HU224343B1 - Mikroorganizmusok és eljárások L-cisztein-, L-cisztin-, N-acetilszerin és ezek tiazolidinszármazékainak előállítására fermentáció útján - Google Patents
Mikroorganizmusok és eljárások L-cisztein-, L-cisztin-, N-acetilszerin és ezek tiazolidinszármazékainak előállítására fermentáció útján Download PDFInfo
- Publication number
- HU224343B1 HU224343B1 HU9801369A HUP9801369A HU224343B1 HU 224343 B1 HU224343 B1 HU 224343B1 HU 9801369 A HU9801369 A HU 9801369A HU P9801369 A HUP9801369 A HU P9801369A HU 224343 B1 HU224343 B1 HU 224343B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cysteine
- production
- fermentation
- cystine
- seq
- Prior art date
Links
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 125
- 150000003548 thiazolidines Chemical class 0.000 title claims abstract description 46
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 title claims abstract description 20
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 43
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 41
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims abstract description 40
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 23
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 claims abstract description 14
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 3
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101000787090 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Uncharacterized 33.9 kDa protein in glnA 5'region Proteins 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- JJIHLJJYMXLCOY-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-DL-serine Natural products CC(=O)NC(CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 6
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- JCAKCGQZNBEITC-FWRGRRDFSA-N (4r)-2-methyl-1,3-thiazolidine-2,4-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(C)N[C@H](C(O)=O)CS1 JCAKCGQZNBEITC-FWRGRRDFSA-N 0.000 description 5
- JCAKCGQZNBEITC-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1,3-thiazolidine-2,4-dicarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1(C)NC(C(O)=O)CS1 JCAKCGQZNBEITC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100498063 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) cysB gene Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 101150111114 cysE gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine Chemical class C1CSCN1 OGYGFUAIIOPWQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N O-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O VZXPDPZARILFQX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N sulfurothioic S-acid Chemical compound OS(O)(=O)=S DHCDFWKWKRSZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 3
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- -1 methionine amino acid Chemical class 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DQMLFUMEBNHPPB-UHFFFAOYSA-N 2-Methylthiazolidine Chemical compound CC1NCCS1 DQMLFUMEBNHPPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2,3-dimethylquinoxaline Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N=C(C)C(C)=NC2=C1 CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 150000008538 L-cysteines Chemical class 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 101150051927 bmr gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000003574 free electron Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 101150025975 qacA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát mikroorganizmusok és eljárások képezik L-cisztein,L-cisztin, N-acetil-szerin és ezek tiazolidinszármazékainakelőállítására fermentáció útján. A találmány szerintimikroorganizmustörzsek cisztein- anyagcseréje olyan módon deregulált,hogy megnövekedett mennyiségű L-ciszteint termel, és a mar-lokuszlegalább egy effluxgénjét fokozottan expresszálják; előnyösencisztein-anyagcsere visszacsatolásos gátlással szemben érzéketlennétett cisz-E-allélen keresztül deregulált, és a törzs mar-lokusz-génként a 2. vagy 3. azonosító számon megadott szekvenciájú, L-cisztein-termelés fokozására képes fehérjét vagy funkcionálisváltozatát kódoló effluxgént fokozott mértékben expresszál. Atalálmány tárgyát képezik továbbá izolált, L-cisztein-termelésfokozására képes fehérjék, eljárások L-cisztein, L- cisztin, N-acetil-szerin vagy ezek tiazolidinszármazékainak előállítására, továbbá afehérjék alkalmazása fermentáció során intracellulárisan keletkezőaminosavak vagy aminosavszármazékok fokozott termelésére expresszióútján. A találmány szerinti megoldás alkalmas L-cisztein, L-cisztin,N-acetil-szerin és ezek tiazolidinszármazékainak sztereoszelektív,olcsó, kereskedelmi méretekben történő előállítására.
Description
A találmány tárgyát mikroorganizmusok, fehérjék és eljárások képezik L-cisztein, L-cisztin, N-acetil-szerin és ezek tiazolidinszármazékainak előállítására fermentáció útján. A találmány szerinti mikroorganizmustörzsek cisztein-anyagcseréje olyan módon deregulált, hogy megnövekedett mennyiségű L-ciszteint termelnek, és a mar-lokusz legalább egy effluxgénjét fokozottan expresszálják.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható L-cisztein, L-cisztin, N-acetil-szerin és ezek tiazolidinszármazékainak sztereoszelektív, olcsó, kereskedelmi méretekben történő előállítására.
Aminosavak fermentáció útján történő előállítása sok aminosav esetében a technika állásához tartozik. L-cisztein előállítására azonban mindeddig nem létezett gazdaságos fermentációs eljárás.
HOOC
H-C-NHi +
H-C-H
I
SH λ cisztein 1
Cisztein ketonokkal és aldehidekkel való kondenzációs reakciója során általában tiazolidinszármazékok és ezeknek megfelelő hemitioketálok keletkeznek. A cisztein kémiai kondenzációja különböző ketonokkal és aldehidekkel, különösen α-ketosavakkal, régóta ismert reakció. A kondenzáció hemitioketál-intermedieren keresztül megy végbe. A hemitioketál a kén szabad elektronpárjának az aldehidcsoport vagy a ketocsoport elektronhiányos szénatomját célzó nukleofil támadása során keletkezik. A víz kilépésével járó gyűrűzáródás azután a megfelelő tiazolidinszármazék keletkezéséhez vezet.
Az (I) általános képletű tiazolidinszármazékok keletkezése általánosan az alábbi reakcióvázlattal jelle15 mezhető:
0=^
Rí karbonilvegyület
HOOC I κOH
Rí hemitioketál
HzO
H
HOOC λ
O-s H I
H tiazolidin-származék
Az (I) általános képletben R.| és R2 jelentése tetszőleges szerves gyök.
A kiindulási vegyületek és a tiazolidinszármazékok mennyisége a hemitioketálon keresztül következetesen egyensúlyban van. Emiatt a hemitioketál általában 55 vizes oldatban szintén jelen van a tiazolidinszármazék mellett. A leírás szerinti értelemben „tiazolidinszármazék” alatt ezeknek az anyagoknak a belőlük keletkező hemitioketállal való egyensúlyát, illetve egyensúlyi elegyét is értjük. 60
Mindeddig nem ismertettek olyan tiazolidineket, amelyek sejtek közvetlen anyagcseretermékei lettek volna. Minden olyan közlés, amely tiazolidinek sejtek általi keletkezésére vonatkozik, a kiindulási vegyületek egyikének, általában L-ciszteinnek, a külső, feleslegben való hozzáadásán alapul. A cisztein deszulfhidratálódással és deamidálódással piroszőlősavvá alakul, majd a hozzáadott cisztein reakcióba lép a piroszőlősavval [Rónáid C. Simpson és munkatársai, „Biochimica et Biophysic Acta”, 496, 12-19 (1977)]. Noha Kre2
HU 224 343 Β1 dich és munkatársai közlése szerint, amennyiben L-ciszteint enzimatikus deszulfhidratációnak vetünk alá, 2-metil-2,4-tiazolidin-dikarbonsav keletkezik [Kredich és munkatársai, „J. of Bioi. Chem. 248, (17) 6187-6196], ugyanezen szerzők véleménye szerint 5 rendkívül kicsi a valószínűsége annak, hogy ugyanez az anyag in vitro keletkezzen.
Tiazolidinek racém prekurzorokkal való alkalmazása L-cisztein biotranszformációval történő előállításával ismert [EP-A 0,101,052 számú európai közzétételi 10 irat; Ok Hee Ryu és munkatársai, Biotechnology Letters, 17, (3) 275-280, (1995. március)]. Amennyiben L-cisztein előállítására racemát elegyet használunk, azt sztereoszelektíven kell L-ciszteinné konvertálnunk enzimeket vagy egész sejteket alkalmazva. A megma- 15 radó diasztereomereket azután újra racemizálnunk kell. Ezen okból a biotranszformálást igen magas költségek terhelik.
Tiazolidinek racém ciszteinből és a megfelelő ketonból vagy aldehidből kiinduló kémiai szintézise négy 20 különböző diasztereomerhez vezet. A kémiai szintézist enantiomerek szempontjából tiszta L-ciszteinből kiindulva elvégezni drága és értelmetlen, ha a cél L-cisztein azt követő izolálása. Emiatt egy, olyan tiazolidindiasztereomerek előállítására szolgáló eljárást, ame- 25 lyek C4 szénatomja R-konfigurációjú, a kiindulási vegyületek magas költsége terhel.
A találmány tárgyát mikroorganizmusok képezik, amelyek alkalmasak L-cisztein, L-cisztin, L-acetil-szerin és/vagy tiazolidinszármazékaik fermentációs úton 30 történő előállítására.
Egy találmány szerinti mikroorganizmustörzset az jellemez, hogy legalább egy antibiotikumot vagy más a szervezet számára toxikus - anyagot közvetlenül a sejten kívülre szekretálni képes fehérjét kódoló gént fo- 35 kozottan expresszál.
A leírás szerinti értelemben „az organizmusra toxikus anyagok” alatt előnyösen olyan vegyületeket értünk, amelyek az organizmus növekedésére negatív hatással vannak. Ilyen vegyületek például a karbonsa- 40 vak vagy karbonsavszármazékok, amelyek nagy intracelluláris koncentrációban vannak jelen.
A továbbiakban azokat a géneket, amelyek antibiotikumok vagy más toxikus anyagok sejten kívül történő szekretálására közvetlenül alkalmas fehérjéket kódol- 45 nak, vagy amelyek ilyen fehérjék kialakulását segítik elő, „efflux’-géneknek nevezzük.
Ebből következően a találmány tárgyát effluxgének alkalmazásai is képezik intracellulárisan keletkező aminosavak vagy aminosavszármazékok expressziójának fokozása céljából, fermentáció során.
