PL195784B1 - Szczep mikroorganizmu, białko, sposób wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych oraz zastosowanie białka - Google Patents
Szczep mikroorganizmu, białko, sposób wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych oraz zastosowanie białkaInfo
- Publication number
- PL195784B1 PL195784B1 PL326915A PL32691598A PL195784B1 PL 195784 B1 PL195784 B1 PL 195784B1 PL 326915 A PL326915 A PL 326915A PL 32691598 A PL32691598 A PL 32691598A PL 195784 B1 PL195784 B1 PL 195784B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cysteine
- leu
- ala
- gly
- acetylserine
- Prior art date
Links
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 99
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 30
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 29
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims description 39
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 150000003548 thiazolidines Chemical class 0.000 claims abstract description 46
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims abstract description 31
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims abstract description 26
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 claims abstract description 19
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 12
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- JCAKCGQZNBEITC-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,3-thiazolidine-2,4-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(C)NC(C(O)=O)CS1 JCAKCGQZNBEITC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 101000787090 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Uncharacterized 33.9 kDa protein in glnA 5'region Proteins 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- JJIHLJJYMXLCOY-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-DL-serine Natural products CC(=O)NC(CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- JCAKCGQZNBEITC-FWRGRRDFSA-N (4r)-2-methyl-1,3-thiazolidine-2,4-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(C)N[C@H](C(O)=O)CS1 JCAKCGQZNBEITC-FWRGRRDFSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 5
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 5
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine Chemical class C1CSCN1 OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N Ala-Phe-Pro Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)C(=O)N1[C@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N 0.000 description 3
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N O-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N Phe-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 3
- GRVMHFCZUIYNKQ-UFYCRDLUSA-N Phe-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O GRVMHFCZUIYNKQ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 3
- URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- WHNSHJJNWNSTSU-BZSNNMDCSA-N Val-Val-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WHNSHJJNWNSTSU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 3
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 3
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 3
- ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 2
- JAQNUEWEJWBVAY-WBAXXEDZSA-N Ala-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JAQNUEWEJWBVAY-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 2
- BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N BUQICHWNXBIBOG-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N Arg-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JEOCWTUOMKEEMF-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- QUBKBPZGMZWOKQ-SZMVWBNQSA-N Arg-Trp-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 QUBKBPZGMZWOKQ-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 2
- GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N Asn-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GLWFAWNYGWBMOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N Leu-Asp-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HGFGEMSVBMCFKK-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N Leu-Val-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N Phe-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N Phe-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1ccccc1)C(C)C)C(O)=O APZNYJFGVAGFCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N Pro-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIZQGKLMXKGDIV-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- GZYNMZQXFRWDFH-YTWAJWBKSA-N Thr-Arg-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O GZYNMZQXFRWDFH-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- OGXQLUCMJZSJPW-LYSGOOTNSA-N Trp-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O OGXQLUCMJZSJPW-LYSGOOTNSA-N 0.000 description 2
- KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N Valylglycine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 108010094001 arginyl-tryptophyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010045126 glycyl-tyrosyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydroxy-[[phosphonatomethyl(phosphonomethyl)amino]methyl]phosphinate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(=O)CN(CP(O)([O-])=O)CP([O-])([O-])=O SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N Ala-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N LMFXXZPPZDCPTA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N PCIFXPRIFWKWLK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N Ala-Ile-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCTFKEJEIMPOLW-JURCDPSOSA-N 0.000 description 1
- WUHJHHGYVVJMQE-BJDJZHNGSA-N Ala-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WUHJHHGYVVJMQE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- YCRAFFCYWOUEOF-DLOVCJGASA-N Ala-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 YCRAFFCYWOUEOF-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- CYBJZLQSUJEMAS-LFSVMHDDSA-N Ala-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C)N)O CYBJZLQSUJEMAS-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N Ala-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 IHMCQESUJVZTKW-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N Ala-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N ADSGHMXEAZJJNF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N Ala-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNFSAYFQLXPHPY-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 1
- XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PJOPLXOCKACMLK-KKUMJFAQSA-N Arg-Tyr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PJOPLXOCKACMLK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PPCORQFLAZWUNO-QWRGUYRKSA-N Asn-Phe-Gly Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PPCORQFLAZWUNO-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- KBQOUDLMWYWXNP-YDHLFZDLSA-N Asn-Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N KBQOUDLMWYWXNP-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QVXWAFZDWRLXTI-NWLDYVSISA-N Glu-Thr-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O QVXWAFZDWRLXTI-NWLDYVSISA-N 0.000 description 1
- MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N Gly-Ala-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MZZSCEANQDPJER-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N Gly-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN JRDYDYXZKFNNRQ-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- XUORRGAFUQIMLC-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN)O XUORRGAFUQIMLC-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N Gly-Ile-Ala Natural products NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(C)C(O)=O SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IUZGUFAJDBHQQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N Gly-Leu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LHYJCVCQPWRMKZ-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N Gly-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 HQSKKSLNLSTONK-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VIVSWEBJUHXCDS-DCAQKATOSA-N His-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VIVSWEBJUHXCDS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- CIJLNXXMDUOFPH-HJWJTTGWSA-N Ile-Pro-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CIJLNXXMDUOFPH-HJWJTTGWSA-N 0.000 description 1
- WKSHBPRUIRGWRZ-KCTSRDHCSA-N Ile-Trp-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)NCC(=O)O)N WKSHBPRUIRGWRZ-KCTSRDHCSA-N 0.000 description 1
- YBHKCXNNNVDYEB-SPOWBLRKSA-N Ile-Trp-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N YBHKCXNNNVDYEB-SPOWBLRKSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- QPRQGENIBFLVEB-BJDJZHNGSA-N Leu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O QPRQGENIBFLVEB-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N Leu-Ala-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- VKOAHIRLIUESLU-ULQDDVLXSA-N Leu-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O VKOAHIRLIUESLU-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N Leu-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 XYUBOFCTGPZFSA-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KEVYYIMVELOXCT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- CFZZDVMBRYFFNU-QWRGUYRKSA-N Leu-His-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(O)=O CFZZDVMBRYFFNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- ZALAVHVPPOHAOL-XUXIUFHCSA-N Leu-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N ZALAVHVPPOHAOL-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N Leu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N OMHLATXVNQSALM-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- DDVHDMSBLRAKNV-IHRRRGAJSA-N Leu-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DDVHDMSBLRAKNV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- ARNIBBOXIAWUOP-MGHWNKPDSA-N Leu-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ARNIBBOXIAWUOP-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VKCPHIOZDWUFSW-ONGXEEELSA-N Lys-Val-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VKCPHIOZDWUFSW-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZVXPUHLTZRQEL-UWVGGRQHSA-N Met-Leu-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O HZVXPUHLTZRQEL-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- USBFEVBHEQBWDD-AVGNSLFASA-N Met-Leu-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O USBFEVBHEQBWDD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CIIJWIAORKTXAH-FJXKBIBVSA-N Met-Thr-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O CIIJWIAORKTXAH-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- QYIGOFGUOVTAHK-ZJDVBMNYSA-N Met-Thr-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QYIGOFGUOVTAHK-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N Met-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- -1 N-acetylserine thiazolidine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 101100205189 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MIDZLCFIAINOQN-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N Phe-Ala-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 LBSARGIQACMGDF-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 1
- CGOMLCQJEMWMCE-STQMWFEESA-N Phe-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CGOMLCQJEMWMCE-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UEHNWRNADDPYNK-DLOVCJGASA-N Phe-Cys-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N UEHNWRNADDPYNK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ZLGQEBCCANLYRA-RYUDHWBXSA-N Phe-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZLGQEBCCANLYRA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 APJPXSFJBMMOLW-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- VJLLEKDQJSMHRU-STQMWFEESA-N Phe-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VJLLEKDQJSMHRU-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ACJULKNZOCRWEI-ULQDDVLXSA-N Phe-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ACJULKNZOCRWEI-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- BPIMVBKDLSBKIJ-FCLVOEFKSA-N Phe-Thr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 BPIMVBKDLSBKIJ-FCLVOEFKSA-N 0.000 description 1
- OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OOLOTUZJUBOMAX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N Pro-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HMNSRTLZAJHSIK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VCYJKOLZYPYGJV-AVGNSLFASA-N Pro-Arg-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VCYJKOLZYPYGJV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WOIFYRZPIORBRY-AVGNSLFASA-N Pro-Lys-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WOIFYRZPIORBRY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BUEIYHBJHCDAMI-UFYCRDLUSA-N Pro-Phe-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BUEIYHBJHCDAMI-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108010003201 RGH 0205 Proteins 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CRZNCABIJLRFKZ-IUKAMOBKSA-N Thr-Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N CRZNCABIJLRFKZ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- ZOCJFNXUVSGBQI-HSHDSVGOSA-N Thr-Trp-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O ZOCJFNXUVSGBQI-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C([O-])=O)=CNC2=C1 OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- GHXXDFDIDHIEIL-WFBYXXMGSA-N Trp-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N GHXXDFDIDHIEIL-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- ICNFHVUVCNWUAB-SZMVWBNQSA-N Trp-Arg-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N ICNFHVUVCNWUAB-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N Tyr-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- NXRGXTBPMOGFID-CFMVVWHZSA-N Tyr-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NXRGXTBPMOGFID-CFMVVWHZSA-N 0.000 description 1
- SMKXLHVZIFKQRB-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N SMKXLHVZIFKQRB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N Val-Ala-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- BVWPHWLFGRCECJ-JSGCOSHPSA-N Val-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N BVWPHWLFGRCECJ-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MYLNLEIZWHVENT-VKOGCVSHSA-N Val-Ile-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N MYLNLEIZWHVENT-VKOGCVSHSA-N 0.000 description 1
- DAVNYIUELQBTAP-XUXIUFHCSA-N Val-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N DAVNYIUELQBTAP-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- CKTMJBPRVQWPHU-JSGCOSHPSA-N Val-Phe-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)O)N CKTMJBPRVQWPHU-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N Val-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)C(C)C NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 108010054812 diprotin A Proteins 0.000 description 1
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010062266 glycyl-glycyl-argininal Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 108010077158 leucinyl-arginyl-tryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010051673 leucyl-glycyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150008274 marA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N pirenzepine hydrochloride Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].[Cl-].C1CN(C)CCN1CC(=O)N1C2=NC=CC=C2NC(=O)C2=CC=CC=C21 FFNMBRCFFADNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
1. Szczep mikroorganizmu, który jest zdolny do fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych, znamienny tym, ze ma rozregulowa- ny metabolizm cysteiny tak, ze tworzy zwiekszona ilosc L-cysteiny i nadwyraza co najmniej jeden gen kodujacy bialko o sekwencji Id. Sekw. Nr 2 lub jego wariant, który przyczynia sie do wytwarzania L-cysteiny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych. PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest szczep mikroorganizmu, który jest zdolny do fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych, białko, sposób wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych oraz zastosowanie białka.
