fra enkelttrådete fragmenter som er fra 20 til 100 nukleotider i lengde. For gjennomganger av polynukelotidsyntese, se f. eks. Glick og Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al, Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984)m og Climie et al, Proe. Nat'l Acad. Sei. USA 87:633 (1990).

[00063] Eksempel på alternative teknikker som kan benyttes for å fremstille IL-21-genet og ekspresjonsvektorer inkluderer for eksempel restriksjonsendonukleasefordøying og ligering og polymerasekjedereaksjon, der alle disse er velkjente på fagområdet.

[00064] Et bredt utvalg av selekterbare markørgener er tilgjengelige (se for eksempel Kaufman, Meth. Enzymol. 185-487 (1990), Kaufman, Meth. Enzymol. 185:537 (1990)). Det er vanlig at ekspresjonsvektorer omfatter seleksjonsmarkører slik som tetrasyklinresistens, amplicillinresistens, kanamycinresistens, neomycinresistens eller kloramfenikolresistens. En selekterbar markør vil tillate seleksjon og/eller påvisning av celler som har blitt transformert med ekspresjonsvektor fra celler som ikke har blitt transformert. En ekspresjonsvektor kan bære mer enn ett slikt antibiotikaresistens gen. Et eksempel på en selekterbar markør uten antibiotikaresistens benytter hok/ sok- systemet fra plasmid-Rl. Hok- genet koder for det toksiske Hok-proteinet på 52 aminosyrer og soÆ-genet koder for en antisens-RNA som er komplementær til Ao^-mRNA-ledersekvensen. Denne selekterbare markøren er kjent for fagfolk på området og er beskrevet i mer detalj av Gerdes, K. et al., Genetic Engineering, 19:49-61,1997.

[00065] Et bredt utvalg av passende rekombinante vertsceller er omfattet av foreliggende oppfinnelse og inkluderer, men er ikke begrenset til, gram-negative prokaryote verts-organismer. Passende stammer av E. coli inkluderer W3110, Kl 2-avledete stammer MM294, TG-1, JM-107, BL21 og UT5600. Andre hensiktsmessige stammer inkluderer: BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH1IS, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER1647, E. coli- YLU, E. coli- YLU RV308, E. coli- YLU C600, E. cø/zHB101, E. coli- YLU C600 R.sub.k-M.sub.k-, E. coli K12 RR1 (se for eksempel Brown (utg.) Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Andre gram-negative prokaryote verter kan inkludere Serratia, Pseudomonas, Caulobacter. Prokaryote verter kan inkludere gram-positive organismer slik som Bacillus, for eksempel B. subtilis og B. thuringienesis, og B. thuringienesis var. israelensis, i tillegg til Streptomyces, for eksempel S. lividans, S. ambofaciens, S. fradiae og S. griseofuscus. Passende stammer sv Bacillus subtilus inkluderer BR151, YB886, Mil 19, MI 120 og Bl70 (se for eksempel Hardy, Bacillus Cloning Methods, i DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (utg.) (IRL Press 1985)). Standard-teknikker for å fremføre vektorer i prokaryote verter er velkjente for fagfolk på området (se for eksempel, Ausubel et al (utg.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995), Wu et al, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)). For en oversikt over proteasemanglende stammer i prokaryoter, se Meerman et al., Biotechnology 12:1107-1110, 1994. Foreliggende oppfinnelse er eksemplifisert ved å benytte W3110-stammen, som har blitt deponert hos the American Type Culture Collection (ATCC) som ATCC # 27325.

[00066] Teknikker for manipulering av klonede DNA-molekyler og introdusering av eksogent DNA inn i en mengde vertsceller er tilkjennegitt av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, og Ausubel et al., utg. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley og Sons, Inc. NY, 1987. Transformerte eller transfekterte vertsceller blir dyrket i henhold til konvensjonelle prosedyrer i et kulturmedium inneholdende næringsmidler og andre komponenter som er nødvendige for veksten av de valgte vertscellene. En mengde passende medier, inkludert definert medium og komplekst medium, er kjent på fagområdet og inkluderer generelt en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer og mineraler. Medium kan også inneholde slike komponenter som vekstfaktorer eller serum, etter behov. Vekstmediet vil generelt selektere for celler inneholdende det eksogent tilsatte DNA ved for eksempel legemiddelseleksjon eller mangel i et essensielt næringsmiddel som ble komplimentert ved den selekterbare markøren som er båret av ekspresjonsvektoren eller kotransfektert inn i vertscellen. Flytende kulturer blir tilveiebrakt ved tilstrekkelig lufting ved hjelp av konvensjonelle måter, slik som risting av små flasker eller gjennombobling av fermentorer. Transformerte celler kan bli selektert og videreført for å tilveiebringe rekombinante vertsceller som uttrykker genet av interesse. IL-21 kan bli uttrykt i E. coli ved å benytte MBP (maltosebindende protein)-fusjonssystemet (New England Biolabs (NEB, Beverly, MA)). I dette systemet er IL-21-cDNA bundet til den 3' enden av malE-genet for å danne et MBP-IL-21-fusjonsprotein. Fusjonsproteinekspresjon blir drevet av tac-promotoren og er skrudd av inntil promotoren blir indusert ved tilsetning av 1 mmol IPTG (isopropyl-b-tiogalaktosylpyranosid). Konstruksjonene kan bli fremstilt som i-ramme-fusjoner med MBP i overensstemmelse med det multiple kloningssete (MCS) i pMAL-c2-vektoren (NEB) og i henhold til forhandlers spesifikasjoner.

FERMENTERING

[00067] I én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan en ladningsfermentering bli benyttet, spesielt når en storskalaproduksjon av IL-21 ved å benytte ekspresjonssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse er nødvendig. Generelt omfatter ladningsfermentering at en første stadiums utsåingsflaske blir klargjort ved å dyrke E. co/z-stammer som uttrykker IL-21 i et passende medium i en risteflaskekultur for å tillate vekst til en optisk tetthet (OD) på 5 til 20 ved 600 nm. Et passende medium vil innehold nitrogen fra en kilde/kilder slik som ammoniumsulfat, ammoniumfosfat, ammoniumklorid, gjærekstrakt, hydrolyserte dyre proteiner, hydrolyserte planteproteiner eller hydrolyserte kaseiner. Fosfat vil bli tilgjengelig fra kaliumfosfat, ammoniumfosfat, fosforsyre eller natriumfosfat. Andre komponenter vil være magnesiumklorid eller magnesiumsulfat, jernsulfat eller jernklorid og andre sporstoffer. Vekstmedium kan bli tilsatt karbohydrater, slik som fruktose, glukose, galaktose, laktose og glyserol for å bedre vekst. I visse utførelsesformer vil karbohydrattilsetninger være glyserol eller glukose tilsatt fra 1 til 20 g per liter medium. I visse utførelsesformer er glyserolen eller glukosen 5-10 g per liter. Vekst blir igangsatt ved å inokulere en risteflaske (skvalpeflaske fra 500 ml til 2000 ml) inneholdende et foretrukket vekstmedium med E. coli fra et agarmedium inneholdende antibiotika, for eksempel kanamycin ved 10 til 50 fig per ml ved den passende konsentrasjonen eller fra en frossen stokkultur. Veksten i ristefiaskene foregår ved en temperatur på mellom 28 og 40 °C. I visse utførelsesformer blir veksten i ristefiaskene utført ved 30 til 37 °C. Flaskene blir inkubert med risting satt på 200 til 300 rpm.

[00068] Fermenteringsbeholdere blir klargjort med et passende vekstmedium og sterilisert.

pH i mediet blir justert til en pH på 6,5 til 7,5.1 visse utførelsesformer er pH 6,8. 6,9, 7,0, 7,1 eller 7,2. Beholderne blir plassert under de hensiktsmessige luftings- og agitasjonsnivåene og inokulert fra en første stadiums utsåingsflaskekultur som har blitt dyrket 10 til 20 timer og har en OD på 5 til 20 ved 600 nm. Inokuleringsnivået er mellom 1 % og 12 % volum/volum (v/v). I visse utførelsesformer er inokuleringsnivået på 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % eller 10 volum%. Det oppløste oksygennivå blir opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjons-hastighet, øke nivået av gjennomlufting, gjennombobling av oksygen eller ulike kombinasjoner. Kulturen blir dyrket inntil OD 600 når 2 til 20 OD-enheter ved 600 nm. Isopropyltiogalaktopyranosid (IPTG) blir deretter tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,1 til 2,0 mM. IPTG induserer tac-promotoren til å uttrykke IL-21. Alternativt kan laktose ved 30 %-løsning bli tilsatt med 10 g per liter ved 24 timer for induksjon. Kulturen blir så tillatt å vokse i en ytterligere tid mellom 2 og 8 timer. I visse utførelsesformer blir kulturen dyrket i 3 til 4 timer.

[00069] I en annen utførelsesform blir en tilført ladningskultur benyttet for å generere et høyt utbytte av IL-21-protein. De IL-21-produserende E. co/z-stammene blir dyrket i et passende medium i risteflaskekultur for å tillate vekst til en OD på 5 til 20 ved 600 nm. Et passende medium vil inneholde nitrogen fra en kilde/kilder, slik som ammoniumssulfat, ammoniumfosfat, ammoniumklorid, gjærekstrakt, hydrolyserte dyreproteiner, hydrolyserte planteproteiner eller hydrolyserte kaseiner. Fosfat vil være tilgjengelig fra kaliumfosfat, ammoniumfosfat, fosforsyre eller natriumfosfat. Andre komponenter vil være magnesiumklorid eller magnesiumsulfat, jernsulfat eller jernklorid og andre sporstoffer. Vekstmedium kan bli tilsatt karbohydrater slik som fruktose, glukose, galaktose, laktose og glyserol for å fremme vekst. I visse utførelsesformer vil karbohydrattilsetninger være glyserol eller glukose tilsatt fra 1 til 40 g per liter medium. I en utførelsesform er glyserolen eller glukosen 5 til 10 g per liter. Vekst blir igangsatt ved å inokulere en risteflaske (skvalpeflaske fra 500 ml til 2000 ml) inneholdende et foretrukket vekstmedium med E. coli fra et agarmedium inneholdende kanamycin (10 til 50 ug per liter) eller fra en frossen stokkultur. Veksten i ristefiaskene foregår ved en temperatur på 28 til 40°C. I visse utførelsesformer er veksttemperaturen 30 til 37°C. Flaskene blir inkubert med agitasjon satt til 200 til 300 rpm.

[00070] En andrestadiumsbeholder blir klargjort med et passende vekstmedium og sterilisert. Et passende medium vil for eksempel være Super Brotn II (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ), APS-Super Broth, Luria Broth eller ZSM (se tabell 1 til 4) og kanamycin. Vekstmedium kan bli tilsatt karbohydrater for å bedre vekst. Visse utførelsesformer tilveiebringer karbohydrattilsetninger som har glyserol eller glukose tilsatt fra 1 til 40 g per liter medium. I en utførelsesform er glyserol eller glukose 5-10 g per liter. pH i mediet blir justert til en pH på 6,5 til 7,5.1 visse utførelsesformer er pH 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 eller 7,2. Beholderne blir installert ved hensiktsmessige gjennomluftings- og agitasjonsnivåer. Vekst blir igangsatt ved å inokulere beholderen fira en førstestadiumsutsåingsflaskekultur som har blitt dyrket i 10 til 20 timer og har en OD på fira 5 til 20 ved 600 nm. Inokuleringsnivået er 1 % til 12 volum%. I visse utførelsesformer vil induksjonsnivået være 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % eller 10 volum%. Det oppløste oksygennivået blir opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjons-hastighet, øke gjennomlutfingsnivå, gjennombobling i oksygen eller ulike kombinasjoner derav.

[00071] Fermenteringsbeholdere blir klargjort med et passende vekstmedium (som beskrevet ovenfor) og sterilisert. pH i mediet blir justert til en pH på mellom 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 eller 7,2.1 en utførelsesform blir mediet justert til en pH på 6,8. Vekstmedium kan bli tilsatt karbohydrater for å bedre vekst. I noen utførelsesformer er karbohydrattilsetninger glyserol eller glukose tilsatt fra 5 til 40 g per liter medium, der visse utførelsesformer har glyserol eller glukose ved 15 til 20 g per liter. Beholderne blir installert ved de hensiktsmessige gjennomluftings- og agitasjonsnivåene og inokulert fira en første-stadiumsutsåingsflaskekultur eller andrestadiumsutsåingsbeholder som har blitt dyrket i 10 til 20 timer og har en OD på 5 til 20 ved 600 nm. Inokuleringsnivået er mellom 1 % og 12 volum%. I visse utførelsesformer er inokuleringsnivået 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % eller 10 volum%. Det oppløste oksygennivået blir holdt over 20 % metning ved å øke agitasjons-hastighet, øke gjennomluftingsnivå, gjennombobling i oksygen ved de ulike kombinasjoner derav.

[00072] En karbohydratløsning blir tilsatt til fermentoren ved en på forhånd bestemt hastighet og ved å starte ved begynnelsen av fermenteringskj øringen, men generelt etter 6 timer gjennomført fermenteringstid (EFT) og ikke lenger enn 12 timer EFT. Tilsetningen blir fortsatt inntil slutten av fermenteringen. Tilsetningsløsningen kan være glyserol klargjort ved 40-70 volum% eller glukose klargjort ved 40-70 % vekt/volum (w/v). I visse utførelsesformer blir glyserol eller glukose klargjort ved 70 volum% glyserol og 60 % vekt/vol. glukose. Tilsetningshastigheter kan variere mellom 5-15 gram glukose eller glyserol per liter per time. I en utførelsesform er tilsetningshastigheten 8, 9, eller 10 g per liter per time. På et tidspunkt 20 til 30 timer EFT, for eksempel ved 24 timer, blir IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 til 2 mM. Alternativt kan laktose ved 30 % løsning bli tilsatt ved 10 g per liter ved 24 timer for induksjon. Ved et tidspunkt på 48 til 56 timer EFT blir fermenteringen høstet. Alternativt blir ytterligere 0,5 til 2 mmol per liter med IPTG tilsatt til fermentorkulturen. Fermenteringen blir deretter høstet ved 52 til 56 timer EFT.

[00073] Ved slutten av fermenteringskjøringen blir temperaturen justert nedover til 4 til 20°C og pH blir enten opprettholdt eller justert fra 5,0 til 9,0.1 visse utførelsesformer er intervallet 6,0 til 8,0 pH-enheter. Fermenteringsbuljongen blir høstet ved overtrykk i beholderen og uttak av buljongen gjennom prøveventilen. Alternativt kan buljongen bli pumpet ut gjennom en av prøveventilene. Fermenteringsbuljongen kan inneholde 10 % - 30 % vekt/vol. faste stoffer.

IL-21-GJENVINNING

[00074] Etter fermentering blir cellene høstet ved sentrifugering, resuspendert i homogeniseringsbuffer og homogenisert, for eksempel i en APV-Gaulin-homogenisator (Invensys APV, Tonawanda, New York) eller annen type av celleknusingsutstyr, slik som kulemøller eller sonikatorer. Alternativt blir cellene tatt direkte fra fermentoren og homogenisert i en APV-Gaulin-homogenisator. Alternativt kan fermenteringsbuljongen bli fortynnet med vann eller buffer i forkant av homogeniseringen.

[00075] I én utførelsesform blir cellene homogenisert direkte i fermenteringsbuljongen. For eksempel blir en APV-Gaulin-1000 eller APV-Gaulin-2000-homogenisator avkjølt til 4-15 °C i minst 30 minutter. Fermenteringsbuljongen blir sendt gjennom homogenisatoren og cellesuspensjonen blir samlet opp. Homogenisatortrykket bør bli satt til 6.000 til 14.000 psi for maksimal celleknusing. I én utførelsesform blir trykket satt til 10.000 psi. Suspensjonen blir sendt gjennom homogenisatoren fra 1-5 ganger, f. eks. for 3 passeringer. I en annen utførelsesform blir buljongen fortynnet med et likt volum med vann før homogeniseringen. Mengden av DNA kan være minsket ved tilsetningen av PEI, spermin eller benzonase i løpet av eller etter homogeniseringstrinnet.

[00076] Homogenatet blir sentrifugert og pelleten inneholdende inklusjonslegemene blir fremskaffet etter å ha dekantert supernatanten. Inklusjonslegemepelleten blir vasket i vann eller Tris-buffer med eller uten varierende nivåer av de følgende forbindelsene: natriumklorid, urea, tri ton X-100, sinkklorid, natriumlaurylsulfat, sukrose.

[00077] I en annen utførelsesform blir cellene høstet ved å overføre fermenteringsbuljongen til sentrifugeflasker og ved å sentrifugere ved 2 til 8°C i 20 til 60 minutter. For eksempel kan en Beckman J6MI-sentrifuge med KompSpin-KAJ7.100-rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) ved 7500 x G bli benyttet for å høste celler. En Beckman Avanti-JHC-sentrifuge med en Beckman-JLA-8.1 -fiksert vinkelrotor (8.000 - 15.800 x G) eller en Aries JS-5.0-Swinging-Bucket-rotor med 2,25 litersflasker ved 7500 x G kan også bli benyttet. En kontinuerlig sentrifuge slik som de som blir tilveiebrakt av Carr Separations, Inc. (Franklin, MA) eller Westfalia Separator, Inc. (Northvale, NJ) kan også bli benyttet.

[00078] Kulturbuljongen eller supernatanten blir fjernet fra sentrifugeflaskene. Celle-pellettene ble resuspendert i homogeniseringsbuffer (100 mM Tris, 5 mM ZnCb, pH 7,5) ved 10 til 30 % vekt/vol. faste stoffer. Fermenteringsbuljongen blir passert gjennom APV-Gaulin-homogenisatoren og cellesuspensjonen blir samlet opp. Homogenisatortrykket bør bli satt til 6.000-14.000 psi for maksimal celleknusing. I en utførelsesform er trykket 10.000 psi. Suspensjonen blir passert gjennom homogenisatoren i 1-5 passeringer, for eksempel 3 passeringer.

