ES2236845T3 - Microorganismos y procedimientos para la obtencion fermentativa de l-cisteina, l-cistina, n-acetil-serina o derivados de tiazolidina. - Google Patents
Microorganismos y procedimientos para la obtencion fermentativa de l-cisteina, l-cistina, n-acetil-serina o derivados de tiazolidina.Info
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UNOS MICROORGANISMOS Y DE UNOS PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION FERMENTATIVA DE L CISTEINA, L CISTINA, N ACETIL SERINA O DERIVADOS DE TIAZOLIDINA. LA CEPA DE MICROORGANISMOS CORRESPONDIENTE A LA INVENCION, QUE ES APTA PARA LA PRODUCCION FERMENTATIVA DE L CISTEINA, L CISTINA, N ACETIL SERINA Y/O DERIVADOS DE TIAZOLIDINA, SE CARACTERIZA PORQUE SOBREEXPRIME AL MENOS UN GEN QUE CODIFICA PARA UNA PROTEINA, SIENDO IDONEO PARA HACER SALIR ANTIBIOTICOS U OTRAS SUSTANCIAS TOXICAS PARA LOS MICROORGANISMOS DE LA CELULA.
Description
Microorganismos y procedimientos para la
obtención fermentativa de L-cisteína,
L-cistina,
N-acetil-serina o derivados de
tiazolidina.
La invención se refiere a microorganismos y a
procedimientos para la obtención fermentativa de
L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina o derivados de
tiazolidina.
La obtención fermentativa de aminoácidos es entre
tanto parte de la técnica actual para muchos aminoácidos. Sin
embargo, hasta ahora no existe ningún procedimiento fermentativo
industrial para la obtención de L-cisteína.
Los derivados de tiazolidina y los
correspondientes hemitiocetales se forman en general durante la
condensación de cisteína con cetonas o aldehídos. La condensación
química de cisteína con diversas cetonas o aldehídos,
particularmente con acetoácidos, se conoce desde hace mucho tiempo.
La condensación se efectúa a través del hemitiocetal como etapa
intermedia, que se forma por el ataque del par de electrones libre
del azufre al átomo de carbono positivo del grupo aldehído o ceto.
Una ciclización bajo la disociación de agua lleva después al
correspondiente derivado de tiazolidina.
En el siguiente esquema se muestra en general la
formación de derivados de tiazolidina:
Fórmula
I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R1 y R2 pueden significar cualquier radical
orgánico.
Así, los eductos están en equilibrio a través
del hemitiocetal con el derivado de tiazolidina. Por esta razón,
además del derivado de tiazolidina, en solución acuosa se presenta
en general también el hemitiocetal.
En el sentido de la presente invención, por
"derivado de tiazolidina" se entiende también un equilibrio de
estas sustancias con el correspondiente hemitiocetal.
Las tiazolidinas no han sido descritas hasta
ahora como metabolitos directos de células. Todos los reportes de
formaciones de tiazolidina por células se basan en la adición
externa en exceso de uno de los eductos, por lo general
L-cisteína, el cual después se transforma mediante
la desulfhidrogenación y desaminación en piruvato, el cual a su vez
reacciona con la cisteína agregada. (Ronald C. Simpson y
colaboradores, Biochimica et Biophysic Acta, 496 (1977),
12-19). Kredich y colaboradores describieron en J.
of Biol. Chem. 248, 17: 6187-6196, la formación
in vitro de ácido
2-metil-2,4-tiazolidindicarbónico
en una desulfhidrogenación enzimática de L-cisteína,
sin embargo consideran la formación de esta sustancia in
vivo como muy poco probable.
Es conocido emplear tiazolidinas como
precursores racémicos para la obtención de
L-cisteína mediante biotransformación
(EP-A 0 101 052, Ok Hee Ryu y colaboradores,
Biotechnology Letters 17 No. 3, 275-280 (Marzo de
1995)). Cuando se emplea el racemato para la obtención de
L-cisteína, éste se debe transformar
estereoselectivamente mediante enzimas o células completas a
L-cisteína. Los diastereómeros restantes se deben
racemizar nuevamente a continuación. Por estas razones, dicha
biotransformación va ligada a altos costos.
La síntesis química de tiazolidinas a partir de
cisteína racémica y una cetona o un aldehído correspondiente lleva
a cuatro diferentes diastereómeros. Una síntesis química a partir
de L-cisteína pura de enantiómeros es cara y no es
conveniente para la finalidad de la obtención posterior de
L-cisteína. Por ello, un procedimiento para la
obtención de diastereómeros de tiazolidina que presentan en el
átomo C4 la configuración R, se ve obstaculizado por los altos
costos de los eductos.
La presente invención se refiere a una cepa de
microorganismos que es apropiada para la obtención por fermentación
de L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina, caracterizada porque la misma está desregulada en su
metabolismo de la cisteína de tal manera que forma una cantidad
incrementada de L-cisteína y sobreexpresa al menos
un gen codificante de una proteína que tiene la secuencia
SEQ.ID.NO: 2 o una de sus variantes, que contribuye a la obtención
de L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina.
La invención se refiere además a proteínas que
incluyen la secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una variante de la secuencia que contribuya a
la obtención de L-cisteína,
L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina.
El marco de lectura abierto que codifica la
proteína con la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ. ID. NO: 2,
se denomina en lo sucesivo también como ORF 306.