Wynalazek dotyczy mikroorganizmów i procesów fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych.
Fermentacyjne wytwarzanie aminokwasów jest obecnie powszechne w przypadku wielu aminokwasów. Jednakże, nie istniał uprzednio żaden ekonomiczny proces fermentacyjny wytwarzania L-cysteiny.
Pochodne tiazolidynowe i odpowiednie hemitioketale na ogół powstają, gdy cysteinę kondensuje się z ketonami albo aldehydami. Chemiczna kondensacja cysteiny z różnymi ketonami albo aldehydami, w szczególności z a-ketokwasami, znana była od dłuższego czasu. W kondensacji jako związek pośredni zostaje wytworzony hemitioketal przez nukleofilowy atak wolnej pary elektronów siarki na ubogi w elektrony atom węgla grupy aldehydowej albo ketonowej. Zamknięcie pierścienia z eliminacją cząsteczki wody prowadzi do powstania odpowiedniej pochodnej tiazolidynowej.
Wytwarzanie pochodnych tiazolidynowych przedstawione jest w sposób ogólny na załączonym schemacie, w którym R1 i R2 mogą oznaczać dowolny rodnik organiczny.
Związki wyjściowe są w równowadze z pochodną tiazolidynową przez hemitioketal. Z tego powodu, hemitioketal jest zwykle również obecny w roztworze wodnym oprócz pochodnej tiazolidynowej.
W znaczeniu zastosowanym w niniejszym wynalazku, termin „pochodna tiazolidynowa” obejmuje odpowiedni hemitioketal będący z nią w równowadze. Nie donoszono dotychczas, że tiazolidyny są bezpośrednimi metabolitami komórek. Wszystkie doniesienia o tworzeniu tiazolidyn przez komórki oparte są na zewnątrzpochodnym dodatku, w nadmiarze, jednego ze związków wyjściowych, zwykle L-cysteiny, która ulega przekształceniu do pirogronianu przez desulfhydratację i deaminację, przy czym pirogronian reaguje z kolei z dodaną cysteiną (Ronald C. Simpson i in., Biochemica et Biophysic Acta, 496 (1977), 12-19). Kredich i in. donoszą w J. Biol. Chem., 248, 17:6187-6196, że kwas 2-metylo-2,4-tiazolidynodikarboksylowy tworzy się in vitro, gdy L-cysteina poddawana jest enzymatycznej desulfhydratacji, jednak ich zdaniem, jest niezwykle mało prawdopodobne, żeby substancja ta była wytwarzana in vivo.
Znane jest zastosowanie tiazolidyn jako racemicznych prekursorów do wytwarzania L-cysteiny metodą biotransformacji (EP-A 0101052, Ok Hee Ryu i in., Biotechnology Letters 17 nr 3, 275-280 (marzec 1995)). Gdy do wytwarzania L-cysteiny wykorzystuje się mieszaninę racemiczną, musi być ona stereoselektywnie przekształcona w L-cysteinę przy użyciu enzymów albo całych komórek. Pozostałe diastereoizomery muszą ponownie ulec racemizacji. Z tego powodu, tego rodzaju biotransformacja obciążona jest wysokimi kosztami.
Chemiczna synteza tiazolidyn z racemicznej cysteiny i odpowiedniego ketonu albo aldehydu prowadzi do powstania czterech różnych diastereoizomerów. Przeprowadzanie syntezy chemicznej z enancjomerycznie czystej L-cysteiny jest drogie i bezsensowne w związku z izolacją L-cysteiny. Z tego powodu, proces wytwarzania diastereoizomerów tiazolidyny, które posiadają konfigurację R przy atomie C4, obarczony jest wysokimi kosztami związków wyjściowych.
Niniejszy wynalazek dotyczy mikroorganizmów, które są przydatne do fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych. Szczep mikroorganizmu według wynalazku, jest zdolny do fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych, i ma rozregulowany metabolizm cysteiny tak że tworzy zwiększoną ilość L-cysteiny i nadwyraża co najmniej jeden gen kodujący białko o sekwencji Id. Sekw. Nr 2 lub jego wariant, które bierze udział w wytwarzaniu L-cysteiny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych.
Korzystnie metabolizm cysteiny w mikroorganizmie według wynalazku uległ rozregulowaniu przez allel Cys-E odporny na sprzężenie zwrotne.
PL 195 784 B1
W zakres wynalazku wchodzi również białko obejmujące sekwencję
| 1 | MKFRGGRMSR | KDGVLALLW | WWGLNFWI | KVGLHNMPRL | MLAGLRFMLV |
| 51 | AFPAIFFVAR | PKVPLNLLLG | YGLTISFAQF | AFLFCAINFG | MPAGLASLVL |
| 101 | QAQAFFTIML | GAFTFGERLH | GKQLAGIALA | IFGVLVLIED | SLNGQHVAML |
| 151 | GFMLTLAAAF | SWACGNIFNK | KIMSHSTRPA | VMSLVIWSAL | IPIIPFFVAS |
| 201 | LILDGSATMI | HSLVTIDMTT | ILSLMYLAFV | ATIVGYGIWG | TLLGRYETWR |
| 251 | VAPLSLLVPV | VGLASAALLL | DERLTGLQFL | GAVLIMTGLY | INVFGLRWRK |
310 AVKVGS* (Identyfikator Sekw. nr 2) lub wariant sekwencji, który bierze udział w wytwarzaniu L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych.
Otwarta ramka odczytu, która koduje białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Identyfikatorze Sekw. nr 2, jest również określana poniżej jako ORF 306.
Poniższa sekwencja stanowi kolejny przykład białka według wynalazku.
MSR KDGVLALLW WWGLNFWI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV
| 44 | AFPAIFFVAR | PKVPLNLLLG | YGLTISFAQF | AFLFCAINFG | MPAGLASLVL |
| 94 | QAQAFFTIML | GAFTFGERLH | GKQLAGIALA | IFGVLVLIED | SLNGQHVAML |
| 144 | GFMLTLAAAF | SWACGNIFNK | KIMSHSTRPA | VMSLVIWSAL | IPIIPFFVAS |
| 194 | LILDGSATMI | HSLYTIDMTT | ILSLMYLAFV | ATIVGYGIWG | TLLGRYETWR |
| 244 | VAPLSLLVPV | VGLASAALLL | DERLTGLQFL | GAYLIMTGLY | INYFGLRWRK |
294 AVKVGS (Identyfikator Sekw. nr 3).
Białka o sekwencji aminokwasowej, która wykazuje homologię wyższą niż 50%, z sekwencją przedstawioną na Identyfikatorze Sekw. nr 2 albo 3 wchodzą w zakres wynalazku.
Korzystnie homologia sekwencji białka według wynalazku z Identyfikatorem Sekw. nr 2 albo 3 jest wyższa niż 75%, zaś szczególnie korzystnie homologia sekwencji z Identyfikatorem Sekw. nr 2 albo 3 jest wyższa niż 90%.
Przykładem nadekspresji genu, który zgodnie z wynalazkiem zwiększa wytwarzanie cysteiny, jest nadekspresja fragmentu DNA wielkości 5,5 kb, który również koduje locus mar. Plazmid ten, określany również jako 100-1-1, zdeponowano w E. coli K12 W3110, w DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Brunszwik, pod numerem DSM 11545. Na fig. 1 pokazano mapę plazmidową tego plazmidu. Plazmid ten można zastosować do amplifikacji genów według wynalazku przy użyciu PCR.
PL 195 784 B1
Specjaliście znane jest zastosowanie znanych sposobów, przykładowo techniki ukierunkowanej mutagenezy, w celu osiągnięcia dalszych konkretnych modyfikacji tych genów w pożądanym w danym przypadku miejscu sekwencji. Mikroorganizmy, które zawierają geny zmodyfikowane w ten sposób, wchodzą również w zakres wynalazku, o ile biorą udział w wytwarzaniu L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny albo pochodnych tiazolidynowych.
W znaczeniu zastosowanym w niniejszym wynalazku, nadekspresja oznacza, że białko wyrażane jest w mikroorganizmie według wynalazku przynajmniej dwukrotnie silniej niż w organizmie typu dzikiego, z którego pochodzi białko.
Korzystnie białko ulega ekspresji przynajmniej pięciokrotnie silniej w mikroorganizmie według wynalazku niż w organizmie typu dzikiego, szczególnie korzystnie przynajmniej dziesięciokrotnie silniej niż w organizmie typu dzikiego, z którego pochodzi białko.
Bez nadekspresji określonych powyżej genów nie można zaobserwować wyraźnego zwiększenia ilości L-cysteiny ani pochodnych tiazolidynowych w porównaniu ze szczepem wyjściowym, przykładowo przy użyciu niezależnej transkrypcji z użyciem osobnego promotora, albo przykładowo, bez genu kodującego marA obecnego w wielu kopiach na plazmidzie.
Wzrost ilości produktu spowodowany nadekspresją wspomnianych sekwencji był tym bardziej nieoczekiwany, ponieważ nadekspresja produktu genu opisanego w literaturze, otwartej ramki odczytu ORF266, którego sekwencja od metioniny w pozycji 41 Identyfikatora Sekw. nr 2 do przodu, odpowiada Identyfikatorowi Sekw. nr 4, nie prowadzi do wzrostu wydajności L-cysteiny.
W sekwencji aminokwasowej, pochodzącej z ORF306, i która opisana jest powyżej, początkowa metionina ORF266 jest wytłuszczona i podkreślona.
