CN117510596A - 一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺及其应用，包括以下步骤将表达犬瘟热抗原的大肠杆菌置于基础固体培养基中培养；产生单菌落后，将单菌落接种至基础培养基中，培养得种子液；将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵；当发酵罐中的菌液的OD600nm值为4～8时，添加补料培养基；当发酵罐中的菌液的OD600nm值达到33时，添加诱导培养基；诱导表达12h～16h，收集菌体。本发明的技术方案能够克服现有的犬瘟热疫苗的生产不能脱离鸡胚或细胞的问题；通过将工程菌的增殖能力增强，从而提高抗原的产量；能够促使抗原以最大程度的可溶性表达，确保抗原的功能完整性，提高疫苗的有效性和安全性；通过高密度发酵，降低生产成本和生产周期。

Description

一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺及其应用。
背景技术
犬瘟热病毒是一种高度传染且致命的兽类疾病，可以攻击病犬的呼吸、消化、皮肤和中枢神经系统。它主要通过直接接触病患的分泌物、呼吸道分泌物、排泄物以及间接接触污染的物体传播。市售的由鸡胚或细胞生产的犬瘟热减毒活疫苗虽然在预防犬瘟热方面起到了重要作用，但在接种者免疫能力较低的情况下可能会出现毒力回复的风险，从而导致接种者成为传播源，再经由呼吸道和生食进行犬瘟热病毒的传播，间接地导致犬瘟热病毒在野生物种间的流行。
亚单位疫苗是一种包含病原体的特定成分或部分，如蛋白质、多糖或病毒的表面抗原的疫苗类型。通过提供病原体的特定抗原或抗原组合，亚单位疫苗可以激活机体产生特定的抗体和细胞免疫应答，这种针对特定抗原的免疫应答能够提供针对目标病原体的保护，减少感染和疾病的发生。与传统的完整病原体疫苗(灭活疫苗、减毒活疫苗)相比，亚单位疫苗具有良好的可操控性、可组合性、稳定性和安全性。
亚单位疫苗的表达系统主要分为真核表达系统和原核(大肠杆菌)表达系统。真核细胞中的基因表达和蛋白质合成过程较复杂、蛋白质产量较低、生产成本高，不适用于大规模的兽用疫苗。原核细胞中没有复杂的蛋白质修饰、产量高且成本低，适合大规模制造。但在原核系统进行抗原表达时，表达量过低和过高都会带来一些问题。如果表达量过低会导致抗原产能低，从而增加生产成本、生产周期、纯化难度；如果表达量过高会导致抗原以包涵体形式表达，从而增加后续纯化的复杂性和成本，还可能影响抗原的正确折叠和功能性。因此在原核系统中进行抗原表达时，需要保证较高的表达量，同时保持抗原的可溶性和功能完整性，以降低后续纯化难度和成本，确保疫苗的质量和效果。
当前犬瘟热疫苗、大肠杆菌发酵技术存在的缺点和问题主要包括以下几点：
1.安全性：减毒犬瘟热疫苗可能会出现毒力回复的风险，从而导致接种者成为传播源。
2.生产复杂和耗时：减毒犬瘟热疫苗生产过程需要在鸡胚或细胞中培养病毒，经过处理后制成疫苗。这种生产方法复杂、耗时且依赖性强，不利于快速应对病毒的变异。
3.大肠杆菌发酵工艺的可控性：需要在保证较高的表达量的同时保持抗原的可溶性和功能完整性，以降低后续纯化难度和成本，确保疫苗的质量和效果。
综上所述，如何克服现有的犬瘟热疫苗通过鸡胚或细胞的生产问题；是目前本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明实施例的主要目的在于提出一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，旨在设计一种克服了现有的犬瘟热疫苗的生产不能脱离鸡胚或细胞，确保疫苗的质量和效果的犬瘟热抗原发酵方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺及其应用，包括以下步骤：
将表达犬瘟热抗原的大肠杆菌置于基础固体培养基中培养；
产生单菌落后，将单菌落接种至基础培养基中，培养得种子液；
将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵；
当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基；
当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基；
诱导表达12h～16h，收集菌体。
进一步地，所述将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵的步骤中，
每升基础培养基包括：胰蛋白胨8～16g、酵母提取物5～10g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油10～20g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基的步骤中，
每升补料培养基包括：胰蛋白胨15～30g、酵母提取物10～20g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油20～50g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g、铁离子5～10mg、锰离子1～5mg、锌离子1～3mg、铜离子1～3mg。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基的步骤中，