[00079] I tillegg kan fremgangsmåtene for gjenvinning av IL-21 omfatte ytterligere et trinn med presipitering, vasking og reløsning av IL-21. De vaskede inklusjonslegemene blir løseliggjort i 6 M guanidin eller 8 M urea, fortynnet 6-10 ganger i vann eller buffer, inkubert 30 minutter og sentrifugert eller filtrert. Alternativt kan ultrafiltrering eller makrofiltrering bli benyttet for å vaske inklusjonslegemer etter homogenisering. Det resulterende presipitatet blir vasket i 2-6 M urea og inneholder IL-21-proteinet. Presipitatet blir deretter vasket med vann i forkant av solubilisering. Tilsetning av Al<3+>eller Fe<3+>eller anioniske eller kationiske polymerer eller midler, slik som spermin, PEI og benzonase kan bli tilsatt for å presipitere celleavfall, løselige proteiner, DNA, RNA og karbohydrater.

SOLUBILISERING AV INKLUSJONSLEGEMER

[00080] Det vaskede inklusjonslegemepreparatet kan bli løseliggjort ved å benytte guanidinhydroklorid (5-8 M), guanidintiocyanat (5-6 M) eller urea (7-8 M) inneholdende et reduserende middel slik som betamerkaptoetanol (10-100 mM) eller ditiotreitol (5-50 mM). Løsningene kan bli klargjort i Tris, fosfat, HEPES eller annen passende buffer. Inklusjonslegemer kan også bli løseliggjort med urea (2-4 M) inneholdende natriumlaurylsulfat (0,1-2 %). Inklusjonslegemer fra 1 liter med fermenteringsbuljong kan bli løseliggjort ved å benytte 50 - 200 ml av de beskrevne løsningene. I én fremgangsmåte tilveiebringes solubilisering av inklusjonslegemepelletene fra 1 liter med fermenteringsbuljong i 150 ml med 6 M GuHCl klargjort i 100 mM Tris, pH 8,0 inneholdende 40 mM DTT. I en annen utførelsesform blir en inklusjonslegemevelling blandet med 50 til 100 ml 8 M GuHCl. Vellingen blir resuspendert ved å blande med en spatel etterfulgt av homogenisering med en Omni-EZ-homogenisator (Omni International, Warrenton, VA) eller blande med en mekanisk innretning. Suspensjonen blir blandet i 30-120 minutter ved 3-37 °C. I en utførelsesform blir suspensjonen blandet ved 15-25 °C for å sluttføre solubiliseringsprosessen. Prøven blir deretter sentrifugert ved 7.500 - 16.000 x G ved 4 °C i 10-30 minutter ved å benytte en hensiktsmessig sentrifuge. Supernatantprøven inneholdende det solubiliserte IL-21 blir dekantert og tilbakeholdt.

[00081] Konsentrasjonen av IL-21 i den solubiliserte fraksjonen blir bestemt ved hjelp av et reversfase-HPLC. En Jupiter-C5-kolonne (Phenomenex, Torrance, CA) blir benyttet med acetonitril/trifluoreddiksyre som den mobile fasen. IL-21-standard blir fortynnet i en guanidin/DTT/Tris-inneholdende buffer og ulike mengder blir injisert på kolonne. Arealet under IL-21-toppen blir benyttet for å konstruere en standardkurve. Den solubiliserte IL-21- prøven blir mikrosentrifugert for å fjerne partikler i forkant av injeksjon på HPLC-kolonnen. Bestemmelse av arealet under IL-21-toppen tillater kvantifisering av IL-21-konsentrasjon fra standar dkurven.

[00082] I tillegg kan det solubiliserte IL-21 bli renset på dette trinnet ved å benytte tangentiell-strøm-filtrering, reversfase-HPLC av immobilisert metallaffinitetskromatografi.

REFOLDING

[00083] I ett aspekt av oppfinnelsen, i prosessen for å gjenvinne rense-IL-21 fra transformerte E. coli-vertsstammer der IL-21 blir uttrykt som refraktile inklusjonslegemer, blir cellene knust og inklusjonslegemer blir gjenvunnet ved hjelp av sentrifugering.

[00084] Inklusjonslegemene blir deretter løseliggjort og denaturert i 6 M guanidinhydroklorid inneholdende et reduserende middel. Det reduserte IL-21 blir deretter oksidert i et kontrollert renatureringstrinn. Dette trinnet involverer fortynning i en refoldingsbuffer inneholdende argininhydroklorid, salter og et oksido-shufflingsystem. Oksido-shufflingsystemet blir benyttet for å initiere disulfidbinding av IL-21-molekylet og er basert på blandinger av reduserte og oksiderte molekyler slik som cystein og cystin, DTT og cystin, redusert glutation og oksidert glutation og DTT og oksidert glutation. Forholdet mellom redusert og oksidert glutation kan variere fra 1:1 til 6:1 med et konsentrasjonsområde på 0,5 og 8 mM. I én utførelsesform er den optimale konsentrasjonen 4 mM redusert glutation: 2 mM oksidert glutation. Forholdet mellom cystein og cystin kan variere fra 2:1 til 1:1 ved et konsentrasjonsområde på 4 mM til 1 mM av hver reagens. I en utførelsesform er den optimale konsentrasjon 4 mM cystein med 2 mM cystin. Optimal refolding kan også bli oppnådd ved å benytte 4 mM cystin og 2 mM DTT som danner 4 mM cystein og 2 mM cystin. Refolding kan også bli utført ved hjelp av sulfittolyse i nærvær av reagenser slik som natriumsulfitt og natriumtetrationat. Det renaturerte IL-21 blir innfanget fra den fortynnede refoldingsbufferen ved å benytte kationbytterkromatografi og blir renset ved å benytte hydrofob interaksjonskromatografi og høyeffektiv kationbytterkromatografi.

[00085] Løsningen som inneholder IL-21 blir tilsatt raskt (1-5 minutter) eller sakte (0,5-5 timer) til refoldingsbufferen under blanding. Refoldingsbufferen inneholder arginin (0,5 til 1,25 M), PEG og salter. Den kan også inneholde glyserol, guanidin HC1, urea, EDTA, proteaseinhibitorer og chaperoner, alkohol, detergenter, glyserol og kobbersulfat. IL-21 kan bli tilsatt i én tilsetning, i flere tilsetninger eller tilsatt over tid. IL-21 blir tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,05 til 1,2 mg/ml. Temperaturområdet er 4-30 °C. pH er 7,3 til 8,5. beholderen som inneholder refoldingsblandingen blir hensatt åpen for atmosfæren eller kan bli gjennomboblet med luft eller nitrogen i løpet av renatureringen. Refoldingen blir tillatt å foregå i 1 til 26 timer.

[00086] Refolding kan også bli utført i nærvær av EDTA for å minske metioninoksidasjon eller på en størrelseseksklusjonskolonne eller ved å benytte tangentiell-strøm-filtrering eller elektrodialyse.

KLARING OG KONSENTRASJON AV REFOLDET IL-21

[00087] Refoldet IL-21 blir justert til pH 5,5 og deretter passert gjennom et filter på 1,2 um for klaring og fjerning av uløselig protein. Den filtrerte løsningen blir konsentrert 10-30 ganger ved å benytte tangentiell-strøm-filtrering på en plate- og rammesystem eller med en hul fiberhylse. Konsentratet blir deretter fortynnet 3-10 ganger med buffer eller vann for å tillate at ufoldete og aggregerte proteiner presipiterer. Løsningen blir deretter passert gjennom et filter for klaring og fjerning av uløselig protein.

[00088] Alternativt blir det refoldete IL-21 fortynnet 2 ganger til 10 ganger i vann eller 25 mM natriumacetat, pH 5,5. Et presipitat eller en klump av partikler dannes og etter omtrent 30 minutter til fem timer blir det fjernet ved filtrering. Et nominelt filter på 1,2 um etterfulgt av et nominelt filter på 0,45 um eller et dybdefilter med et positivt zetapotensial kan bli benyttet for fjerne klumpen av partikler. Det vil være mulig å benytte andre filtre slik som graderte tetthetsfiltre. Det er også mulig å benytte sentrifugering eller mikrofiltrering for å fjerne klumpen av partikler.

INNFANGING AV IL-21

[00089] I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse, etter at IL-21-proteinet er refoldet og konsentrert, omfatter fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen å innfange det refoldede IL-21-proteinet i fortynnet buffer på en kationbytterkolonne og rensing av IL-21-proteinet ved å benytte hydrofob interaksjonskromatografi og høyeffektiv kationbytterkromatografi.

[00090] Innfangingstrinnet er designet for å fange inn det fortynnede foldete IL-21 og utføre en første rensing. For at IL-21 skal kunne binde til kolonnen blir en fortynning først utført. Det klarede fortynnede IL-21 blir fanget på en kationbytterkolonne ved pH 5,5. Typisk blir SP Sepharose-XL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) eller TOYOPEARL-SP-550C (Tosoh Biosep, Montgomery, PA) benyttet. Balanseringsbufferen er 25 mM natriumacetat, 0,2 til 0,45 M natriumklorid, pH 5,5 og det bundne IL-21 blir eluert med en økende salt-gradient. IL-21 eluerer fra SP-Sepharose-XL ved omtrent 0,6 M natriumklorid og fra TOYOPEARL-SP-550C ved omtrent 0,8 M natriumklorid.

[00091] Ekspandert sedimentkromatografi kan også bli benyttet for å fange inn IL-21 etter refolding. I dette tilfellet blir fortynningstrinnet utført samtidig med at IL-21 blir satt på kolonnen. Streamline-SP-XL (Amersham Bioscences) blir balansert med 25 mM natriumacetat, 0,2 M NaCl, pH 5,5. IL-21 blir deretter påsatt i oppoverstrømmende modus på det balanserte Streamline-SP-XL-resinet, som blir opprettholdt på to ganger den fastsatte sedimenthøyden, mens det blir fortynnet internt 1:3 med vann. Etter vasking i både oppoverstrømmende og nedoverstrømmende modus, blir IL-21 eluert i nedoverstrømmende modus med et 0,6 M NaCl-trinn eller en NaCl-gradient.

[00092] Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelsen av mange ulike kationbytterresiner i dette trinnet, inkludert svake kationbyttere, slik som karboksymetyl, ulike typer av faste bærere slik som agarose eller cellulose og ulike partikkelstørrelser. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også tilveiebringe kjøring av kolonnene ved ulike pH-verdier i området fra 5,0 til 7,0, og med ulike buffere og salter. Alternativt kan andre kromatografiske fremgangsmåter slik som hydrofobinteraksjon, anionbytter og metallchelat bli benyttet for å fange inn det refoldete IL-21.

RENSING

[00093] I ett aspekt av foreliggende oppfinnelse er det et mellomliggende rensetrinn av IL-21-protein. Dette trinnet er designet for å oppnå ytterligere rensing av IL-21 ved å benytte hydrofob interaksjonskromatografi. Typisk blir Butyl-Sepharose-FF (Amersham Bioscences) eller TOYOPEARL-butyl-650M (Tosoh Biosep) resiner benyttet i dette trinnet. Resinet er balansert med 25 mM natriumacetat, 5 mM NaCl, 1,5 M (NH4)2S04, pH 5,5. IL-21 som har blitt renset på kationbytterkromatografi ble justert til 1,5 M (NH4)2S04og deretter passert gjennom et nominelt filter på 0,45 um. Det justerte og filtrerte IL-21 blir deretter satt på det balanserte resinet, som deretter blir vasket med balanseringsbuffer for å fjerne ubundet materiale. IL-21 blir eluert med en gradient til 25 mM natriumacetat, 50 mM NaCl, pH 5,5.

IL-21 eluerer fra kolonnen ved omtrent 0,75 M (NH4)2S04til 0,3 M (NH4)2S04.

[00094] Andre hydrofobe interaksjonskromatografiresiner som kan bli benyttet i dette trinnet inkluderer f. eks. de som er substituert med fenyl eller heksyl, ulike typer av faste bærere slik som agarose eller cellulose og ulike partikkelstørrelser. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også kjøring av kolonner ved ulike pH-verdier i området fra 5,0 til 9,0 og med ulike buffere og salter. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også kjøring av kolonnen på en slik måte at IL-21 ikke binder.

[00095] IL-21 blir ytterligere renset ved hjelp av høyeffektiv kationbytterkromatografi. Typisk blir IL-21 fortynnet til en konduktivitet på 30 ms/cm, justert til pH 6,0 med 0,5 M dibasisk fosfat og satt på en kolonne med Sepharose-SP-HP (Amersham Biosciences). Kolonnen blir balansert med 25 mM natriumfosfat, 0,3 M natriumklorid, pH 6,0. Den blir vasket med balanseringsbuffer og deretter blir IL-21 eluert med en natriumkloridgradient. Foreliggende forbindelse tilveiebringer også anvendelse av andre høyeffektive kationbytterresiner. Kolonnene kan bli kjørt ved ulike pH-verdier i området fra 5,0 til 7,5 med ulike buffere, slik som fosfat. Materiale som settes på kan bli fortynnet med vann eller buffer til konduktivitetsverdier i området fra 5 til 35 ms/cm.

[00096] Fremgangsmåtene for rensing av IL-21 kan omfatte konsentrering og utføring av et bufferbytte for proteinet. Dette trinnet er designet for å konsentrere det høyeffektive kation-bytterkolonneeluatet og bytte det over i formuleringsbuffer. Det endelig totale eluatvolumet fra kolonnen blir konsentrert omtrent 10 ganger ved å benytte en tangentiell-strøm-filtrerings-plate med en grense på 5 kDa og rammemembran, diafiltrert mot fosfatbufret saltløsning, pH 6,0, eller mot 10 mM histidin, 4,72 % (w/v) mannitol, pH 5,0, 5,1,5,2 eller 5,3, deretter konsentrert en andre gang for ytterligere å øke konsentrasjonen av IL-21.

[00097] Andre membraner kan bli benyttet slik som membraner begrenset til 3 kDa eller 8 kDa på rammemembran eller et hult fibersystem med en grense på 10 kDa for å oppnå dette ultrafiltrerings-, diafiltreringstrinnet. Renheten av IL-21 etter høyeffektiv kationbytterkromatografi er minst 95 % og typisk større enn 98 %, som bestemt ved dodecylsulfatpoly-akrylamidgelelektroforese. Endotoksinnivået i IL-21-preparatet etter kationbytter-kromatografiinnfanging, hydrofob interaksjonskromatografirensing og bufferbytte, er generelt

< 10 endotoksinenheter per mg IL-21-protein, og typisk < 2 endotoksinenheter per mg IL-21-protein. Endotoksinnivået etter høyeffektiv kationbytterkromatografi er generelt < 1 endo-toksinenhet per mg IL-21.

[00098] Analyse av materialet produsert ved å benytte Streamline-SP-XL og butyl-Sepharose-FF (uten 20 ganger konsentreringen i forkant av kationbytterkromatografi) viste at aggregatene utgjorde mindre enn 0,2 % som målt ved størrelseseksklusjons-HPLC, at ladningsheterogenitet som målt ved kationbytter-HPLC er omtrent 10 % og at renhetsmålet som valgt ved reversfase-HPLC er omtrent 90 %. Analyse av materialet produsert ved å benytte Toyopearl-SP-550C, Toyopearl-butyl-650 M og Sepharose- SP-HP viste at aggregatene utgjør mindre enn 2 % som målt ved størrelseseksklusjon-HPLC, at renhet som valgt ved reversfase-HPLC er omtrent 90 % og at ladningsheterogenitet som målt ved kationbytte-HPLC er omtrent 4 %.

[00099] Ytterligere rensing av IL-21 for å fjerne de gjenværende urenhetene og kontamineringene, kan være ønskelig. For eksempel kan en anionbytterkolonne benyttes for å redusere endotoksinnivået. IL-21 fortynnes til et konduktivitetsnivå på < 10 mS/cm og pH justeres til 8,0. Det påsettes på en Q-Sepharose-FF-kolonne (Amersham Biosciences) som har blitt balansert til 20 mM Tris, pH 8,0. IL-21 passerer gjennom kolonnen og har en reduksjon på omtrent 80 % i endotoksin sammenlignet med det som ble påsatt. Mustang Q eller Mustang E (Pall, Port Washington, NY)-membraner, kan også benyttes for å redusere endotoksinnivåer mellom pH 5,0 og 9,0.

[000100] Andre rensetrinn som potensielt kan benyttes for ytterligere å rense IL-21 inkluderer metallchelatkromatografi, anionbytterkromatografi eller hydrofob interaksjonskromatografi på en fenylkolonne. Det er også mulig å innføre rensing før refolding av IL-21, ved for eksempel å benytte reversfase-HPLC, ionebytterkromatografi eller metallchelatkromatografi. Dermed tilveiebringer foreliggende oppfinnelse ytterligere fremgangsmåter som omfatter de ytterligere trinnene med rensing som er tilkjennegitt her.

KARAKTERISERING AV RENSET IL-21

[000101] BaF3 er en interleukin-3 (IL-3)-avhengig prelymfoid cellelinje avledet fra murin benmarg (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135,1986). BaF3-celler som uttrykker fullengde-IL-21 -reseptor er blitt fremstilt som beskrevet i US patentskrift nr. 6307024. Denne cellelinjen som er avhengig av den IL-21-reseptorbundne veien for å overleve, og dyrking av cellelinjen i fravær av andre vekstfaktorer, kan bli benyttet for å analysere for biologisk aktiv IL-21. Proliferasjon av BaF3/IL-21R-celler kan bli undersøkt ved å benytte ulike fortynninger av renset IL-21-protein som ble tilsatt til cellene og sammenligne vekst av de behandlede cellene med vekst for celler dyrket i fravær IL-21-protein.