A találmány szerinti mikroorganizmusban effluxgénként előnyösen az alábbi gének közül legalább egyet expresszáltatunk fokozottan: mar-lokusz [Cohen S. P. és munkatársai, Journal of Bacteriology, Mar. 175, (5) 1484-1492 (1993)], emr-lokusz, acr-lokusz, cmr-lokusz [Miller P. F. és Sulavik M. C., Molecular Microbiology 21, (3) 441-448 (1996)], mex-gének [Köhler és munkatársai, Molecular Microbiology 23, (2) 345-354, (1997)], bmr-gén [Neyfakh A. A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4781-4785 (1991)] és qacA-gén [Tennent és munkatársai, J. Gén. Microbiol. 135, 1-10(1989)].
A találmány szerinti mikroorganizmusban effluxgénként előnyösen a mar-lokusz génjei vannak fokozottan expresszálva.
A találmány szerinti mikroorganizmusban különösen előnyösen az MSR KDGVLALLW VVWGLNFWI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV szekvenciát (1. azonosító számon megadott szekvencia) tartalmazó fehérjét kódoló gén vagy egy, az 1. azonosító számon megadott szekvenciával 50%-nál nagyobb homológiát mutató kódológén van fokozottan expresszálva.
Az expresszált fehérjeszekvencia homológiája az első azonosító számon megadott szekvenciával előnyösen nagyobb mint 75%, különösen előnyösen pedig nagyobb mint 90%.
A találmány tárgyát képezik tehát MSR KDGVLALLW WWGLNFWI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV szekvenciát (1. azonosító számon megadott szekvencia) tartalmazó fehérjét kódoló gének is, valamint az 1. azonosító számon megadott szekvenciával 50%-nál nagyobb homológiát mutató szekvenciát kódoló gének.
A találmány tárgyát képezik továbbá az MSR KDGVLALLW WWGLNFWI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV szekvenciát (1. azonosító számon megadott szekvencia) tartalmazó fehérjék, valamint az 1. azonosító számon megadott szekvenciával 50%-nál nagyobb homológiát mutató szekvenciát tartalmazó fehérjék.
Előnyösen az 1. azonosító számon megadott szekvenciához képest nagyobb mint 75%, különösen előnyösen pedig nagyobb mint 90%.
A találmány szerinti fehérje szekvenciája lehet például a következő:
MKFRGGRMSR KDGVLALLW WWGLNFWI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV 51 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL 101 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML 151 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS 201 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR 251 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK
301 avkvgs* (2. azonosító számon megadott szekvencia)
Az alábbiakban a 2. azonosító számon megadott aminosavszekvenciájú fehérjét kódoló nyílt leolvasási fázist ORF306-nak jelöljük.
A találmány szerinti fehérje szekvenciájára egy másik példa a következő:
HU 224 343 Β1
MSR KDGVLALLW WWGLNFWI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV 44 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL 94 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML
144 GMFLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS 194 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR 244 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK 2 94 avkvgs* (3. azonosító számon megadott szekvencia)
A találmány tárgyát képezik azok a fehérjék is, amelyek aminosavszekvenciája több mint 50%-ban homológ, aminosavszinten, a 2. és a 3. azonosító számokon megadott szekvenciákkal.
A találmány tárgyát képező fehérjék szekvenciájának homológiája a 2. és a 3. azonosító számokon megadott szekvenciákhoz képest előnyösen nagyobb mint 75%, különösen előnyösen pedig nagyobb mint 90%.
fgy azok a gének, amelyek a 2. vagy a 3. azonosító számokon megadott aminosavszekvenciájú fehérjék, vagy a 2. vagy a 3. azonosító számokon megadott szekvenciákkal nagyobb mint 50%-ban, előnyösen nagyobb mint 75%-ban, különösen előnyösen nagyobb mint 95%-ban homológ aminosavszekvenciájú fehérjét kódolnak, szintén a találmány tárgyát képezik. A leírásban megadott homológiaértékeket a Wisconsin Package Version 9.0 [Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin] segítségével számoltuk ki. A homológja meghatározását az adatbázisban a fasta alprogram és az alapbeállítási értékek (2 szóméret) alkalmazásával kutatást folytatva kezdtük meg. A legnagyobb hasonlóságot mutató szekvenciákat vizsgáltuk meg homológja szempontjából a gap alprogramot és a „gap creation penalty 12”, valamint a „gap extension penalty 4” alapbeállítási paramétereket alkalmazva.
Egy másik példa a találmány szerinti gén ciszteintermelés céljából történő fokozott expressziójára a mar-lokuszt kódoló 5,5 kb hosszúságú DNS-fragmens fokozott expressziója. Ezt a plazmidot, amelyet 100-1-1-nek jelöltünk, E. coli K12 W3110 törzsben helyeztünk letétbe a Német Mikroorganizmus és Sejttenyészet Gyűjteménynél (DSMZ, Deutsche Sammlungen von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124, Braunschweig) a DSM 11 545 hozzáférési számon. Az 1. ábra a plazmid térképét mutatja. Ez a plazmid alkalmazható a találmány szerinti gének amplifikálására PCR segítségével.
Szakember számára nem jelent nehézséget az ismert eljárások - például helyspecifikus mutagenezis alkalmazása a találmány szerinti gének további specifikus módosítása érdekében a szekvencia minden esetben külön meghatározandó kívánt helyein. Következésképpen az ilyen módon módosított géneket tartalmazó mikroorganizmusok szintén a találmány tárgyát képezik, amennyiben az ilyen módon módosított gének hozzájárulnak L-cisztein, L-cisztin, N-acetil-szerin és/vagy tiazolidinszármazékok előállításához.
A leírás szerinti értelemben fokozott expresszió alatt azt értjük, hogy a fehérje legalább kétszeres mértékben expresszálódik a találmány szerinti mikroorganizmusban, mint a vad típusú mikroorganizmusban, amelyből a fehérje származik.
A találmány szerinti mikroorganizmusban a fehérje előnyösen ötszörös mértékben expresszálódik a vad típusú organizmusbeli expresszióhoz képest, különösen előnyösen pedig legalább 10-szeres mértékben expresszálódik ahhoz a vad típusú mikroorganizmushoz képest, amelyből a fehérje származik.
A találmány szerinti gének fokozott mértékű expressziója nélkül nem figyelhető meg növekedés az L-cisztein vagy a tiazolidinszármazékok kitermelésében a kiindulási törzshöz képest, vagyis például anélkül, hogy egy külön promoter felhasználásával független transzkripció menne végbe, vagy anélkül, hogy a marA-t kódoló gén több kópiában lenne jelen a plazmidban.
Az említett szekvencia fokozott expressziójának eredményeképpen bekövetkezett kitermelésnövekedés annál is meglepőbb volt, mivel az ORF266 jelölésű nyílt leolvasási keret géntermékének irodalomban leírt fokozott expressziója nem vezet az L-cisztein kitermelésének megnövekedéséhez. Az ORF266 jelölésű nyílt leolvasási keret szekvenciája, a 2. azonosító számon a 41. metionin-aminosavtól kezdődő szekvencia megfelel a 4. azonosító számon megadott szekvenciának.
Az ORF306-ból származó fent ismertetett aminosavszekvenciában az ORF266-nak megfelelő kezdő metionint félkövér betűtípussal szedtük és aláhúztuk.
Szakember számos eljárást ismer egy gén fokozott expressziójának megvalósítására. Az egyik lehetőség például az, hogy a gént egy olyan plazmid segítségével expresszáltatjuk, amely nap kópiaszámban van jelen a sejtben. Ilyen plazmidok ismertek, megemlíthetjük például közülük a pACYC177, pACYC184, a pACY184 származékai, pBR322, más pBR-származékok, pBlurescript, pUC18, pUC19 és más, Escherichia coli esetében szokványosán alkalmazott plazmidok.
A találmány szerinti fokozott expresszáltatás szempontjából előnyös plazmidok a pACYC177, a pACYC184, a pACYC184 származékai, a pBR322 és más pBR-származékok.
A találmány szerinti megoldásban különösen előnyösen alkalmazható a pACYC184 és származékai, mint például a pACYC184-LH (letétbe helyezve a Német Mikroorganizmus- és Sejttenyészet-Gyűjteménynél [„Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”, DSMZ, D-38124 Braunschweig], a DSM 10 172 hozzáférési számon.
A találmány tárgyát képezik tehát a találmány szerinti gént tartalmazó plazmidok is.
Egyéb lehetőségek az expresszió fokozására például egy effluxgén kópiaszámának növelése a kromoszómában található génszegmens amplifikálásával, to4
HU 224 343 Β1 vábbá erős promoterek alkalmazása az effluxgén transzkripciójának javítása érdekében.
Megfelelően erős promoterek például a GAPDH-promoter, a tac-promoter (PtaC), a lac-promoter (Piac), a trp-promoter (ptrp), a lambda-PL vagy a lambda-PR.
A GAPDH-promoter és a tac-promoter (ptac) előnyösek.
A GAPDH-promoter különösen előnyösen alkalmazható. További lehetőség az expresszió fokozására az effluxgének expressziójára gátlóhatást gyakorló represszorgének inaktiválása. A mar-génlokusz esetében ez például a mar-R-gén inaktiválását jelenti.
A transzlációra pozitív hatású elemek szintén hozzájárulnak az effluxgén fokozott expressziójához. Ilyen elemek például egy jó (hatásos) riboszómakötő hely (például Shine-Dalgarno-szekvencia) vagy egy 3’-végi „doboz”.
Ilyen, a találmány szerinti megoldás során előnyösen alkalmazható elem a GAPDH-gén riboszómakötő helye, amely pozitív hatást gyakorol a transzlációra.
Expressziójuk érdekében az effluxgéneket egy, L-ciszteint termelő mikroorganizmusba transzformáljuk.