每升诱导培养基包括：胰蛋白胨15～30g、酵母提取物10～20g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油20～50g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g、铁离子0.5～1mg、锰离子0.1～0.5mg、锌离子0.1～0.3mg、铜离子0.1～0.3mg、甲硫氨酸0.5～1g、亮氨酸0.5～1g、异亮氨酸0.5～1g、赖氨酸0.5～1g、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1～5mM。
进一步地，所述将表达犬瘟热抗原的大肠杆菌置于基础固体培养基中培养的步骤中，培养条件为：37℃倒置培养10h～14h至产生单菌落。
进一步地，所述产生单菌落后，将单菌落接种至基础培养基中，培养得种子液的步骤中，将单菌落接种至基础培养基中，37℃、150～250rpm培养8h～14h至大肠杆菌处于对数生长期即得种子液。
进一步地，所述将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵的步骤中，将种子液以1％～5％的比例接种于含有基础培养基的发酵罐中，设置发酵温度36℃～38℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基的步骤中，添加补料培养基时，以每小时补料5mL/L～20mL/L的补料速度添加补料培养基；设置发酵温度36℃～38℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基的步骤包括：
当菌液的OD600 nm值达到33时，降温至16℃～25℃，加入诱导培养基；
前半小时将诱导培养基加至总体积的5％～10％，之后添加速度为每小时添加5mL/L～10mL/L；设置温度16℃～25℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4；
诱导表达12h～16h后收集菌体，得犬瘟热抗原。
为解决上述技术问题，本发明还提出了将上述大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺在抗原生产及疫苗制备中的应用。
本发明的一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，克服了现有的犬瘟热疫苗的生产不能脱离鸡胚或细胞的问题；通过将工程菌的增殖能力增强，从而提高抗原的产量；能够促使抗原以最大程度的可溶性表达，确保抗原的功能完整性，提高疫苗的有效性和安全性；通过高密度发酵，从而降低生产成本和生产周期。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明所述大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺的步骤流程图；
图2为不同基础培养基的菌种的生长曲线图；
图3为不同补料培养基扩菌培养后菌体的质量图；
图4为不同诱导培养基诱导16h后菌体的质量图；
图5为不同诱导培养基诱导16h后获得的可溶性抗原的质量图；
图6为使用本发明的发酵工艺和传统发酵工艺所获得的可溶性抗原的质量图。
具体实施方式
下面将结合本发明说明书附图中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中如涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“若干”、“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“连接”、“固定”等应做广义理解，例如，“固定”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，旨在设计一种在保证产量高的同时，保持抗原的可溶性和功能完整性，以降低后续纯化难度和成本，确保疫苗的质量和效果的犬瘟热抗原发酵方法。
下面将在具体实施例中对本发明提出的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺进行说明：
在本实施例的技术方案中，如图1所示，一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，包括以下步骤：
S10：将表达犬瘟热抗原的大肠杆菌置于基础固体培养基中培养；
可以理解地，将冻存的表达犬瘟热抗原的大肠杆菌在冰浴中缓慢解冻；解冻后，将菌株取出在无菌条件下划线或涂布至基础固体培养基中。
S20：产生单菌落后，将单菌落接种至基础培养基中，培养得种子液；
S30：将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵；
S40：当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基；
S50：当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基；
S60：诱导表达12h～16h，收集菌体。
在一种可行的实施方式中，步骤S10中的表达犬瘟热抗原的大肠杆菌是由冻存的表达犬瘟热抗原的大肠杆菌在冰浴中缓慢解冻得到的。
本发明提供了一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，克服了现有的犬瘟热疫苗的生产不能脱离鸡胚或细胞的问题；通过将工程菌的增殖能力增强，从而提高抗原的产量；能够促使抗原以最大程度的可溶性表达，确保抗原的功能完整性，提高疫苗的有效性和安全性；通过高密度发酵，从而降低生产成本和生产周期。
进一步地，所述将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵的步骤中，