Specjaliście znane są liczne sposoby uzyskania nadekspresji genu. Jedną z możliwości jest, przykładowo, ekspresja genu na plazmidzie obecnym w komórce w znacznej liczbie kopii. Znane są takie plazmidy. Przykłady, które można wymienić, obejmują pACYC177, pACYC184, pochodne pACYC184, pBR322, inne pochodne pBR, pBluescript, pUC18, pUC19 i inne plazmidy, które są konwencjonalnie stosowane w E. coli.
Plazmidy, które są korzystne do nadekspresji obejmują pACYC177, pACYC184, pochodne pACYC184, pBR322 i inne pochodne pBR.
Szczególnie korzystne są pACYC184 i jego pochodne, takie jak pACYC184-LH (zdeponowany w DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Brunszwik, pod numerem DSM 10172).
Inne możliwości wspomagania ekspresji obejmują: zwiększenie liczby kopii genu wypływu przez powielenie segmentu genu na chromosomie albo zastosowanie silnych promotorów w celu poprawy transkrypcji genu wypływu.
Przykładami odpowiednich silnych promotorów jest promotor GAPDH, promotor tac (ptac), promotor lac (plac), promotor trp (ptrp), lambda PL albo lambda PR.
Szczególnie korzystny jest promotor GAPDH albo promotor tac (ptac).
Szczególnie korzystny jest promotor GAPDH.
Dalszą możliwością wspomagania ekspresji jest inaktywacja genów represorowych, które wywierają wpływ hamujący ekspresję genu wypływu. W przypadku genów locus mar może to obejmować, przykładowo, gen mar R.
Elementy, które mają pozytywny wpływ na translację, również przyczyniają się do nadekspresji genu wypływu. Przykładami takich elementów są miejsca wiązania rybosomu (sekwencję Shine-Delgarno) albo kaseta znajdująca się poniżej sekwencji.
Miejsce wiązania rybosomu genu GAPDH jest korzystnym elementem, który ma pozytywny wpływ na translację.
W celu uzyskania ekspresji, geny wypływu są transformowane do mikroorganizmu, który wytwarza L-cysteinę.
Geny wypływu są korzystnie transformowane do mikroorganizmu, który jest wybrany z grupy obejmującej Bacillus takie jak B. subtilis, Corynebacterium, takie jak C. glutamicum, Streptomyces i E. coli.
Geny wypływu są transformowane do organizmów, których metabolizm cysteiny uległ rozregulowaniu, w taki sposób, że zachodzi wytwarzanie zwiększonych ilości L-cysteiny i, ewentualnie, tworzenie w następstwie pochodnych tiazolidynowych L-cysteiny albo N-acetyloseryny.
Korzystnymi przykładami mikroorganizmów, które wytwarzają zwiększone ilości L-cysteiny, są mikroorganizmy posiadające allele Cys-E odporne na sprzężenie zwrotne.
PL 195 784 B1
W innym korzystnym wykonaniu, transformowane są mikroorganizmy, które wytwarzają pochodne tiazolidynowe wewnątrzkomórkowo przez kondensację L-cysteiny i ketonu albo aldehydu, szczególnie pirogronianu.
Mikroorganizmy, które wytwarzają zwiększone ilości L-cysteiny opisano, przykładowo, w zgłoszeniu patentowym DE 19539952.
Specjaliście znane są, przykładowo ze standardowych podręczników, sposoby transformowania mikroorganizmów. Wszystkie znane sposoby można zastosować do wytwarzania mikroorganizmu według wynalazku.
Zwiększona ekspresja genów wypływu w mikroorganizmach, które wytwarzają aminokwasy albo pochodne aminokwasów, które wytwarzane są wewnątrzkomórkowo, takie jak L-cysteina, L-cystyna, N-acetyloseryna albo ich pochodne tiazolidynowe, nieoczekiwanie powoduje zwiększone wydzielanie na zewnątrz komórki aminokwasów albo pochodnych aminokwasów, które wytwarzane są wewnątrzkomórkowo, takich jak L-cysteina, L-cystyna, N-acetyloseryna albo ich pochodne tiazolidynowe. Powoduje to zasadniczo wyższą wydajność tych produktów uzyskiwanych podczas fermentacji.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub ich pochodnych tiazolidynowych, który polega na prowadzeniu fermentacji w sposób znany per se, w której stosuje się mikroorganizmy według wynalazku.
Sposób według wynalazku fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny albo ich pochodnych tiazolidynowych posiada kilka zalet:
Wytworzone są wyłącznie diastereoizomery tiazolidynowe, które posiadają konfigurację R przy atomie węgla C4, ponieważ z powodu enzymów obecnych w komórce L-cysteina jest wytwarzana w sposób stereoselektywny, po czym jest zdolna do reakcji z konkretnym ketonem albo aldehydem, który jest dostępny, dając wyłącznie wspomniane diastereoizomery tiazolidynowe.
W celu uzyskania L-cysteiny z tiazolidyn można zastosować konwencjonalne sposoby oraz techniki chemiczne i biologiczne, które mają konfigurację R przy atomie węgla C4, przez proste przesunięcie równowagi w kierunku związków wyjściowych.
Dla pochodnych tiazolidynowych, które są wytwarzane w procesie według wynalazku, przynajmniej jeden rodnik R1 albo R2 na załączonym schemacie korzystnie oznacza grupę karboksylową, szczególnie korzystnie R1 oznacza COOH, zaś R2 oznacza CH3 we wzorze I.
Oba związki wyjściowe do kondensacji, w wyniku której powstają pochodne tiazolidynowe, mogą być wytwarzane przez mikroorganizm; alternatywnie tylko jeden związek wyjściowy wytwarzany jest przez mikroorganizm, zaś drugi związek wyjściowy dodawany jest podczas fermentacji.
W korzystnym wykonaniu wynalazku, oba związki wyjściowe do kondensacji, w wyniku której powstaje pochodna tiazolidynowa wytwarzane są przez mikroorganizm.
Hydroksylamina albo 2,4-dinitrofenylohydrazyna mogą być, m.in. zastosowane jako czynniki derywatyzujące w celu derywatyzacji pirogronianu, który następnie może być usuwany ze stanu równowagi.
W procesie według wynalazku pochodna tiazolidynowa (i odpowiedni hemitioketal) mogą korzystnie być wytwarzane z prostych i tanich źródeł C, N i S.
W sposobie według wynalazku do fermentacji mogą być zastosowane źródła C takie jak glukoza, laktoza, fruktoza, skrobia itp., źródła N takie jak amoniak albo hydrolizaty białkowe itp. oraz źródła S takie jak sulfid, siarczyn, siarczan, tiosiarczan albo ditionin, które są stosowane zwykle w fermentacji.
Pochodne tiazolidyn, które wytwarza się przez fermentację, można zastosować do innych celów jak również w celu uzyskania cysteiny. Znanych jest wiele możliwości zastosowania, które wykorzystują pochodne tiazolidynowe, wytworzone przez fermentację, i mające konfigurację R przy atomie węgla C4, jako materiał wyjściowy (blok budujący) do szerszej syntezy.
Wynalazek obejmuje też zastosowanie białka według wynalazku do zwiększania ekspresji L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych w fermentacji.
Poniższe przykłady podane są w celu dalszego wyjaśnienia wynalazku.
Możliwe jest ilościowe określenie pochodnej tiazolidynowej/hemitioketalu metodą pośrednią. W przykładach, związki te są określane przez oznaczenie cysteiny metodą Gaitonde M. K. (1967), Biochem. J., 104, 627-633. Derywatyzacja cysteiny ninhydryną w silnie kwasowych warunkach usuwa ją ze stanu równowagi. Powoduje to następnie reakcję hemitioketalu, i powstanie na końcu pochodnej tiazolidynowej. Po około 10 minutach w 100°C cała pochodna tiazolidynowa i odpowiedni hemitioketal
PL 195 784 B1 ulegają przekształceniu do pochodnej ninhydrynowej cysteiny, którą można oznaczyć przy długości fali 560 nm. W tej metodzie, wolna cysteina jest włączana do oznaczenia.
Ilość wolnych grup SH i w konsekwencji wolnej cysteiny określa się przy użyciu testu opisanego przez Sang-Han Lee i in., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 213, 3 (1995), str. 837, przy użyciu kwasu 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzenowego (DTNB).
Po wytworzeniu wolnej cysteiny, ulega ona oksydacji do L-cysteiny podczas fermentacji z dostępem powietrza atmosferycznego. Cysteina jest tylko słabo rozpuszczalna w ośrodku wodnym w pH 7,0 i precypituje jako biały osad. Gdy wytworzy się nierozpuszczalny osad cysteiny, jest on rozpuszczany w półstężonym HCli ponownie oznaczany w wyżej wymienionym teście w warunkach redukujących uzyskanych przy użyciu ditiotreitolu (DTT).
W przykładzie 3, ilości „cysteiny całkowitej” które są zmierzone w supernatancie przy użyciu testu Gaitonde, podane są jako wynik fermentacji. W tym kontekście „cysteina całkowita” składa się z, w szczególności, kwasu 2-metylotiazolidyno-2,4-dikarboksylowego, odpowiedniego hemitioketalu, wolnej L-cysteiny i rozpuszczonej cystyny. Precypitowaną cystynę oznacza się ilościowo osobno.
Możliwość wytrącania kwasu 2-metylotiazolidyno-2,4-dikarboksylowego, który jest wytwarzany w jednym z wykonań wynalazku, przy użyciu dwuwartościowych jonów metalu, można wykorzystać do wykrywania tworzenia tej pochodnej. Opisano uprzednio, że pochodną można wytrącić wyłącznie octanem cynku (Schubert i in., patrz odnośniki). Jednakże, możliwe jest również wytrącanie innymi dwuwartościowymi jonami metali, takich jak magnez, żelazo, miedź, cynk, mangan, kobalt itp. Wytrącanie i następująca po nim identyfikacja wytworzonego produktu tiazolidynowego opisane są w przykładzie 4. Przykład ten pokazuje również, że kwas 2-metylotiazolidyno-2,4-dikarboksylowy jest głównym produktem po okresie fermentacji równym 24 godziny. Łatwość z jaką produkt fermentacji może być wytrącony jest zarówno pomocna w analizowaniu go, jak i przydatna podczas jego oczyszczania.
Przykład 1
Amplifikacja alleli metodą PCR
A. Amplifikacja alleli cysE
Allele cysE, tj. cysEIV i cysEX, które są stosowane poniżej opisano w DE 19539952 przykład 2/10.