Otro ejemplo de una proteína conforme a la
invención es mostrado por la siguiente secuencia.
Las proteínas conforme a la invención son
también aquellas proteínas que poseen una secuencia de aminoácidos
con una homología de secuencia a nivel aminoácidos mayor al 50% a
la secuencia de aminoácidos conforme a SEQ. ID. NO: 2 o SEQ. ID.
NO: 3, hasta el punto que ellas contribuyan -[5,6]-.
De preferencia, la homología de secuencia de las
proteínas conforme a la invención a SEQ ID: 2 o SEQ. ID. NO: 3 es
mayor a 75%, de manera particularmente preferida la homología de
secuencia a SEQ. ID. NO: 2 o SEQ. ID. NO: 3 es mayor a 90%, hasta
el punto que ellas contribuyan -[5,6]-.
Otro ejemplo de la sobrexpresión de un gen para
el aumento de la formación de cisteína es la sobrexpresión de un
fragmento de ADN de 5.5 kb de longitud, el cual también codifica el
mar-Locus. Este plásmido con la denominación
100-1-1 se depositó en la DSMZ
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
D-38124 Braunschweig en E. coli K12 W3110
bajo el número DSM 11545. La figura 1 muestra una carta de plásmido
de dicho plásmido. Éste se puede aprovechar para la amplificación
de genes conforme a la invención mediante
PCR.
PCR.
Otra modificación controlada de estos genes en
la posición respectivamente deseada de la secuencia mediante
procedimientos conocidos, por ejemplo la técnica de la mutagénesis
site directed, es conocida para el experto en la materia. También
los microorganismos que contienen genes modificados de esta
manera, son parte de la invención siempre y cuando los genes
modificados de esta manera contribuyan a la obtención de
L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina.
Por la sobrexpresión se debe entender en el
sentido de la invención que la expresión de la proteína en el
microorganismo conforme a la invención se efectúa al menos dos
veces más fuerte que en el tipo salvaje del que proviene de la
proteína.
De preferencia, la expresión de la proteína en
el microorganismo conforme a la invención se efectúa al menos cinco
veces más fuerte que en el tipo salvaje, de manera particularmente
preferida al menos diez veces más fuerte que en el tipo salvaje del
que proviene la proteína.
Sin una sobrexpresión de los genes mencionados,
por ejemplo mediante una transcripción independiente por un
promotor por separado o, por ejemplo, sin la presencia del gen que
codifica MarA, en varias copias en un plásmido, no se observa
ningún aumento significativo de rendimiento para
L-cisteína o derivados de tiazolidina con respecto
a la cepa de partida.
El aumento de rendimiento por la sobrexpresión
de las secuencias mencionadas fue más sorprendente en tanto que el
producto génico descrito en la literatura especializada del marco
de lectura abierto ORF266 corresponde a la secuencia SEQ. ID. NO:
4 en su secuencia a partir de metionina en la posición 41 en la
SEQ. ID. NO: 2, no lleva en una sobrexpresión a un aumento del
rendimiento de L-cisteína.
En la secuencia de aminoácidos indicada
anteriormente, derivada de ORF306, la metionina de partida de
ORF266 está escrita en negritas y subrayada.
El experto en la materia conoce una serie de
procedimientos que logran una sobrexpresión de un gen. Una
posibilidad es, por ejemplo, la expresión del gen en un plásmido
que está presente en la célula con un número aumentado de copias.
Dichos plásmidos son conocidos. Se mencionan como ejemplo pACYC177,
pACYC184, derivados de pACYC184, pBR322, otros derivados de pBR,
pBlueskript, pUC18, pUC19, así como otros plásmidos empleados
usualmente en Escherichia coli.
Los plásmidos preferidos para la sobrexpresión
conforme a la invención son pACYC177, pACYC184, derivados de
pACYC184, pBR322 y otros derivados de pBR.
Se prefieren particularmente pACYC184 y sus
derivados, como por ejemplo pACYC184-LH (depositado
en la DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, D-38124 Braunschweig, bajo el número DSM
10172).
Otras posibilidades para una amplificación de la
expresión es el aumento del número de copias de un de los genes
mencionados mediante una amplificación de la sección del gen en el
cromosoma o el empleo de promotores fuertes para la mejor
transcripción del gen de eflujo.
Como promotores fuertes son adecuados, por
ejemplo, el promotor GAPDH, el promotor tac (p_{tac}), el
promotor Lac (p_{lac}) , el promotor trp (p_{trp}), lambda PL o
Lambda PR.
Son preferentemente adecuados el promotor GAPDH
o el promotor tac (P_{tac}).
De manera particularmente preferida es adecuado
el promotor GAPDH.
Otra posibilidad para una amplificación de
expresión es la inactivación de genes represores, los cuales actúan
de manera inhibitoria sobre la expresión de un de los genes
mencionados. Para el gen mar, esto sería, por ejemplo, la
inactivación del gen mar R.
También los elementos que influyen positivamente
en la translación contribuyen a una sobrexpresión de los genes
mencionados. Dichos elementos son, por ejemplo, un buen lugar de
unión de ribosomas (por ejemplo, secuencia
Shine-Dalgarno) o Downstream Box.
Un elemento preferido que influye positivamente
en la translación es el buen punto de unión de ribosomas del gen
GAPDH.