每升基础培养基包括：胰蛋白胨8～16g、酵母提取物5～10g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油10～20g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g。
具体地，基础培养基由以下操作获得：将胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甘油和消泡剂溶于水，调节溶液的pH值至6.8～7.4，115～121℃高压灭菌25～30min，待降温至50℃以下时，向其中加入使用0.22μm滤器无菌过滤后的抗生素和硫酸镁溶液。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基的步骤中，
每升补料培养基包括：胰蛋白胨15～30g、酵母提取物10～20g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油20～50g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g、铁离子5～10mg、锰离子1～5mg、锌离子1～3mg、铜离子1～3mg。
具体地，补料培养基由以下操作获得：将胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甘油和消泡剂溶于水，调节溶液的pH值至6.8～7.4，115～121℃高压灭菌25～30min，待降温至50℃以下时，向其中加入使用0.22μm滤器无菌过滤的抗生素、硫酸镁、微量元素(硫酸镁、铁离子、锰离子、锌离子、铜离子)溶液。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基的步骤中，
进一步地，每升诱导培养基包括：胰蛋白胨15～30g、酵母提取物10～20g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油20～50g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g、铁离子0.5～1mg、锰离子0.1～0.5mg、锌离子0.1～0.3mg、铜离子0.1～0.3mg、甲硫氨酸0.5～1g、亮氨酸0.5～1g、异亮氨酸0.5～1g、赖氨酸0.5～1g、IPTG 1～5mM。
具体地，所述诱导培养基包括：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甘油、消泡剂、抗生素、硫酸镁、铁离子、锰离子、锌离子、铜离子、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、IPTG。诱导培养基由以下操作获得：将胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甘油和消泡剂溶于水，调节溶液的pH值至6.8～7.4，115～121℃高压灭菌25～30min，待降温至50℃以下时，向其中加入使用0.22μm滤器无菌过滤的抗生素、硫酸镁、微量元素(铁离子、锰离子、锌离子、铜离子)、氨基酸和IPTG溶液。
进一步地，所述将表达犬瘟热抗原的大肠杆菌置于基础固体培养基中培养的步骤中，培养条件为：37℃倒置培养10h～14h至产生单菌落。
进一步地，所述产生单菌落后，将单菌落接种至基础培养基中，培养得种子液的步骤中，将单菌落接种至基础培养基中，37℃150～250rpm培养8h～14h至大肠杆菌处于对数生长期，得种子液。
具体地，大肠杆菌处于对数生长期，也即菌液的OD600 nm值为0.6～0.8。
进一步地，所述将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵的步骤中，将种子液以1％～5％的比例接种于含有基础培养基的发酵罐中，设置发酵温度36℃～38℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4。
具体地，含有基础培养基的发酵罐中，发酵罐的装液量为30％～50％。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基的步骤中，添加补料培养基时，以每小时补料5mL/L～20mL/L的补料速度添加补料培养基；设置发酵温度36℃～38℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4。
进一步地，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基的步骤包括：
当菌液的OD600 nm值达到33时，降温至16℃～25℃，加入诱导培养基；
前半小时将诱导培养基加至总体积的5％～10％，之后添加速度为每小时添加5mL/L～10mL/L；设置温度16℃～25℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4；
诱导表达12h～16h后收集菌体，得犬瘟热抗原。