Mutacje wymienione w tym dokumencie można uzyskać stosując ukierunkowaną mutagenezę. Zestawy do przeprowadzania mutagenezy można uzyskać w handlu, przykładowo ze Stratagene (Stratagene GmbH, PO Box 105466, D-69044 Heidelberg) pod nazwą handlową ExSite albo Chameleon.
Po przeprowadzeniu ukierunkowanej mutagenezy, powstałe allele amplifikowano z odpowiedniego DNA stosując reakcję łańcuchowej polimerazy (PCR) (Saiki i in., 1988, Science 239:487-491) przy użyciu następujących starterów:
5'-TGGACCAGAGCTCTGGCTGGCGCATCGCTTCGGCGTTG-3'
SacI cysE-rev (Identyfikator Sekw. nr 6)
5'-CTCGATGCATTACGTAGGGGTATCCGGGAGCGGTATTG-3'
Nsil
Doświadczenia PCR przeprowadzono w 30 cyklach w obecności 200 mM trifosforanów deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 mM każdego z odpowiednich oligonukleotydów, 100 ng matrycowego DNA zawierającego konkretny allel cysE, 1/10 10-krotnego buforu reakcyjnego (100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl (pH 8,8), 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100 i 1000 mg/ml BSA) oraz 2,5 jednostki termostabilnej, rekombinowanej polimerazy DNA Pfu (Stratagene) w urządzeniu Thermocycler (Gene-ATAQ-Controller, Pharmacia) stosując następujące warunki: 94°C przez 1 minutę, 60°C przez 1 minutę i 72°C przez 3 minuty.
Produkt amplifikacji hydrolizowano stosując SacI i Nsil (Boehringer Mannheim GmbH) w warunkach sugerowanych przez producenta, rozdzielono na 1% żelu agarozowym i izolowano z żelu jako fragment wielkości około 1,0 kb stosując metodę Geneclean (zestaw Geneclean BI0101, PO Box
PL 195 784 B1
2284 La Jolla, Kalifornia, 92038-2284) według instrukcji producenta. Do momentu dalszego użycia fragment przechowywano w -20°C.
B. Amplifikacja locus mar
Locus mar E. coli amplifikowano metodą PCR. Sposób izolowania produktów amplifikacji jest taki sam jak opisane w przykładzie 1 dział A. Jako matrycę DNA zastosowano chromosomalny DNA E. coli szczep W3110 (ATCC 27325). Jako matrycę DNA można zastosować również plazmid 100-1-1 (DSM 11545). Komórki poddano lizie i oczyszczono chromosomalny DNA według protokołu opisanego w Ausubel i in., 1987, 2.4.1.-2.4.2. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Willey-lnterScience. W celu amplifikacji locus mar zastosowano następujące startery:
mar-fw (Identyfikator Sekw. nr 7).
5'-TTTGGCGCGCCGATCAGCGGCGGCGCAACCATCAG-3'
Ascl mar-rev (Identyfikator Sekw. nr 8)
5'-GCCTTAATTAAGATCGACACTCAGGCTGTACTGGCGAC-3'
PacI
Amplifikacja locus mar dała fragment wielkości około 3 kb, który oczyszczono jak to opisano w przykładzie 1 dział A. Trawienie restrykcyjne przeprowadzono stosując enzymy AscIi PacI (oba z New England Biolabs GmbH, PO Box 2750, D-65820 Schwalbach/Taunus) według instrukcji producenta i stosując dostarczone przez niego bufory. Po oczyszczeniu fragmentu przez elektroforezę na żelu agarozowym, przechowywano go w -20°C.
C. Amplifikacja DNA ORF306
DNA kodujący ORF306 namnożono przez PCR jak to opisano w przykładzie 1 dział A. Jako matrycę DNA zastosowano chromosomalny DNA izolowany z E. coli szczepu W3110 (ATCC 27325). Jako matrycę DNA można również zastosować plazmid 100-1-1 (DSM 11545).
Zastosowano następujące startery:
ORF306-fw: (Identyfikator Sekw. nr 9)
5'-GGAATTCATTAATCCGGCGACTAACGAATCAACTG-3'
AsnI
ORF306-rev: (Identyfikator Sekw. nr 10)
5'-GCCTTAATTAACGCTATGTAGTTTGTTCTGGCCCCG-3'
PacI
Amplifikowany fragment DNA miał wielkość około 1,05 kb i został oczyszczony przez elektroforezę na żelu agarozowym, jak to opisano. Trawienie restrykcyjne enzymami AsnI (Boehringer Mannheim) i PacI (New England Biolabs) dało po usunięciu enzymów żądany fragment DNA. Fragment ten przechowywano w -20°C do użycia.
D. Amplifikacja fragmentu DNA kodującego promotor GAPDH
Promotor genu dehydrogenazy gliceroaldehydofosforanowej zastosowano w celu uzyskania efektywnej transkrypcji ORF306. Ten żądany fragment DNA uzyskano podobnie przy użyciu PCR. Chromosomalny DNA E. coli szczep W3110 (ATCC 27325) zastosowano jako matrycę DNA. Plazmid 100-1-1 (DSM 11545) można również zastosować jako matrycę DNA.
PL 195 784 B1
Zastosowano następujące startery:
GAPDH-fw (Identyfikator Sekw. nr 11)
5'-GTCGACGCGTGAGGCGAGTCAGTCGCGTAATGC-3'
Mlul
GAPDH-rev (Identyfikator Sekw. nr 12)
5'-GACCTTAATTAAGATCTCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAG-3'
PacI Ndel
Powstały fragment DNA wielkości około 0,3 kb wyizolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym i oczyszczono jak to opisano w przykładzie 1 dział A. Trawienie restrykcyjne enzymami Mlul i PacI dało żądany fragment DNA. Po usunięciu enzymów restrykcyjnych DNA przechowywano w -20°C.
P r zyk ł a d 2
Konstruowanie plazmidów
Plazmid pACYC184 zastosowano jako plazmid podstawowy do konstruowania plazmidów, które użyto do wytwarzania zmodyfikowanych organizmów według wynalazku. Plazmid ten zmodyfikowano jak to opisano w DE 19539952 i zdeponowano jako plazmid pACYC184-LH w Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen und Zellkulturen GmbH w Brunszwiku, pod numerem DSM 10172.
Figura 2 pokazuje mapę plazmidową i funkcjonalną plazmidu pACYC184-LH. Plazmid pACYC184-LH niesie polilinker. Ten polilinker posiada następujące miejsca cięcia restrykcyjnego:
Notl-NcoI-SacI-Nsil-MluI-PacI-NotI
Fragmenty DNA, które uzyskano w przykładzie 1 przy użyciu PCR i trawienia restrykcyjnego poddano ligacji z tym linkerem.
A. Konstruowanie plazmidów kontrolnych pACYC184/cysEIV i pACYC184/cysEX
Wytwarzanie pACYC184/cysEIV i pACYC184/cysEX opisano w DE 19539952, przykład 3 i podsumowano pokrótce poniżej:
Około 1 mg plazmidu pACYC184-LH (DSM 10172) trawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i NsiI według zaleceń producenta (Boehringer Mannheim). Trawiony DNA oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym w celu usunięcia enzymów, jak to opisano uprzednio. Fragmenty DNA, które uzyskano w przykładzie 1 dział A, i które kodowały odpowiednie allele cysE, zmieszano w ilościach równomolowych z plazmidem pACYC184-LH trawionym SacI i NsiI; do tej mieszaniny dodano 1 ml ligazy DNA T4 i 2 ml 10-krotnego buforu ligazy (Boehringer Mannheim), po czym dopełniono do 20 ml sterylną, bidestylowaną wodą. Mieszaninę inkubowano w 4°C przez noc i zastosowano do transformowania E. coli W3110 (ATCC 27325). Metodę transformacji opisaną niżej zastosowano we wszystkich transformacjach opisanych w przykładach.
E. coli W3110 transformowano przy użyciu elektroporacji. W tym celu, 500 ml pożywki LB (10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 5 g NaCl) w 1-litrowej butelce Erlenmeyera zaszczepiono 1% (obj.) takiej samej całonocnej hodowli. Po inkubacji na wytrząsarce poziomej w 37°C do gęstości optycznej 0,5-0,6 OD przy 600 nm, komórki zebrano przez odwirowanie do sterylnego pojemnika w 4°C. Wszystkie kolejne etapy przeprowadzono na lodzie, zachowując warunki sterylności. Osad komórek płukano dwukrotnie w 500 ml lodowatej, bidestylowanej, sterylnej wody, i zawieszono na koniec w 30 ml 10% (obj./obj.) sterylnej gliceryny. Po dalszym odwirowaniu, pobrano osad komórek w 500 m l 10% gliceryny i przechowywano w -80°C w porcjach po 200 m l. W celu transformacji, komórki rozmrożono na lodzie, po czym dodano do nich około 10-100 ng DNA i wprowadzano mieszaninę do sterylnej kuwety do elektroporacji (BioRad). Kuwetę umieszczano w urządzeniu Gene Pulser (BioRad) i przeprowadzano elektroporację przy napięciu 2500 wolt, oporności równoległej 200 Ohm i pojemności 25 mF. Komórki zawieszono w 1ml pożywki SOC (pepton kazeinowy, 20 g/l, ekstrakt drożdżowy 5,0 g/l, NaCl 0,58 g/l, KCl 0,19 g/l, MgCl2 2,03 g/l, MgSO4 2,46 g/l, glukoza 3,6 g/l, pH = 7,0) i wytrząsano w37°C przez godzinę. Następnie, komórki rozcieńczano odpowiednio i wysiewano na płytki z agarem LB (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl, 15 g/l agaru, pH = 7,2), po czym płytki inkubowano w 37°C przez noc dopóki nie stały się widoczne poszczególne kolonie.
PL 195 784 B1
Żądane transformanty identyfikowano analizą restrykcyjną po wyizolowaniu plazmidu przy użyciu zestawu QIAprep Spin Plazmid (Quiagen GmbH, Max Volmerstrasse 4, D-40724 Hilden). Zastosowano je w przykładzie 3 jako kontrolę fermentacji.
Plazmidy pACYC184/cysEIV i pACYC184/cysEX przedstawiono na fig. 3.