[000102] Analyser som måler celleproliferasjon eller differensiering er velkjente på fagområdet. For eksempel inkluderer analyser som måler proliferasjon slike analyser som kjemosensitivitet overfor nøytral rødfarge (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354,1990, inkorporering av radiomerkede nukleotider (Cook et al., Analytical Biochem, 179:1-7,1989), inkorporering av 5-brom-2'deoksyuridin (BrdU) i DNA hos prolifererende celler (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985, og anvendelse av tetrazoliumsalter (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; og Scudiero et al., Cancer Res. 48:4827-4833,1988).

[000103] Analyser som måler differensiering inkluderer for eksempel måling av celle-overflatemarkører assosiert med tidspunktsspesifikk ekspresjon av et vev, enzymatisk aktivitet, funksjonell aktivitet eller morfologiske endringer (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Fracis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989). IL-21 som ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet her er i stand til å stimulere proliferasjon av BaF3/IL-21R-celler.

[000104] Renset IL-21 kan blikarakterisert vedet antall fysiske fremgangsmåter. Optimalt indikerer aminosyreanalyse aminosyresammensetningen av alle residier innenfor 10 % av de forventede verdier. N-terminal sekvensering gir en enkelt sekvens som begynner med metionin og tilsvarer sekvensen som var forventet fra IL-21-ekspresjonsvektoren. Total masseanalyse ved å benytte massespektrometri gir en verdi innenfor 0,01 % av den forventede massen for IL-21 (15593,84 Da). Endoproteinase-Lys-C-fordøying etterfulgt av flytende kromatografi-massespektrometri kan bli benyttet for å generere et peptidkart der alle topper i masse tilsvarer forutsette tryptiske peptider i IL-21 og der alle forutsette tryptiske peptider fra IL-21 blir identifisert. Peptidkartlegging indikerer også disulfidbinding som er i overensstemmelse med dem som er forutsett for et protein som er et medlem av IL-2-familien, i tillegg til et fravær av metioninoksidasjon.

FORMULERING

[000105] pH-verdien ble valgt for å minimere degradering observert ved SE-HPLC (løselig dimerdannelse, mengdetap), CIE-HPLC (tilsynelatende deamidering) og RP-HPLC (oksidasjon og degradering ved reaksjonsveier som enda ikke er identifisert). I visse utførelsesformer er pH-området 5,0-5,6 ved å benytte en histidinbuffer basert på buffer-kapasitet, stabilitet og parenteral administreringskompatibilitet. Alternativt kan citrat- eller suksinatbuffere benyttes. I én utførelsesform ble mannitol valgt som en tonisitetsjusterer (isoton løsning) på basis av stabilitet og kompatibilitet med lyofilisering. I andre utførelses- former kan sorbitol eller glysin benyttes. NaCl kan bli benyttet, men kan være mindre stabilt. Trehalose eller sukrose kan benyttes, men kan potensielt hydrolysere ved disse lett sure betingelsene. Likevel kan formuleringer inkludere fra 1 mg/ml til 100 mg/ml IL-21 i formuleringen. I én utførelsesform er IL-21-protein formulert ved en konsentrasjon på 10 mg/ml IL-21 i 10 mM histidin, 4,7 % vekt/vol. mannitol, pH 5,3. Produktet ble lagret frosset ved -20 °C. Bestemmelse av hvorvidt et løsningsprodukt er anvendbart avhenger av spesifikasjonsbegrensningene som er ansett som akseptable, og fagfolk på området vil definere begrensninger for å maksimere produktgjenvinning, minimere aggregering, minimere ladningsheterogenitet, minimere urenheter og opprettholde akseptabel biologisk aktivitet. Når begrensninger på < 3 % dimer (høymolekylær vekt), > 90 % renhet ved CIE- og RP-HPLC, og > 90 % av innholdet som er skrevet på etiketten ble satt, var et avkjølt løsningsprodukt stabilt og ansett som et hensiktsmessig alternativ. Doser av IL-21 på mellom 0,1 til 3 mg/kg vil generelt ikke overstige 30 ml for IV-boluslevering.

[000106] Et lyofilisert produkt kan også fremstilles og vil falle innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Andre eksipienser kan også bli inkludert i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel inkluderer akseptable eksipienser disakkarider, slik som trehalose og sukrose ved 0,5 % til 10 % som stabilisatorer, polyetylenglykol ved 0,001 % til 0,1 % som en stabilisator eller fuktiggjørende middel, overflateaktive midler, slik som tween-20, tween-80 eller triton-X-100 ved 0,001 % til 0,1 % som en stabilisator eller fuktgjørende middel, eller andre utfyllende midler slik som glysin, hydroksyetylstivelse i området 0,5 % til 5 %.

[000107] Stabilitetsundersøkelser kan bli utført ved akselererte betingelser slik som lagring ved for forhøyet temperatur på 25 °C til 45 °C eller agitasjon. For eksempel ble multiple fryse-tinings-sykler utført, der IL-21-formuleringen viste seg å være stabil ved konsentrasjoner på 20 mg/ml. I én utførelsesform er pH 5,25 benyttet for å redusere degraderingshastighet. Likevel er et optimalt pH-område for lyofilisert produkt 4,75 til 7,5, med ikke-lyofiliserte produkter i pH-området 5 til 5,6.

[000108] Ett eller flere preserveirngsmidler kan også bli inkludert i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt i de preparatene som er forpakket til multippel anvendelse. Preserveringsmidler som kan bli benyttet i foreliggende oppfinnelse inkluderer dem som er i vanlig bruk i farmasøytiske preparater slik som metylparaben, propylparaben, benzylalkohol, m-kresol, etylmerkuritiosalicylat, fenol, timerosal og liknende.

[000109] IL-21-preparater som er ment for farmasøytisk anvendelse vil være sterile og pyrogenfrie, og vil bli fremstilt og forpakket i henhold til aksepterte farmasøytiske prosedyrer. Preparatene kan bli forpakket i enhetsdoserings- eller multidoseringskvanta. Preparatene vil typisk være forpakket i forseglede glassrør med polytetrafiuoretylenbelagte stoppere og med hensiktsmessig merking. Lyofiliserte preparater kan bli forpakket som et sett som inkluderer en hensiktsmessig mengde av et passende fortynningsmiddel, slik som vann for injeksjon (WFI) eller 5 % dekstrose i WFI.

[000110] Oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved hjelp av de etterfølgende eksemplene.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Fremstilling av ekspresjonsvektor pTAP237

[000111] Plasmid pTAP237 ble fremstilt ved å sette inn en PCR-generert linker i Smal-sete på pTAP186 ved hjelp av homolog rekombinasjon. Plasmid pTAP186 ble avledet fra plasmidene pRS316 (en Saccharomyces cerevisiae shuttelvektor) og pMAL-c2, et E. coli-ekspresjonsplasmid avledet frapKK223-3 og omfattende tac-promotoren og rrnB-terminatoren. Plasmid pTAP186 inneholder et kanamycinresistensgen der Sma I-sete er blitt ødelagt og har Noti og Sfil-seter som flanker gjær-ARS-CEN6 og URA3-sekvensene, for å fremme deres fjerning fra plasmidet ved fordøying med Noti. Den PCR-genererte linker erstattet ekspresjonskoblingssekvensen i pTAP186 med den syntetiske RBS-II-sekvensen. Den ble fremstilt fra 100 pmol hver av oligonukleotider zc29,740 og zc29,741, som vist i SEQ ID NO: 3 og 4, og omtrent 5 pmol hver av oligonukleotider zc29,736 og zc29,738 som vist i SEQ ID NO 5 og 6. Disse oligonukleotidene ble kombinert ved hjelp av PCR i ti sykler med 94 °C i 30 sekunder, 50 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder etterfulgt av 4 °C. De resulterende PCR-produktene ble konsentrert ved hjelp av presipitering med to ganger volumet av 100 % etanol. Pellet ble resuspendert i 10 jlxI vann for å bli benyttet i rekombinasjon i mottakervektoren pTAP186 fordøyd med Smal for å fremstille konstruksjonen inneholdende den syntetiske RBS-II-sekvensen. Omtrent 1 jag av den PCR-genererte linker og 100 ng med pTAP186 fordøyd med Smal ble blandet sammen og transformert inn i kompetente gjærceller ( S. cerevisiae). Gjæren ble deretter platet på -URA-D-plater og hensatt ved romtemperatur i omtrent 72 timer. Deretter ble Ura+-transformanter fra en enkelt plate resuspendert i 1 ml H2O og spunnet kort til en pellet av gjærcellene. Cellepelleten ble resuspendert i 0,5 ml lysisbuffer. DNA ble gjenvunnet og transformert inn i E. coli MC 1061. Kloner ble screenet ved hjelp av koloni-PCR som tilkjennegitt ovenfor ved å benytte 20 pmol hver av oligonukleotider zc29,740 og zc29,741 som vist i henholdsvis SEQ ID NO 3: og 4. Kloner som viste de korrekte båndstørrelser på en agarosegel ble underkastet sekvensanalyse. Det korrekte plasmid ble betegnet pTAP237.

Eksempel 2

Konstruksjon av pTAP252

[000112] Den humane IL-21-kodende sekvensen (som vist i SEQ ID NO: 1) ble generert ved hjelp av PCR-amplifisering ved å benytte et CD3+-cDNA-bibliotek som templat og oligonukleotidprimere zc29,084 og zc22,127 (hhv. SEQ ID NO: 7 og 8). For å optimalisere translasjonsprosessen i E. coli tilførte primer zc29,084 (SEQ ID NO 7) et ATG-initierings-kodon på den 5' enden av den IL-21-kodende sekvensen. Den resulterende gensekvensen kodet for den modne IL-21 med ett ekstra metionin på N-terminalen (IL-2Imet). Det endelige PCR-produktet ble innsatt i ekspresjonsvektor pTAP237 (beskrevet i Eksempel 1) ved hjelp av gjærhomologrekombinasjon (Raymond et al., Biotechniques. 26(1): 134-8, 140-1, 1999; US patent 6027442. Ekspresjonskonstruksjonen pTAP252 ble ekstrahert fra gjær og transformert inn i kompetente E. coli MC 1061. Kanamycinresistente kloner ble identifisert ved hjelp av koloni-PCR. En positiv klon ble bekreftet ved hjelp av sekvensering og deretter transformert inn i enten produksjonsvertsstamme El04 eller UT5600.

Eksempel 3

Kodonoptimalisering

[000113] Induksjon av ekspresjon av human IL-21met fra pTAP252 produserte omtrent 2-5 % av totalt cellulært protein i E. co/z-stamme El04. Undersøkelse av kodonene som ble benyttet i den IL-21-kodende sekvensen indikerte at de inneholdt et overskudd av de minst hyppig benyttede kodoner i E. coli med en CAI-verdi lik 0,181. CAI-verdien er et statistisk mål på synonymt kodongrunnlag og kan bli benyttet til å forutse nivået av proteinproduksjon (Sharp et al., Nucleic Acids Res. 15(3): 1281-95, 1987). Gener som koder for høyt uttrykte proteiner har en tendens til å ha høye CAI-verdier (> 0,6) mens proteiner som er kodet av gener med lave CAI-verdier (< 0,2) generelt blir lite effektivt uttrykt. Dette var muligens en grunn for en dårlig produksjon av IL-21 i E. coli. I tillegg er de sjeldne kodonene samlet i den andre halvdelen av meldingen noe som fører til høyere sannsynlighet for translasjonen oppstopping, for tidlig terminering av translasjon og gal innsetting av aminosyre (Kane JF. Curr. Opin. Biotechnol. 6 (5):494-500,1995).

[000114] Det er blitt vist at ekspresjonsnivået av proteiner hvis gener inneholder sjeldne kodoner kan bli dramatisk forbedret når nivået av visse sjeldne tRNAer blir økt i verten.

(Zdanovsky et al., ibid., 2000; Calderone et al., ibid., 1996; Kleber-Janke et al., ibid., You et al., 1999). pRARE-plasmidet bærer gener som koder for tRNAene for flere kodoner som sjelden blir benyttet i E. coli (argU, argW, leuW, proL, ileX og glyT).Genene er under kontrollen av deres native promotorer (Novy, ibid.). Ekspresjon sammen med pRARE forbedret IL-21met-produksjon i E. coli omtrent 5-10 ganger. Ekspresjon sammen med pRARE minsket også nivået av trunkert IL-2 Imet i E. coli-lysat. Disse dataene tyder på at resyntetisering av genet som koder for IL-2 Imet med mer hensiktsmessig kodonbruk tilveiebringer en forbedret vektor for ekspresjon av store mengder med IL-21.

[000115] Den kodonoptimaliserte IL-2 lmet-kodende sekvensen ble konstruert fra seksten overlappende oligonukleotider: zc22,913 (SEQ ID NO:9), zc22,914 (SEQ ID NO: 10),zc22,915 (SEQIDNO:ll),zc22,916 (SEQ ID NO: 12),zc22,961 (SEQ ID NO: 13), zc22,962 (SEQ ID NO: 14), zc22,963 (SEQ ID NO: 15), zc22,964 (SEQ ID NO: 16), zc22,965 (SEQ ID NO: 17), cz22,966 (SEQ ID NO: 18), cz22,968 (SEQ ID NO: 20), cz22,969 (SEQIDNO:21),zc22,967 (SEQ ID NO: 19), zc22,970 (SEQ ID NO: 22), cz22,971 (SEQ ID NO: 23), og zc22,972 (SEQ ID NO: 24). Primerforlenging av disse overlappende oligonukleotidene etterfulgt av PCR-amplifisering produserte et fullengde IL-21met-gen med kodoner optimalisert for ekspresjon i E. coli. Det endelige PCR-produktet ble innsatt i ekspresjonsvektor pTAP168 ved hjelp av gjærhomologrekombinasjon. Ekspresjonskonstruksjonen ble ekstrahert fra gjær og transformert inn i kompetente E. coli MC 1061. Kloner som var resistente mot kanamycin ble identifisert ved hjelp av koloni-PCR. En positiv klon ble bekreftet ved hjelp av sekvensering og påfølgende transformert inn i enten produksjonsvertsdannende El04 eller UT5600. Ekspresjonsvektoren med den optimaliserte IL-21met-sekvensen ble kalt pTAP196. Det endelige PCR-produktet ble introdusert inn i vektor pTAP168 for ekspresjon under kontrollen av Tac-promotoren. Likevel var ekspresjonen svært lav og produktet kunne bare bli påvist ved hjelp av Western-analyse ved å benytte monoklonale antistoffer rettet mot IL-21 som proben.

[000116] Undersøkelse av sekundærstrukturen av IL-2 lmet-beskj eden avslørte en eksepsjonelt stabil hårnålstruktur i regionen mellom basene 36 og 64 (SEQ ID NO: 1). Det ble mistenkt at dette strukturelle elementet forhindret effektiv translasjon fra IL-21met-beskjeden. Derfor ble en hybrid IL-21met-kodende sekvens generert ved hjelp av overlappende PCR. Et fragment inneholdende de første åtti basene i den ikke-optimaliserte IL-21met-sekvensen ble generert ved hjelp av PCR-amplifisering ved å benytte pTAP252 som templat og oligonukleotidprimere zc29,740 (SEQ ID NO: 3) og zc40,133 (SEQ ID NO: 25). Den optimaliserte regionen i IL-21met fra base 81 til 405 (SEQ ID NO:27) ble generert ved hjelp av PCR-amplifisering ved å benytte pTAP196 som templat og oligonukleotidprimere zc22,971 (SEQ ID NO:23) og zc40,107 (SEQ ID NO: 26). Disse to PCR-produktene ble kombinert og amplifisert ved å benytte oligonukleotidprimere zc22,971 (SEQ ID NO: 23) og zc29,740 (SEQ ID NO: 3) for å generere fullengde-IL-21met ved hjelp av overlappende PCR. Det endelige PCR-produktet ble innsatt i ekspresjonsvektor pTAP237 ved hjelp av gjærhomolog rekombinasjon. Ekspresjonskonstruksjonen ble ekstrahert fra gjær og transformert inn i kompetente E. coli MC 1061. Kloner som var resistente overfor kanamycin ble identifisert ved hjelp av koloni-PCR. En positiv klon ble bekreftet ved hjelp av sekvensering og deretter transformert inn i enten produksjonsvertsstamme El04 eller UT5600. Ekspresjonsvektoren med den hybride IL-21met-kodende sekvensen ble kalt pTAP337.

[000117] Med en gang hårnålstrukturen var eliminert ved å erstatte de første åtte basene i den optimaliserte sekvensen med de første åtti nukleotidene i den ikke-optimaliserte IL-21 met-sekvensen (vist i SEQ ID NO: 1) ble det resulterende genet uttrykt svært godt i E. coli. Ekspresjonsnivåer med den nye konstruksjonen økte til omtrent 20 % av totalt celleprotein.

Eksempel 4

Ekspresjon av IL-2 Imet

[000118] E. coli ble inokulert i 100 ml Superbroth-II-medium (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) inneholdende 0,01 % Antifoam 289 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 30 |J,g/ml kanamycin, og dyrket over natt ved 37 °C. Et inokuleringsvolum på 10 ml ble tilsatt til 500 ml av det samme medium i en kulturflaske på 2 1 som hadde blitt ristet ved 275 rpm ved 37 °C inntil kulturen oppnådde en OD600 på 4. IPTG ble deretter tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM og risting ble fortsatt i ytterligere 2,5 timer. Cellene ble sentrifugert ved 4000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Cellepelletene ble frosset ved -80 °C for anvendelse på et senere tidspunkt.