Para la expresión de los genes mencionados,
éstos se transforman en un microorganismo que produce
L-cisteína.
De preferencia, los genes se transforman en
microorganismos elegidos a partir del grupo Bacillus, como
B. subtilis, Corynebacterium como C. glutamicum,
Streptomyces y E. coli.
Los genes se transforman en organismos que en su
metabolismo de cisteína están tan desregulados, que se llega a la
formación de grandes cantidades de L- cisteína y, dado el caso, a
continuación a la formación de un derivado de tiazolidina de
L-cistina o de N- acetil-serina.
Ejemplos de microorganismos que producen
cantidades elevadas de L-cisteína son
microorganismos con alelo CysE resistente a la
retroalimentación.
En otra modalidad preferida se transforman
microorganismos que forman intracelularmente un derivado de
tiazolidina mediante la condensación de L-cisteina
y una cetona o un aldehído, particularmente piruvato.
Los microorganismos que producen cantidades
elevadas de L-cisteína se describen, por ejemplo, en
la solicitud de patente DE 19539952.
El experto en la materia conoce procedimientos
para la transformación de un microorganismo, por ejemplo, a través
de los libros de texto estándar. Todos los procedimientos conocidos
se pueden aplicar para la obtención de un microorganismo conforme
a la invención.
Mediante una expresión reforzada de los genes
mencionados en microorganismos, los cuales producen aminoácidos o
derivados de aminoácidos formados intracelularmente de los mismos,
como por ejemplo L-cisteína,
L-cistina,
N-acetil-serina o derivados de
tiazolidina, se llega sorprendentemente a una esclusión reforzada
de aminoácidos o de derivados de aminoácidos formados
intracelularmente de los mismos a partir de la célula, como por
ejemplo L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina y derivados de
tiazolidina. De esta manera se logran rendimientos claramente
mayores de estos productos en la fermentación.
Así, la invención se refiere también a
procedimientos para la obtención de L-cisteína,
L-cistina,
N-acetil-serina o derivados de
tiazolidina de los mismos, caracterizados porque se emplea en la
fermentación un microorganismo conforme a la reivindicación 1 o 2 de
manera en sí conocida.
El procedimiento conforme a la invención para la
obtención fermentativa de L-cisteína,
L-cistina,
N-acetil-serina o derivados de
tiazolidina presenta varias ventajas:
Se forman únicamente diastereómeros de
tiazolidina que en el átomo de carbono C4 presenta sólo la
configuración R, pues por la provisión de enzima de la célula se
forma estereoselectivamente L-cisteína, la cual
puede reaccionar después con la cetona o el aldehído
respectivamente disponible para dar como resultado exclusivamente
los diastereómeros de tiazolidina mencionados.
A partir de las tiazolidinas con la
configuración R en el átomo de carbono C4, aplicando procedimientos
y técnicas químicos y biológicos usuales, se puede obtener
L-cisteína únicamente por el desplazamiento al
equilibrio en dirección de los eductos.
De preferencia, para los derivados de tiazolidina
que se forman en el procedimiento conforme a la invención, en el
esquema de la página 2, al menos un radical R1 o R2 significa un
grupo carboxilo, de manera particularmente preferida, en la fórmula
I R1 significa COOH y R2 CH3.
Los eductos para la condensación a derivado de
tiazolidina, ya sea que ambos puedan ser formados por el
microorganismo o que sólo un educto es formado por el
microorganismo y el segundo educto se agrega durante la
fermentación.
En una modalidad preferida de la invención,
ambos eductos para la condensación a derivado de tiazolidina son
formados por el microorganismo.
Como agente de derivación para la derivación de
piruvato, que así puede ser sacado del equilibrio, se pueden emplear
entre otros hidroxilamina o
2,4-dinitrofenilhidrazina.
De manera ventajosa, en el procedimiento conforme
a la invención se puede obtener el derivado de tiazolidina (y el
correspondiente hemitiocetal) a partir de fuentes de C y N y S
sencillas y económicas.
En el procedimiento conforme a la invención, en
la fermentación se pueden emplear las fuentes de C usuales en una
fermentación, como por ejemplo glucosa, lactosa, fructosa, almidón y
similares, fuentes de N, como por ejemplo amonio o hidrolizados de
proteína y similares, y fuentes de S, como por ejemplo sulfuros,
sulfitos, sulfatos, tiosulfatos o ditionita.
Los derivados de tiazolidina obtenidos
fermentativamente no sólo se pueden emplear para la obtención de
cisteína. Se conocen muchas posibilidades de aplicación que pueden
emplear los derivados de tiazolidina obtenidos fermentativamente
con la configuración R en el átomo de carbono C4, como producto de
partida para síntesis más amplias (building block).
Los siguientes ejemplos sirven para ,ilustrar la
invención más detalladamente.
La determinación cuantitativa de derivado de
tiazolidina/hemitiocetal sólo es posible de manera indirecta. En
los ejemplos, se efectuó por la determinación de cisteína según
Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633.
Por la derivación de la cisteína en ácido fuerte con ninhidrina,
aquélla sale del equilibrio. Así, el hemitiocetal reacciona y
finalmente también el derivado de tiazolidina. Después de
aproximadamente 10 minutos a 100ºC, todo el derivado de tiazolidina
y el correspondiente hemitiocetal se transforma en el derivado de
cisteína-ninhidrina, el cual se puede cuantificar
entonces a 560 nm. La cisteína libre también se incluye en la
determinación.