Az effluxgéneket előnyösen az alábbi mikroorganizmusok valamelyikébe transzformáljuk: Bacillus, mint például a B. subtilis, Corynebacterium, mint például a C. glutamicum, Streptomyces és E. coli-törzsek.
Az effluxgéneket előnyösen olyan organizmusokba transzformáljuk, amelyek cisztein-anyagcseréje olyan módon deregulált, hogy ez megnövekedett mennyiségű L-cisztein-mennyiség keletkezését és előnyösen, az L-cisztein vagy az N-acetil-szerin tiazolidinszármazékainak azt követő keletkezését eredményezi.
Ilyen, megnövekedett mennyiségű L-ciszteint termelő mikroorganizmusok például azok, amelyek visszacsatolásos gátlással szemben érzéketlenné tett cisz-E-allélt hordoznak.
Egy másik, előnyös megvalósítási mód szerint olyan mikroorganizmusokat transzformálunk, amelyek L-cisztein és egy keton vagy aldehid - előnyösen piroszőlősav - kondenzációja útján intracellulárisan tiazolidinszármazékokat állítanak elő.
L-ciszteint megnövekedett mennyiségben előállító mikroorganizmusokat ismertet például a DE 19539952 számú német szabadalmi bejelentés, amelyet a kitanítás részének kell tekinteni.
Mikroorganizmusok transzformálására szolgáló eljárások szakember számára jól ismertek, például közkézen forgó szakkönyvekből. Minden ismert ilyen jellegű eljárás alkalmazható a találmány szerinti megoldás megvalósítása során.
Az effluxgének fokozott expressziója intracellulárisan keletkező aminosavakat vagy aminosavszármazékokat - mint például az L-cisztein, az L-cisztin, N-acetil-szerin vagy azok tiazolidinszármazékai - keletkező mikroorganizmusokban meglepő módon az intracellulárisan keletkező aminosavak vagy aminosavszármazékok - mint például az L-cisztein, az L-cisztin, az N-acetil-szerin és azok tiazolidinszármazékai - megnövekedett, a sejten kívüli térbe irányuló szekrécióját eredményezi. Ennek eredménye ezen termékek lényegesen megnövekedett, a fermentáció során elérhető hozama.
A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás L-cisztein, L-cisztin, N-acetil-szerin vagy ezen tiazolidinszármazékainak előállítására, amelyet az jellemez, hogy egy effluxgéneket fokozott mértékben expresszáló mikroorganizmust alkalmazunk a fermentáció során, önmagában ismert módon.
Az L-cisztein, az L-cisztin, az N-acetil-szerin vagy tiazolidinszármazékok fermentációs előállítására szolgáló, találmány szerinti eljárásnak számos előnye van: csupán azok a diasztereomer tiazolidinek keletkeznek, amelyek C4 szénatomja R-konfigurációjú, mivel a sejt enzimatikus „apparátusának” eredményeképpen az L-cisztein sztereoszelektív módon keletkezik. Ez az L-cisztein képes azután reagálni az adott, hozzáférhető ketonnal vagy aldehiddel, és a reakció során kizárólag az említett diasztereomer tiazolidinek keletkeznek.
L-cisztein előállítására olyan tiazolidinekből, amelyek C4 szénatomja R-konfigurációjú, hagyományos kémiai és biológiai eljárásokat alkalmazhatunk, oly módon, hogy egyszerűen eltoljuk az egyensúlyt a kiindulási vegyületek keletkezésének irányába.
Azt tapasztaltuk továbbá, hogy - meglepő módon a fermentáció során előnyös az L-ciszteint az intracellulárisan keletkezett tiazolidinszármazékokból előállítani. Ez a meglepő felfedezés alaposabb vizsgálatra indított minket, amely ahhoz a további felfedezéshez vezet, hogy a tiazolidin lényegesen kevésbé toxikus a sejt számára, mint az L-cisztein.
A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás L-cisztein előállítására, amelyet az jellemez, hogy mikroorganizmusba intracellulárisan keletkező L-ciszteint a mikroorganizmusban intracellulárisan jelen lévő ketonnal vagy aldehiddel reagáltatunk intracellulárisan a mikroorganizmusban, antibiotikumok vagy más - a mikroorganizmus számára toxikus - anyagok szekretálására közvetlenül alkalmas fehérje felhasználásával a tiazolidinszármazékokat a mikroorganizmus sejtjein kívülre szekretáljuk, és adott esetben a tiazolidinszármazék elkülönítése után, az L-cisztein és a tiazolidinszármazék közötti reakció-egyensúly cisztein keletkezésének irányába való eltolásával L-ciszteint állítunk elő.
Az egyik lehetőség tiazolidinszármazék intracelluláris előállítására az, hogy az L-ciszteint minden esetben intracellulárisan jelen lévő ketonnal vagy aldehiddel reagáltatjuk. Organizmusok anyagcsere-útvonalának állomásaiként számos, a kondenzációra alkalmas keton és aldehid ismert. A baktériumok anyagcsere-útvonalán ilyen ketonok és aldehidek például a piroszőlősav, az oxálecetsav, az α-ketoglutársav és a glioxilsav.
Az L-cisztein előnyösen és különösen szívesen reagál piroszőlősavval vagy glioxilsavval.
Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás során keletkező tiazolidinszármazékok I általános képletében Rt és R2 közül legalább az egyiknek a jelentése karboxilcsoport, előnyösen Rt jelentése karboxilcsoport és R2 jelentése metilcsoport.
A tiazolidinszármazékok keletkezését eredményező kondenzáció kiindulási vegyületei közül mindkettőt
HU 224 343 Β1 előállíthatja a mikroorganizmus; alternatív lehetőség, hogy csupán az egyik kiindulási vegyületet állítja elő a mikroorganizmus, a másik kiindulási vegyületet a fermentáció során mi adjuk hozzá az elegyhez.
A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a tiazolidinszármazék keletkezését eredményező kondenzáció mindkét kiindulási vegyületét a mikroorganizmus állítja elő.
Piroszőlősav származékolására származékképző vegyületként többek között hidroxil-amint vagy 2,4-dinitro-fenil-hidrazint használhatunk, és ilyen módon a piroszőlősavat eltávolíthatjuk az egyensúlyi reakcióból.
A találmány szerinti eljárásban a tiazolidinszármazékot (és a neki megfelelő hemitioketált) előnyösen egyszerű és olcsó szén-, nitrogén- és kénforrásokból állíthatjuk elő.
A találmány szerinti eljárás során a fermentációs eljárásokban szokványosán alkalmazott szénforrásokat, például glükózt, laktózt, fruktózt, keményítőt és hasonlókat, nitrogénforrásokat, például ammóniát vagy fehérjelizátumot és hasonlókat, továbbá nitrogénforrásokat, például szulfidot, szulfitot, szulfátot, tioszulfátot vagy ditionitot alkalmazhatunk a fermentációhoz.
A fermentációval előállított tiazolidinszármazékokat cisztein előállításán kívül más célokra is felhasználhatjuk. Fermentációval előállított tiazolidinszármazékok amelyek 4. szénatomja R-konfigurációjú - bonyolultabb szintézisek kiindulási anyagaként (vagy egyéb felhasznált anyagaként) történő alkalmazására számos lehetőség ismert.
Az alábbi példák segítségével a találmány szerinti megoldást alaposabban megvilágítjuk.
A tiazolidinszármazékokat és a hemitioketált csupán közvetett módon lehetséges kvantitatívan meghatározni. Az alábbi példákban ezeket a vegyületeket cisztein meghatározásán keresztül határoztuk meg Gaitonde Μ. K. módszerével [Biochem. J. 104, 627-633 (1967)]. Amennyiben a ciszteint erősen savas körülmények között ninhidrinnel reagáltatjuk, a kapott származék eltávozik az egyensúlyból. Ez azt eredményezi, hogy a hemitioketál folyamatosan elreagál, aminek következtében elreagál a tiazolidinszármazék is. Körülbelül 10 percig tartó reakció után, 100 °C-on, az összes tiazolidinszármazék és a belőle keletkező hemitioketál átalakul cisztein-ninhidrin-származékká, amelyet 560 nm-en mennyiségileg megmérhetünk. Ezzel az eljárással a szabad ciszteint is megmérjük.
A szabad SH-csoportok mennyiségét, tehát a szabad ciszteint önmagában, a Sang-Han Lee és munkatársai által közölt vizsgálattal határoztuk meg [Biochemical and Biophysical Research Communications, 213, (3) (1995)] 5,5’-ditiobisz-2-nitro-benzoesav (DTNB) felhasználásával.
Amennyiben szabad cisztein keletkezik, az L-cisztinné oxidálódik a fermentáció során a bejuttatott légköri oxigén hatására. A cisztin csupán enyhén oldható vizes közegben pH 7,0-en, mivel nagyrészt fehér csapadékként kicsapódik. Amennyiben oldhatatlan cisztincsapadék keletkezett, a tömény sósav koncentrációja felének megfelelő koncentrációjú sósavat feloldottuk, majd ditiotreitol (DTT) alkalmazásával előállított redukáló körülmények között megmértük a fenti vizsgálati eljárással.
A 3. példában az „összes cisztein” mennyiségét - amelyet a felülúszóban Gaitonde módszerével határoztunk meg - adtuk meg mint a fermentáció eredményét. Előnyösen, ebben az összefüggésben az „összes ciszteinbe” beleértjük a 2-metil-tiazolidin-2,4-dikarbonsavat, a keletkező hemitioketált, a szabad L-ciszteint és az oldott cisztint. A kicsapódott cisztint külön mértük meg és tüntettük fel.