B. Konstruowanie plazmidów pACYC184/cysEIV-mar i pACYC184/cysEX-mar
W każdym przypadku, 1 m g plazmidu pACYC184/cysEIV-mar i pACYC184/cysEX-mar, które skonstruowano w przykładzie 2 dział A, trawiono enzymami restrykcyjnymi MluI (Boehringer) i PacI (New England Biolabs) według zaleceń producenta. Po trawieniu restrykcyjnym, DNA izolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym i oczyszczono jak to opisano w przykładzie 1 dział A. Około 20 ng wektorów pACYC184/cysEIV i pACYC184/cysEX trawionych MluI/PacI zmieszano z 200 ng fragmentu DNA wytworzonego w przykładzie 1 dział A, 1 ml ligazy DNA T4 i 2 ml 10-krotnego buforu ligazy (Boehringer Mannheim), po czym dopełniono do 20 ml sterylną, bidestylowaną wodą. Mieszaninę inkubowano w 4°C przez noc i zastosowano do transformowania E. coli W3110 (ATCC 27325). Po wyizolowaniu plazmidu przy użyciu zestawu QlAprep Spin Plazmid (Qiagen GmbH) i poddaniu analizie restrykcyjnej, wyizolowano żądane transformanty i zastosowano w fermentacji, jak to opisano w przykładzie 3. Figura 4 pokazuje mapy restrykcyjne i funkcjonalne plazmidów pACYC184/cysEIV-mar i pACYC184/cysEX-mar.
C. Konstruowanie plazmidów pACYC184/cysEIV-GAPDH i pACYC184/cysEX-GAPDH
Plazmidy pACYC184/cysEIV i pACYC184/cysEX, które skonstruowano w przykładzie 2 dział A, trawiono enzymami restrykcyjnymi Mlul (Boehringer) i PacI (New England Biolabs) według instrukcji producenta.
Po trawieniu plazmidów, oczyszczono je, zapoczątkowano dwie ligacje, jak to opisano w przykładzie 2 dział B, przy użyciu fragmentu DNA wytworzonego w przykładzie 1 dział D.
Po całonocnej inkubacji w 4°C, mieszaniny ligacyjne transformowano do E. coli W3110. Prawidłowe transformanty zidentyfikowano po izolacji plazmidowego DNA przez analizę z użyciem odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
Plazmidy pACYC184/cysEIV-GAPDH i pACYC184/cysEX-GAPDH zastosowano jako materiały wyjściowe do konstruowania plazmidów pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306 i pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306, jak to opisano w dziale D, poniżej.
D. Konstruowanie plazmidów pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306 i pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306
Plazmidy wytworzone w dziale C trawiono Ndel (Boehringer Mannheim) i PacI (New England Biolabs) według instrukcji producenta. Po oczyszczeniu plazmidowego DNA, zapoczątkowano dwie ligacje z użyciem fragmentów DNA z przykładu 1 dział C, które kodowały ORF306 i które cięto Asnl-Pacl.
Po inkubacji w 4°C przez noc, mieszaniny DNA transformowano do E. coli W3110, zaś transformowane bakterie wysiewano na płytki LB. Po pojawieniu się pojedynczych kolonii, badano je na prawidłowość przez izolowanie ich plazmidów i poddanie ich analizie restrykcyjnej.
Na figurze 5 pokazano mapy restrykcyjne i funkcjonalne plazmidów pACYC184/cysEIV-GAPDH-ORF306 i pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306.
P r z y k ł a d 3
Porównanie wydajności uzyskanych konstruktów i znanych konstruktów
Wszystkie plazmidy, które porównywano w fermentacji, poddano fermentacji w E. coli W3110. Gwarantuje to, że wydajność zwiększa się w każdym z obserwowanych przypadków jedynie w wyniku zastosowanych nowych genów.
ml pożywki LB zawierającej 15 mg/l tetracykliny zaszczepiono odpowiednim konstruktem
E. coli w kolbie Erlenmeyera (100 ml). Po inkubacji przez 7 godzin w inkubatorze z wytrząsarką (150 obrotów na minutę, 30°C) odpowiednie wstępne hodowle przeniesiono do 100 ml pożywki SM1 (12 g/l K2HPO4, 3 g/l KH2PO4, 5 g/l (NH4)2SO4, 0,3 g/l MgSO4x7 H2O, 0,015 g/l CaCl2x2 H2O, 0,002 g/l FeSO4x7 H2O, 1 g/l cytrynianu trisodux2 H2O, 0,1 g/l NaCl, 1 ml/l roztworu metali śladowych zawierającego 0,15 g/l Na2MoO4x2 H2O, 2,5 g/l H3BO3, 0,7 g/l CoCl2x6 H2O, 0,25 g/lCuSO4x5 H2O, 1,6 g/l MnCl2x4 H2O, 0,3 g/l ZnSO4x7 H2O), którą uzupełniono 5 g/l glukozy, 5 mg/l witaminy B1 i 15 mg/l tetracykliny. Hodowle wytrząsano przy 150 obrotów na minutę w 30°C przez 17 godzin w kolbach Erlenmeyera (1 l). Po inkubacji, gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) wynosiła od 3 do 5.
Fermentację przeprowadzono w fermentorze BIOSTAT M Braun-Melsungen. Zastosowano naczynie hodowlane o objętości całkowitej 2 litry. Pożywka fermentacyjna zawierała 15 g/l glukozy, 10 g/l tryptonu (Difco), 5 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco), 5 g/l (NH4)2SO4, 1,5 g/l KH2PO4, 0,5 g/l NaCl, 0,3 g/l
PL 195 784 B1
MgSO4x7 H2O, 0,015 g/l CaCl2x2 H2O, 0,075 g/l FeSO4x7 H2O, 1 g/l cytrynianu trisodux2 H2O i 1ml roztworu pierwiastków śladowych (patrz wyżej), 0,005 g/ witaminy B1 i 15 mg/l tetracykliny. pH w fermentatorze ustalono początkowo na 7,0 przez pompowanie 25% roztworu NH4OH. Podczas fermentacji, pH utrzymywano na wartości 7,0 przy użyciu automatycznej korekcji 25% NH4OH. W celu zaszczepienia, 100 ml wstępnej hodowli wpompowano do fermentatora. Początkowa objętość wynosiła 1 l. Hodowle mieszano początkowo z 200 obrotów na minutę i gazowano 1,5 vvm sprężonego powietrza, które sterylizowano podczas filtracji. Wysycenie tlenem atmosferycznym w czasie fermentacji doprowadzono do 50%, co kontrolowano to automatycznie przez szybkość mieszania. Fermentację prowadzono w temperaturze 30°C. Po 2 godzinach fermentacji rozpoczęto podawanie 30% roztworu podstawowego tiosiarczanu sodux5 H2O z szybkością 3 ml na godzinę. Po osiągnięciu OD600 równej 10, rozpoczęto podawanie sterylnego 56% roztworu podstawowego glukozy z szybkością około 8-14 ml/godz. Zawartość glukozy oznaczano enzymatycznie stosując analizator YSI. Podczas fermentacji, stężenie glukozy doprowadzano automatycznie do między 10 i 20 g/l przez uzupełnianie jej w sposób ciągły. Całkowita zawartość cysteiny w pożywce badana była kolorymetrycznie według Gaitonde M.K. (1967), Biochem. J., 104, 627-633, w bezkomórkowym supernatancie próbki. W tym kontekście należy zauważyć, że cysteina pozostała w roztworze podczas fermentacji była obecna w większości jako pochodna tiazolidynowa, ale nie była rejestrowana przez test. Jeżeli keton albo aldehyd (w tym przypadku pirogronian) nie jest dostępny w odpowiednich ilościach do przekształcania cysteiny, która jest przekształcana do pochodnej tiazolidynowej, tworzy się wolna L-cysteina, która jest również rejestrowana w teście. Gdy tworzy się wolna L-cysteina, ulega on powolnemu utlenianiu do L-cystyny podczas fermentacji przez wprowadzany tlen atmosferyczny. Cystyna jest tylko słabo rozpuszczalna w ośrodku wodnym w pH 7,0 i wytrąca się jako biały osad. Gdy wytworzy się nierozpuszczalny osad cystyny, jest on rozpuszczany w półstężonym HCl po oddzieleniu supernatantu z usuniętej próbki i po odwirowaniu ponownie oznaczany w wyżej wymienionym teście w warunkach redukujących uzyskanych przy użyciu ditiotreitolu (DTT).
W tych warunkach, wydajności przedstawione w tabelach 1 i 2, osiągnięto po okresie fermentacji równym, odpowiednio, 24 i 48 godzin. Tabele te dostarczają oczywistych dowodów, że geny modyfikujące mikroorganizmy zgodnie z wynalazkiem, tj. locus mar E. coli i, w szczególności, segment kodujący ORF306, znacznie zwiększają wydajność cysteiny i/lub pochodnej tiazolidynowej (cysteina całkowita). Tworzenie osadu cystyny odnotowano osobno w tabelach.
Tabela 1
Wydajność cysteiny całkowitej przy użyciu allelu cysEIV
| Wydajność cysteiny całkowitej (g/l) przy użyciu następujących konstruktów plazmidowych | |||
| czas fermentacji | pACYC184/ cysEIV | pACYC184/ cysEIV-mar | pACYC184/ cysEIY-GAPDH-ORF306 |
| 24 godziny | 1 | 3,8 | 3,8 |
| 48 godzin | 1,6 | 5 | 3,2+6,3* |
* Ilość cystyny, w gramach na litr, obecnej jako osad
Ta be la 2
Wydajność cysteiny całkowitej przy użyciu allelu cysEX
| Wydajność cysteiny całkowitej (g/l) przy użyciu następujących konstruktów plazmidowych | |||
| czas fermentacji | pACYC184/ cysEX | pACYC184/ cysEX-mar | pACYC184/ cysEX-GAPDH-ORF306 |
| 24 godziny | 4,9 | 5,9 | 12,8 |
| 48 godzin | 6,8 | 11,4 | 7,2+12, 0* |
* Ilość cystyny, w gramach na litr, obecnej jako osad Przykład 4
Wykazanie tworzenia kwasu 2-metylotiazolidyno-2,4-dikarboksylowego
PL 195 784 B1
Konstrukt E. coli W3110 x pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 poddano fermentacji, jak to opisano w przykładzie 3, w celu wykazania, że w trakcie fermentacji według przykładu 3 jako główny produkt tworzy się kwas 2-metylotiazolidyno-2,4-dikarboksylowy.