La cantidad de grupos SH libres y, así, de
cisteína libre sola se determinó mediante la prueba descrita por
Sang-Han Lee y colaboradores, Biochemical and
Biophysical Research Communications, Vol. 213, No. 3 (1995),
páginas 837 y siguientes, mediante ácido
5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico
(DTNB).
En el caso de una formación de
L-cisteína libre, ésta es oxidada por el oxígeno
del aire alimentado durante la fermentación para obtener
L-cistina. La cistina es de difícil disolución en
medio acuoso a pH 7.0 y se precipita como perla blanca. En el caso
de una formación de una perla de cistina insoluble, ésta se
disuelve en HC1 semiconcentrado y también se mide bajo condiciones
reductoras con ditiotreita (DTT) en la prueba antes
mencio-
nada.
nada.
En el ejemplo 3, como resultados de fermentación
se indican las cantidades medidas conforme a la prueba según
Gaitonde de "cisteina total". Son sobre todo ácido
2-metil-tiazolidin-2,4-dicarbónico,
el correspondiente hemitiocetal, L-cisteína libre y
cistina disuelta. La cistina precipitada se cuantificó e indicó por
separado.
La gran capacidad de precipitación del ácido
2-metil-tiazolidin-2,4-dicarbónico
que se forma en la presente invención, mediante iones de metal
bivalentes, puede ser aprovechada para la comprobación de la
formación de dicho derivado. Hasta ahora únicamente se ha descrito
la capacidad de precipitación con acetato de zinc (Schubert y
colaboradores, véase indicación anterior de literatura
especializada). Sin embargo, también es posible una precipitación
con otros iones de metal bivalentes, como magnesio, hierro, cobre,
zinc, mangano, cobalto y similares. La precipitación y
subsiguiente identificación del producto de tiazolidina formado se
describe en el ejemplo 4. Ahí se muestra también que después de 24
horas de tiempo de fermentación, el producto principal es ácido
2-metil-tiazolidin-2,4-dicarbónico.
La gran capacidad de precipitación no es de gran ayuda únicamente
en el análisis del producto de la fermentación, sino también en la
purificación del mismo.
Los alelos cysE, cysEIV y cysEX empleados a
continuación se describen en el documento DE 19539952, ejemplo
2/10.
La obtención de las mutaciones ahí citadas es
posible con el empleo de la mutagénesis específica del lugar. Se
pueden obtener equipos para la realización de la mutagénesis en el
comercio, por ejemplo de Stratagene (Stratagene GmbH, Postfach
105466, D-69044 Heidelberg) bajo el nombre
comercial de ExSite o Chameleon.
Después de efectuar la mutagénesis específica
del lugar, los alelos obtenidos se amplifican mediante la reacción
de cadenas de polimerasa (PCR) (Saiki y colaboradores 1988, Science
239: 487-491) del correspondiente ADN, mediante los
siguientes iniciadores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos PCR se efectuaron en 30 ciclos
en presencia de 200 \muM de trifosfatos de deoxinucleótido (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP), respectivamente 1 \muM del correspondiente
oligonucleótido, 100 ng de matrices ADN con el correspondiente
alelo cysE, 1/10 amortiguador de reacción x 10 (100 mM de KCl, 100
mM (NH4) 2SO4, 200 mM de tris-HCl (pH 8.8), 20 mM
de MgSO4, 1% de triton X-100 y 1000 \mug/ml de
BSA) y 2.5 unidades de una polimerasa Pfu-ADN
recombinante, estable al calor (Stratagene), en un Thermocycler
(Gene-ATAG-Controler, Pharmacia)
bajo las siguientes condiciones: 94ºC durante 1 min, 60ºC durante 1
min y 72ºC durante 3 min.
El producto de la amplificación se hidrolizó con
Sacl y NsiI (ambos de Boehringer Mannheim GmbH) bajo las
condiciones indicadas por el fabricante, se separaron mediante un
gel de agarosa al 1% y se aislaron con la ayuda del método
Geneclean (Geneclean Kit BIO101, P.O. Box 2284, La Jolla,
California, 92038-2284), según las indicaciones del
fabricante, del gel de agarosa como fragmento de aproximadamente
1.0 kb. Hasta su utilización, el fragmento se almacenó a -20ºC.
El mar-Locus de Escherichia coli se
amplificó mediante PCR. El procedimiento para la obtención de los
amplificados es el mismo que se describe en el ejemplo 1, sección A.
Como ADN de matrices se empleó el ADN cromosomal de Escherichia
coli W3110 (ATCC 27325). Como ADN de matrices también es
adecuado el plásmido 100-1-1 (DSM
11545). La lisis de las células y la purificación del ADN
cromosomal conforme al protocolo descrito en Ausubel y
colaboradores, 1987, 2.4.1 - 2.4.2, Current Protocols in Molecular
Biology, Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience. Los siguientes iniciadores se
emplearon para la amplificación del mar-Locus:
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación del mar-Locus llevó a un
fragmento de aproximadamente 3 kb, el cual se purificó como se
describe en el ejemplo 1, sección A. La siguiente digestión de
restricción se efectúa con las enzimas AscI y PacI (ambos de New
England Biolabs GmbH, Postfach 2750, D-65820
Schwalbach/Taunus), conforme a las instrucciones y con los
amortiguadores del fabricante. Después de la purificación del
fragmento mediante electroforesis de gel de agarosa, se almacenó a
-20ºC.