[000119] Ekspresjon av IL-2 Imet ble utført i en større skala i en 25 ml kultur ved 37 °C. Én ml kultur ble samlet 2 timer etter IPTG-induksjon. E. co/z-celler ble resuspendert i et likt volum BugBuster® Protein Extraction Reagent (Novagen, Madison, WI) ved 4 °C og inkubert i 20 min. De løselige og uløselige fraksjonene ble separert ved hjelp av sentrifugering ved 16000 x g i 10 min ved 4 °C.

[000120] Rekombinant IL-2 Imet akkumulerte som uløselige inklusjonslegemer. Det gjenvunne utbytte av IL-2 Imet fra de fleste av E. co/z-stammene ble ansett å være lavt. Omtrent 80 til 90 % av IL-2 Imet i inklusjonslegemene ble tapt i løpet av 20 minutter etter cellelysering og inkubasjon ved 4 °C. Lysering av bakterier med 8 M urea forbedret ikke gjenvinning. Ved å inkludere proteaseinhibitorer, slik som 5 mM ZnCk og 0,5 mM benzamidin, i cellelysisbufferen, forhindret likevel tapet av IL-2 Imet fra stamme El04 (W3110 arabinose"). Dette tyder på at en bakteriell protease som er i stand til å kløyve IL-21met ved denaturerende betingelser ble renset sammen med inklusjonslegemene. Det ble observert at IL-2 Imet var stabilt i cellelysater fra stamme UT5600, men ikke i E104-cellelysater. Dette tydet på at proteasen var til stede i El04, men ikke i UT5600. Sammenligning av genotypene for disse stammene avslørte at OmpT, som kløyver mellom dibasiske residuer, var til stede i El04, men ikke i UT5600. OmpT er varmestabil og aktiv selv under denaturerende betingelser (White et al., ibid. 1995). Undersøkelse av aminosyresekvensen til IL-21 tyder på at den inneholdt minst fire potensielle OmpT-kløyvingsseter. IL-2 Imet viste også utmerket stabilitet i BL21, som er en annen OmpT-manglende E. co/z-stamme. Disse dataene tyder på at OmpT-proteaseaktivitet var kritisk for stabiliteten og gjenvinningen av IL-21. Anvendelsen av E. co/z-stamme UT5600 som produksjonsverten forbedret signifikant gjenvinningen av IL-2 Imet. Totalt ble utbyttene av IL-2 Imet økt fra 2 mg/l til 50-100 mg/l under kombinasjonen av konstruksjonsforbedring og vertsstammeforbedring.

Eksempel 5

Karakterisering av IL-21

[000121] For Western-analyse ble proteinprøver separert på en 4-20 % MES-SDS-NuPAGE-gel (Invitrogen) under reduserende betingelser og overført til nitrocellulose-membran (Invitrogen) ved 30 V i en 1 time. Membranen ble blokkert med 5 % fettfri melk i TTBS-buffer (20 mM Tris pH 7,4, 160 mM NaCl, 0,1 % Tween-20). Polyklonalt antistoff spesifikt for human IL-21 ble tilsatt i TTBS-buffer med 5 % fettfri melk og inkubert i 1 time. Etter vasking med TTBS ble blottet probet med HRP-konjugert geit-anti-kanin-IgG (Bio-Rad) i 1 time. Blottet ble deretter vasket tre ganger med TTBS før kjemiluminescent påvisning med ECL-reagens fra Pierce.

Eksempel 6

Plasmidstabilitetsanalyse

[000122] E. coli ble inokulert i 25 ml Superbroth-II-medium (Becton Dickinson) inneholdende 0,01 % Antifoam 289 (Sigma) og 30\iglm\ kanamycin, og dyrket over natt ved 37 °C. Et inokuleringssvolum på 25 jul ble tilsatt til 25 ml av det samme medium uten kanamycin i en kulturflaske på 25 ml som ble ristet ved 275 rpm ved 37 °C. 100 jlxI kultur ble samlet ved fire ulike tidspunkter (når kulturen nådde OD600-verdier på 2, 4, 6 og 8). Prøvene ble fortynnet og platet på LB-agarplater uten noen tilsetninger. Etter overnattinkubasjon ved 37 °C ble 100 E. co/z-kolonier platet på en LB-agarplate og en LB-agarplate inneholdende 30Hg/ml kanamycin. Etter overnattinkubasjon ved 37 °C ble antallet kolonier som var dannet på hver plate telt og sammenlignet. Antallet kolonier som vokste på LB pluss kanamycin relativt i forhold til antallet som vokste på platen uten antibiotika gjenspeilte prosentandelen av celler som fremdeles inneholdt ekspresjonsvektoren.

[000123] Når kloner med W3110 som bærer pTAP337-ekspresjonsvektoren ble dyrket i 12 timer i medium som ikke inneholdt kanamycin opprettholdt mer enn 90 % plasmidet. Kloner som bar ekspresjonsvektoren uten IL-21-genet viste tilsvarende opprettholdelse av plasmidet. Disse dataene viser at pTAP337-ekspresjonsvektoren som bærer IL-21 er stabil i W3110.

[000124] E. co/z-stammer, TG1 og MM294, ble ikke valgt som produksjonsverten på grunn av lav produktivitet av IL-21 og alvorlig plasmidustabilitet. De mest oppløftende resultatene kom fra undersøkelsene ved å benytte E. co/z-stamme W3110 (ATCC #27325) til å produsere IL-21. Produktiviteten til W3110 var sammenlignbar med den for UT5600. Plasmidstabilitetsundersøkelser viste at ekspresjonsvektoren pTAP337 ble opprettholdt i W3110 i tillegg. UT5600 er en auxotrof stamme og mer vanskelig å dyrke i stor skala. Disse overveielsene førte til valget av W3110 som den foretrukne vertsstammen for produksjon av IL-21.

Eksempel 7

Ladningsfermentering

[000125] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med Difco APS-Super Broth (Difco Laboratories, Detroit, MI) tilsatt glyserol ved 5 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble satt i gang ved å inokulere risteflasken med en løkke full av E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337 (EE410) fra en 24 timer gammel agarplate (Luria agar (Difco Laboratories)) inneholdende kanamycin 25Hg/ml). Vekst i risteflaske foregikk ved en temperatur på 30 °C. Flasken ble inkubert med agitasjon satt på 250 rpm.

[000126] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 3,01 Difco-APS-Super Broth og sterilisert. Vekstmediet ble tilsatt glyserol ved 10 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. pH i mediet ble justert til 7,2. Gjennomlufting av beholderen ble satt til 1 wm og agitasjon ble satt til 350 rpm. Temperaturen ble satt til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra en førstestadiumsutsåingsflaskekultur dyrket i 16 timer til en optisk tetthet (OD) på 16 ved 600 nm. Inokuleringen var 5 volum%. Oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet.

[000127] Kulturen ble dyrket inntil OD600 nådde 2,5 (omtrent 2,5 timer). Isopropyltiogalaktopyranosid (IPTG) ble tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 1,0 mM. Kulturen ble deretter tillatt å vokse i ytterligere 3 timer.

Eksempel 8

A. Tilsatt ladningsfermentering

[000128] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med Difco-APS-Super Broth tilsatt glyserol ved 5 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble satt i gang ved å inokulere risteflasken med en løkke full av E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektor pTAP 337 (beskrevet ovenfor) fra en 24 timer gammel agarplate (Luria-agar inneholdende kanamycin 25 |J.g/ml). Risteflasken ble inkubert ved 30 °C med agitasjon satt på 250 rpm.

[000129] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 3,0 1 ZymoM-vekstmedium og sterilisert. Vekstmediet ble tilsatt glyserol ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. pH i mediet ble justert til pH 6,4. Gjennomlufting ble satt til 1 vvm, agitasjon til 350 rpm og temperatur til 32 °C. Fermentoren ble inokulert fra en førstestadiumsutsåingsflaskekultur som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet.

[000130] En karbohydratløsning ble tilsatt til fermentoren med start ved 10 timer EFT. Tilsetningen ble fortsatt inntil slutten på fermenteringen. Tilsetningsløsningen var glyserol klargjort ved 70 volum%. Tilsetningshastigheten var 6 gram glyserol pr. liter pr. time basert på det opprinnelige utgangsvolumet. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 2 mM. Ved 48 timer EFT ble fermenteringen høstet.

[000131] I en alternativ tilføringsladningsprosess ble en førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) klargjort med ZSM tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere risteflasken med 300 \ i\ E. coli W3110 frosset i 20 % glyserol og inneholdende ekspresjonsvektor pTAP337. Kulturen ble inkubert ved 30 °C med agitasjon på 250 rpm.

[000132] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 3,0 1 ZymoM-vekstmedium og sterilisert. Vekstmediet ble tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. pH i mediet ble justert til 6,8. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra en førstestadiumsutsåingsflaskekultur som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 på 16. Inokulering var 5 volum% og det oppløste oksygennivå ble opprettholdt på over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet.

[000133] En karbohydratløsning ble tilsatt til fermentoren fra 10 timer EFT. Tilsetningen ble fortsatt inntil slutten på fermenteringen. Tilsetningsløsningen var glukose klargjort ved 60 volum% og tilsetningshastigheten var 9,5 gram glukose pr. liter pr. time basert på det opprinnelige utgangsvolumet. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 2 mM. Ved 48 timer EFT ble 2 mmol/1 IPTG tilsatt til kulturen for å bringe IPTG-konsentrasjonen til 4 mM. Fermenteringen ble høstet ved 56 timer.

B. Tilsatt ladningsfermentering med PCOL22-medium

[000134] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere flasken med 300 jlxI materiale fra et tint frossent rør inne-holdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Risteflasken ble inkubert ved 32 °C med agitasjon satt til 250 rpm.

[000135] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 2,7 1 PCOL22-medium og sterilisert. Etter avkjøling ble vekstmediet tilsatt glukose ved 20 g/l, magnesiumsulfat, kalsiumklorid og kanamycin ved 25 \ i$/ ml. pH i mediet ble justert til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra en førstestadiumutsåingsflaskekultur med EE410 som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 nm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet. pH ble kontrollert ved 6,8 ved tilsetning av 5N NH4OH.

[000136] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. liter utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 timer EFT.

C. Tilsatt ladningsfermentering med PCOL22-medium minus kanamycin

[000137] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |jl/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere flasken med 300 jlxI materiale fra et tint frossent rør inneholdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Risteflasken ble inkubert ved 32 °C med agitasjon satt til 250 rpm.

[000138] En fermenteringsbeholder på 61 ble klargjort med 2,7 1 PCOL22-medium og sterilisert. Etter avkjøling ble vekstmediet tilsatt glukose ved 20 g/l, magnesiumsulfat og kalsiumklorid. Kanamycin ble ikke tilsatt. pH i mediet ble justert til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra en førstestadiumsutsåingsflaskekultur med EE410 som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 nm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet. pH ble kontrollert ved 6,8 ved tilsetning av 5 N NH4OH.

[000139] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. liter utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 timer EFT.

D. Tilsatt ladningsfermentering med PCOL22-L-medium

[000140] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere flasken med 300 ju.1 materiale fra et tint frossent rør inneholdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110) inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Risteflasken ble inkubert ved 32 °C med agitasjon satt til 250 rpm.

[000141] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 2,7 1 PCOL22-L-medium og sterilisert. Dette mediet inneholder sitronsyre og har en tredjedel mindre salter for å hindre presipitering. Etter avkjøling ble mediet tilsatt glukose ved 20 g/l, magnesiumsulfat, kalsiumklorid og kanamycin med 25 |j,g/ml. pH i mediet ble justert til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra en førstestadiumsutsåingsflaskekultur med EE410 som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 nm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt på over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet. pH ble kontrollert til 6,8 ved tilsetning av 5 N NH4OH.

[000142] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) minus magnesiumsulfat ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. liter utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 timer EFT.

E. Tilsatt ladningsfermentering med PCOL12-L-medium

[000143] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere flasken med 300 jlxI materiale fra et tin frossent rør inneholdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Risteflasken ble inkubert ved 32 °C med agitasjon satt til 250 rpm.

[000144] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 2,7 1 PCOL22-L-medium og sterilisert. Dette mediet inneholder 1/4 mindre salter for å hindre presipitering. Etter avkjøling ble vekstmediet tilsatt glukose ved 20 g/l, magnesiumsulfat, kalsiumklorid og kanamycin ved 25 |ag/ml. pH i mediet ble justert til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fira en førstestadiumutsåingsflaskekultur med EE410 som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 nm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet. pH ble kontrollert til 6,8 ved tilsetning av 5 N NH4OH.

[000145] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) minus magnesiumsulfat ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. liter utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT, ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 timer EFT.

F. Tilsatt ladningsfermentering med PCOL12-R-medium

[000146] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere flasken med 300 jlxI materiale fra et tint frossent rør inneholdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Risteflasken ble inkubert ved 32 °C med agitasjon satt til 250 rpm.

[000147] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 2,7 1 PCOL22-R-medium og sterilisert. Dette medium inneholder økte nivåer av gjærekstrakt og glukose for å øke veksten av vertsstammen før glukosetilsetning blir igangsatt. Etter avkjøling ble mediet tilsatt glukose ved 40 g/l, magnesiumsulfat, kalsiumklorid og kanamycin ved 25 |j,g/ml. pH i mediet ble stilt til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fira en førstestadiumutsåings-flaskekultur med EE410 som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 nm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasj onshastighet.

[000148] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. liter utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 EFT.

G. Tilsatt ladningsfermentering i 201 beholder

[000149] I en alternativ tilsatt ladningsprosess ble en førstestadiumsutsåingsbeholder (6 1) klargjort med 3,0 1 ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og, kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere beholderen ved 3,0 ml materiale fra et tint frossent rør inneholdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 32 °C.

[000150] En fermenteringsbeholder på 201 ble klargjort med 10,8 1PCOL22-medium og sterilisert. Etter avkjøling ble vekstmediet tilsatt glukose ved 20 g/l, magnesiumsulfat, kalsiumklorid, og kanamycin ved 25 |j,g/ml. pH i mediet ble justert til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra førstestadiumsutsåingsbeholderkultur med EE410 som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 nm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet. pH i kultur ble kontrollert ved 6,8 ved tilsetning av 5N ammoniumhydroksid.

[000151] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. liter utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 timer EFT.

H. Tilsatt ladningsfermentering med utsåing i 2 stadier

[000152] En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere flasken med 300 ju.1 materiale fra et tint frossent rør inneholdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Risteflasken ble inkubert ved 32 °C med agitasjon satt til 250 rpm.

[000153] En annenstadiumsutsåingsbeholder (6 1) ble klargjort med 3,0 1 ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere beholderen med 100 ml materiale fra en førstestadiumsutsåingsflaske inneholdende produksjonsstarnmen EE410 ( E. coli W3110 inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337). Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 32 °C.

[000154] En fermenteringsbeholder på 20 1 ble klargjort med 10,8 1 PCOL22-medium og sterilisert. Etter avkjøling ble vekstmediet tilsatt glukose ved 20 g/l, magnesiumsulfat, kalsiumklorid og kanamycin ved 25 |j,g/ml. pH i mediet ble justert til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra en annenstadiumsutsåingsbeholder som hadde blitt dyrket i 12 timer til en OD600 nm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet. pH i kultur ble kontrollert ved 6,8 via tilsetning av 5N ammoniumhydroksid.

[000155] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. liter utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 timer EFT.

I. Tilsatt ladningsfermentering med ZGOLD1

[000156] Konstruksjon av ekspresjonsvektoren zGOLDl er beskrevet i Eksempel 19. En førstestadiumsutsåingsflaske (ristet 500 ml flaske med 100 ml medium) ble klargjort med ZSM-medium tilsatt glukose ved 20 g/l og kanamycin ved 25 |j,g/ml. Vekst ble igangsatt ved å inokulere flasken med 300 jlxI materiale fra et tint frossent rør inneholdende produksjonsstarnmen E. coli W3110 ompT - (ZGOLDl) inneholdende ekspresjonsvektoren pTAP337. Risteflasken ble inkubert ved 32 °C med agitasjon satt til 250 rpm.

[000157] En fermenteringsbeholder på 6 1 ble klargjort med 2,7 1 PCOL22-medium og sterilisert. Etter avkjøling ble mediet tilsatt glukose ved 20 g/l, magnesiumsulfat, kalsiumklorid og kanamycin ved 25 \ i\ lvsA. pH i mediet ble justert til 6,8 med 5N ammoniumhydroksid. Gjennomlufting ble satt til 1 wm, agitasjon ble satt til 350 rpm og temperatur til 37 °C. Fermentoren ble inokulert fra en førstestadiumsutsåingsflaskekultur med EE410 som hadde blitt dyrket i 16 timer til en OD600 mm på 16. Inokulering var 5 volum% og oppløst oksygen ble opprettholdt over 20 % metning ved å øke agitasjonshastighet. pH i kultur ble kontrollert ved 6,8 via tilsetning av 5N ammoniumhydroksid.

[000158] En glukoseløsning (60 % vekt/vol.) ble tilsatt til fermentoren fra 8 timer EFT. En konstant tilsetningshastighet på 9,5 g glukose pr. 1 utgangsvolum pr. time ble opprettholdt gjennom hele fermenteringen. Ved 24 timer EFT ble IPTG tilsatt til kulturen til en konsentrasjon på 0,5 mM. Fermenteringen ble høstet ved 48 timer EFT.