Az a módszer, amellyel a találmány szerinti megvalósítása során termelődő 2-metil-tiazolidin-2,4-dikarbonsavat - kétszeresen töltött fémionok alkalmazásával - kicsaphatjuk, kihasználható ezen származék keletkezésének kimutatására is. Nemrégiben közölték, hogy ez a származék kicsapható cink-acetáttal [Schubert és munkatársai, lásd fent]. A kicsapást azonban elvégezhetjük más, kétszeresen töltött fémionokkal is, például magnéziumionnal, vasionnal, rézionnal, cinkionnal, mangánionnal, kobaltionnal és hasonlókkal. A keletkezett tiazolidintermék kicsapását és azt követő azonosítását a 4. példában ismertetjük. Ez a példa azt is bemutatja, hogy 24 órás fermentációs idő után a 2-metil-tiazolidin-2,4-dikarbonsav a reakció főterméke. A fermentációs termék kicsapásának könnyű kivitelezhetősége a termék analízise és tisztítása során egyaránt hasznos.
1. példa
Az allélek amplifikálása PCR-eljárással
A) A cysE-allélek amplifikálása
Az alábbiakban alkalmazott cysE-alléleket, azaz a cysEIV-t és a cysEX-et a DE 19539952 számú német szabadalmi bejelentésben található 2/10 példa tárja fel.
Az ebben az iratban leírt mutációk előállíthatok helyspecifikus mutagenezissel. A mutagenezis elvégzésére alkalmas reagenskészletek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, például a Stratagene cégtől (Stratagene GmbH, PO Box 105466, D-69044 Heidelberg, Németország) ExSite vagy Chameleon márkaneveken.
Miután a helyspecifikus mutagenezist elvégeztük, a kapott alléleket a releváns DNS-ből polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazásával [Saiki és munkatársai, Science 239, 487-491 (1988)] amplifikáltuk az alábbi láncindítók felhasználásával:
cysE-fw (a szekvencialistában az 5. azonosító számon megadott szekvencia)
5'-TGG ACC AGA GCT CTG GCT GGC GCA TCG CTT CGG CGT TG-3' SacI cysE-rev: (a szekvencialistában a 6. azonosító számon megadott szekvencia)
5'-CTC GAT GCA TTA CGT AGG GGT ATC CGG GAG CGG TAT TG-3' Nsil
HU 224 343 Β1
A PCR-kísérleteket 30 ciklusban hajtottuk végre 200 μΜ koncentrációjú dezoxinukleotid-trifoszfátok (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), a megfelelő oligonukleotidok 1 μΜ koncentrációja, 100 ng - az adott cysE-allélt tartalmazó templát-DNS, 1/10 térfogatú, 10-szeres tö- 5 ménységű reakciópuffer [100 mM KCI, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM tris-HCI (pH 8,8), 20 mM MgSO4,
1% Triton X-100 és 1000 gg/ml BSA] és 2,5 egység hőstabilis rekombináns Pfu DNS-polimeráz (Stratagene) jelenlétében egy PCR-készülékben (Gene- 10 ATAQController, Pharmacia). Egy ciklus az alábbi lépésekből állt: az elegyet 94 °C-on tartottuk 1 percig, °C-on újabb 1 percig, majd 72 °C-on 3 percig.
Az amplifikálási reakció termékét Sacl-Nsil-enzimekkel (Boehringer Mannheim GmbH) elhidrolizáltuk a gyár- 15 tó cég által ajánlott körülmények között, a reakcióelegyet ezután 1%-os agarózgélben elválasztottuk, majd a terméket mintegy 1,0 kb méretű fragmensként a Genec/ean-eljárás (Geneclean kit BI0101 P. O. Box 2284 La
Jolla, Kalifornia, USA, 92038-2284) alkalmazásával agarózgélből izoláltuk a gyártó cég útmutatásai szerint.
További felhasználásig a fragmenst -20 °C-on tároltuk.
B) A mar-lokusz amplifikálása
Az Escherichia coli mar-lokuszt PCR-reakcióval amplifikáltuk. Az amplifikált termékek izolálására szolgáló eljárás ugyanaz, mint amit az 1. példa A) részében leírtunk. Templát-DNS-ként az Escherichia coli W3110 (ATCC 27 325) kromoszomális DNS-ét használtuk. A 100-1-1-plazmid (DSM 11 545) szintén alkalmazható templát-DNS-ként. A sejteket lizáltattuk, belőlük kromoszomális DNS-t tisztítottunk, Ausubel és munkatársai által leírt előirat szerint [Ausubel és munkatársai, „Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-lnterscience” 2,4.1-2,4.2 (1987)]. Az alábbi láncindítókat alkalmaztuk a mar-lokusz amplifikálásakor:
mar-fw: (a szekvencialistában a 7. azonosító számon megadott szekvencia)
5'-TTT GGC GCG CCG ATC AGC GGC GGC GCA ACC ATC AG-3'
Ascl mar-rev: (a szekvencialistában a 8. azonosító számon megadott szekvencia)
5'-GCC TTA ATT AAG ATC GAC ACT CAG GCT GTA CTG GCG AC-3' Paci
A mar-lokusz amplifikálásakor egy, körülbelül 3 kb méretű fragmenst kaptunk, amelyet az 1. példa A) ré- 30 szében leírt módon tisztítottunk. Az ezt követő restrikciós emésztést az Ascl- és Paci-enzimekkel végeztük (mindkét enzimet a New England Biolabs GmbH-tól szereztük be, P. O. Box 2750, D-65820 Schwalbach/Taunus, Németország), a gyártó cég utasításai 35 szerint és a gyártó cég által mellékelt pufferek felhasználásával. Miután a fragmenst agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk, -20 °C-on tároltuk.
ORF306-fw: (a szekvencialistaban a 9. azonosító számon megadott szekvencia)
5'-GGA ATT CAT TAA TCC GGC GAC TAA CGA ATC AAC TG-3' Ásni
ORF306-rev: (a szekvencialistában a 10. azonosító számon megadott szekvencia) '-GCC TTA ATT AAC GCT ATG TAG TTT GTT Paci
Az amplifikált DNS-fragmens körülbelül 1,05 kb hosszúságú. Ezt a fragmenst a leírt módon agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk. A fragmensen Asnl(Boehringer Mannheim) és Paci-enzimekkel (New Eng- 50 land Biolabs) restrikciós emésztést hajtottunk végre, aminek eredményeképpen az enzimek eltávolítása után megkaptuk a kívánt DNS-fragmenst. Ezt a fragmenst felhasználásig -20 °C-on tároltuk.
C) Az ORF306-DNS amplifikálása
Az ORF306-ot kódoló DNS-t az 1. példa A) részében leírtakkal azonos módon amplifikáltuk PCR-eljárással. Templát-DNS-ként az E. coli W3110 (ATCC 27 325) törzsből izolált [1. példa B) rész] kromoszomális DNS-t alkalmaztuk, a 100-1-1-plazmid (DSM 11 545) szintén alkalmazható templát-DNS-ként. Az alábbi láncindítókat használtuk:
CTG GCC CCG-3
D) A GAPDH-promotert kódoló DNS-fragmens amplifikálása
A gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz génjét alkalmaztuk annak érdekében, hogy az ORF306 hatékony transzkripcióját érjük el. Ezt a DNS-fragmenst a fentiekhez hasonlóan állítottuk elő PCR alkalmazásával. Ebben az esetben is az Escherichia coli W3110 (ATCC 27 325) kromoszomális DNS-ét alkalmaztuk templát-DNS-ként. Ugyanerre a célra a 100-1-1-plazmid is felhasználható. A láncindítók az alábbiak voltak:
GAPDH-fw (a szekvencialistában a 11. azonosító számon megadott szekvencia)
5'-GTC GAC GCG TGA GGC GAG TCA GTC GCG TAA TGC-3' Miül
HU 224 343 Β1
GAPDH-rev: (a szekvencialistában a 12. azonosító számon megadott szekvencia)
5'-GAC CTT AAT TAA GAT CTC ATA TGT TCC ACC AGC TAT TTG TTA G-3' Paci Ndel
A kapott, körülbelül 0,3 kb méretű DNS-fragmenst agaróz-gélelektroforézissel izoláltuk, és az 1. példa A) részében leírt módon tisztítottuk. Az Miül- és a Pacienzimekkel végzett restrikciós emésztés a kívánt DNS-fragmenst eredményezte. Miután a restrikciós enzimeket eltávolítottuk, a DNS-t -20 °C-on tároltuk.
2. példa
A találmány szerinti plazmidok létrehozása
A pACYC184 plazmidot alkalmaztuk kiindulási plazmidként a találmány szerinti plazmidok megalkotásakor. Ezt a plazmidot a DE 19539952 számú német szabadalmi bejelentésben ismertetett módon módosítottuk, majd a módosított plazmidot pACYC184-LH néven letétbe helyeztük a braunschweigi Német Mikroorganizmusgyűjteménynél (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen in Braunschweig) a DSM 10 172 hozzáférési számon.
A 2. ábra a pACYC184-LH-plazmid restrikciós és funkcionális térképét mutatja be. A pACYCI 84LH-plazmid tartalmaz egy polilinkert is, amelyben az alábbi restrikciós helyek találhatók: Notl - Ncol - Sacl - Nsil - Miül - Paci —Notl.
Az 1. példa szerint PCR-rel és az azt követő restrikciós emésztéssel előállított DNS-fragmenseket ebbe a linkerrégióba inszertáltuk.
A) A pACYCI84/cysEIV és a pACYCI84/cysEX kontrollplazmidok létrehozása A pACYCI 84/cysEIV és a pACYCI 84/cysEX plazmidokat a DE 19539952 számú német szabadalmi bejelentés 3. példájában leírt módon állítottuk elő, azonban az előállítási eljárást az alábbiakban röviden összefoglaljuk.