El ADN que codifica el ORF306 se amplificó
mediante PCR como se describe en el ejemplo 1, sección A. Como ADN
de matrices se empleó el ADN cromosomal aislado en el ejemplo 1,
sección B, de E. coli W3110 (ATCC 27325). Como ADN de
matrices también es adecuado el plásmido
100-1-1 (DSM 11545). Los iniciadores
empleados son los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de ADN amplificado es de
aproximadamente 1.05 kb y, como se describió, se purificó mediante
electroforesis de gel de agarosa. Una subsiguiente digestión de
restricción con las enzimas AsnI (Boehringer Mannheim) y PacI (New
England Biolabs) llevó después de retirar las enzimas al fragmento
de ADN deseado. Éste se almacenó hasta su utilización a -20ºC.
Para la transcripción efectiva del ORG306, se
empleó el promotor del gen de
glicerinaldehid-3-fosfatdehidrogenasa.
Este fragmento de ADN deseado también se obtuvo mediante PCR.
Como ADN de matrices se empleó el ADN cromosoma)
de Escherichia coli W3110 (ATCC 27325). Como ADN de matrices
también es adecuado el plásmido
100-1-1. Se emplearon los siguientes
iniciadores:
El fragmento de ADN obtenido, con
aproximadamente 0.3 kb, se aisló y purificó mediante electroforesis
de gel de agarosa, como se describe en el ejemplo 1, sección A. Una
subsiguiente digestión de restricción con las enzimas MluI y PacI
llevó al fragmento de ADN deseado. Después de retirar las enzimas
de restricción, el ADN se almacenó a -20ºC.
Como plásmido base para la construcción de los
plásmidos conforme a la invención se empleó el plásmido pACYC184.
Este plásmido se modificó como se describe en el documento DE
19539952 y se depósito como plásmido pACYC184-LH
bajo el número de depósito DSM 10172 en la Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen en Braunschweig.
En la figura 2 se muestra una carta de
restricción y función del plásmido pACYC184-LH.
Dicho plásmido porta un poliligador. Este poliligador presenta las
siguientes intersecciones de restricción:
NotI - NcoI - SacI - NsiI - MluI - PacI -
NotI
En estos ligadores se ligaron los fragmentos de
ADN obtenidos en el ejemplo 1 mediante PCR y una subsiguiente
digestión de restricción.
La obtención de los plásmidos pACYC184/cysEIV y
pACYC184/cysEX se describe en el documento DE 195399
52, ejemplo 3 y se resume a continuación:
52, ejemplo 3 y se resume a continuación:
Se digirió aproximadamente 1 \mug del plásmido
pACYC184-LH (DSM 10172) con las enzimas de
restricción SacI y NsiI, conforme a las indicaciones del fabricante
(Boehringer Mannheim). El ADN digerido se purificó a continuación
mediante electroforesis de gel de agarosa para retirar las enzimas,
como se describió anteriormente. Los fragmentos de ADN obtenidos en
el ejemplo 1, sección A, los cuales codifican el correspondiente
alelo cysE, se mezclaron entonces de manera equimolar con el
plásmido pACYC184-LH digerido con SacI y NsiI y se
agregaron 1 \mul de ligasa T4 ADN y 2 \mul de amortiguador de
ligasa x 10 (ambos de Boehringer Mannheim) y se llenó con H2O
estéril, dos veces destilada a un volumen total de 20 \mul. La
mezcla se incubó durante la noche a 4ºC y se empleó para la
transformación de Escherichia coli W3110 (ATCC 27325). El
procedimiento de transformación descrito a continuación se empleó
en todas las transformaciones mencionadas en los ejemplos.
La transformación de E. coli W3110 se
efectuó mediante electroporación. Para ello se inocularon 500 ml
de medio LB (10 g de triptón, 5 g de extracto de levadura, 5 g de
NaCl) en un matraz Erlenmeyer de 1 1 con 1% (V/V) de una cultura de
una noche en el mismo medio. Después de una incubación en el
agitador redondo a 37ºC hasta una densidad óptica de 0.5 - 0.6 a 600
nm, las células se cultivaron mediante centrifugación a 4ºC en un
recipiente estéril. Todos los demás pasos se realizaron sobre hielo
y conservando condiciones estériles. La perla de células se lavó
dos veces con 500 ml de H2O destilada dos veces, estéril, helada y
finalmente se resuspendió en 30 ml 10% (V/V) de glicerina estéril.
Después de otra centrifugación, la perla de células se incorporó en
500 \mul 10% (V/V) de glicerina y se almacenó en 200 \mul de
alicuota a -80ºC. Para la transformación, las células se
descongelaron sobre hielo, se agregaron aproximadamente
10-100 ng de ADN y se dispusieron en una cubeta
estéril de electroporación (BioRad). La cubeta se colocó en el Gene
Pulser (BioRad) y se electroporizó a una tensión de 2500 Volts, una
resistencia paralela de 200 Ohms y una capacidad de 25 \mutF. A
continuación, las células se resuspendieron en 1 ml de medio SOC
(caseinpeptona 20.0 g/l, extracto de levadura 5.0 g/l, NaCl 0.58
g/l, KCl 0.19 g/l, MgCl2 2.03 g/l, MgSO4 2.46 g/l, glucosa 3.60
g/l, pH = 7.0) y se agitaron una hora a 37ºC. Después, las células
se diluyeron de manera correspondiente, se dispusieron sobre placas
de agar LB (10 g/l de triptón, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l
de NaCl, 15 g/l de agar, pH = 7.2) y se incubaron durante la noche
a 37ºC, hasta que se observaron colonias
aisladas.
aisladas.