Po 24 godzinach, supernatant fermentacyjny oddzielono od komórek przez odwirowanie. W pomiarze cysteiny opisanym powyżej uzyskano wartość 12,8 g dla cysteiny całkowitej w supernatancie. Następnie, do supernatantu dodano MgSO4 w stężeniu końcowym 0,3 M. Po całonocnej inkubacji w 4°C z ciągłym mieszaniem supernatantu wytworzył się biały precypitat. Precypitat ten był słabo rozpuszczalną solą magnezową kwasu 2-metylotiazolidyno-2,4-dikarboksylowego.
Po oddzieleniu precypitatu przez odwirowanie, resztkową ilość cysteiny w supernatancie określono na tylko 2,5 g/l.
Precypitat rozpuszczono w półstężonym HCl i poddano testowi na cysteinę. W tym przypadku stwierdzono, że stężenie cysteiny wynosi 9,5 g/l. Po rozpuszczeniu precypitatu w D2O+HCl badano go przez 1H NMR i 13C NMR, i zidentyfikowano przez porównanie z substancją referencyjną (MP Schubert, J. Biol. Chem., 121, 539-548 (1937)), jako kwas 2-metylotiazolidyno-2,4-dikarboksylowy.
P r zyk ł a d 5
Różna toksyczność L-cysteiny i kwasu 2-metylotiazolidyno-2,4(R)-dikarboksylowego
Do tego doświadczenia kwas 2-metylotiazolidyno-2,4(R)-dikarboksylowy wytworzono z L-cysteiny i pirogronianu, stosując metodę Schuberta (M.P. Schubert, J. Biol. Chem., 121, 539-548 (1937)). Całonocną hodowlą E. coli W3110 w pożywce LB zaszczepiono 20 ml pożywki SM1 (patrz, przykład 3), do której dodano 10 g/l glukozy, 10% pożywki LB, 5 mg/l witaminy B1, 15 mg/l tetracykliny i w każdym przypadku odpowiednią ilość L-cysteiny albo kwasu 2-metylotiazolidyno-2,4(R)-dikarboksylowego. Po 7 godzinach inkubacji w 37°C, nie obserwowano dalszego wzrostu w pożywce zawierającej L-cysteinę, w stężeniu 1 mM i wyżej, podczas gdy obserwowano wzrost w pożywce zawierającej kwas 2-metylotiazolidyno-2,4(R)-dikarboksylowy w stężeniach do 50 mM. Nie była możliwa dalsza inkubacja, z powodu łatwego utleniania cysteiny. Wynika z tego, że L-cysteina jest znacznie bardziej toksyczna dla E. coli, niż kwas 2-metylotiazolidyno-2,4(R)-dikarboksylowy. Stąd, kwas 2-metylotiazolidyno-2,4(R)-dikarboksylowy jest bardziej przydatny do uzyskiwania L-cysteiny metodą fermentacyjną, nawet gdy, jak w tym przypadku, konieczny jest etap chemiczny w celu uwolnienia L-cysteiny.
P r zyk ł a d 6
Zwiększone wytwarzanie N-acetylo-L-seryny
N-acetylo-L-seryna jest wytwarzana z O-acetylo-L-seryny przez spontaniczną rearanżację. Ta O-acetylo-L-seryna jest bezpośrednim prekursorem L-cysteiny w bakteryjnym szlaku biosyntezy. W następstwie, produktem końcowym takiej fermentacji jest N-acetylo-L-seryna, gdy włączanie siarki do O-acetylo-L-seryny jest niewystarczające albo go brak. Gdy nie jest dostarczana siarka, geny modyfikujące mikroorganizmy według wynalazku zwiększają również wydajność produktu fermentacji.
Fermentację opisaną w przykładzie 3 przeprowadzono bez dostarczania tiosiarczanu. Zastosowanymi konstruktami, które były przeznaczone do wykazania skuteczności zawartych genów, w szczególności ORF306, były pACYC184/cysEX i pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306.
Jak pokazują wyniki w tabeli 3, geny modyfikujące mikroorganizmy według wynalazku, w szczególności ORF306, znacznie zwiększają wydajność N-acetylo-L-seryny w fermentacji.
Tabe l a 3
Wydajność N-acetylo-L-seryny po 24 godzinach fermentacji
| Konstrukt | N-acetylo-L-seryna (g/l) |
| pACYC184/cysEX | 7,6 |
| pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 | 15,9 |
Wydajność N-acetylo-L-seryny ponad 30 g/l można uzyskać stosując allele cysE silniej odporne na sprzężenie zwrotne (przykładowo, cysEXIV, cysEXI i cysEXXII z DE 19539952) w kombinacji z genami modyfikującymi organizmy według wynalazku.
PL 195 784 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE
| (i)ZGŁASZAJĄCY: | |
| (A) | NAZWA: Consortium fur elektrochemische Industrie GmbH |
| (B) | ULICA: Zielstattstrasse 20 |
| (C) | MIASTO: Monachium |
| (D) | KRAJ FEDERALNY: Bawaria |
| (E) | KRAJ: Niemcy |
| (F) | KOD: 81379 |
| (G) | TELEFON: 089-74844-0 |
| (H) | TELEFAX: 089-74844-350 |
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Mikroorganizmy i sposoby fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N acetyloseryny lub pochodnych tiazolidynowych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 12 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY:: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 43 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:
(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
PL 195 784 B1 (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: fragment wewnętrzny (Vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia Coli (B) SZCZEP: K12 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
| Met | Ser | Arg | Lys | Asp | Gly | Val | Leu | Ala | Leu | Leu | Val | Val | Val | Val Trp |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Gly | Leu | Asn | Phe | Val | Val | Ile | Lys | Val | Gly | Leu | His | Aan | Met | Pro Arg |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Leu | Met | Leu | Ala | Gly | Leu | Arg | Phe | Met | Leu | Val |
40 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 306 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:
(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia Coli (B) SZCZEP: K12
PL 195 784 B1 (XX) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:
| Mec | Lya | Phe Arg Gly Gly Arg | Mec Ser Arg Lya Asp | Gly | Val | Leu | Ala |
| X | 5 | 10 | 15 | ||||
| Leu | Leu | Val Val Val Val Trp | Gly Leu Aan Phe Val | Val | Ile | Lya | Val |
| 20 | 25 | 30 | |||||
| Gly | Leu | Kia Asa Mec Pro Arg | Leu Mec Leu Ala Gly | Leu | Arg | Phe | Mec |
| 35 | 40 | 45 | |||||
| Leu | Val | Ala Phe Pro Ala Ile | Phe Phe Val Ala Arg | Pro | Lya | Val | Pro |
| 50 | .. . 55 | 60 | |||||
| Leu | Aan | Leu Leu Leu Gly Tyr | Gly Leu Thr Ile Ser | Phe | Ala | Gin | Phe |
| €5 | 70 | 75 | 80 | ||||
| Ala | Phe | Leu Phe Cys Ala Ile | Aan Phe Gly Mec Pro | Ala | Gly | Leu | Ala |
| 85 | 90 | 95 | |||||
| Ser | Leu | Val Leu Gin Ala Gin | Ala Phe Phe Thr Ile | Mec | Leu | Gly | Ala |
| Χ00 | 105 | 110 | |||||
| Phe | Thr | Phe Gly Glu Arg Leu | His Gly Lya Gin Leu | Ala | Gly | Ile | Ala |
| 115 | 120 | 125 | |||||
| Leu | Ala | He Phe Gly Val Leu | Val Leu Ile Glu Asp | Ser | Leu | Aan | Gly |
| Χ30 | 135 | 140 | |||||
| Gin | His | Val Ala Mec Leu Gly | Phe Mec Leu Thr Leu | Ala | Ala | Ala | Phe |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||
| Ser | Trp | Ala Cya Gly Aan Ile | Phe Aan Lya Lya Ile | Mec | ser | His | Ser |
| 165 | 170 | 175 | |||||
| Thr | Arg | Pro Ala Val Mec Ser | Leu Val Ile Trp Ser | Ala | Leu | Ile | Pro |
| 180 | IBS | 190 | |||||
| Ile | Ile | Pro Phe Phe Val Ala | Ser Leu Ile Leu Aap | Gly | Ser | Ala | Thr |
PL 195 784 B1 195 200 205 Mec *1· Ser k®u Va-1 Thr Ile Asp Met Thr Thr Ile Leu ser Leu 210 215 220
Met Tyr Leu Al* Phe V*1 Ala Thr Ile V*1 Gly Tyr Gly ile Trp Gly 225 230 235 240
Thr Leu Leu Gly Arg Tyr Glu Thr Trp Arg V*1 Al* Pro Leu Ser Leu
2<S 250 255
Leu V*1 Pro V*l. Val Gly Leu Al* Ser Al* Al* Leu Leu Leu Asp Glu 260 265 270
Arg Leu Thr Gly Leu Gin Phe Leu Gly Al* Val Leu Ile Met Thr- Gly 275 280 285