PCOL22 - produksi onsmedium

[000159]

PCOL22 - L- medium

[000160]

60 % glukose til tilført ladning ved å benytte PCOL22-L- og PCOL-12-L-medium

[000161]

PCOL12 -R-medium

[000162]

PC0L12 - L-medium

[000163]

Eksempel 9

IL-21 -Gjenvinning

A. Knusing av høstede celler

[000164] Den høstede E. co/z-pelleten ble fremstilt ved tilført ladningsfermentering og inneholdt omtrent 5 - 6 g/l med IL-2 Imet ved inklusjonslegemeform. Fermenteringsbuljongen (1 1) ble omgjort til en pellet ved hjelp av sentrifugering ved 8000 x g i 30 minutter. Pelleten ble resuspendert i 850 ml knusingsbuffer (100 mM tris, pH 7,2, 5 mM ZnCk) og avkjølt på is. Buljongen ble passert gjennom APV-homogenisatoren tre ganger ved 10000 psi. Buljongen ble deretter sentrifugert ved 8000 x g i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet forsiktig for ikke å miste pelleten. Pelleten ble vasket to ganger ved resuspensjon i 800 ml DI-vann og sentrifugering ved 8000 x g i 40 minutter. Supernatanten ble fjernet forsiktig for å holde tilbake den løse pelleten. Inklusjonslegemepelleten ble lagret ved -80 °C eller refoldet uten frysing.

D. Direkte knusing av høstet buljong

[000165] Den høstede E. cø/z-buljongen ble produsert ved tilsatt ladningsfermentering og inneholdt omtrent 6-7 g/l med IL-21met i inklusjonslegemeform. Fermenteringsbuljongen (0,5 1) ble fortynnet til 1,0 1 med deionisert vann og passert gjennom APV-homogenisatoren tre ganger ved 10000 psi. Buljongen ble deretter sentrifugert ved 15000 x g i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet forsiktig for å holde tilbake den løse pelleten. Pelleten ble resuspendert i 500 ml med DI-vann og sentrifugert ved 15000 x g i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet forsiktig for å holde tilbake den løse pelleten. Vasketrinnet ble gjentatt og inklusjonslegemepelleten ble lagret ved -80 °C eller refoldet uten frysing.

C. Solubilisering og presipitering

[000166] 1. Solubilisering ble oppnådd ved suspendering av den vaskede inklusjonslegemepelleten i 200 ml 100 mM tris, 6 M guanidinhydroklorid, 5 mM ZnCl2, pH 7,2 ved romtemperatur i én time. Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved 12000 g i 30 minutter. Supernatanten ble holdt ved 4 °C. Supernatanten ble fortynnet 1:8 (v/v) tris, 5 mM ZnCb, pH 7,2. Suspensjonen ble sentrifugert ved 12000 g i 10 minutter. Supernatanten ble fjernet. Pelleten ble resuspendert i 200 ml 100 mM tris, 8 molar urea, pH 7,2. Suspensjonen ble sentrifugert ved 12000 g i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet. Vaskeprosedyren ble gjentatt to ganger. Resolubilisering ble oppnådd ved suspensjon av den vaskede pelleten i 200 ml 100 mM tris, 6 molar guanidinhydroklorid, 10 mM DTT, pH 7,2. Suspensjonen ble sentrifugert ved 12000 g i 30 minutter. Proteinkonsentrasjonen i supernatanten som målt ved HPLC-poteinanalyse var 10 mg/ml. IL-21-prøven ble deretter lagret ved 4 °C. 2. Solubiliseringen av IL-21 ble oppnådd ved å suspendere den vaskede inklusjonslegemepelleten i 6 M guanidinhydroklorid, 40 mM ditiotreitol (DTT) klargjort i 100 mM tris, pH 8,0 (GDT40). Omtrent 150 ml GDT40 ble benyttet pr. liter med original-fermenteringsbuljong. Solubiliseringen foregikk ved romtemperatur i én time. Suspensjonen ble deretter sentrifugert. Supernatanten fra løste inklusjonslegemer ble refoldet ved fortynning (20-30 X) i en refoldingsbuffer inneholdende 0,75 M arginin pluss DTT/cystinoksidasjons-reduksjonspar. Refolding ble tillatt å foregå i 5-16 timer og etter dette ble pH i blandingen justert til pH 5,5 og filtrert før overlevering til rensing.

D. Direkte knusing av høstet buljong fra ZGOLDl

[000167] Den høstede E. co/z-ZGOLDl-buljongen ble produsert ved hjelp av tilsatt ladningsfermentering i PCOL22-medium (beskrevet ovenfor) og inneholdt omtrent 9-10 g/l med IL-2 Imet i inklusjonslegemeform. Fermenteringsbuljongen (0,5 1) ble fortynnet til 1,0 1 med deionisert vann og passert gjennom APV-homogenisatoren tre ganger ved 10000 psi. Buljongen ble deretter sentrifugert ved 15000 x g i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet forsiktig for å holde tilbake den løse pelleten. Pelleten ble resuspendert i 500 ml DI-vann og sentrifugert ved 15000 x g i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet forsiktig for å holde tilbake den løse pelleten. Pelleten ble resuspendert i 500 ml DI-vann og sentrifugert ved 15000 x g i 30 minutter. Supernatanten ble fjernet forsiktig for å holde tilbake den løse pelleten. Inklusjonslegemepelleten ble lagret ved -80 °C eller refoldet uten frysing.

Eksempel 10

A. Solubilisering av vaskede inklusjonslegemer

[000168] Solubilisering ble nådd ved suspensjon av den vaskede inklusjonslegemepelleten i 150 ml 100 mM tris, 6 M guanidinhydroklorid, 20 mM ditiotreitol, pH 7,5 ved romtemperatur i én time. Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved 12000 g i 30 minutter. Proteinkonsentrasjonen i supernatanten som målt ved HPLC-proteinanalyse var 21 mg/ml. IL-21-prøven ble lagret ved 4 °C.

B. Solubilisering av vaskede inklusjonslegemer fra ZGOLDl

[000169] Solubilisering ble oppnådd ved suspensjon av en vasket inklusjonslegemepellet fra en 1 liter fermenteringsbuljong i 150 ml 100 mM tris, 6 M guanidinhydroklorid, 40 mM ditiotreitol, pH 8,0 ved romtemperatur i én time. Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved 15000 x i 30 minutter. Proteinkonsentrasjonen i supernatanten som målt ved HPLC-proteinanalyse var 29 mg/ml. IL-21-prøven ble lagret ved 4 °C.

C. Klaring av solubiliserte inklusjonslegemer

[000170] Immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) resin ble benyttet for å klare solubiliserte IL-21-inklusjonslegemepelleter. I ett eksempel ble vaskede inklusjonslegeme-pelleter løseliggjort i 1 time ved romtemperatur i 6 M guanidin-HCl inneholdende 10 mM imidazol, pH 7,5,1,0 ml his-trap-kolonner (Amersham Biosciences) ble ladet med 0,5 ml 0,1 M NiS04. Etter ladning og vannvasking, ble 5,0 ml med bindingsbuffer bestående av 6 M GuHCl, 20 mM imidazol, 0,5 M NaCl, og 20 mM fosfat benyttet for å balansere kolonnen.

[000171] Den løste prøven (1,0 ml) ble påsatt kolonnen og kolonnen ble vasket med 5,0 ml med bindingsbufferen. IL-21 ble eluert ved å sette på 2,5 ml med elueringsbuffer (6 M GuHCl, 0,5 M imidazol, 0,5 M NaCl og 20 mM fosfat) på kolonnen. Elueringstrinnet ble gjentatt og prøvene ble analysert for renhet og klaring ved å benytte SDS-page-geler.

Eksempel 11

Refolding

A. Renaturering med GSH og GSSG

[000172] Konsentrasjonen av IL-21 i den solubiliserte fraksjonen ble bestemt ved hjelp av reversfase-HPLC til å være 21 mg/ml. Bestemmelse av refoldingsbuffervolum ble basert på mengden av oppløst produkt og konsentrasjon av IL-21 til stede i oppløst produkt. Refoldingsbufferen (50 mM tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KC1, 2 mM MgCl2,2 mM CaCl2, 0,05 % (w/v) PEG3350,1,1 M L-arginin, 2 mM GSH, 1 mM GSSG, pH 7,5) ble avkjølt til romtemperatur (21 °C). GSH og GSSG ble løst straks før anvendelse.

[000173] Det oppløste produktet inneholdende IL-21 (175 ml) ble tilsatt sakte (1,5 time) til refoldingsbufferen (111) ved omrøring. IL-21 ble tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,30 mg/ml. Temperaturområdet var mellom 20 til 22 °C. Beholderen inneholdende refoldingsblandingen ble hensatt åpen til atmosfæren. Refolding ble tillatt å foregå i 16 timer. Konsentrasjonen av refoldet IL-21 ble bestemt å være 0,165 mg/ml, noe som gir et renatureringsutbytte på 55 %.

B. Renaturering med DTT og GSSG

[000174] Konsentrasjonen av IL-21 i den solubiliserte fraksjonen ble bestemt ved hjelp av reversfase-HPLC til å være 15,02 mg/ml. Bestemmelse av refoldingsbuffervolum var basert på mengden av oppløst produkt og konsentrasjonen av IL-21 til stede i det oppløste produkt. Refoldingsbufferen (50 mM tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KC1, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05 % (w/v) PEG3350, 1,1 M L-arginin, 2 mM DTT, 4 mM GSSG, pH 7,5) ble avkjølt til romtemperatur (21 °C). DTT og GSSG ble løst straks før anvendelse.

[000175] Det oppløste produktet inneholdende IL-21 (88 ml) ble sakte tilsatt (1,0 time) til refoldingsbufferen (1,0 1) under omrøring. IL-21 ble tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,50 mg/ml. Temperaturområdet var mellom 20-22 °C. Beholderen inneholdende refoldingsblandingen ble hensatt åpen mot atmosfæren. Refolding ble tillatt å foregå i 16 timer. Konsentrasjonen av refoldet IL-21 ble bestemt til å være 0,27 mg/ml, noe som gir et renatureringsutbytte på 59,5 %.

C. Renaturering med cystein og cystindihydroklorid

[000176] Konsentrasjonen av IL21 i den solubiliserte fraksjon ble bestemt ved hjelp av reversfase-HPLC til å være 18,6 mg/ml. Bestemmelse av refoldingsbuffervolum ble basert på mengden av oppløst produkt og konsentrasjonen av IL-21 til stede i det oppløste produkt. Refoldingsbuffer (50 mM tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KC1, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05 % (w/v) PEG3350,1,0 M L-arginin, 4 mM cystein, 2 mM cystin-HCl, pH 7,5) ble avkjølt til romtemperatur (21 °C). Cystein og cystindihydroklorid ble løst straks før anvendelse.

[000177] Det oppløste produktet inneholdende IL-21 (20,5 ml) ble tilsatt sakte (0,5 time) til refoldingsbufferen (0,78 1) under omrøring. IL-21 ble tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,49 mg/ml. Temperaturområdet var mellom 20-22 °C. Beholderen inneholdende refoldingsblandingen ble hensatt åpen mot atmosfæren. Refolding ble tillatt å foregå i 21 timer. Konsentrasjonen av refoldet IL-21 ble bestemt å være 0,29 mg/ml, noe som gir et renatureringsutbytte på 58 %.

D. Renaturering med DTT og cystindihydroklorid

[000178] Konsentrasjonen av IL-21 i den solubiliserte fraksjonen ble bestemt ved hjelp av reversfase-HPLC til å være 18,6 mg/ml. Bestemmelse av refoldingsbuffervolum ble basert på mengden av oppløst produkt og konsentrasjonen av IL-21 til stede i det oppløste produkt. Refoldingsbufferen (50 mM tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KC1, 2 mM MgCl2,2 mM CaCl2, 0,05 % (w/v) PEG3350,1,1 M L-arginin, 2 mM DTT, 4 mM cystindihydroklorid, pH 7,5) ble avkjølt til romtemperatur (21 °C). DTT og GSSG ble løst straks før anvendelse.

[000179] Det oppløste produktet inneholdende IL-21 (20,5 ml) ble tilsatt sakte (0,5 time) til refoldingsbufferen (0,78 1) under omrøring. IL-21 ble tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,49 mg/ml. Temperaturområdet var mellom 20 til 22 °C. Beholderen inneholdende refoldingsblandingen ble hensatt åpen mot atmosfæren. Refolding ble tillatt å foregå i 16 timer. Konsentrasjonen av refoldet IL-21 ble bestemt å være 0,28 mg/ml, noe som gir et renatureringsutbytte på 58 %.

E. Tidspulsrefolding

[000180] Tidspulset refolding tilveiebringer en fremgangsmåte for å refolde humant IL-21 met til en sluttkonsentrasjon på 0,3 til 0,9 mg/ml. I ladningsrefoldingen ble sluttkonsentrasjonen av IL-21-protein i refoldingsbufferen optimalisert mellom 0,2 til 0,3 mg/ml. En høy konsentrasjon av arginin (IM) var nødvendig, og utbyttet i refoldingstrinnet var 40-50 %. Selv om dette er tilfredsstillende i henhold til konvensjonelle kriterier for proteinrefolding vil det være svært ønskelig å refolde IL-2 Imet ved enda høyere konsentrasjoner.

[000181] Fremstillingen av solubiliserte inklusjonslegemer var som beskrevet i eksempel 4 med det unntaket at sluttproteinkonsentrasjon er 15 mg/ml. En fortynning på 1:50 av det oppløste produktet ble oppnådd ved å benytte refoldingsbuffer som beskrevet. Løsningen ble deretter rørt i 3 timer ved romtemperatur. En prøve ble tatt på slutten av 3 timers perioden og sentrifugert. Supernatanten ble underkastet HPLC-analyse. Prosessen ble deretter gjentatt fire ganger til.

[000182] Det prosentvise utbytte av hensiktsmessig refoldet IL-2 Imet forble konstant i løpet av de første tre gjentagelsene, men gikk ned etter den fjerde repetisjonen. Den høyeste slutt-proteinkonsentrasjonen som ble oppnådd uten tap i utbytte var 0,9 mg/ml. Høy protein-konsentrasjon (> 0,3 mg/ml) i løpet av det tidlige stadium av refolding (< 3 timer) førte til lavere utbytte noe som skyldes aggregering. Med en gang refoldingen var fullstendig (> 3 timer) kan tilsetning av refoldingsstokk bli utført uten tap i utbytte. Den maksimale guanidin-hydrokloridkonsentrasjon i sluttrefoldingsbufferen var 0,3 til 0,6 M.

F. Refolding med DTT og cystin i minskede argininkonsentrasjoner

[000183] Konsentrasjonen av IL-21 i den solubiliserte fraksjonen ble bestemt ved hjelp av reversfase-HPLC til å være 14,53 mg/ml. Refoldingsbufferen (50 mM tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KC1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,05 % (w/v) PEG3350, 0,75 M L-arginin, 2 mM DTT, 4 mM cystin, pH 8,0) ble avkjølt til 21 °C. Cystin ble løst i 0,25 M NaOH til en konsentrasjon på 80 mM og tilsatt sammen med DTT rett før anvendelse.

[000184] Det oppløste produktet inneholdende IL-21 (96 ml) ble tilsatt sakte (1,0 time) til refoldingsbufferen (1,0 1) under omrøring. IL-21 ble tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,61 mg/ml. Temperaturområdet var mellom 14 -16 °C. Beholderen inneholdende refoldingsblandingen ble hensatt åpen mot atmosfæren. Refoldingen ble tillatt å foregå i 16 timer. Det refoldede IL-21 ble bestemt å være 0,40 mg/ml og gir et renatureringsutbytte på 66 %.

G. Volumetrisk refolding med DTT og cystin

[000185] Volumetrisk refolding er basert på volumet av oppløst IL-21 og ikke på konsentrasjon av IL-21 i det løste produkt. Konsentrasjonen av IL-21 i den solubiliserte

fraksjon ble bestemt ved hjelp av reversfase-HPLC til å være 26,1 mg/ml. Refoldingsbufferen (50 mM tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KC1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2, 0,05 % (w/v) PEG3350, 0,75 M L-arginin, 2 mM DTT, 4 mM cystin, pH 8,0 ble avkjølt til 15 °C. Cystin ble løst i 0,25 M NaOH til en konsentrasjon på 80 mM og tilsatt sammen med DTT rett før anvendelse.

[000186] Det løste produktet inneholdende IL-21 (935 ml) ble tilsatt sakte (2,0 timer) til refoldingsbufferen (28,0 1) under omrøring. IL-21 ble tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,83 mg/ml. Temperaturområdet var mellom 14 - 16 °C. Beholderen som inneholder refoldingsblandingen ble hensatt åpen mot atmosfæren. Refoldingen ble tillatt å foregå i 16 timer. Det refoldede IL-21 ble bestemt å være 0,51 mg/ml og gir et renatureringsutbytte på 61 %.

H. Volumetrisk refolding i WIB fra ZGOLDl

[000187] Konsentrasjonen av IL-21 i den solubiliserte fraksjonen ble bestemt ved hjelp av reversfase-HPLC til å være 29,9 mg/ml. Refoldingsbufferen (50 mM tris, 10 mM NaCl, 0,5 mM KC1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2, 0,05 % (w/v) PEG3350,0,75 M L-arginin, 2 mM DTT, 4 mM cystin, pH 8,0 ble avkjølt til 15 °C. Cystin ble løst i 0,25 M NaOH til en konsentrasjon på 80 mM og tilsatt sammen med DTT rett før anvendelse.

[000188] Det opplaste produktet inneholdende IL-21 (935 ml) ble tilsatt sakte (2,0 timer) til refoldingsbufferen (27,3 1) under omrøring. IL-21 ble tilsatt til refoldingsblandingen til en sluttkonsentrasjon på 0,96 mg/ml. Temperaturområdet var mellom 14 -16 °C. Beholderen som inneholdt refoldingsblandingen ble hensatt åpen mot atmosfæren. Refoldingen ble tillat å foregå i 16 timer. Det refoldede IL-21 ble bestemt å være 0,60 mg/ml og gir et renatureringsutbytte på 62,3 %.