Los transformandos deseados se identificaron
mediante un análisis de restricción después de un aislamiento de
plásmido mediante QIAprep Spin Plasmid Kit (Qiagen GmbH,
Max-Volmer-Strasse 4,
D-40724 Hilden). Se emplearon como control en la
fermentación en el ejemplo 3.
Los plásmidos pACYC184/cysEIV y pACYC184/cysEX se
muestran en la figura 3.
Se digirió respectivamente 1 \mug de los
plásmidos pACYC184/cysEIV y pACYC184/cysEX construidos en el ejemplo
2, sección A, sucesivamente con las enzimas de restricción MluI
(Boehringer) y PacI (New England Biolabs), conforme a las
indicaciones del fabricante. Después de esta digestión de
restricción, el ADN se aisló y purificó mediante una electroforesis
de gel de agarosa, como se describe en el ejemplo 1, sección A. Se
mezclaron aproximadamente 20 ng de los vectores pACYC184/cysEIV, o
bien, pACYC184/cysEX digeridos con M1uI-PacI
respectivamente con 200 ng del fragmento de ADN obtenido en el
ejemplo 1, sección A, 1 \mul de ligasa de ADN T4 (Boehringer
Mannheim) y 2 \mul de amortiguador de ligasa x 10 (Boehringer
Mannheim) y la cantidad necesaria de H2O destilada dos veces,
estéril, en un volumen final de 20 \mul. Después de una
incubación durante la noche a 4ºC, las dos mezclas de ADN se
emplearon para la transformación de Escherichia coli W3110
(ATCC 27325). Después de un aislamiento de plásmido mediante
QIAprep Spin Plasmid Kit (Qiagen GmbH) y un análisis de
restricción, se aislaron los transformandos deseados y se emplearon
en la fermentación, como se describe en el ejemplo 3. En la figura
4 se muestra una carta de restricción y función de los plásmidos
pACYC184/cysEIV-mar, o bien,
pACYC184/
cysEX-mar.
cysEX-mar.
Los plásmidos pACYC184/cysEIV y pACYC184/cysEX
construidos en el ejemplo 2, sección A se digirieron
respectivamente con las enzimas de restricción MluI (Boehringer
Mannheim) y PacI (New England Biolabs), conforme a las indicaciones
del fabricante.
Después de la purificación de estos plásmidos
tratados de esa manera, se cargaron respectivamente con el
fragmento de ADN obtenido en el ejemplo 1, sección D, dos ligandos,
como se describe en el ejemplo 2, sección B.
Después de una incubación durante la noche a
4ºC, las cargas de ligazón se transformaron en E. coli W3110.
Los transformandos correctos se identificaron después del
aislamiento del plásmido ADN, mediante un análisis con las enzimas
de restricción adecuadas.
Los plásmidos
pACYC184/cysEIV-GAPDH y
pACYC184/cysEX-GAPDH se emplearon como materiales de
partida para la construcción de los plásmidos
pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306 y
pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306, como se
describe en la siguiente sección D.
Los plásmidos obtenidos en la sección C se
digirieron con NdeI (Boehringer Mannheim) y PacI (New England
Biolabs), conforme a las indicaciones del fabricante. Después de
purificar los plásmidos ADN, se cargaron dos ligandos con el
fragmento de ADN del ejemplo 1, sección C, que codifica ORF306,
cortado con AsnI-PacI.
Después de una incubación durante la noche a
4ºC, la mezcla de ADN se transformó respectivamente en E.
coli W3110 y se dispuso en placas LB. Después de aparecer
colonias aisladas, éstas se examinaron mediante aislamiento de
plásmido y digestión de restricción en cuanto a su exactitud.
La figura 5 muestra una carta de restricción y
función de los plásmidos
pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORG306 y
pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306.
Todos los plásmidos comparados en la fermentación
se fermentaron en E. coli W3110. De esta manera está
garantizado que los aumentos de rendimientos respectivamente
observados resultan exclusivamente por el empleo conforme a la
invención de los genes.
Se inocularon 20 ml de medio LB con 15 mg/l de
tetraciclina en un matraz de Erlenmeyer (100 ml) con la
correspondiente estructura de E. coli. Después de una
incubación de siete horas en la incubadora de agitación (150
r.p.m., 30ºC), las respectivas culturas previas se transfirieron a
100 ml de medio SM1 (12 g/l de K2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 5 g/l de
(NH4)2SO4, 0.3 g/l de MgSO4 x 7H2O, 0.015 g/l de CaCl2 x
2H2O, 0.002 g/l de FeSO4 x 7H2O, 1 g/l de Na3citrato x 2H2O, 0.1
g/l de NaCl, 1 ml/l de solución de elementos traza, compuesta por
0.15 g/l de Na2MoO4 x 2H2O, 2.5 g/l de H3BO3, 0.7 g/l de CoCl2 x 6
H2O, 0.25 g/l de CuSO4 x 5H2O, 1.6 g/l de MnCl2 x 4H2O, 0.3 g/l de
ZnSO4 x 7H2O), el cual tenía como suplemento 5 g/l de glucosa, 5
mg/l de vitamina B1 y 15 mg/l de tetraciclina. Las culturas se
agitaron con 150 r.p.m. en matraces de Erlenmeyer (1 l) a 30ºC
durante 17 h. Después de esta incubación, la densidad óptica a 600
nm (OD600) fue de entre 3 y 5.