Megközelítőleg 1 pg pACYCI84-LH-plazmidot (DMS 10172) emésztettünk Sacl- és Nsil-restrikciós enzimekkel a gyártó cég (Boehringer Mannheim) útmutatásai alapján. Az emésztett DNS-t azután agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk az enzimek eltávolítása céljából, amint azt fent leírtuk. Az 1. példa A) részében leírt módon kapott DNS-fragmenseket, amelyek a megfelelő cysE-allélokat kódolták, ekvimoláris arányban összekevertük a Sacl- és Nsil-enzimekkel emésztett pACYCI 84-LH-plazmiddal. Az elegyhez ezután 1 μΙ T4-DNS-ligázt és 2 μΙ 10-szeres töménységű ligázpuffert (mindkettőt a Boehringer Mannheim cégtől szereztük be) adtunk, amit 20 μΙ-re egészítettünk ki steril, kétszer desztillált vízzel. A keveréket 4 °C-on inkubáltuk éjszaka, majd Escherichia coli W3110 (ATCC 27 325) sejtek transzformálására használtuk fel. Az alább leírt transzformálási eljárást alkalmaztuk minden, a példákban ismertetett transzformálás esetében.
Az E. coli W3110-sejteket elektroporációval transzformáltuk. Ennek érdekében 500 ml LB-tápközeget (10 g tripton, 5 g élesztőkivonat és 5 g NaCI) beoltottunk ugyanezen tápközegben egy éjszakán át tenyésztett („overnight”) tenyészettel, abból az össztérfogat
1%-át adva a tápközeghez. Miután a sejteket egy, körmozgást végző rázógépben, 37 °C-on - 600 nm-en mérve - 0,5-0,6 optikai sűrűség értékig növesztettük, 4 °C-on végzett centrifugálással összegyűjtöttük őket egy steril edénybe. Minden ezt követő lépést azután jégen és steril körülményeket fenntartva végeztünk. A leülepedett sejteket kétszer mostuk 500 ml jéghideg, steril, kétszer desztillált vízzel, majd végül 30 ml 10 t%-os steril glicerinnel. Újabb centrifugálás után a leülepedett sejteket 500 μ110 t%-os glicerinben felszuszpendáltuk, és 200 μΙ-es adagokban -80 °C-on tároltuk. A transzformáláshoz a sejteket jégen kiolvasztottuk, majd 10-100 ng DNS-t adtunk hozzájuk, és a keveréket egy steril elektroporációs küvettába (BioRad) vittük át. A küvettát ezután egy Gene Pulser készülékbe (BioRad) helyeztük, majd 2500 V-tal, párhuzamosan 200 ohm ellenállást és 25 pF kapacitást alkalmazva elvégeztük az elektroporációt. A sejteket ezután 1 ml SOC-tápközegben (kazein-pepton 20,0 g/l, élesztőkivonat 5,0 g/l, NaCI 0,58 g/l, KCI 0,19 g/l, MgCI2 2,03 g/l, MgSO4 2,46 g/l, glükóz 3,60 g/l, pH=7,0), majd 37 °C-on egy órán keresztül rázattuk. Ezután a sejteket megfelelő módon hígítottuk és LB-agar táptalajt (10 g/l tripton, 5 g/l élesztőkivonat, 5 g/l NaCI, 15 g/l agar, pH=7,2) lemezeken szélesztettük. Ezután a lemezeket 37 °C-on inkubáltuk éjszaka, vagy amíg az egyes telepek láthatókká nem váltak.
A kívánt transzformánsokat restrikciós analízissel azonosítottuk, miután a plazmidokat QIAprep Spin plazmidreagens-készlettel (Qiagen GmbH, Max-Volmerstrasse 4, D-40724 Hilden, Németország) izoláltuk. A 3. példában ezeket a plazmidokat alkalmaztuk kontrollként a fermentáció során.
A pACYC184/cysEIV és a pACYCI 84/cysEX plazmidokat a 3. ábrán mutatjuk be.
B) A pACYCI84/cysEIV-mar és a pACYCI84/cysEX-mar plazmidok létrehozása
Mindegyik esetben a 2. példa A) része szerint előállított pACYCI 84/cysEIV és pACYCI 84/cysEX plazmidok 1 pg-ját emésztettük meg rendre Miül (Boehringer Mannheim) és pACI (New England Biolabs) restrikciós enzimekkel a gyártó cégek útmutatásai szerint. Ezután a restrikciós emésztés után a DNS-t agaróz-gélelektroforézissel izoláltuk, és az 1. példa A) részében leírt módon tisztítottuk. Az Miül- és Paci-enzimekkel megemésztett pACYCI 84/cysEIV, illetve a pACYC184/cysEX vektorok körülbelül 20 ng-ját minden egyes esetben összekevertünk 200 ng, az 1. példa A) része szerint előállított DNS-fragmenssel, 1 pl T4-DNS-ligázzal (Boehringer Mannheim) és 2 pl 10-szeres töménységű ligázpufferrel (Boehringer Mannheim), valamint steril, kétszer desztillált víz azon térfogatával, amely a reakcióelegy 20 μΙ-re való kiegészítéséhez szükséges. Miután a két DNS-elegyet 4 °C-on inkubáltuk egy éjszakán át, Escherichia coliW3110- (ATCC 27 325) sejteket transzformáltunk velük. Miután a plazmidokat a QIAprep Spin
HU 224 343 Β1 plazmidreagens-készlettel (Qiagen GmbH) izoláltuk és restrikciós analízisnek vetettük alá, a megfelelő transzformánsokat izoláltuk és a fermentáció során alkalmaztuk a 3. példában leírt módon. A 4. ábra a pACYC184/cysEIV-mar és pACYCI 84/cysEX-mar plazmidok restrikciós és funkcionális térképeit mutatja be.
C) A pACYCI 84/cysEIV-GAPDH és pACYC184/cysEX-GAPDH plazmidok létrehozása
A pACYC184/cysEIV és pACYC184/cysEX plazmidokat, amelyeket a 2. példa A) részében leírtak szerint alkottunk meg, Miül (Boehringer Mannheim) és Paci (Biolabs) restrikciós enzimekkel emésztettük a gyártó cégek útmutatásai szerint.
Miután az így kezelt plazmidokat tisztítottuk, minden esetben két ligálást indítottunk el [a 2. példa B) részében leírt módon], az 1. példa D) részében leírt módon előállított DNS-fragmenst alkalmazva.
°C-os inkubálás mellett a ligálóelegyeket E. coli W3110-sejtekbe transzformáltuk. A megfelelő transzformánsokat a plazmid-DNS izolálása után a megfelelő restrikciós enzimekkel analízist végezve azonosítottuk.
A pACYCI 84/cysEIV-GAPDH és pACYCI 84/cysEX-GAPDH plazmidokat használtuk fel kiindulási anyagként a pACYCI 84/cysEIV-GAPDH-ORF306 és pACYCI 84/cysEX-GAPDHORF306 plazmidok megalkotásához, amint azt az alábbi D) részben ismertetjük.
D) A pACYCI84/cysEIV-GAPDH-ORF306 és pACYC184/cysEXGAPDH-ORF306 plazmidok megalkotása
A C) részben leírt módon előállított plazmidokat Ndel- (Boehringer Mannheim) és Paci-enzimekkel (New England Biolabs) emésztettük a gyártó cégek útmutatásai szerint. Miután a plazmid-DNS-t megtisztítottuk, az 1. példa C) része szerint előállított, majd Asnlés Paci-enzimekkel megemésztett ORF306-ot tartalmazó DNS-fragmensből és a tisztított plazmid-DNS-ekből kiindulva két ligálási reakciót indítottunk el.
A DNS-elegyeket egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk, majd E. coli W3110-sejtekbe transzformáltuk mindkét esetben. A transzformált baktériumokat LB-táptalajt tartalmazó lemezeken szélesztettük. Amint megjelentek a különálló telepek, megvizsgáltuk, hogy megfelelőek-e, vagyis plazmid-DNS-t tisztítottunk belőlük, amit restrikciós emésztésnek vetettünk alá.
Az 5. ábra a pACYCI 84/cysEIV-GAPDHORF306 és pACYCI84/cysEX-GAPDH-ORF306 plazmidok restrikciós és funkcionális térképét mutatja be.
3. példa
A találmány szerinti konstrukciók és az ismert konstrukciók fermentáció utáni hozamának összehasonlítása
Az összehasonlított plazmidokat minden esetben az E. coli W3110-sejtek hordozták, és ezen sejtek fermentációja után végeztük el az összehasonlítást. Ez garantálja tehát azt, hogy a kitermelésekben minden esetben megfigyelt növekedés kizárólag a gének új alkalmazásának eredménye.
ml 15 mg/l tetraciklint tartalmazó LB-tápközeget oltottunk be a megfelelő E. coli konstrukcióval egy
100 ml-es Erlenmeyer-lombikban. Miután a tenyészeteket 7 órán keresztül rázattuk egy rázógépen (150 ford./perc, 30 °C), a megfelelő előzetes tenyészeteket 100 ml SM1-tápközegbe vittük át (12 g/l K2HPO4, 3 g/l KH2PO4, 5 g/l (NH4)2SO4, 0,3 g/l MgSO4*7 H2O, 0,015 g/l CaCI2x2 H2O, 0,002 g/l FeSO4x7 H2O, 1 g/l Na3-citrátx2 H2O, 0,1 g/l NaCI, 1 ml/l nyomelemoldat, amely a következőket tartalmazta: 0,15 g/l Na2MoO4x2 H2O, 2,5 g/l H3BO3, 0,7 g/l CoCI2x6 H2O, 0,25 g/l CuSO4x5 H2O, 1,6 g/l MnCI2x4 H2O, 0,3 g/l ZnSO4x7 H2O), amelyet előzőleg 5 g/l glükózzal, 5 mg/l B1-vitaminnal és 15 mg/l tetraciklinnel egészítettünk ki. A tenyészeteket 17 órán keresztül rázattuk egy literes Erlenmeyer-lombikokban 150 ford./perccel, 30 °C-on. Ennyi inkubálás után az optimális sűrűség 600 nm-en mérve (OD600) 3 és 5 között volt.