Eksempel 12

A. Klaring av refoldet IL-21

[000189] Dette trinnet blir utført for å stoppe refoldingsreaksjonen og for å fjerne partikler fra den refoldede IL-21 .-løsningen. Refoldet IL-21 blir typisk justert til pH 5,5 og deretter passert gjennom et nominelt filter på 1,2 um. I noen tilfeller blir ikke pH justert før filtreringen og i andre tilfeller kan et filter av ulik størrelse (0,45 - 2,0 um) eller type bli benyttet. Det er mulig å fjerne partiklene ved sentrifugering ved å benytte en Carr-powerfuge-kontinuerlig sentrifuge (Carr Separation, Inc., Franklin, MA) eller ved sentrifugering i flasker.

[000190] Etter refolding behøver konduktiviteten i bufferløsningen å bli redusert for påsetning på SP550-C-innfangingsresin. Den uklare løsningen trenger også å bli filtrert for å fjerne ufoldet IL-21 og presipiterte is.cø/z-proteiner. I ett eksempel ble 29,5 1 med refoldet buffer inneholdende refoldet IL-21 fortynnet med 1,4 deler (42,01) med 25 mM acetatbuffer pH 5,5. Løsningen ble tillatt å presipitere ved romtemperatur i 4 timer. Løsningen ble deretter filtrert gjennom et Cuno-Zeta-Plus-dybdefilter på 1,2 - 0,8 um.

B. Fortynning og klaring av refoldet IL-21

[000191] Dette trinnet er til for å stoppe refoldingsreaksjonen, fortynne det refoldede materialet for å muliggjøre binding til kationbytterkromatografi og for å fjerne partikler fra den refoldede IL-21-løsningen. Refoldet IL-21 blir typisk justert til pH 5,5 og deretter fortynnet 1,4 ganger med 25 mM natriumacetat, pH 5,5. Denne løsningen blir tillatt å bli stående i omtrent fire timer ved romtemperatur med utsikter til å forbedre fysisk separasjon av løselige og uløselige proteiner som er til stede i den fortynnede refoldingsløsningen. Den hensatte og fortynnede refoldingsløsningen som for det meste er fri for partikler blir deretter typisk passert gjennom et dybdefilter 1,2 til 0,8 um (Cuno Zeta Plus A30M03).

Eksempel 13

Konsentrasjon av klaret, refoldet IL-21

[000192] Klaret, refoldet IL-21 blir konsentrert 10 ganger til 30 ganger ved hjelp av tangentiell-strøm-filtrering. De tangentielle-strøm-filtreringsapparatene og -membranene (Millipore, Pellicon Biomax 5 kDa molekylvektsgrenseplate (Millipore, Bedford, MA) og rammesystemer eller hulfibersystemer med 10 kDa molekylvektsgrense fra Amerham Biosciences) blir renset ved å benytte 0,5 M NaOH og skylt med vann. For refoldet IL-21 fra 11 fermenteringsbuljong blir et membranareal på 0,2 m<2>til 0,3 m<2>benyttet med en kryss-strømningshastighet på omtrent 48 l/t og et transmembrantrykk på 20 psi til 30 psi.

Eksempel 14

Innfanging av refoldet IL-21

A. Kationbytting ved å benytte TOYOPEARL-SP-550-C-resin

[000193] Etter konsentrering fanges IL-21 på en kationbytterkolonne. I et eksempel fortynnes det konsentrerte IL-21 3 ganger med vann eller 25 mM natriumacetat, pH 5,5. Et presipitat dannes som fjernes ved filtrering etter 30 minutter inkubering ved romtemperatur. Et Millipor-Polysep-II-filter på 1,2 um (Millipore) eller en Cuno-Zeta-Plus-A30M03-membran på 1,2 -0,8 um (Cuno, Meriden, CN) blir benyttet. Det filtrerte IL-21 påsettes en kolonne med TOYOPEARL-SP550C-resin (Tosoh Biosep) som er balansert med balanseringsbuffer (25 mM natriumacetat, 0,2 M NaCl, pH 5,5). Kolonnen blir påsatt ved en kapasitet på 6-10 g IL-21 per 1-resin, høyden på pakkematerialet er 15 cm, UV-absorbans ved 280 nm og 215 nm overvåkes og en strømningshastighet på 150 cm/t benyttes. Etter påsetning vaskes kolonnen med balanserings-buffer inntil UV-absorbansen returnerer til baselinje. Kolonnen vaskes deretter med 4 kolonnevolumer med 50 % balanseringsbuffer, 50 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, 1,0 M NaCl, pH 5,5). IL-21 elueres fra kolonnen med 25 % balanseringsbuffer, 75 % elueringsbuffer. Etter påsetning av IL-21 på kolonnen og vasking med balanseringsbuffer elueres IL-21 alternativt fra kolonnen med 10 kolonnevolum lineær gradient fra 100 % balanseringsbuffer til 100 % elueringsbuffer.

[000194] Etter pH-justering, fortynning, ventetrinn og filtrering ved å benytte dybde-filtrering, fanges alternativt IL-21 på kationbytterkromatografi. Den filtrerte løsningen settes på en kolonne med TOYOPEARL-SP-550-C-resin (Tosoh Biosep) og balansert med balanseringsbufferbetingelser (25 mM natriumacetat, pH 5,5, 0,4 M NaCl). Kolonnen påsettes til en kapasitet på 6 til 15 g IL-21 per L-resin. UV-absorbans ved 280 nm og 215 nm overvåkes og strømningshastighet på 150 cm/t benyttes. Etter påsetning vaskes kolonnen med balansering-buffer inntil UV-absorbansen returnerer til baselinje. IL-21 elueres fra kolonnen ved å benytte en trinngradient til 100 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, pH 5,5, 0,75 M NaCl).

B. Kationbytterkromatografi ved å benytte SP-sepharose-XL-resin

[000195] Det konsentrerte IL-21 fortynnes 10 ganger med 25 mm, natriumacetat pH 5,5. Et presipitat dannes som fjernes ved filtrering etter 30 minutter inkubering ved rom-temperatur. Et Millipore-Polypro-XL-filter på 1,2 um (Millipore) benyttes etterfulgt av et Whatman-Polycap-75-AS-filter på 0,45 um (Maidstone, Kent, UK). Det filtrerte IL-21 settes på en kolonne med SP-sepharose-XL-resin fra Amersham Biosciences som er balansert med balanseringsbuffer (25 mM natriumacetat, 0,2 M NaCl, pH 5,5). Kolonnen påsettes med en kapasitet på 3 - 6 g IL-21 per L-resin, høyden på pakkematerialet er 15 cm, UV-absorbans ved 280 nm og 215 nm overvåkes og strømningshastighet på 150 cm/t benyttes. Etter påsetting vaskes kolonnen med balanserings-buffer inntil UV-absorbans returnerer til baselinje. Kolonnen vaskes deretter med 4 kolonnevolumer med 25 % balanseringsbuffer, 75 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, 1,0 M NaCl, pH 5,5). IL-21 blir eluert fra kolonnen med 50 % balanseringsbuffer, 50 % elueringsbuffer.

C. Kationbytterkromatografi ved å benytte Streamline-SP-XL-resin

[000196] I et annet eksempel konsentreres ikke IL-21 ved hjelp av tangentiell-strøm-filtrering før innfanging med kationbytterkromatografi. Etter refolding justeres pH til 5,5 og materialet filtreres gjennom et nominelt filter på 1,2 um. En streamlinekolonne fra Amersham Biosciences pakket med Streamline-SP-XL fra Amersham Biosciences balanseres med balanseringsbuffer (25 mM natriumacetat, 0,2 M NaCl, pH 5,5). Etter balansering settes det filtrerte det, pH-justerte IL-21 på kolonnen ved å benytte intern fortynning, dvs. 30 % filtrert, pH-justert, refoldet IL-21 og 70 % vann påsettes ved å benytte kromatografisystemet til å generere det korrekte forholdet. IL-21 settes på kolonnen i en oppoverstrømmende retning ved å benytte en strømningshastighet som forårsaker en togangers utvidelse av resinet sammenlignet med den stillestående pakkematerialhøyden. Med en gang det filtrerte, pH-justerte, refoldede IL-21 er påsatt erstattes det med balanseringsbuffer. Pumping inn på kolonnen fortsetter deretter med 30 % balanseringsbuffer og 70 % vann inntil konduktiviteten som registreres ved kolonnens inntak er < 10 mS/cm. Kolonnen vaskes deretter med balanseringsbuffer i oppoverstrømmende modus med en 2-gangers stillestående pakkematerialekspansjon inntil UV-absorbansen ved 280 nm returnerer til baselinje. Strømningen stoppes deretter og resinpakkematerialet tillattes å sette seg. Stempelet på Streamline-kolonnen senkes til nivået på pakkematerialet og kolonnen vaskes med balanseringsbuffer i nedoverstrømmende modus med 2 kolonnevolumer ved en strømnings-hastighet på 150 cm/t. IL-21 blir deretter eluert med 50 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, 1,0 M NaCl, pH 5,5) og 50 % balanseringsbuffer i nedoverstrømmende modus ved 150 cm/t.

Eksempel 15

Intermediær rensing av IL-21 ved hjelp av hydrofobinteraksjonskromatograf

A. Hydrofob interaksjonskromatografi (HIC) ved å benytte butyl-sepharose-resin

[000197] IL-21 blir justert til 1,5 M ammoniumsulfat ved å tilsette 198 g fast ammoniumsulfat per liter IL-21-løsning. Løsningen blir rørt inntil ammoniumsulfatet er løst og deretter blir fast materiale fjernet ved filtrering gjennom et nominelt filter med en grense på 0,45 um. I et eksempel blir en 15 cm høy kolonne fra Amersham Biosciences med butyl-sefarose-4-FF balansert med balanseringsbuffer (25 mM natriumacetat, 50 mM natriumklorid, 1,5 ammoniumsulfat, pH 5,5). Den justerte, filtrerte IL-21-løsningen blir satt på kolonnen ved en kapasitet på 1,0 - 2,5 g IL-21 per L-resin ved en strømningshastighet på 150 cm/t. UV-absorbans ved 280 nm og 215 nm blir overvåket. Etter påsetning blir kolonnen vasket med balanseringsbuffer inntil UV-absorbans returnerer til baselinje. IL-21 blir eluert fra kolonnen med 50 % balanserings-buffer og 50 elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, 50 mM natriumklorid, pH 5,5). Etter påsetning av IL-21 på kolonnen og vasking med balanseringsbuffer blir alternativt IL-21 eluert fra kolonnen med en 10 kolonners volumlineærgradient fra 100 % balanseringsbuffer til 100 % elueringsbuffer.

B. HIC ved å benytte TOYOPEARL-650M-resin.

[000198] I et annet eksempel blir et annet resin, Tosoh Biosep TOYOPEARL butyl 650M benyttet for å rense IL-21. Fremgangsmåten er den samme som den som blir benyttet med butyl-sepharose-FF-resinet med de følgende unntak: kationbyttereluatet blir justert til 1,5 M (NH4)2S04ved å benytte en stokkløsning på 3,5 M på (NH^SCU, den justerte filtrerte IL-21-løsningen blir satt på kolonnen ved en kapasitet på 10 -12 g IL-21 per L-resin, etter påsetning blir kolonnen vasket med balanseringsbuffer inntil UV-absorbans returnerer til baselinje, IL-21 blir eluert fra kolonnen med 100 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, pH 5,5,0,05 NaCl, 0,15 M (NH4)2S04).

Eksempel 16

A. Konsentrering og bufferskifting av renset IL-21 til fosfatbufret saltløsning

[000199] Etter rensing blir IL-21 utsatt for ultrafiltrering og diafiltrering for å konsentrere den og bytte den over til en buffer som er hensiktsmessig for lagring. Et tangentiell-strøm-filtreringsapparat og membraner (plate- og rammesystem med 5 kDa molekylvekstsgrense fra Millipore Pellicon Biomax) blir renset ved å benytte 0,5 M NaOH og skylt med vann. For renset IL-21 fra 11 fermenteringsbuljong blir et membranareal på 0,1 m<2>eller mindre benyttet med en kryss-strømningshastighet på omtrent 20 - 25 l/t og et transmembrantrykk på 10 psi til 15 psi. IL-21 blir konsentrert til omtrent 15-20 mg/ml og deretter diafiltrert mot omtrent 5-10 diavolumer med fosfatbufret saltoppløsning, pH 6,0. Det konsentrerte IL-21 i ny buffer lagres ved -80 °C.

B. Konsentrering og buffer skifte for renset IL-21 til histidin/mannitolbuffer

[000200] Etter rensing med SP-HP-sepharose underkastes IL-21 ultrafiltrering og diafiltrering for å konsentrere og skifte renset IL-21 over i en buffer som er hensiktsmessig for lagring. Et tangentiell-strøm-ifltreringsapparat og membraner (plate- og rammesystem med 5 kDa-molekylvektsgrense fra Millipore Pellicon Biomax) blir renset ved å benytte 0,5 M NaOH og skylt med vann. For renset IL-21 fra 11 fermenteringsbuljong blir et membranareal på 0,1 m<2>eller mindre benyttet med en kryss-strømningshastighet på omtrent 30 l/t ved et transmembrantrykk på 25. IL-21 blir konsentrert til omtrent 10-15 mg/ml og deretter diafiltrert mot omtrent 5 -10 diavolumer av 10 mM histidin, 4,72 (w/v) mannitol, pH 5,0 - 5,3. Den resulterende løsningen blir sterilfiltrert.

Eksempel 17

Ytterligere rensing av IL- 21

A. Kationbytterkromatografi ved å benytte SP-HP-sepharose-resin for polering

[000201] Ytterligere rensing ved å benytte SP-HP-sepharose blir utført for ytterligere å forbedre total renhet. TOYOPEARL-butyl-650M-eluatet blir fortynnet til 30 mS/cm med vann og deretter justert til pH 6,0 ved å benytte en dibasisk natriumfosfatstokkløsning. Den justerte løsningen blir deretter filtrert ved å benytte et filter på 0,22 um. Det filtrerte materialet blir satt på kolonnen med 10 -15 g i IL-21 per liter resin på en kolonne balansert med 50 mM fosfat, pH 6,0, 0,3 M NaCl. UV 280 nm og UV 215 nm blir benyttet for å overvåke kromatografien. Etter påsetning blir kolonnen vasket med balanseringsbuffer inntil UV når baselinje. IL-21 blir eluert fra kolonnen ved å benytte en 20-kolonners volumgradient til 100 % elueringsbuffer (50 mM fosfat, pH 6,0,0,7 M NaCl).

B. Anionbytterkromatografi

[000202] IL-21 blir passert gjennom en anionbytterkolonne for å fjerne endotoksin. En kolonne med Q-sepharose-FF fra Amersham Biosciences blir balansert med balanseringsbuffer (20 mM tris, pH 8,0). IL-21-løsningen blir justert til en konduktivitet på < 10 mS/cm med balanseringsbuffer. Den justerte IL-21 blir satt på kolonnen med en strømningshastighet på 150 cm/t. IL-21 binder ikke til kolonnen og blir samlet i det som passerer rett igjennom. I andre eksempler kan DEAE-sepharose-FF-resin fra Amersham Biosciences eller Pall-Mustang-Q-membranen bli benyttet istedenfor Q-sepharose-FF for å rense IL-21.1 ytterligere andre eksempel har pH-verdier i området fra 5,0 til 9,0 blitt vist å føre til at IL-21 passerer gjennom anionbyttermediet.

C. Hydrofob interaksjonskromatografi

[000203] I andre eksempler har hydrofob interaksjonskromatografi ved å benytte betingelser som er forskjellige fra de som er beskrevet ovenfor med butylresin blitt benyttet for å rense IL-21. Fenyl-sepharose-FF-high-sub fra Amersham Biosciences, fenyl-sepharose-HP fra Amersham Biosciences og butyl-sefarose-4-FF fra Amersham Biosciences, kan bli benyttet som resin i både bindings- og gjennomstrømningsmodus. For å binde IL-21 blir kolonnene balansert til 25 mM natriumacetat, 50 mM natriumklorid, 1,5 M ammoniumsulfat, pH 5,5. IL-21 blir justert til 1,5 M ammoniumsulfat ved å tilsette fast ammoniumsulfat og røre inntil det blir løst. Den justerte IL-21-løsningen blir satt på den balanserte kolonnen med en strømningshastighet på 150 cm/t. UV-absorbans ved 280 nm og 215 nm blir overvåket. Etter vasking blir IL-21 eluert fra kolonnen med en 10-kolonners volumlineærgradient fra 100 % balanseringsbuffer til 100 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, 50 mM NaCl, pH 5,5). I gjennomstrømningsmodus blir den IL-21-inneholdende løsningen justert til 1,0 M eller mindre med ammoniumsulfat og satt på en kolonne balansert med 25 mM natriumacetat, 50 mM NaCl, 1,0 M ammoniumsulfat, pH 5,5. Løsningen som går rett igjennom kolonnen blir oppsamlet.

[000204] I andre eksempler har hydrofobe interaksjonskromatografi ved å benytte natriumsulfat som salt heller enn ammoniumsulfat blitt benyttet for å rense IL-21. Fenyl-sepharose-FF-high-sub, fenyl-sepharose-HP og butyl-sefarose-4-FF fra Amersham Biosciences kan bli benyttet som resin. Kolonnene blir balansert til 25 mM natriumacetat, 50 mM natriumklorid, 1,5 M natriumsulfat, pH 5,5. IL-21 blir justert til 1,5 M natriumsulfat ved å tilsette fast natriumsulfat og røre inntil natriumsulfatet er løst. Den justerte IL-21-løsningen blir satt på den balanserte kolonnen med en strømningshastighet på 150 cm per time. UV-absorbans ved 280 nm og 215 nm blir overvåket. Etter vasking blir IL-21 eluert fra kolonnen med en 10-kolonnevolumslineær-gradient fra 100 % balanseringsbuffer til 100 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, 50 mM NaCl pH 5,5).