La fermentación se realizó en el fermentador
BIOSTAT M de la compañía Braun-Melsungen. Se empleó
un recipiente de cultura con 2 l de volumen total. El medio de
fermentación contiene 15 g/l de glucosa, 10 g/l de triptón (Difco),
5 g/l de extracto de levadura (Difco), 5 g/l de (NH4)2SO4,
1.5 g/l de KH2PO4, 0.5 g/l de NaCl, 0.3 g/l de MgSO4 x 7H2O, 0.015
g/l de CaCl2 x 2H2O, 0.075 g/ñ de FeSO4 x 7H2O, 1 g/l de Na3citrato
x 2H2O y 1 ml de solución de elementos traza (véase antes), 0.005
g/l de vitamina B1 y 15 mg/l de tetraciclina. El pH en el
fermentador se ajustó al inicio a 7.0 bombeando una solución de
NH4OH al 25%. Durante la fermentación, el pH se mantuvo mediante
corrección automática con NH4OH al 25% en un valor de 7.0. Para
inocular se bombearon 100 ml de precultura al recipiente del
fermentador. El volumen inicial fue de aproximadamente 1 l. Las
culturas se agitaron primero con 200 r.p.m. y se gasificaron con
1.5 vvm de aire a presión desgerminado a través de un filtro
estéril. La saturación de oxígeno del aire se ajustó durante la
fermentación a 50%. El control se realizó automáticamente mediante
la velocidad de agitación. La fermentación se llevó a cabo a una
temperatura de 30ºC. Después de 2 h de tiempo de fermentación, se
efectuó una alimentación a partir de una solución madre estéril al
30% de Na-tiosulfato x 5H2O, con un flujo de 3 ml
por hora. Después de alcanzar una OD600 de 10, se agregó una
solución madre estéril al 56% de glucosa, con un flujo de
aproximadamente 8 a 14 ml por hora. La determinación del contenido
de glucosa se efectuó enzimáticamente con la ayuda de un analizador
de glucosa de la compañía YSI. La concentración de glucosa se
ajustó durante la fermentación mediante alimentación continua a
entre 10 y 20 g/l. El contenido total de cisteína del medio se
determinó a partir del exceso libre de células de la muestra, de
manera clorimétrica conforme a Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J.
104, 627-633. Se debe observar que la cisteína que
permanece en solución durante la fermentación, está presente sobre
todo como derivado de tiazolidina, pero que también fue incluida en
la prueba. Si para la reacción de la cisteína que se formó para
obtener el derivado de tiazolidina, ya no se tiene a disposición la
cantidad suficiente de la cetona o el aldehído necesario (en este
caso piruvato), se forma L-cisteína libre, la cual
también se incluye en el test. En el caso de una formación de
L-cisteína libre, ésta se oxida lentamente por el
oxígeno de aire alimentado durante la fermentación a
L-cistina. Cistina es de difícil disolución en
medio acuoso a pH 7.0 y se precipita como perla blanca. En el caso
de una formación de una perla de cistina insoluble, ésta se
disuelve después de separar un exceso de una muestra tomada,
después de una centrifugación, en HCl semiconcentrado y también se
mide bajo condiciones reductoras (DTT) en el test antes
mencionado.
Bajo estas condiciones, después de una duración
de fermentación de 24 horas, o bien, 48 horas, se lograron los
rendimientos mostrados en las tablas 1 y 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| * cantidad de cistina presente como perla, en gramos por litro |
| * cantidad de cistina presente como perla, en gramos por litro |
Para la comprobación de la formación de ácido
2-metil-tiazolidin-2,4-dicarbónico
como producto principal de la fermentación descrita en el ejemplo
3, se fermentó la estructura E. coli W3110 x
pACYC184/cysEX-GAPDH-0RF306 como se
describe en el ejemplo 3.
Después de 24 horas, el sobresaliente de la
fermentación se separó de las células mediante una centrifugación.
La medición de cisteína descrita dio como resultado 12.8 g de
cisteína total en el sobresaliente. El sobresaliente de la
fermentación se mezcló después con MgSO4 en una concentración final
de 0.3 M. Después de una incubación de este sobresaliente durante
la noche a 4ºC bajo agitación, se formó un precipitado blanco. Se
trató de la sal de magnesio difícilmente soluble del ácido
2-metil-tiazolidin-2,4-dicarbónico.
Después de una separación de dicho precipitado
mediante centrifugación, en el sobresaliente se midió únicamente
una cantidad residual de cisteína de 2.5 g/l.
El precipitado se disolvió en HCl semiconcentrado
y también se sometió a una prueba de cisteína. Se encontró una
concentración de 9.5 g/l de cisteína. Después de un examen NMR 1H y
13C del precipitado disuelto en D2O + HCl, éste se identificó
contra una sustancia de referencia (M.P. Schubert, J. Biol. Chem.