A fermentációt BIOSTAT M (Braun-Melsungen) fermentorokban végeztük. Az alkalmazott tenyésztőedény össztérfogata 2 liter volt. A fermentációs tápközeg 15 g/l glükózt, 10 g/l triptont (Difco), 5 g/l élesztőkivonatot (Difco), 5 g/l (NH4)2SO4-ot, 1,5 g/l KH2PO4-ot, 0,5 g/l NaCI-ot, 0,3 g/l MgSO4x7 H2O-ot, 0,015 g/l CaCI2x2 H2O-ot, 0,075 g/l FeSO4x7 H2O-ot, 1 g/l Na3-citrátx2 H2O-ot és 1 ml nyomelemoldatot (lásd fent) tartalmazott, továbbá 0,05 g/l B1-vitamint és 15 mg/l tetraciklint. A pH-t a fermentorban kezdetben 7,0-re állítottuk be 25%-os NH4OH-oldat bepumpálásával. A fermentáció során a pH-t 7,0 értéken tartottuk 25%-os NH4OH-oldattal automata korrekciót végezve. Beoltásképpen 100 ml előzetesen előállított tenyészetet pumpáltunk be a tenyésztőedénybe. A kiindulási térfogat körülbelül 1 liter volt. A tenyészeteket kezdetben 200 ford./perccel kevertettük és 1,5 vvm sűrített levegővel öblítettük át, amelyet előzőleg steril szűrőn átáramoltatva sterilizáltunk. Az atmoszferikus oxigéntelítettséget a fermentáció során 50%-ra állítottuk be. Ezt a keverési sebesség automata beállításával szabályoztuk. A fermentációt 30 °C-on végeztük. 2 órával a fermentáció kezdete után nátrium-tioszulfátx5 H2O 30%-os steril törzsoldatát tápláltuk be 3 ml/órás sebességgel a fermentorba. Amint a tenyészet elérte az OD600=10 értéket, glükóz 56%-os steril törzsoldatát adagoltuk a tenyészethez körülbelül 8-14 ml/órás sebességgel. A glükóztartalmat enzimatikusan határoztuk meg egy, az YSI-cégtől beszerzett glükózanalizáló készülékkel. A fermentáció során a glükóz koncentrációját 10 g/l és 20 g/l közé állítottuk be folyamatos betáplálással. A cisztein teljes mennyiségét a tápközegben kolorimetriásan határoztuk meg Gaitonde szerint [Gaitonde M. K„ Biochem J. 104, 627-633 (1967)] a minta sejtmentes felülúszójából. Ebben az összefüggésben meg kell jegyeznünk, hogy az oldatban maradó cisztein a fermentáció során főleg tiazolidinszármazék formájában volt jelen, de mindazonáltal a vizsgálattal ezt a ciszteinmennyiséget is megmértük. Amennyiben a keton vagy az aldehid (ebben az esetben piroszőlősav) már nincs jelen elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a cisztein a tiazolidinszármazékká alakuljon át, szabad cisztein keletkezik, amit ezzel a mérési eljárással szintén ugyanúgy megmérünk. Amennyiben sza9
HU 224 343 Β1 bad L-cisztein keletkezik, az lassan L-cisztinné oxidálódik a fermentáció során a bejuttatott légköri oxigén hatására. A cisztin csupán gyengén oldódik vizes közegben pH 7,0-en, nagyobb mennyiségében fehér csapadékként kicsapódik. Amennyiben oldhatatlan cisztin- 5 csapadék keletkezett, egy kivett mintából centrifugálás és a felülúszó eltávolítása után a csapadékot feloldottuk féltömény sósavban, és redukáló körülmények között (DDT) a fent leírt vizsgálathoz hasonló módon megmértük. 10
Ilyen körülmények között az 1. és a 2. táblázatban bemutatott kitermeléseket 24 órás és 48 órás fermentációs idő után kaptuk meg. A táblázatban közölt adatok világosan bizonyítják, hogy a találmány szerinti megoldásban alkalmazott gének - azaz az E. coli mar-lokusz, és előnyösen az ORF306-ot kódoló szegmens, jelentős mértékben növelik a ciszteinkitermelést és/vagy a tiazolidinszármazékok kitermelését (összes cisztein). A keletkezett ciszteincsapadékok mennyiségét külön tüntettük fel a táblázatokban.
1. táblázat
A cysEIV-allél alkalmazásával termeltetett összes ciszteinkitermelés
| Az összes cisztein ciszteinkitermelés (g/l) az alábbi plazmidkonstrukciókat alkalmazva | |||
| Fermentációs idő | pACYC184/cysEIV | pACYCI 84/cysEIV-mar | pACYCI 84/cysEIVGAPDH-ORF306 |
| 24 óra | 1 | 3,8 | 3,8 |
| 48 óra | 1,6 | 5 | 3,2+6,3* |
* A lecentrifugált csapadékként jelentkező ciszteinmennyiség g/l-ben
2. táblázat
A cysEx-allél alkalmazásával termeltetett összes ciszteinkitermelés
| Az összes cisztein ciszteinkitermelés (g/l) az alábbi plazmidkonstrukciókat alkalmazva | |||
| Fermentációs idő | pACYCI 84/cysEX | pACYCI 84/cysEX-mar | pACYC184/cysEX- GAPDH-ORF306 |
| 24 óra | 4,9 | 5,9 | 12,8 |
| 48 óra | 6,8 | 11,4 | 7,2+12,0* |
* A lecentrifugált csapadékként jelentkező ciszteinmennyiség g/l-ben
4. példa
A 2-metil-tialozidin-2,4-dikarbonsav keletkezésének igazolása
A pACYCI 84/cysEX-GAPDH-ORF306 plazmid és 40 a plazmidot hordozó E. coli W3110-sejtek által alkotott konstrukciót a 3. példában leírt módon tenyésztettük, annak igazolása érdekében, hogy a 3. példában leírt fermentáció főtermékeként 2-metil-tiazolidin-2,4-dikarbonsav keletkezik. 45 óra múlva a fermentáció során kapott felülúszót centrifugálással elkülönítettük a sejtektől. A ciszteint a leírt módon mértük meg a felülúszóban, és eredményül az összes ciszteinre 12,8 gramm értéket kaptunk. Ezután a fermentációs felülúszóhoz MgSO4-ot adtunk 50 olyan mennyiségben, hogy koncentrációja 0,3 M legyen. Miután ezt a felülúszót egy éjszakán át 4 °C-on kevertettük, fehér csapadék keletkezett. Ez a csapadék a 2-metil-tiazolidin-2,4-dikarbonsav rosszul oldódó magnéziumsója volt. 55
Miután ezt a csapadékot centrifugálással elválasztottuk, a felülúszóban megmértük a cisztein maradék mennyiségét, és eredményül csupán 2,5 g/l-t kaptunk.
A csapadékot feloldottuk féltömény sósavban, és a fent leírtakhoz hasonló módon ciszteinvizsgálatnak ve- 60 tettük alá. Ebben az esetben a cisztein koncentrációja
9,5 g/l-nek adódott. Miután a csapadékot D2O és HCI elegyében feloldottuk, 1H-NMR-rel és 13C-NMR-rel megvizsgálva referenciaanyaggal szemben [Schubert M. P„ J. Bioi. Chem. 121, 539-548 (1937)] egyértelműen megállapítottuk, hogy az anyag a 2-metil-diazolidin-2,4-dikarbonsav.
5. példa
Az L-cisztein és a 2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dikarbonsav eltérő toxicitása
Ehhez a kísérlethez 2,4-metil-tiazolidin-2,4(R)-dikarbonsavat szintetizáltunk L-ciszteinből és piroszőlősavból Schubert módszerével [Schubert Μ. P., J. Bioi. Chem. 121, 539-548 (1937)]. Az E. coli W3110-sejtek egy éjszakán át LB-tápközegben szaporított tenyészetét 20 ml SM1-tápközegben (lásd 3. példa) oltottuk be, amelyet előzőleg 10 g/l glükózzal, 10% LB-tápközeggel, 5 mg/l B1-vitaminnal és 15 mg/l tetraciklinnel egészítettünk ki, továbbá minden egyes esetben megfelelő mennyiségű L-ciszteinnel vagy 2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dikarbonsavval. 7 órán keresztül 37 °C-on inkubálva a tenyészeteket a ciszteintartalmú tenyészetekben 1 mM-os és annál nagyobb koncentrációk ese10
HU 224 343 Β1
A 3. példában leírt fermentációt úgy is elvégeztük, hogy nem tápláltunk be tioszulfátot. A pACYC184/cysEX és a pACYC184/cysEX-GAPDH-ORF306 konstrukciókat alkalmaztuk abból a célból, hogy igazoljuk az általuk tartalmazott gének, előnyösen az ORF306 hatékonyságát.
Amint a 3. táblázatban ismertetett eredmények mutatják, a találmány szerinti gének, előnyösen az ORF306, jelentős mértékben növeli az N-acetil-L-szerin kitermelését a fermentáció során.
tében megállt a növekedés, miközben a 2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dikarbonsavat 50 mM-os és annál nagyobb koncentrációban tartalmazó tenyészetekben további növekedés volt megfigyelhető. Hosszabb ideig tartó inkubálást nem tudtunk végezni a cisztein oxidációval szembeni érzékenysége miatt. Az L-cisztein tehát jelentősen toxikusabbnak bizonyult az E co//-sejtek számára, mint a 2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dikarbonsav. A 2-metil-tiazolidin-2,4(R)-dikarbonsav tehát lényegesen alkalmasabb L-cisztein fermentációs úton történő előállítására, még akkor is, ha - mint ebben az esetben is - egy kémiai lépés is szükséges az L-cisztein felszabadítása érdekében.