为解决上述技术问题，本发明还提出了将上述大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺在抗原生产及疫苗制备中的应用。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、本发明提供了一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，可以使工程菌的增殖能力增强，从而提高抗原的产量；能够促使抗原以最大程度的可溶性表达，确保抗原的功能完整性，提高疫苗的有效性和安全性；通过高密度发酵，从而降低生产成本和生产周期。在抗犬瘟热病毒疫苗、抗体、药物研发中有着广泛的应用前景。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明提供了一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，包括培养种子菌、扩菌增殖和诱导表达等多个环节，以及基础培养基、补料培养基和诱导培养基的成分，在保证产量高、成本低的同时保持抗原的可溶性和功能完整性，从而确保疫苗的质量和效果，具备传统疫苗不可比拟的优点。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
本发明提供了一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，生产成本低廉、生产速度快、产量高、纯化难度低、质量高、安全性高，这有助于提高产品的竞争力，满足市场需求。该工艺技术方案的转化预计将为犬瘟热领域的生物医药企业带来显著的收益和商业价值，同时也为犬瘟热疾病的预防和治疗提供了更好的工具和选择。
(2)本发明的技术方案是否解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
本发明提供了一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，该工艺可以增强工程菌的增殖能力，提高工程菌的高密度发酵效果，并促使抗原以最大程度可溶性表达，以确保抗原功能完整性。同时，本发明也为其他病毒的亚单位疫苗生产提供了基础。
(3)本发明的技术方案是否克服了技术偏见：
本技术方案克服了现有的犬瘟热疫苗的生产不能脱离鸡胚或细胞的问题。
实施例1
一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，发酵步骤为：
1)培养种子菌：
将冻存的表达犬瘟热抗原的大肠杆菌在冰浴中缓慢解冻；解冻后，将菌株取出，在无菌条件下划线或涂布至基础固体培养基中，37℃倒置培养14h至产生单菌落；将单菌落接种至基础培养基中，37℃，220rpm培养8h至大肠杆菌处于对数生长期，即得种子液；将种子液以1％的比例接种于含有基础培养基的发酵罐(30％装液量)中，设置发酵温度37℃、溶氧量30％、转速400rpm，pH值7.2。
2)扩菌增殖：
当菌液的OD600 nm值为4～8时，加入补料培养基，补料速度为每小时补料5mL/L，设置发酵温度37℃、溶氧量30％、转速400rpm，pH值7.2。
3)诱导表达：
当菌液的OD600 nm值达到33时，降温至18℃；加入诱导培养基，前半小时将诱导培养基加至总体积的10％，之后添加速度为每小时添加10mL/L，设置温度18℃、溶氧量30％、转速400rpm，pH值7.2；诱导表达16h后收集菌体。
基础培养基由以下方式获得：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、氯化钾0.1g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠1.4g、甘油10g、消泡剂0.1wt‰溶于水，调节溶液的pH值至7.2，115℃高压灭菌30min，待降温至50℃以下时，向其中加入使用0.22μm滤器无菌过滤后的抗生素(50μg)、硫酸镁(0.2g)溶液。
补料培养基由以下方式获得：将胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、氯化钠5g、氯化钾0.1g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠1.4g、甘油20g、消泡剂0.1wt‰溶于水，调节溶液的pH值至7.2，115℃高压灭菌30min，待降温至50℃以下时，向其中加入使用0.22μm滤器无菌过滤后的抗生素(50μg)、硫酸镁(0.2g)、微量元素(铁离子5mg、锰离子1mg、锌离子1mg、铜离子1mg)溶液。
诱导培养基由以下方式获得：将胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、氯化钠5g、氯化钾0.1g、磷酸二氢钾0.3g、磷酸氢二钠1.4g、甘油20g、消泡剂0.1wt‰溶于水，调节溶液的pH值至7.2，115℃高压灭菌30min，待降温至50℃以下时，向其中加入使用0.22μm滤器无菌过滤后的抗生素(50μg)、硫酸镁(0.2g)、微量元素(铁离子5mg、锰离子1mg、锌离子1mg、铜离子1mg)、甲硫氨酸0.5g、亮氨酸0.5g、异亮氨酸0.5g、赖氨酸0.5g、IPTG 1mM溶液。
实施例2
分别使用实施例1的基础培养基、LB培养基、SOB培养基对表达犬瘟热抗原的大肠杆菌生产用菌种进行培养，并绘制菌种的生长曲线。结果如图2所示，使用本发明的基础培养基培养生产菌种时，菌种在6～12h处于对数生长期，较LB培养基缩短了约1h，与SOB培养基时间相似。同时，菌种在基础培养基中的对数生长期和平台期的OD600 nm值更高。
向上述三种不同的进入对数生长期的三种培养基初培养的菌液分别使用实施例1的补料培养基、LB培养基、SOB培养基对表达犬瘟热抗原的大肠杆菌生产用菌种进行补料扩增培养6h，收取100mL菌液并称量菌体的质量。结果如图3所示，使用本发明的补料培养基扩增培养所收获的菌体显著高于LB培养基和SOB培养基。