Leu Tyr Ile Asn V*1 Phe Gly Leu Arg Trp Arg Lys Ala Val Lys V*1 290 295 300
Gly Ser
305 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 299 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:
(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia Coli (B) SZCZEP: K12
PL 195 784 B1
| (xi) OPIS SEKWENCJI: | IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3: |
| Het Ser Arg Lye Aap 1 5 | Gly V*1 Leu Ala Leu Leu Val Val Val Val Trp 10 15 |
| Gly Leu Aan Phe Val 20 | Val Ile Lye Val Gly Leu His Asn Met Pro Arg 25 30 |
| Leu Met Leu Ala Gly 35 | Leu Arg Phe Met Leu Val Ala Phe Pro Ala Ile 40 45 |
| Phe Phe Val Ala Arg 50 | Pro Lye Val Pro Leu Asn Leu Leu Leu Gly Tyr 55 €0 |
| Gly Leu Thr Ile Ser €5 | Phe Ala Gin Phe Ala Phe Leu Phe Cya Ala Ile 70 75 Θ0 |
| Aan Phe Gly Met Pro 85 | Ala Gly Leu Ala Ser Leu Val Leu Gin Ala Gin 90 95 |
| Ala Phe Phe Thr Ile 100 | Met Leu Gly Ala Phe Thr Phe Gly Glu Arg Leu 105 110 |
| Hia Gly Lye Gin Leu 115 | Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Leu 120 125 |
| Val Leu Ile Glu Aap 130 | Ser Leu Aan Gly Gin Hia Val Ala Met Leu Gly 135 140 |
| Phe Met Leu Thr Leu 145 | Ala Ala Ala Phe Ser Trp Ala Cya Gly Aan Ile 150 155 160 |
| Phe Aan Lye Lye Ile 165 | Met Ser Hia Ser Thr Arg Pro Ala Val Met Ser 170 175 |
| Leu Val Ile Trp Ser 180 | Ala Leu Ile Pro Ile Ile Pro Phe Phe Val Ala 185 ISO |
PL 195 784 B1
| Ser | Leu | Ile 195 | Leu | Asp | Gly | Ser | Ala 200 | Thr | Mec | Ile | His | Ser 205 | Leu | Val | Thr |
| Ile | Asp 210 | Mec | Thr | Thr | Ile | Leu 215 | Ser | Leu | Mec | Tyr | Leu 220 | Ala | Phe | Val | Ala |
| Thr 225 | Ile | Val | Gly | Tyr | Gly 230 | Ile | Trp | Gly | Thr | Leu 235 | Leu | Gly | Arg | Tyr | Glu 240 |
| Thr | Trp | Arg | Val | Ala 245 | Pro | Leu | Ser | Leu | Leu 250 | Val | Pro | Val | Val | Gly 255 | Leu |
| Ala | Ser | Ala | Ala 260 | Leu | Leu | Leu | Asp | Glu 265 | Arg | Leu | Thr | Gly | Leu 270 | Gin | Phe |
| Leu | Gly | Ala | Val | Leu | Ile | Mec | Thr | Gly | Leu | Tyr | Ile | Asn | Val | Phe | Gly |
275 280 285
Leu Arg Trp Arg Lya Ala Val Lye Val Gly Ser 290 295 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 266 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ:
(D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) RODZAJ FRAGMENTU: fragment wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO ORYGINALNE:
(A) ORGANIZM: Escherichia Coli (B) SZCZEP: K12
PL 195 784 B1 (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4
| Met 1 | Leu | Ala | Gly | Leu 5 | Arg | Phe | Met | Leu | Val 10 | Ala | Phe | Pro | Ala | Ile 15 | Phe |
| Phe | Val | Ala | Arg 20 | Pro | Lys | Val | Pro | Leu 25 | Asn | Leu | Leu | Leu | Gly 30 | Tyr | Gly |
| Leu | Thr | Ile 35 | Ser | Phe | Ala | Gin | Phe 40 | Ala | Phe | Leu | Phe | Cys 45 | Ala | Ile | Asn |
| Phe | Gly 50 | Met | Pro | Ala | Gly | Leu 55 | Ala | Ser | Leu | Val | Leu 60 | Gin | Ala | Gin | Ala |
| Phe 65 | Phe | Thr | Ile | Met | Leu 70 | Gly | Ala | Phe | Thr | Phe 75 | Gly | Glu | Arg | Leu | His 80 |
| Gly Lys | Gin | Leu | Ala 85 | Gly | Ile | Ala | Leu | Ala 90 | Ile | Phe | Gly | Val | Leu 95 | Val | |
| Leu | Ile | Glu | Asp 100 | Ser | Leu | Asn | Gly | Gin 105 | His | Val | Ala | Met | Leu 110 | Gly | Phe |
| Met | Leu | Thr 115 | Leu | Ala | Ala | Ala | Phe 120 | Ser | Trp | Ala | Cys | Gly 125 | Asn | Ile | Phe |
| Asn | Lys 130 | Lys | Ile | Met | Ser | His 135 | Ser | Thr | Arg | Pro | Ala 140 | Val | Met | Ser | Leu |
| Val 145 | Ile | Trp | Ser | Ala | Leu 150 | Ile | Pro | Ile | Ile | Pro 155 | Phe | Phe | Val | Ala | Ser 160 |
| Leu | Ile | Leu | Asp | Gly 165 | Ser | Ala | Thr | Met | Ile 170 | His | Ser | Leu | Val | Thr 175 | Ile |
| Asp | Met | Thr | Thr | Ile | Leu | Ser | Leu | Met | Tyr | Leu | Ala | Phe | Val | Ala | Thr |
180 185 190
PL 195 784 B1
| Ile | Val Gly 1S5 | Tyr Gly Ile Trp | Gly Thr 200 | Leu Leu Gly Arg Tyr Glu Thr 205 |
| Trp | Arg Val | Ala Pro Leu Ser | Leu Leu | Val Pro Vał Val Gly Leu Ala |
| 210 | 215 | 220 | ||
| Ser | Ala Ala | Leu Leu Leu Aap | Glu Arg | Leu Thr Gly Leu Gin Phe Leu |
| 225 | 230 | 235 240 | ||
| Gly | Ala Val | Leu Ile Met Thr | Gly Leu | Tyr Ile Asn Val Phe Gly Leu |
| 245 | 250 255 | |||
| Arg | Trp Arg | Lya Ala Val Lys | Val Gly | Ser |
260 265 ¢2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS; /desc = „syntetyczny (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5
TGGACCJUJAG CTCTCOCTGG CGCATCGCTT CGGCGTPG
PL 195 784 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6:
{i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6
CTCGA.TGCAT TACGTAGGGG TATCCOOOAO CGGTATTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:
TTTOOCOCOC COATCAOCOG CGOCOCAACC ATCAG
PL 195 784 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:
GCCTTAATTA AfiATCSACAC TCAGOCTCTA CTGOCBAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny (iii) HIPOTETYCZNA: nie (IV) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:
«AATOATT AATCCOOCSA CTJUkCawuc AACTC
PL 195 784 B1 (2} INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii} RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny (iii} HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 10:
GCCTTAATEK ACGCTATGTA GITTOTTCTO GCCCCG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:II:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 11:
GTCGACOCOT OAGOCGAGTC AGTCGCGTAA TOC
PL 195 784 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 43 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: różny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = „syntetyczny (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 12:
OACCTTAATT AAGATCTCAT ATGTTCCACC AGCTATTTGT TAG 43
Claims (5)
1. Szczep mikroorganizmu, który jest zdolny do fermentacyjnego wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych, znamienny tym, że ma rozregulowany metabolizm cysteiny tak, że tworzy zwiększoną ilość L-cysteiny i nadwyraża co najmniej jeden gen kodujący białko o sekwencji Id. Sekw. Nr 2 lub jego wariant, który przyczynia się do wytwarzania L-cysteiny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych.
2. Szczep mikroorganizmu według zastrz. 1, znamienny tym, że metabolizm cysteiny uległ rozregulowaniu przez allel Cys-E odporny na sprzężenie zwrotne.
3. Białko, znamienne tym, że obejmuje sekwencję:
1 MKFRGGRMSR KDGYLALLW WWGLNFWI KVGLHNMPRL MLAGLRFMJL.v
51 AFPAIFF7AR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLYL
101 QAQAPFTIML GAFTFGERLH GKQ LAG LALA IFGVLVLII5D SLNGQKVAML .
151 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS
201 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMY1AF7 ATTUGYGIWG TLLGRYETWR
251 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK
301 AVKVGS* ^Id. Sekw. Nr 2 \
PL 195 784 B1 lub wariant sekwencji, który przyczynia się do wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych.
4. Sposób wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych w znanym jako taki procesie fermentacji, znamienny tym, że stosuje się szczep mikroorganizmu określony w zastrz. 1 lub2.