121, 539-548 (1937)) como ácido
2-metil-tiazolidin-2,
4-dicarbónico.
Para este ensayo se sintetizó ácido
2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dicarbónico
según el método de Schubert (M.P. Schubert, J. Biol. Chem. 121,
539-548 (1937)), a partir de
L-cisteína y piruvato. Una cultura de una noche de
E. coli W3110 en medio LB se inoculó en 20 ml de medio SMl
(véase ejemplo 3), el cual tenía como suplemento 10 g/l de glucosa,
10% de medio LB, 5 mg/l de vitamina B1, 15 mg/l de tetraciclina y
cantidades respectivas de L-cisteína o ácido
2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dicarbónico.
Después de una incubación de 7 horas a 37ºC, en el medio adicionado
con L-cisteína no se observó ningún crecimiento a
partir de 1 mM, mientras que en el medio adicionado con ácido
2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dicarbónico
se observó un crecimiento de hasta 50 mM. Debido a la fácil
oxidación de cisteína no fueron posibles tiempos de incubación más
largos. Así, para L-cisteína resulta una toxicidad
claramente más alta para E. coli que para ácido
2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dicarbónico.
Por ello, el ácido
2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dicarbónico
es adecuado de manera claramente mejor para la obtención de
L-cisteína mediante procedimientos fermentativos,
incluso cuando aún se necesite un paso químico para la liberación
de la L-cisteína.
La formación de
N-acetil-L-serina se
efectúa mediante reposicionamiento espontáneo a partir de
O-acetil-L-serina.
Esta
O-acetil-L-serina es
la etapa previa inmediata de L-cisteína en el
camino de biosíntesis en el caso de bacterias. Con una inclusión
de azufre insuficiente o faltante en
O-acetil-L-serina,
el producto final de una fermentación de este tipo es así
N-acetil-L-serina.
Si falta la alimentación de azufre, los genes conforme a la
invención aumentan también el rendimiento de este producto de
fermentación.
La fermentación descrita en el ejemplo 3 se
realizó sin alimentación de tiosulfato. Las estructuras empleadas,
las cuales deben mostrar la efectividad de los genes presentes,
particularmente de ORF306, fueron pACYC184/cysEX y
pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306.
Como muestran los resultados en la tabla 3, los
genes conforme a la invención, particularmente ORF306, aumentan
claramente el rendimiento de
N-acetil-L-serina en
la fermentación.
| Estructura | N-acetil-L-serina (g/l) |
| pACYC184/cysEX | 7.6 |
| pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 | 15.9 |
En el caso de emplear alelos cysE más
fuertemente resistentes a la retroalimentación (por ejemplo,
cysEXIV, cysEXI y cysEXXII del documento DE 19539952) en
combinación con los genes conforme a la invención, se pueden
alcanzar rendimientos de
N-acetil-L-serina de
más de 30 g/l.
(1) DATOS GENERALES
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Consortium für elektrochemische Industrie GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Zielstattstr. 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LUGAR: Munich
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO FEDERADO: Baviera
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 81379
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 089-74844-0
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 089-74844-350
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Microorganismos y procedimientos para la obtención fermentativa de L-cisteína, L-cistina, N-acetil-serina o derivados de tiazolidina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN LEGIBLE CON COMPUTADORA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- PORTADOR DE DATOS: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 306 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROVENIENCIA ORIGINAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: K12
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 299 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROVENIENCIA ORIGINAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: K12
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 266 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- PROVENIENCIA ORIGINAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Escherichia coli
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: K12
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT CGGCGTTG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGATGCAT TACGTAGGGG TATCCGGGAG CGGTATTG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTGGCGCGC CGATCAGCGG CGGCGCAACC ATCAG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTTAATTA AGATCGACAC TCAGGCTGTA CTGGCGAC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAATTCATT AATCCGGCGA CTAACGAATC AACTG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTTAATTA ACGCTATGTA GTTTGTTCTG GCCCCG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACGCGT GAGGCGAGTC AGTCGCGTAA TGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE LA SEQ ID NO: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE BANDA: Banda individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "synthetic"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCTTAATT AAGATCTCAT ATGTTCCACC AGCTATTTGT TAG
\hfill43
Claims (5)
1. Una cepa de microorganismos adecuada para la
obtención fermentativa de L-cisteína,
L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina, caracterizada porque la misma está desregulada
en su metabolismo de la cisteína de tal manera que forma una
cantidad incrementada de L-cisteína y sobreexpresa
al menos un gen codificante de una proteína que tiene la secuencia
SEQ.ID.NO: 2 o una de sus variantes, que contribuye a la obtención
de L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina.
2. Una cepa de microorganismos conforme a la
reivindicación 1, caracterizada porque el metabolismo de la
cisteína está desregulado por un alelo Cys-E
resistente a la retroalimentación.
3. Una proteína que incluye la secuencia
o una variante de la secuencia que
contribuya a le obtención de L-cisteína,
L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina.
4. Un procedimiento para la obtención de
L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina o derivados de
tiazolidina de los mismos, caracterizado porque en la
fermentación se emplea de manera en sí conocida una cepa de
microorganismos conforme a la reivindicación 1 ó 2.
5. El empleo de proteínas conforme a la
reivindicación 3 para la expresión amplificada de
L-cisteína, L-cistina,
N-acetil-serina y/o derivados de
tiazolidina.
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