三种不同菌液的OD600 nm值分别达到33时，降温至18℃；向实施例3中的三种培养基的培养物中分别加入实施例1的诱导培养基、LB培养基(含1mM IPTG)、SOB培养基(含1mMIPTG)对表达犬瘟热抗原的大肠杆菌进行诱导，前半小时将诱导培养基或LB培养基或SOB培养基加至总体积的10％，之后添加速度为每小时添加10mL/L，设置温度18℃、溶氧量30％、转速400rpm，pH值7.2；诱导表达16h后收集菌体并称重。结果如图4所示，使用本发明的诱导培养基诱导所收获的菌体显著高于LB培养基和SOB培养基。
称取等质量(10g)的由诱导培养基、LB培养基(含1mM IPTG)、SOB培养基(含1mMIPTG)诱导的菌体，分别加入100mL PBS进行冰浴超声破碎(工作5s，停5s)1h，立即进行离心(16000rpm，4℃，30min)，收取上清液经0.22μm滤器过滤后进行蛋白纯化。结果如图5所示，使用本发明的诱导培养基所收获的可溶性抗原的质量显著高于LB培养基和SOB培养基。
实施例3
对比采用实施例1的培养基及发酵工艺与传统培养基及发酵方法对表达犬瘟热抗原的工程菌进行高密度培养和诱导蛋白表达的影响。结果如图6所示，与传统培养基及发酵方法相比较，本发明的培养基及发酵工艺的可溶性抗原的表达量更高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
将表达犬瘟热抗原的大肠杆菌置于基础固体培养基中培养；
产生单菌落后，将单菌落接种至基础培养基中，培养得种子液；
将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵；
当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基；
当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基；
诱导表达12h～16h，收集菌体。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵的步骤中，
每升基础培养基包括：胰蛋白胨8～16g、酵母提取物5～10g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油10～20g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基的步骤中，
每升补料培养基包括：胰蛋白胨15～30g、酵母提取物10～20g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油20～50g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g、铁离子5～10mg、锰离子1～5mg、锌离子1～3mg、铜离子1～3mg。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基的步骤中，
每升所述诱导培养基包括：胰蛋白胨15～30g、酵母提取物10～20g、氯化钠5～10g、氯化钾0.1～0.2g、磷酸二氢钾0.3～0.5g、磷酸氢二钠1.4～2g、甘油20～50g、消泡剂0.1～0.3wt‰、抗生素50～100μg、硫酸镁0.1～0.5g、铁离子0.5～1mg、锰离子0.1～0.5mg、锌离子0.1～0.3mg、铜离子0.1～0.3mg、甲硫氨酸0.5～1g、亮氨酸0.5～1g、异亮氨酸0.5～1g、赖氨酸0.5～1g、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷1～5mM。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述将表达犬瘟热抗原的大肠杆菌置于基础固体培养基中培养的步骤中，培养条件为：37℃倒置培养10h～14h至产生单菌落。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述产生单菌落后，将单菌落接种至基础培养基中，培养得种子液的步骤中，将单菌落接种至基础培养基中，37℃、150～250rpm培养8h～14h至大肠杆菌处于对数生长期，得种子液。
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述将种子液接种于含有基础培养基的发酵罐中发酵的步骤中，将种子液以1％～5％的比例接种于含有基础培养基的发酵罐中，设置发酵温度36℃～38℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4。
8.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值为4～8时，添加补料培养基的步骤中，添加补料培养基时，以每小时补料5mL/L～20mL/L的补料速度添加补料培养基；设置发酵温度36℃～38℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4。
9.根据权利要求1所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺，其特征在于，所述当发酵罐中的菌液的OD600 nm值达到33时，添加诱导培养基的步骤包括：
当菌液的OD600 nm值达到33时，降温至16℃～25℃，加入诱导培养基；
前半小时将诱导培养基加至总体积的5％～10％，半小时后添加速度为每小时添加5mL/L～10mL/L；设置温度16℃～25℃、溶氧量20％～50％、转速200rpm～1000rpm，pH值6.8～7.4；
诱导表达12h～16h后收集菌体，得犬瘟热抗原。
10.权利要求1至9中任一项所述的大肠杆菌高密度表达犬瘟热抗原的发酵工艺在抗原生产及疫苗制备中的应用。
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