[000205] I et annet eksempel ble HIC-FPLC-gj ennomstrømning utført på et BIOCAD-700E-FPLC-system (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) utstyrt med en butyl-sefarose-4-FF-kolonne (Amersham Biosciences). Kolonnen ble klargjort med 25 mM NaOAc, 600 mM NaCl, 1 M (NH4)2S04. pH 5,5. Fast (NH4)2S04 ble tilsatt til kationbyttereluatet til en sluttkonsentrasjon på 1 M. Løsningen ble satt på kolonnen og IL-21 ble oppsamlet i løsningen som går rett igjennom.

D. IMAC ved å benytte metallkelaterende sepharose

[000206] Relaterende sepharose fra Amersham Biosciences blir benyttet for ytterligere å rense IL-21. Oppsamlet i IL-21 -CIE-eluat blir satt på en kolonne ladet med kobber-, sink- eller nikkel-ioner deretter balansert med 25 mM natriumacetat, pH 5,5, 0,8 M NaCl. UV 280 nm og UV 215 nm blir benyttet for å overvåke kromatografien. Kolonnen blir deretter vasket med balanserings-buffer til baselinje og eluert ved å benytte en 10-CV-gradient til 100 % elueringsbuffer (25 mM natriumacetat, pH 5,5,0,8 M NaCl, 0,5 M imidizol).

Eksempel 18

A. Reversfase-HPLC-analyse av løseliggjort IL-21 i acetonitrilbuffer

[000207] Fremgangsmåten som blir beskrevet her blir benyttet for kvantifisere IL-21 i solubiliserte inklusjonslegemeprøver og rensede prøver. En Jupiter C5-kolonne på 4,6 x 50 mm (300 Å, 5fim, Phenomenex) blir benyttet på et 1 100-serie-HPLC-system fra Agilent Technologies med termostatutstyrt autoprøvetaker og termostatutstyrt kolonneavdeling. Et prekolonnefilter på 0,2fim blir plassert foran kolonnen. Mobilfase-A er 0,1 % TF A i HPLC-grad vann og mobilfase-B er 0,1 TFA i acetonitril.

[000208] Elueringsgradient/tidstabellen for rensede prøver er som følger:

[000209] Elueringsgradient/tidstabellen for solubiliserte inklusjonslegemeprøver er:

[000210] Kolonnen blir balansert til utgangsbetingelsene i elueringsgradient/tidstabellen inntil en stabil baselinje blir oppnådd.

[000211] Fremgangsmåteparametere er som følger:

1. Strømningshastighet: 1 ml/minutt

2. Total kjøretid: 20 minutter

3. Kolonnetemperatur: 40 °C

4. Autoprøvetakertemperatur: 8 °C

5. Maksimalt kolonnetrykk: 240 bar

6. Injektor inngangshastighet: 100fil/minutt

7. Injektor utgangshastighet: 100fil/minutt

8. Bølgelengde for innsamlede data fra diodeoppstillingsdetektorsignal A: 280 nm, 25

nm båndbredde

9. Bølgelengde for dataovervåkning for diodeoppstillingsdetektorsignal B: 215 nm, 10

nm båndbredde

10. Referansebølgelengde for diodeoppstillingsdetektordata: signal A: 350 nm, 25 nm

båndbredde, signal B: 350 nm, 25 nm båndbredde

11. Autobalanse for diodeoppstillingsdetektor: prekjøring/postkjøringsmodus

12. Toppbredderesponstid: > 0,1 minutt

13. Spaltebredde: 4 nm

14. Nålvaskefunksjon: programmert for å redusere oppbyggingen av guanidin på nålen og nålesetet.

[000212] For kvantifisering av ufoldet IL-21, blir IL-21 referansestandard fortynnet til 0,5 mg/ml med 50 mM tris, pH 7,5,6 M guanidin HC1,10 mM DTT og varmet ved 40 °C i 20 minutter. Fortynnet referansestandart blir injisert på kolonnen minst fem nivåer mellomlO jag og 50 [ ig (for eksempel 10,20,30,40 og 50 fig-injeksjoner). Solubiliserte IL-21-prøver blir spunnet i en mikrosentrifuge og fortynnet 1:10 i 50 mM tris, pH 7,5, 6 M guanidin-HCl før injisering av

25 fil prøve.

[000213] For kvantifisering av foldet IL-21 blir IL-21 -referansestandart fortynnet til 1,0 mg/ml med fosfatbufret saltløsning, pH 6,0. Foldede IL-21-prøver blir injisert på HPLC uten noen behandling. Etter kromatografering blir arealet under IL-21-toppene integrert. En standardkurve blir konstruert og konsentrasjonen av IL-21 i prøvene blir avlest fra standardkurven.

B. Metanolbasert RP-HPLC for kvantifisering av IL-21

[000214] En femten-minutters metanolbasert RP-HPLC-fremgangsmåte kan også bli benyttet for å evaluere IL-21-preparater som strekker seg fra solubiliserte inklusjonslegemer til sluttprodukt.

[000215] Fremgangsmåteparametere for IL-21 -metanolbasert RP-HPLC-analyse er som følger:

Kolonne: Zorbax 300SB-CN (4,6 x 50 mm), 3,5 mikron

Mobilfase-A: 0,154 % TF A, HPLC-grad vann

Mobilfase-B: 0,154 % TF A, metanol

Eluerings gradi ent/tidstabell

Total kjøretid: 15 minutter

Kolonnetemperatur: 40 °C

Autoprøvetakertemperatur: 5 °C

Injektorinntakshastighet: 90fil/minutt

Injektorutgangshastighet: 90 ul/minutt

DAD-overvåkningsbølgelengde: signal A: 280 nm, 8 nm båndbredde signal B: 215 nm, 8 nm båndbredde signal C: 280 nm, 6 nm båndbredde

(referansebølgelengde AV)

Bølgelengde for DAD-datainnsamling: signal A: 280 nm, 8 nm båndbredde

DAD-referansebølgelengde: signalene A og B, 360 nm, 16 nm båndbredde DAD-autobalanse: prekjøring/postkjøringsmodus

Båndbredderesponstid: > 0,1 minutt

Spaltebredde: 4 nm

Margin for negativ absorbans: 100 mAu

Grense for mengde påsatt standardkurve: 1 - 20 |ag

Minste injeksjonsvolum: 5 fil

Største injeksjonsvolum: 100 fil

Trykkbegrensning: 350 bar

Normalt kjøretrykk: 130 - 200 bar

Eksempel 19

OmpT- manglende stamme til ekspresjon av IL- 21

A. Konstruering av en ny vertstamme for produksjon av IL-21

[000216] Den nåværende prosessen for fremstilling av IL-21 inkluderer ekspresjon i E. coli-verten W3110 [F- mcrA mcrB IN(rrnD- rrnE)l X-]. Selv om W3110 er en robust vert for produksjon av IL-21 er den ikke ideell for nedstrømsprosessering. Ved cellelysering blir IL-21 kløyvd ved lysin 74 (som vist i SEKV. ID. NR.: 28) ved hjelp av OmpT-proteasen som foreligger i den ytre membranen. Denne proteasen er kjent for å kløyve andre heterologe rekombinante proteiner, inkludert FGF-18. Proteolyse av IL-21 forekommer ikke i stammer som mangler OmpT, slik som BL21 [F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dem lon]. Sev om OmpT-aktivitet kan bli minimalisert i løpet av cellelysering ved hjelp av tilsetningen av ZnS04eller Q1SO4måtte renseskjemaet bli designet for å fjerne trunkert IL-21 fra sluttproduktet. I et forsøk på å strømlinjeforme prosessen for produksjon av IL-21 ble OmpT-proteasen fjernet fra W3110 for å danne en ny produksjonsstamme. Konstruksjonen av denne nye E. coli-vertstammen er beskrevet nedenfor.

B. Konstruksjon av plasmid PCHANl for ekspresjon av rekombinaseoperonet Red

[000217] En strategi basert på homolog rekombinasjon ble benyttet for å fjerne OmpT-proteasen fra W3110. For å fjerne genene effektivt fra is.cø/z-kromosomet ved hjelp av homolog rekombinasjon må visse enzymer med rekombinaseaktivitet være til stede i cellen. For å oppnå dette ble et plasmid konstruert som inneholdt Red-rekombinaseoperonet fra bakteriofag X. Et fragment inneholdende Red-rekombinasegenet ble syntetisert fra bakteriofag X-DNA (New England Biolab) ved hjelp av PCR ved å benytte rekombinasjonspesifikke primere ZC43,586 (SEKV. ID. NR.: 29) og ZC43,587 (SEKV. ID. NR.: 30). Reaksjonen inneholdt 100 pmol av hver av primerne ZC43,586 og ZC43,587,10 ul med 10X PCR-buffer, (Boehringer Mannheim), 1 fil Pwo-polymerase (Boeheringer Mannheim). 10 fil med 0,25 mM nukleotidtrifosfatblanding (Perkin Eimer) og dH20 i et sluttvolum på 100 fil. PCR-reaksjonen besto av en enkel 5 minutters syklus ved 94 °C etterfulgt av 30 sykluser med 1 minutt ved 94 °C, 1 minutt ved 50 °C og 1 minutt ved 72 °C. Den siste av de 30 syklusene ble etterfulgt av en 5 minutters forlenging ved 72 °C og reaksjonen ble sluttført med en hvile over natt ved 4 °C. Det resulterende fragmentet på 1964 basepar (bp) inneholdt Red-rekombinaseoperonet (SEKV. ID. NR.: 31). Nukleotidsekvensen som vist i SEKV. ID. NR.: 31 koder for tre gener, Gam( y) som vist fra nukleotider 41 - 454, Bet( fi) som vist fra nukleotider 463 -1245, Exo som vist fra nukleotider 1245 - 1922.

[000218] Red-rekombinaseoperonet ble inkorporert i et plasmid ved hjelp av homolog rekombinasjon i gjær. Kompetente gjærceller (100 ul med S. cerevisiae SF838-9Dct) ble kombinert med 100 ng Smal-fordøyd pTAP399 (deponert hos American Type Culture Collection i Manassas, VA. (ubetegnet ved innsendingstidspunkt)), akseptorvektor og 1 |ug av PCR-fragmentet fira ovenfor. Gjær/DNA-blandingen ble overført til en elektroporeringskuvette på 0,2 cm og pulsert ved 0,75 kV (5 kV/cm) uendelig Q 25 |uF kapasitor. Transformeringsblandingen ble deretter tilsatt til 1 ml med 1,2 M sorbitol og inkubert ved 30 °C i 1 time. Cellene ble platet i 500 ul volumer på to URA-DS-plater (2 % dekstrose, 2 % sorbitol) og inkubert ved 30 °C i 2 dager. Etter omtrent 48 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra platene suspendert i 2 ml H20 og spunnet til en pellet ved sentrifugering. Cellepelleten ble resuspendert i 1 ml Qiagen Pl-lyseringsbuffer (Qiagen) og overført til et rent rør inneholdende 1 ml 0,5 mm zirkonia/- silikakuler (Biospec Products Inc.). Cellene ble lysert, prøver ble tillatt å hvile, 250 ul med lysat ble overført til et rent rør og plasmid-DNA ble isolert ved å benytte Qiagen-Spin-Miniprep-settet i henhold til produsentens instruksjoner.

[000219] Elektrokompetente Æ.cø/z-DHlOB-celler (Invitrogen) ble transformert med 1 ul gjær-DNA-prep. Cellene ble pulset i kuverter på 0,1 cm ved 2,0 kV, 25 |jF og 100 Q. Etter elektroporering ble 250 fil SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5 % gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1,10 mM MgCl2,10 mM MgS04,20 mM glukose) tilsatt til hver prøve. Cellene ble tillatt å hente seg inn igjen ved 37 °C i 2 timer. Hele prøven på 250 ul ble platet i et volum på en LB-plate (LB broth (Lennox), 1,8 % Bacto Agar (Difco) inneholdende 25/1 kanamycin (Sigma). Plater ble inkubert ved 37 °C over natt. Individuelle kloner som inneholder Red-rekombinaseoperonet blir identifisert ved hjelp av restriksjonsfordøying for å bekrefte tilstedeværelse av innskudd. Innskuddene av positive kloner ble underkastet sekvensanalyse. Et plasmid inneholdende det korrekte innskuddet ble betegnet pCHANl.

[000220] Gjærsekvensen ble deretter fjernet fira vektorstrukturen på pCHANl. 3,0 fil plasmid-DNA ble inkubert over natt med 24,3 fil H20, 2,7 fil buffer-H (Roche) og 2,0 Noti (New England Biolabs) ved 37 °C. 5 ul av overnattfordøyingen ble blandet med 1 fil med 6x DNA-prøvefarge (25 % Ficoll type 400 (Sigma) 0,25 % bromfenolblått (EM Science), 0,25 % xylencyanol (Kodak Biomedicals Inc.)) og 4 fil av denne løsningen ble kjørt på en 1 % agarosegel (EM Science) for å bekrefte fullstendig fordøying. For å resirkularisere plasmidet ble 14 fil av overnatt-Notl-fordøyingen blandet med 4 fil med 5x ligeringsbuffer (Invitrogen) og 2 ul ligase (Invitrogen). Ligeringen ble inkubert over natt ved 25 °C.

[000221] Den religerte pCHAN 1 ble transformert inn i W3110. Elektrokompetente W3110-celler (50 ul) ble transformert med 1 ul pCHANl-DNA ved å benytte elektroporeringsprotokollen for E. coli beskrevet ovenfor. Etter gjenvinning ble hele transformeringsblandingen på 250 fil platet ut i et volum på 1 LB-plate inneholdende 25 mg/l kanamycin. Plater ble inkubert ved 37 °C over natt og ti av de resulterende klonene ble plukket for ytterligere analyse. De ble dyrket ved 37 °C over natt i 2,0 ml Superbroth II (Becton Dickinson) inneholdende 25 ug/ml kanamycin. Den påfølgende dagen ble 1,0 ml av overnattfordøyingen benyttet til å bekrefte nærværet av pCHANl. Qiagen Spin Miniprep-settet ble benyttet til å fremstille plasmid-DNA ved å følge produsentens instruksjoner. Identiteten til plasmidet ble bekreftet ved hjelp av restriksjonsfordøying ved å benytte EcoRI (Gibco BRL) og Noti (New England Biolabs). Isolat #3 ble valgt for ytterligere eksperimentering og navngitt EE670.

Fremstilling av et tetrasvklinfragment til generstatning i W3110

[000222] Tetrasyklingenet ble valgt som en passende markør for homolog rekombinasjon inn i OmptT-lokus, for å gjøre OmpT-genet inaktivt. Tetrasyklinfragmentet promoter: :tetrasyklin (tet::tet) ble fremstilt ved hjelp av PCR fra pBR322 DNA (New England Biolabs) ved å benytte rekombinasjonspesifikke primere ZG45,112 (SEKV. ID. NR.: 32) og ZG45,171 (SEKV. ID. NR.: 33). Reaksjonsblandingen inneholdt 100 pmol hver av primere ZG45,112 og ZG45,171,10 fil med 10X PCR-buffer (Boehringer Mannheim), 1 fil Pwo polymerase (Boehringer Mannehim), 10 fil 0,25 mM nukelotidtrifosfatblanding (Perkin Eimer) og dH20 i et sluttvolum på 100 ul. Betingelsene for PCR-reaksjonen var 1 syklus på 2 minutter ved 94 °C etterfulgt av 30 sykluser på 30 sekunder ved 94 °C, 1 minutt ved 50 °C og 2 minutter ved 72 °C. Dette ble etterfulgt av en 7-minutters forlengelse ved 72 °C og hvile over natt ved 4 °C. Det resulterende fragmentet på 1590 bp bærer tet::tet (SEKV. ID. NR.: 34).

[000223] PCR-reaksjonen ble satt på en preparativ agarosegel på 1 % for å rense tet1": :tet-fragmentet. tet::tet-fragmentet ble kuttet ut av gelen og plassert i et eppendorfrør på 0,5 ml med et lite hull i bunnen som var kantet med aquarium filter floss (Finny Products, Inc., Cincinatti, OH). Røret ble satt inn i et eppendorfrør på 1,5 ml og spunnet på en bordsentrifuge ved 14 000 rpm i 10 minutter ved 25 °C. Væsken i bunnen av 1,5 ml-røret ble blandet med 10 % (vol/vol) 3 M NaOAc og 2 volumer med 100 % etanol. Prøven ble inkubert på - 20 °C i 10 minutter og sentrifugert i 10 minutter ved 4 °C i en bordsentrifuge for å presipitere PCR-fragmentet. Supernatanten ble aspirert og pelleten ble resuspendert i 50 fil H20. tet::tet-fragmentet forelå ved en arbeidskonsentrasjon på 50 ng/fil.

[000224] PCR-fragmentet ble ligert inn i pCR4.0-BLUNT-TOPO-vektoren (Invitrogen) for å benyttes som en positiv kontroll for generstatningseksperimenter. Ligeringen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. is.cø/7-DH10B-celler (Invitrogen) ble transformert med 2 ul av tet::tet-DNA-fragmentet ved å benytte elektroporeringsprotokollen for E. coli beskrevet ovenfor. Etter gjenvinning ble hele transformeringsblandingen på 250 fil platet på en LB-plate inneholdende 100 mg/l ampicillin (Sigma). Plater ble inkubert ved 37 °C over natt.

[000225] Ti kloner ble plukket for ytterligere analyse. De ble dyrket over natt i 2,0 ml Superbroth II (Becton Dickinson) inneholdende 100 ug/ml ampicillin ved 37 °C. Den påfølgende dag ble 1,0 ml av overnattkulturen benyttet til å bekrefte nærværet av plasmid-DNA. Qiagen-Spin-Miniprep-settet ble benyttet til å fremstille plasmid-DNA ved å følge produsentens instruksjoner. Plasmid-DNA ble underkastet restriksjonsanalyse ved å benytte Sali (New England Biolabs) og Pstl (New England Biolabs) for å bekrefte plasmididentitet og innskudds-orientering. Isolat #1 ble plukket for ytterligere eksperimentering. Plasmidet ble kalt pSDH185 og klonen EE686.