5. Zastosowanie białka określonego w zastrz. 3 do powiększenia ekspresji L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych w fermentacji.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19726083A DE19726083A1 (de) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL326915A1 PL326915A1 (en) | 1998-12-21 |
| PL195784B1 true PL195784B1 (pl) | 2007-10-31 |
Family
ID=7833043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL326915A PL195784B1 (pl) | 1997-06-19 | 1998-06-19 | Szczep mikroorganizmu, białko, sposób wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych oraz zastosowanie białka |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5972663A (pl) |
| EP (1) | EP0885962B1 (pl) |
| JP (1) | JP2992010B2 (pl) |
| KR (1) | KR19990007062A (pl) |
| CN (1) | CN100347291C (pl) |
| AT (1) | ATE293165T1 (pl) |
| BR (1) | BR9803346B1 (pl) |
| CA (1) | CA2235419C (pl) |
| DE (2) | DE19726083A1 (pl) |
| DK (1) | DK0885962T3 (pl) |
| ES (1) | ES2236845T3 (pl) |
| HU (1) | HU224343B1 (pl) |
| ID (1) | ID20467A (pl) |
| PL (1) | PL195784B1 (pl) |
Families Citing this family (107)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19857690A1 (de) * | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von 2-Methyl-thiazolidin-2,4-dicarbonsäure |
| DE19949579C1 (de) * | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
| DE10046934A1 (de) * | 2000-09-21 | 2002-04-18 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
| DE60219969T2 (de) * | 2001-02-13 | 2008-01-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Methode zur Production von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia |
| DE10107002A1 (de) * | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| EP1266966B1 (en) * | 2001-06-12 | 2009-04-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium |
| US7252978B2 (en) | 2001-07-25 | 2007-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-arginine |
| DE60230823D1 (de) * | 2001-09-28 | 2009-02-26 | Ajinomoto Kk | L-cystein herstellendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-cystein |
| MXPA04004874A (es) | 2001-11-23 | 2004-09-03 | Ajinomoto Kk | Procedimiento para producir l-aminoacido utilizando escherichia. |
| RU2229513C2 (ru) * | 2001-11-23 | 2004-05-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
| DE10219851B4 (de) * | 2002-05-03 | 2004-06-24 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Serin |
| DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
| DE10237479A1 (de) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Degussa Ag | Schwefel-haltiges Tierfuttermitteladditiv |
| US7348037B2 (en) * | 2002-08-16 | 2008-03-25 | Evonik Degussa Gmbh | Sulfur-containing animal-feed additives |
| JP2004166592A (ja) * | 2002-11-20 | 2004-06-17 | Ajinomoto Co Inc | メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP4120364B2 (ja) * | 2002-11-20 | 2008-07-16 | 味の素株式会社 | メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法 |
| DE10305774A1 (de) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Methionin |
| EP1597364B1 (fr) | 2003-02-18 | 2013-07-24 | Metabolic Explorer | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| RU2275425C2 (ru) * | 2003-11-03 | 2006-04-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина |
| ATE443757T1 (de) * | 2004-01-30 | 2009-10-15 | Ajinomoto Kk | L-aminosäure produzierender mikroorganismus und verfahren zur l-aminosäureproduktion |
| US20050191684A1 (en) * | 2004-02-25 | 2005-09-01 | Zimenkov Danila V. | Method for producing L-amino acids |
| JP4479283B2 (ja) | 2004-03-04 | 2010-06-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP4604537B2 (ja) * | 2004-03-31 | 2011-01-05 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP2007185184A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2009089603A (ja) | 2006-02-02 | 2009-04-30 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2351830B1 (en) | 2006-03-23 | 2014-04-23 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA |
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| BRPI0806790B1 (pt) | 2007-01-22 | 2017-02-14 | Ajinomoto Kk | microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido |
| DE102007007333A1 (de) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| BRPI0906795A2 (pt) | 2008-01-23 | 2015-08-18 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| EP2246420B1 (en) * | 2008-02-21 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine-producing bacterium, and method for production of l-cysteine |
| JP5332237B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| EP2138585B1 (en) * | 2008-03-06 | 2011-02-09 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-cysteine producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| WO2009135048A2 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Gradalis, Inc. | Highly pure plasmid dna preparations and processes for preparing the same |
| US20120231537A1 (en) * | 2008-04-30 | 2012-09-13 | Gradalis, Inc. | Highly Pure Plasmid DNA Preparations |
| ES2624913T3 (es) | 2008-09-08 | 2017-07-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido |
| BRPI1007069A2 (pt) | 2009-01-23 | 2015-08-25 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido. |
| EP2395096B1 (en) | 2009-02-09 | 2014-04-09 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids |
| JP5521347B2 (ja) * | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP5463528B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP5359409B2 (ja) * | 2009-03-12 | 2013-12-04 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| EP2460883A4 (en) | 2009-07-29 | 2013-01-16 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID |
| RU2009136544A (ru) | 2009-10-05 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae |
| WO2011065469A1 (ja) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | 味の素株式会社 | Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法 |
| RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| RU2501858C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae |
| CN103119154B (zh) | 2010-09-14 | 2015-11-25 | 味之素株式会社 | 含硫氨基酸生产菌以及含硫氨基酸的制造方法 |
| KR101208267B1 (ko) | 2010-10-20 | 2012-12-04 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체 |
| KR101381048B1 (ko) | 2010-10-20 | 2014-04-14 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 |
| WO2012053794A2 (en) | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2014-05-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| US9234223B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-01-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-cysteine |
| BR112013023465B1 (pt) | 2011-04-01 | 2020-10-27 | Ajinomoto Co., Inc | método para produzir l-cisteína |
| JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システインの製造法 |
| DE102011007790A1 (de) | 2011-04-20 | 2012-10-25 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| DE102011075656A1 (de) * | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
| DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102012216527A1 (de) * | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| WO2014148377A1 (ja) | 2013-03-19 | 2014-09-25 | 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学 | L-システイン生産能が高められた腸内細菌科に属する細菌 |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
| KR101525663B1 (ko) | 2013-05-10 | 2015-06-04 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린의 생산방법 |
| KR101493154B1 (ko) | 2013-05-10 | 2015-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법 |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| CN104736707B (zh) | 2013-10-21 | 2017-08-25 | 味之素株式会社 | 生产l‑氨基酸的方法 |
| RU2014105547A (ru) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Адзиномото Ко., Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL |
| KR101677328B1 (ko) | 2014-08-12 | 2016-11-18 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법 |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| KR101694632B1 (ko) | 2015-09-11 | 2017-01-10 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| DK3556847T3 (da) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismestamme og fremgangsmåde til antibiotikafri, fermentativ fremstilling af lavmolekylære substanser og proteiner |
| EP3420096A1 (en) | 2016-02-25 | 2019-01-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter |
| KR101825310B1 (ko) | 2016-12-29 | 2018-03-15 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인을 생산하는 방법 |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN117603895A (zh) | 2018-12-26 | 2024-02-27 | 大象株式会社 | 生产l氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l氨基酸的生产方法 |
| WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
| BR112021017870A2 (pt) | 2019-04-05 | 2021-12-07 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
| JP2022550084A (ja) | 2019-09-25 | 2022-11-30 | 味の素株式会社 | 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法 |
| CN115244183A (zh) | 2020-04-03 | 2022-10-25 | 瓦克化学股份公司 | 作为用于生物催化还原胱氨酸的酶催化氧化还原系统的核心组分的生物催化剂 |
| CA3163410A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Hye Min Park | O-phosphoserine export protein variant and method for producing o-phosphoserine, cysteine, and derivatives thereof using the same |
| US20230265473A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-08-24 | Wacker Chemie Ag | Improved cysteine-producing strains |
| KR102414743B1 (ko) | 2020-09-09 | 2022-06-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법 |
| KR20220163754A (ko) | 2021-06-03 | 2022-12-12 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 YhhS 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| JP2024520831A (ja) | 2021-06-11 | 2024-05-24 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規なＭｄｔＨ変異体及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法 |
| KR102654301B1 (ko) | 2021-06-23 | 2024-04-04 | 씨제이제일제당 주식회사 | NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| CN116096909A (zh) | 2021-07-05 | 2023-05-09 | 瓦克化学股份公司 | 用于将亚磺酸酶促氧化成磺酸的方法 |
| KR102688937B1 (ko) | 2021-12-31 | 2024-07-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법 |
| WO2023165684A1 (de) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
| WO2024125794A1 (de) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen herstellung von hypotaurin |
| WO2024125795A1 (de) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur isolierung von taurin aus taurin- und hypotaurin-haltigen fermentationsmedien mikrobieller fermentation |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3376341D1 (en) * | 1982-08-09 | 1988-05-26 | Ajinomoto Kk | Method for producing 2-substituted-thiazolidine-4-carboxylic acids |
| DE19539952A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
| DE19548222A1 (de) * | 1995-12-22 | 1997-06-26 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern |
-
1997
- 1997-06-19 DE DE19726083A patent/DE19726083A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-05-22 DE DE59812730T patent/DE59812730D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 AT AT98109269T patent/ATE293165T1/de active
- 1998-05-22 ES ES98109269T patent/ES2236845T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 EP EP98109269A patent/EP0885962B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 DK DK98109269T patent/DK0885962T3/da active
- 1998-06-15 ID IDP980878A patent/ID20467A/id unknown
- 1998-06-16 CA CA002235419A patent/CA2235419C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-16 US US09/097,759 patent/US5972663A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-17 KR KR1019980022734A patent/KR19990007062A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-06-17 BR BRPI9803346-8B1A patent/BR9803346B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-06-18 CN CNB981026176A patent/CN100347291C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-18 HU HU9801369A patent/HU224343B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-06-19 JP JP10173278A patent/JP2992010B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-19 PL PL326915A patent/PL195784B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2992010B2 (ja) | 1999-12-20 |
| HU224343B1 (hu) | 2005-08-29 |
| ES2236845T3 (es) | 2005-07-16 |
| JPH1156381A (ja) | 1999-03-02 |
| CA2235419A1 (en) | 1998-12-19 |
| HUP9801369A2 (hu) | 1999-05-28 |
| KR19990007062A (ko) | 1999-01-25 |
| ATE293165T1 (de) | 2005-04-15 |
| HU9801369D0 (en) | 1998-08-28 |
| DK0885962T3 (da) | 2005-05-09 |
| EP0885962A1 (de) | 1998-12-23 |
| BR9803346B1 (pt) | 2013-11-12 |
| HUP9801369A3 (en) | 2000-08-28 |
| US5972663A (en) | 1999-10-26 |
| CA2235419C (en) | 2009-06-02 |
| DE59812730D1 (de) | 2005-05-19 |
| EP0885962B1 (de) | 2005-04-13 |
| CN1203274A (zh) | 1998-12-30 |
| BR9803346A (pt) | 2000-02-08 |
| PL326915A1 (en) | 1998-12-21 |
| ID20467A (id) | 1998-12-24 |
| CN100347291C (zh) | 2007-11-07 |
| DE19726083A1 (de) | 1998-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL195784B1 (pl) | Szczep mikroorganizmu, białko, sposób wytwarzania L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny i/lub pochodnych tiazolidynowych oraz zastosowanie białka | |
| US20040038352A1 (en) | Method for fermentative production of amino acids and amino acid derivatives of the phosphoglycerate family | |
| CA2386539C (en) | Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation | |
| JP6807976B2 (ja) | Ｏ−ホスホセリン生産微生物及びそれを用いたｏ−ホスホセリンまたはｌ−システイン生産方法 | |
| JP3329825B2 (ja) | Ｏ−アセチルセリン、ｌ−システイン及びｌ−システイン−関連生成物の製法 | |
| JP2006325607A (ja) | 非タンパク質ｌ−アミノ酸の製造方法 | |
| JP5788593B2 (ja) | 発酵による天然ｌ−システインの製造方法 | |
| US20090298135A1 (en) | Method for fermentative production of L-methionine | |
| JP2014512841A (ja) | 調整された酸素飽和条件下における、発酵によるｌ−シスチンの製造方法 | |
| HU225826B1 (en) | Process for the fermentative production of o-acetyl-serin | |
| JP2010022215A (ja) | Ｌ−システインの製造方法 | |
| US8143032B1 (en) | Alleles of the thrA gene of Enterobacteriaceae | |
| JP2020503053A (ja) | Ｏ−ホスホセリンを生産するエシェリキア属微生物及びこれを用いたｏ−ホスホセリンまたはｌ−システインを生産する方法 | |
| JPH03502758A (ja) | ポリペプチド類においてノルロイシン含有量を制御するための発酵培地および方法 | |
| MXPA98004927A (en) | Microorganisms and procedures for the fermentative obtaining of l-cysteine, l-cistine, n-acetyl-serine or derivatives of tiazolid | |
| JPS637790A (ja) | 酵素によるｌ−システインの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080619 |