Generstatning i W3110: Fjerning av OmpT- genet

[000226] En 500 ml kultur av W3110/pCHAN 1 ble dyrket ved 37 °C i SOB-medium [20 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 0,5 g/l NaCl, 10 ml/l med 250 mM KC1, 5 ml/l med 2 M MgCl2, pH 7,0] til en OD600på 0,6. Kulturen ble delt i fire kulturer på 125 ml. En kultur ble hensatt som en uindusert kontroll mens de andre tre ble indusert med 1 mM IPTG i 15 minutter, 30 minutter eller 60 minutter. Ved slutten av de respektive inkuberingene ble kompetente celler fremstilt fra alle fire kulturer på følgende måte. Celler ble spunnet ned til pellet ved hjelp av sentrifugering ved 5 000 rpm i 10 minutter. Supernatantene ble helt av og hver pellet ble resuspendert i 62,5 ml iskald H2O. Kulturene ble spunnet til pellet igjen, supernatanten ble helt av og hver pellet ble resuspendert i 31,25 ml kald 10 % glyserol. Kulturene ble deretter sentrifugert ved 8 000 rpm i 5 minutter. Pelletene ble skilt nøye fra supernatantene og resuspendert i 10 % glyserol.

[000227] Alle fire kulturer ble delt i seks volumer på 50 ul som ble transformert på

følgende måter: 1) negativ kontroll uten DNA, 2) 1 ul (1 ug/ul) pBR322 (New England Biolabs) positiv kontroll, 3) 1 fil (1fig/fil) pTAP279 positiv kontroll, 4) 1 fil pSDH185 positiv kontroll, 5) 2 fil (50 ng/fil) tet^tet-fragment og 6) 4 fil (50 ng/fil) tet^tet-fragment. Cellene ble transformert ved elektroporering som beskrevet ovenfor for E. coli. Hele transformeringblandinger ble platet på LB-plater inneholdende 10 mg/l tetrasyklin (Sigma) bortsett fra for pTAP279-kontrollene som ble platet på LB-plater inneholdende 35 mg/l kloramfenikol (Sigma). Plater ble inkubert ved 37 °C over natt. I tillegg ble IO"<6->og 10"<7->fortynninger (i H2O) fra hver av de fire kulturene platet på LB-plater for å vurdere total effektivitet av rekombinasjonsprosessen ved å bestemme celle-antallet.

[000228] Den følgende dagen ble kontrollplater tatt ut av inkubatoren og undersøkt. Prøver transformert med tet^tet-fragmentene ble tillatt å inkubere i ytterligere 24 timer før analyse. Tjueseks av de største klonene ble identifisert for ytterligere analyse.

Karakterisering av ompT- manglende kloner

[000229] Hver av de 26 valgte klonene ble dyrket over natt ved 37 °C i 1 ml med LB med 5 ug/ml tetrasyklin. Den påfølgende dagen ble genomisk DNA generert fra alle 26 kloner ved å benytte Genomic-Prep-DNA-Isolation-settet (Amersham Pharmacia) i henhold til produsentens instruksjoner.

[000230] Det genomiske DNA fra hver klon ble fortynnet 1:100 i dFkO for å benyttes som et templat for PCR-analyse. Hver fortynnede prøve ble analysert ved å benytte tre ulike sett av PCR-primere (tre PCR-reaksjoner per klon). Reaksjonene inneholdt 100 pmol hver av primersett #1: ZG45,357 (SEKV. ID. NR.: 35) og ZG45,350 (SEKV. ID. NR.: 36) eller primersett #2: ZG45,353 (SEKV. ID. NR.: 37) og ZG45,355 (SEKV. ID. NR.: 38) eller primersett #3: ZG45,354 (SEKV. ID. NR.: 39) og ZG45,359 (SEKV. ID. NR.: 40). Resten av sluttvolumet på 100 fil ble utgjort av 10 fil 10X PCR-buffer (Boehringer Mannheim), 1 fil Pwo-polymerase (Boehringer Mannheim), 10 fil 0,25 mM nukleotidtrifosfatblanding (Perkin Eimer) og dH20. Reaksjonsbetingelsene var: 1 syklus i 5 minutter ved 94 °C etterfulgt av 30 sykluser på 30 sekunder ved 94 °C, 1 minutt ved 50 °C og 2 minutter ved 72 °C. PCR-reaksjonen ble avsluttet med et 7 minutters forlengelsestrinn ved 72 °C og en hvile over natt ved 4 °C. Dersom OmpT-genet i W3110 var vellykket erstattet med tetrasyklingenet burde primersett #1 amplifisere et bånd på 1584 bp (SEKV. ID. NR.: 41), primersett #2 burde amplifisere et bånd på 1190 bp (SEKV. ID. NR.: 42). Resultatene viste at 25 av de 26 klonene som ble screenet var ompT". W3110-ompT" -kloner #1 og #3 ble valgt for ytterligere analyser.

[000231] For å bekrefte tap av proteolytisk aktivitet ble IL-21 inkubert med cellelysater fra de nylig avledede ompT-stammene og den opprinnelige W3110. Lysat fra ompT-stammen BL21 ble inkludert som en positiv kontroll. Celler ble inokulert i Superbroth II og dyrket over natt ved 37 °C. Fire volumer på 1 ml av hver overnattkultur ble spunnet til en pellet ved romtemperatur og cellene ble lysert ved å benytte BugBuster (Novagen) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellelysater ble inkubert ved 25 °C i 4 timer med enten: 1) 0,332 mg/ml IL-21 eller 2) 0,332 mg/ml IL-21 i nærvær av 5 mM ZnCb. Hver prøve ble blandet med et likt volum med NuPAGE 4x prøvebuffer (Invitrogen) inneholdende 2 % P-merkaptoetanol (Sigma). De reduserte prøvene ble varmet i 5 minutter ved 100 °C og 10 fil ble satt på en 10 % NuPAGE-polyakrylamidgel (Invitrogen). Elektroforese ble utført ved 130v under denaturerende betingelser (SDS-PAGE) ved å benytte lx MES-kjørebuffer (Invitrogen). Geler ble farget med Simply Blue Safestain (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner.

[000232] Resultatene indikerte at OmpT-proteasen ble inaktivert ved generstatningen. IL-21 var fullstendig intakt etter en 4-timers inkubering i lysater fra BL21, W3110-ompT #1 og W3110-ompT" #3 var fullstendig degradert i et lysat fra den opprinnelige W3110. Aktiviteten til ompT-proteasen ble inhibert med sink. I inkuberinger inneholdende 5 mM ZnCl2forble IL-21 intakt, noe som støtter antagelsen av at ompT var ansvarlig for degraderingen. De nylig konstruerte W3110-ompT-stammene ble kalt ZGOLDl (W3110-ompT" #1, (deponert hos American Type Culture Collection i Manassas, VA. (ubetegnet ved innsendelsestidspunkt))) og ZGOLD3 (W3110-ompT" #3).

Karakterisering av ZGOLDl og ZGOLD3

[000233] ZGOLD1 og SGOLD3 ble dyrket sammen med den opprinnelige W3110 for undersøkelse av vekst. Kulturer av alle tre stammer ble dyrket ved 37 °C i LB til en OD6oopå 1,0. Celletetthet ble målt hver time for å undersøke vekst. Fortynninger (IO"<6>, IO"7 og IO"<8>i H2O) av hver kultur ble platet på LB-kanamycinplater (se ovenfor) for å bestemme celleantall. Resultatene tyder på at veksten av ZGOLD-stammer er tilsvarende til den for den opprinnelige W3110-stammen.

[000234] For å undersøke transformeringseffektivitet ble celler høstet og gjort kompetente for transformering som beskrevet ovenfor. Volumer fra hver stamme ble transformert med enten: 1) 1 fil pTAP337 (IL-21-ekspresjonsplasmid, ATCC nr. PA-4853) eller 2) uten DNA (negativ kontroll). Elektroporering ble utført som beskrevet ovenfor. Etter gjenvinning ble hver transformeringsblanding platet på en LB-plate inneholdende 25 mg/l kanamycin og inkubert over natt ved 37 °C. Dataene tyder på at transformeringseffektivitet av W3110 ikke ble påvirket ved fjerningen av opmT.

[000235] Ti kloner av ZGOLD-stamme transformert med IL-21 -ekspresjonsvektoren ble valgt for å evaluere proteinproduksjon. Klonen ble dyrket ved 37 °C over natt i Superbroth II (inneholdende 25 ug/ml kanamycin). Over-natt-kulturene ble benyttet til å inokulere rullerør inneholdende Superbroth II med 25 ug/ml kanamycin. Celler ble dyrket ved 37 °C. En andre kultur av en av klonene ble dyrket og tjente som en uindusert kontroll. Når OD6ooi hver kultur var 1,5 - 2,0 ble de indusert med 1 mM IPTG (ICN Biomedicals Inc.). Inkubering av kulturene fortsatte i ytterligere 5 timer. Prøver fra hver kultur ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE på 4-12 % gradient NuPAGE-gel (Invitrogen) under reduserende betingelser som beskrevet ovenfor. Resultatene tyder på at IL-21 -produksjon ved ZGOLDl og ZGOLD2 er tilsvarende for den for den opprinnelige W3110-stammen. ZGOLDl/pTAP337 #1 (deponert hos American Type Culture Collectin i Manassas, VA. (ubetegnet ved innsendingstidspunkt)) ble valgt for ytterligere utveksling av prosessen for IL-21-produksjon.

Claims

1. Ekspresj onsvektor for fremstilling av IL-21 -protein,karakterisert vedat den omfatter de følgende opererbart bundne elementer: (a) et prokaryot replikasjonsorigo, (b) et transkripsjonsinitierings-DNA-element, (c) en polynukleotidsekvens som vist i SEKV. ID. NR.: 27, og (d) en transkripsjonsterminator.

2. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, hvor den ytterligere omfatter en selekterbar markør.

3. Ekspresjonsvektor ifølge krav 2, hvor den selekterbare markøren omfatter et kanamycinresistensgen.

4. Prokaryot vertcelle,karakterisert vedat den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge et hvert av kravene 1 til 3.

5. Vertcelle ifølge krav 4, hvor vertcellen er E. co/z-stamme W3110.

6. Vertcelle ifølge krav 5, hvor den er deponert hos American Type Culture Collection i Manassas, VA. under patentdeponeringsbetegnelsen PTA-4853.

7. Vertcelle ifølge krav 4, hvor vertcellen er en OmpT proteasemanglende stamme.

8. Vertcelle ifølge krav 7, hvor vertcellen er en OmpT proteasemanglende stamme av Æ.CO//W3110.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av IL-21 -proteiner,karakterisert vedat den omfatter: (a) dyrking av vertceller ifølge ethvert av kravene 4-8 i vekstmedium under betingelser der IL-21 blir uttrykt, (b) gjenvinning av vertceller fra vekstmediet, og (c) isolering av IL-21 -proteinet fra vertcellene.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor vertcellene dyrkes ved hjelp av tilsatt ladningsfermentering.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor dyrkningstrinnet omfatter: (a) dyrking av vertcellene i en risteflaske til en OD600 på 5 til 20 i et vekstmedium, (b) inokulering av en fermenteringsbeholder med 1 til 12 volum% med risteflaskemedium inneholdende vertceller, (c) dyrking av vertcellene i et vekstmedium ved en pH på 6,2 til 7,2 der en tilsetningsløsning blir tilsatt til fermenteringsbeholderen før 15 timer forløpt fermenteringstid (EFT), (d) tilsetning av et induserende middel til fermenteringsbeholderen ved 20 til 30 timer EFT, og hvor gjenvinningstrinnet omfatter høsting av vertcellene ved 48 til 56 timer EFT.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor det induserende midlet er isopropyltiogalaktopyranosid (IPTG) ved 0,5 til 2 mM.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor tilsetningsløsningen omfatter et karbohydrat som er valgt fra gruppen som består av glyserol og glukose ved en konsentrasjon i vekstmedium og en tilsetningshastighet på 5-15 gram karbohydrat per time.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor glyserolen er 40 til 70 volum% glyserol eller glukosen er 40 til 70 % vekt/vol. glukose.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor glyserolen er 70 volum% eller glukosen er 60 % vekt/vol..

16. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor dyrkningstrinnet omfatter: (a) tilsetning av et inokulum, som omfatter en E. coli- W3110-vertcelle som omfatter en ekspresjonsvektor ifølge ethvert av kravene 1-3, hvor et IL-21-polypeptid uttrykkes, til en flaske, og der vekstmediet omfatter 5 g/l glyserol, (b) dyrking av inokulumet i vekstmedium i 16 - 20 timer ved 30 °C. (c) overføring av det dyrkede inokulum i vekstmedium til en ladningsfermentor ved en konsentrasjon på 0,5 - 5 volum% inokulum. (d) fermentering av ladningsfermenteringen ved 37 °C og pH 6,8 med 2 % glyserol, (e) introdusering av en glukosetilsetning ved 8 timers forløpt fermenteringstid (EFT) på 9,5 g glukose/liter/time og fortsetting inntil slutten av fermenteringskjøringen, (f) tilsetning av IPTG ved 24 timer EFT til sluttkonsentrasjon på 0,5 til 2 mM, (g) fermentering i omtrent 28 timer etter tilsetning av IPTG, og hvor gjenvinningstrinnet omfatter høsting av fermenteringsbuljong fira fermentoren, og hvor isoleringstrinnet omfatter tilsetning av et likt volum av vann til fermenteringsbuljongen, og homogenisering og sentrifugering av fermenteringsbuljongen for å samle en cellepellet eller cellevelling omfattende IL-21-proteinmateriale.

17. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 9-16, hvor IL-21 -proteinet omfatter en sekvens av aminosyreresidier som vist i SEKV. ID. NR.: 28, og hvor isoleringstrinnet videre omfatter: (a) separere vannuløselig IL-21 -proteinmateriale fra en cellepellet eller celleoppslemming, (b) løse det uløselige IL-21 -proteinmaterialet i et kaotropisk løsemiddel, (c) fortynne det kaotropiske løsemiddelet og refolde IL-21 -proteinet, hvor det isolerte IL-21-proteinet er i stand til å være biologisk aktivt.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, hvor isoleringstrinnet videre omfatter fjerning av ufoldede og aggregerte proteiner fra det refoldede IL-21-proteinet ved hjelp av filtrering, og hvor metoden videre omfatter (d) rense det refoldede IL-21 -proteinet på en kationbytterkolonne.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, hvor det isolerte IL-21 -proteinet er minst 90 % rent.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, hvor det isolerte IL-21 -proteinet har et endotoksinnivå på mindre 10 endotoksinenheter per mg IL-21-protein.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 18, hvor den omfatter det innledende trinnet å separere en cellepellet eller cellevelling som omfatter vannuløselig IL-21-proteinmateriale fra en fermenteringsbulj ong; hvor separeringstrinnet (a) i krav 17 omfatter homogenisering av cellepelleten eller cellevellingen for å samle inklusjonslegemer, hvor det kaotropiske løsemiddelet omfatter et guanidinsalt, og hvor det kaotropiske løsemiddelet er fortynnet ved tilsetning av en refoldingsbuffer som omfatter argininsalter og en blanding av reduserende og oksiderende komponenter.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, hvor den videre omfatter trinnet (e) rense IL-21 -eluatet fra kationbytterkolonnen på en hydrofob interaksj onskolonne hvor det isolerte og rensede IL-21-proteinet er i stand til å være biologisk aktivt.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 18, hvor separeringstrinnet (a) i krav 17 omfatter homogenisering av cellepelleten eller cellevellingen for å samle inklusjonslegemer, løsningstrinnet (b) i krav 17 omfatter å løse det uløselig IL-21-proteinet i et kaotropisk løse-middel omfattende 6 M guanidinhydroklorid, 40 mM ditiotreitol (DTT) i én time ved rom-temperatur, fortynnings- og refoldingstrinnet (c) i krav 17 omfatter (a) refolde de løste inklusjonslegemene i en løsning ved å fortynne i refoldingsbuffer omfattende 0,75 M arginin, 2 mM DTT/4 mM cystinoksidasjons-reduksjonspar minst 20 ganger: (b) justere pH til 5,5 med 20 % eddiksyre og tillate løsningen å reagere i minst 5 timer, (c) fortynne løsningen med 1 + 1,4 volumer 25 mM acetat, pH 5,5, og hvor filtrerings- og rensetrinnet i krav 18 omfatter: (a) filtrere løsningen, (b) sette løsningen på resinkolonne ekvilibrert til pH 5,5 ved å benytte natriumacetatbuffer, (c) vaske resinkolonnen med 0,4 M natriumklorid (d) vaske resinkolonnen med 0,75 M natriumklorid for å eluere bundet IL-21 -protein, (e) tilsette ammoniumsulfat til en konsentrasjon på 1,5 M til eluat og filtrere eluat-løsning, (f) sette eluat på en Tosohaas-butyl-650-M-kolonne ekvilibrert til 1,5 M ammoniumsulfat, 0,05 M natriumklorid i natriumacetatbuffer, (g) vaske kolonnen med 0,15 M ammoniumsulfat, 0,05 M natriumklorid i natriumacetatbuffer, (h) fortynne eluatet til en konduktivitet på 30 mS/cm med vann, (i) sette eluat på en SP-sepharose-HP-kolonne ekvilibrert med natriumacetatbuffer, (j) vaske kolonne med 20 kolonnevolumer lineær gradient fra 0,3 til 0,7 M natriumklorid, (k) konsentrere IL-21-proteinet, og (1) bytte buffer til formuleringsbuffer ved å benytte tangentiell-strøm-ultrafiltrering.

24. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 17-20, hvor biologisk aktivitet blir målt ved å benytte en IL-21-reseptorbindingscelleanalyse.