6. példa
Az N-acetil-L-szerin fokozott termeltetése Az N-acetil-L-szerin az O-acetil-L-szerinből keletkezik spontán átrendeződéssel. Ez az O-acetil-L-szerin az L-cisztein közvetlen prekurzora a baktériumok bioszintetikus útvonalán. Következésképpen amennyiben a kén beépülése az O-acetil-L-szerinbe vagy nem megfelelő, vagy hiányos, a fent leírt fermentációs folyamat végterméke az N-acetil-L-szerin. Amennyiben hiányzik a kénforrás, a találmány szerinti gének is ennek a fermentációs terméknek a kitermelését növelik.
3. táblázat
N-acetil-L-szerin kitermelése 24 órás fermentáció után
| Konstrukció | N-acetil-L-szerin (g/l) |
| pACYC184/cysEX | 7,6 |
| pACYC184/cysEX- GAPDH-ORF306 | 15,9 |
Amennyiben a találmány szerinti génekkel kombinálva erősebb, visszacsatolásos gátlással szemben rezisztenciát biztosító cysE-allélokat (például cysEXIV-, cysEXI- és cysEXXII-allélokat, amelyeket a DE 19539952 számú német szabadalmi bejelentés) alkalmaztunk, az N-acetil-L-szerin több mint 30 g/l-es kitermelését értük el.
SZEKVENCIALISTA
A szekvencialistában szereplő kötetlen szövegrészek (223-as kód) fordítása:
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus”
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus”
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus”
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus”
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus”
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav LEÍRÁSA: /desc=„szintetikus”
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: egyéb nukleinsav
Claims (5)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Mikroorganizmustörzs, amely alkalmas L-cisztein-, L-cisztin-, N-acetil-szerin- és/vagy tiazolidinszármazékok fermentációs úton történő előállítására, azzal 5 jellemezve, hogy cisztein-anyagcseréje olyan módon deregulált, hogy megnövekedett mennyiségű L-ciszteint termel, és a mar-lokusz legalább egy effluxgénjét fokozottan expresszálja.
- 2. Az 1. igénypont szerinti mikroorganizmustörzs, azzal jellemezve, hogy benne a cisztein-anyagcsere visszacsatolásos gátlással szemben érzéketlenné tett cisz-E-allélen keresztül deregulált, és mar-lokusz-génként a 2. vagy 3. azonosító számon megadott szekvenciája L-cisztein-termelés fokozására képes fehérjét vagy funkcionális változatát kódoló effluxgént fokozott mértékben expresszál.
- 3. Izolált, L-cisztein-termelés fokozására képes fehérje, amely a következő szekvenciát:1 MKFRGGRMSR KDGVLALLW WWGLNFVVI KVGLHNMPRL MLAGLRFMLV 51 AFPAIFFVAR PKVPLNLLLG YGLTISFAQF AFLFCAINFG MPAGLASLVL 101 QAQAFFTIML GAFTFGERLH GKQLAGIALA IFGVLVLIED SLNGQHVAML 151 GFMLTLAAAF SWACGNIFNK KIMSHSTRPA VMSLVIWSAL IPIIPFFVAS 201 LILDGSATMI HSLVTIDMTT ILSLMYLAFV ATIVGYGIWG TLLGRYETWR 251 VAPLSLLVPV VGLASAALLL DERLTGLQFL GAVLIMTGLY INVFGLRWRK301 avkvgs* (2. azonosító számon megadott szekvencia) vagy annak funkcionális változatát tartalmazza. 20
- 4. Eljárás L-cisztein, L-cisztin, N-acetil-szerin vagy ezek tiazolidinszármazékainak előállítására, azzal jellemezve, hogy 1. vagy 2. igénypont szerinti mikroorganizmustörzset alkalmazunk a fermentáció során.
- 5. A 3. igénypont szerinti fehérje alkalmazása fermentáció során intracellulárisan keletkező aminosavak vagy aminosavszármazékok fokozott termelésére expresszió útján.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19726083A DE19726083A1 (de) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9801369D0 HU9801369D0 (en) | 1998-08-28 |
| HUP9801369A2 HUP9801369A2 (hu) | 1999-05-28 |
| HUP9801369A3 HUP9801369A3 (en) | 2000-08-28 |
| HU224343B1 true HU224343B1 (hu) | 2005-08-29 |
Family
ID=7833043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9801369A HU224343B1 (hu) | 1997-06-19 | 1998-06-18 | Mikroorganizmusok és eljárások L-cisztein-, L-cisztin-, N-acetilszerin és ezek tiazolidinszármazékainak előállítására fermentáció útján |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5972663A (hu) |
| EP (1) | EP0885962B1 (hu) |
| JP (1) | JP2992010B2 (hu) |
| KR (1) | KR19990007062A (hu) |
| CN (1) | CN100347291C (hu) |
| AT (1) | ATE293165T1 (hu) |
| BR (1) | BR9803346B1 (hu) |
| CA (1) | CA2235419C (hu) |
| DE (2) | DE19726083A1 (hu) |
| DK (1) | DK0885962T3 (hu) |
| ES (1) | ES2236845T3 (hu) |
| HU (1) | HU224343B1 (hu) |
| ID (1) | ID20467A (hu) |
| PL (1) | PL195784B1 (hu) |
Families Citing this family (107)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19857690A1 (de) * | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von 2-Methyl-thiazolidin-2,4-dicarbonsäure |
| DE19949579C1 (de) * | 1999-10-14 | 2000-11-16 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein oder L-Cystein-Derivaten |
| DE10046934A1 (de) * | 2000-09-21 | 2002-04-18 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von nicht-proteinogenen L-Aminosäuren |
| DE60219969T2 (de) * | 2001-02-13 | 2008-01-17 | Ajinomoto Co., Inc. | Methode zur Production von L-Aminosäuren mittels Bakterien der Gattung Escherichia |
| DE10107002A1 (de) * | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| EP1266966B1 (en) * | 2001-06-12 | 2009-04-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium |
| US7252978B2 (en) | 2001-07-25 | 2007-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-arginine |
| DE60230823D1 (de) * | 2001-09-28 | 2009-02-26 | Ajinomoto Kk | L-cystein herstellendes Bakterium und Verfahren zur Herstellung von L-cystein |
| MXPA04004874A (es) | 2001-11-23 | 2004-09-03 | Ajinomoto Kk | Procedimiento para producir l-aminoacido utilizando escherichia. |
| RU2229513C2 (ru) * | 2001-11-23 | 2004-05-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты) |
| DE10219851B4 (de) * | 2002-05-03 | 2004-06-24 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur Herstellung von L-Serin |
| DE10232930A1 (de) * | 2002-07-19 | 2004-02-05 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren und Aminosäure-Derivaten der Phosphoglycerat-Familie |
| DE10237479A1 (de) * | 2002-08-16 | 2004-02-26 | Degussa Ag | Schwefel-haltiges Tierfuttermitteladditiv |
| US7348037B2 (en) * | 2002-08-16 | 2008-03-25 | Evonik Degussa Gmbh | Sulfur-containing animal-feed additives |
| JP2004166592A (ja) * | 2002-11-20 | 2004-06-17 | Ajinomoto Co Inc | メチロトローフを用いたｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP4120364B2 (ja) * | 2002-11-20 | 2008-07-16 | 味の素株式会社 | メタノール資化性菌を用いたｌ−リジンまたはｌ−アルギニンの製造法 |
| DE10305774A1 (de) * | 2003-02-06 | 2004-08-26 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Methionin |
| EP1597364B1 (fr) | 2003-02-18 | 2013-07-24 | Metabolic Explorer | Procede de preparation de microorganismes evolues permettant la creation ou la modification de voies metaboliques |
| DE10331291A1 (de) | 2003-07-10 | 2005-02-17 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene |
| RU2275425C2 (ru) * | 2003-11-03 | 2006-04-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина |
| ATE443757T1 (de) * | 2004-01-30 | 2009-10-15 | Ajinomoto Kk | L-aminosäure produzierender mikroorganismus und verfahren zur l-aminosäureproduktion |
| US20050191684A1 (en) * | 2004-02-25 | 2005-09-01 | Zimenkov Danila V. | Method for producing L-amino acids |
| JP4479283B2 (ja) | 2004-03-04 | 2010-06-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP4604537B2 (ja) * | 2004-03-31 | 2011-01-05 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP2007185184A (ja) * | 2005-12-16 | 2007-07-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2009089603A (ja) | 2006-02-02 | 2009-04-30 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたｌ−リジンの製造法 |
| JP2009118740A (ja) | 2006-03-03 | 2009-06-04 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| EP2351830B1 (en) | 2006-03-23 | 2014-04-23 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA |
| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| JP2010041920A (ja) | 2006-12-19 | 2010-02-25 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| BRPI0806790B1 (pt) | 2007-01-22 | 2017-02-14 | Ajinomoto Kk | microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido |
| DE102007007333A1 (de) | 2007-02-14 | 2008-08-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法 |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| BRPI0906795A2 (pt) | 2008-01-23 | 2015-08-18 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| EP2246420B1 (en) * | 2008-02-21 | 2014-12-31 | Ajinomoto Co., Inc. | L-cysteine-producing bacterium, and method for production of l-cysteine |
| JP5332237B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2013-11-06 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| EP2138585B1 (en) * | 2008-03-06 | 2011-02-09 | Ajinomoto Co., Inc. | An L-cysteine producing bacterium and a method for producing L-cysteine |
| WO2009135048A2 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Gradalis, Inc. | Highly pure plasmid dna preparations and processes for preparing the same |
| US20120231537A1 (en) * | 2008-04-30 | 2012-09-13 | Gradalis, Inc. | Highly Pure Plasmid DNA Preparations |
| ES2624913T3 (es) | 2008-09-08 | 2017-07-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido |
| BRPI1007069A2 (pt) | 2009-01-23 | 2015-08-25 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido. |
| EP2395096B1 (en) | 2009-02-09 | 2014-04-09 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids |
| JP5521347B2 (ja) * | 2009-02-16 | 2014-06-11 | 味の素株式会社 | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP5463528B2 (ja) * | 2009-02-25 | 2014-04-09 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| JP5359409B2 (ja) * | 2009-03-12 | 2013-12-04 | 味の素株式会社 | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| EP2460883A4 (en) | 2009-07-29 | 2013-01-16 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID |
| RU2009136544A (ru) | 2009-10-05 | 2011-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae |
| WO2011065469A1 (ja) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | 味の素株式会社 | Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法 |
| RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| JP2013074795A (ja) | 2010-02-08 | 2013-04-25 | Ajinomoto Co Inc | 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法 |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| RU2501858C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-12-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae |
| CN103119154B (zh) | 2010-09-14 | 2015-11-25 | 味之素株式会社 | 含硫氨基酸生产菌以及含硫氨基酸的制造方法 |
| KR101208267B1 (ko) | 2010-10-20 | 2012-12-04 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 설피드릴라제 변이체 |
| KR101381048B1 (ko) | 2010-10-20 | 2014-04-14 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 |
| WO2012053794A2 (en) | 2010-10-20 | 2012-04-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-phosphoserine and method of producing l-cysteine or derivatives thereof from o-phosphoserine using the same |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| JP2014087259A (ja) | 2011-02-22 | 2014-05-15 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 |
| US9234223B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-01-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-cysteine |
| BR112013023465B1 (pt) | 2011-04-01 | 2020-10-27 | Ajinomoto Co., Inc | método para produzir l-cisteína |
| JP2014131487A (ja) | 2011-04-18 | 2014-07-17 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−システインの製造法 |
| DE102011007790A1 (de) | 2011-04-20 | 2012-10-25 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur Reinigung von L-Cystein |
| DE102011075656A1 (de) * | 2011-05-11 | 2012-03-29 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin |
| DE102011078481A1 (de) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| DE102012208359A1 (de) | 2012-05-18 | 2013-11-21 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| DE102012216527A1 (de) * | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure |
| WO2014148377A1 (ja) | 2013-03-19 | 2014-09-25 | 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学 | L-システイン生産能が高められた腸内細菌科に属する細菌 |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
| KR101525663B1 (ko) | 2013-05-10 | 2015-06-04 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린의 생산방법 |
| KR101493154B1 (ko) | 2013-05-10 | 2015-02-13 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ＲｈｔＢ 단백질 변이체 및 이를 이용한 Ｏ-포스포세린의 생산방법 |
| DE102013209274A1 (de) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids |
| JP2016165225A (ja) | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| RU2013140115A (ru) | 2013-08-30 | 2015-03-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
| CN104736707B (zh) | 2013-10-21 | 2017-08-25 | 味之素株式会社 | 生产l‑氨基酸的方法 |
| RU2014105547A (ru) | 2014-02-14 | 2015-08-20 | Адзиномото Ко., Инк. | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL |
| KR101677328B1 (ko) | 2014-08-12 | 2016-11-18 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법 |
| RU2015120052A (ru) | 2015-05-28 | 2016-12-20 | Аджиномото Ко., Инк. | Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA |
| KR101694632B1 (ko) | 2015-09-11 | 2017-01-10 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 ｏ-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| DK3556847T3 (da) | 2015-12-11 | 2021-05-25 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismestamme og fremgangsmåde til antibiotikafri, fermentativ fremstilling af lavmolekylære substanser og proteiner |
| EP3420096A1 (en) | 2016-02-25 | 2019-01-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter |
| KR101825310B1 (ko) | 2016-12-29 | 2018-03-15 | 씨제이제일제당 (주) | O-포스포세린을 생산하는 에스케리키아 속 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인을 생산하는 방법 |
| JP7066977B2 (ja) | 2017-04-03 | 2022-05-16 | 味の素株式会社 | Ｌ－アミノ酸の製造法 |
| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN117603895A (zh) | 2018-12-26 | 2024-02-27 | 大象株式会社 | 生产l氨基酸的大肠杆菌突变株或谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l氨基酸的生产方法 |
| WO2020171227A1 (en) | 2019-02-22 | 2020-08-27 | Ajinomoto Co., Inc. | METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE |
| BR112021017870A2 (pt) | 2019-04-05 | 2021-12-07 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido |
| JP2022550084A (ja) | 2019-09-25 | 2022-11-30 | 味の素株式会社 | 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法 |
| CN115244183A (zh) | 2020-04-03 | 2022-10-25 | 瓦克化学股份公司 | 作为用于生物催化还原胱氨酸的酶催化氧化还原系统的核心组分的生物催化剂 |
| CA3163410A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-16 | Hye Min Park | O-phosphoserine export protein variant and method for producing o-phosphoserine, cysteine, and derivatives thereof using the same |
| US20230265473A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-08-24 | Wacker Chemie Ag | Improved cysteine-producing strains |
| KR102414743B1 (ko) | 2020-09-09 | 2022-06-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법 |
| KR20220163754A (ko) | 2021-06-03 | 2022-12-12 | 씨제이제일제당 (주) | 신규한 YhhS 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| JP2024520831A (ja) | 2021-06-11 | 2024-05-24 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 新規なＭｄｔＨ変異体及びそれを用いたＯ－ホスホセリン、システイン及びその誘導体の生産方法 |
| KR102654301B1 (ko) | 2021-06-23 | 2024-04-04 | 씨제이제일제당 주식회사 | NADH:quinone 산화환원효소의 발현이 조절된 재조합 미생물 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 |
| CN116096909A (zh) | 2021-07-05 | 2023-05-09 | 瓦克化学股份公司 | 用于将亚磺酸酶促氧化成磺酸的方法 |
| KR102688937B1 (ko) | 2021-12-31 | 2024-07-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | O-포스포세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-포스포세린 또는 l-시스테인 생산 방법 |
| WO2023165684A1 (de) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Wacker Chemie Ag | Verbesserte cystein produzierende stämme |
| WO2024125794A1 (de) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen herstellung von hypotaurin |
| WO2024125795A1 (de) | 2022-12-15 | 2024-06-20 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur isolierung von taurin aus taurin- und hypotaurin-haltigen fermentationsmedien mikrobieller fermentation |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3376341D1 (en) * | 1982-08-09 | 1988-05-26 | Ajinomoto Kk | Method for producing 2-substituted-thiazolidine-4-carboxylic acids |
| DE19539952A1 (de) * | 1995-10-26 | 1997-04-30 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur Herstellung von O-Acetylserin, L-Cystein und L-Cystein-verwandten Produkten |
| DE19548222A1 (de) * | 1995-12-22 | 1997-06-26 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern |
-
1997
- 1997-06-19 DE DE19726083A patent/DE19726083A1/de not_active Withdrawn
-
1998
- 1998-05-22 DE DE59812730T patent/DE59812730D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 AT AT98109269T patent/ATE293165T1/de active
- 1998-05-22 ES ES98109269T patent/ES2236845T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 EP EP98109269A patent/EP0885962B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 DK DK98109269T patent/DK0885962T3/da active
- 1998-06-15 ID IDP980878A patent/ID20467A/id unknown
- 1998-06-16 CA CA002235419A patent/CA2235419C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-16 US US09/097,759 patent/US5972663A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-06-17 KR KR1019980022734A patent/KR19990007062A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-06-17 BR BRPI9803346-8B1A patent/BR9803346B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-06-18 CN CNB981026176A patent/CN100347291C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-18 HU HU9801369A patent/HU224343B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-06-19 JP JP10173278A patent/JP2992010B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-06-19 PL PL326915A patent/PL195784B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2992010B2 (ja) | 1999-12-20 |
| ES2236845T3 (es) | 2005-07-16 |
| PL195784B1 (pl) | 2007-10-31 |
| JPH1156381A (ja) | 1999-03-02 |
| CA2235419A1 (en) | 1998-12-19 |
| HUP9801369A2 (hu) | 1999-05-28 |
| KR19990007062A (ko) | 1999-01-25 |
| ATE293165T1 (de) | 2005-04-15 |
| HU9801369D0 (en) | 1998-08-28 |
| DK0885962T3 (da) | 2005-05-09 |
| EP0885962A1 (de) | 1998-12-23 |
| BR9803346B1 (pt) | 2013-11-12 |
| HUP9801369A3 (en) | 2000-08-28 |
| US5972663A (en) | 1999-10-26 |
| CA2235419C (en) | 2009-06-02 |
| DE59812730D1 (de) | 2005-05-19 |
| EP0885962B1 (de) | 2005-04-13 |
| CN1203274A (zh) | 1998-12-30 |
| BR9803346A (pt) | 2000-02-08 |
| PL326915A1 (en) | 1998-12-21 |
| ID20467A (id) | 1998-12-24 |
| CN100347291C (zh) | 2007-11-07 |
| DE19726083A1 (de) | 1998-12-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU224343B1 (hu) | Mikroorganizmusok és eljárások L-cisztein-, L-cisztin-, N-acetilszerin és ezek tiazolidinszármazékainak előállítására fermentáció útján | |
| CA2386539C (en) | Method for production of l-cysteine or l-cysteine derivatives by fermentation | |
| JP4173777B2 (ja) | 微生物株、プラスミド、微生物株の製造方法及びホスホグリセレート−ファミリーのアミノ酸の製造方法 | |
| JP3329825B2 (ja) | Ｏ−アセチルセリン、ｌ−システイン及びｌ−システイン−関連生成物の製法 | |
| JP4186564B2 (ja) | Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法 | |
| FR2484448A1 (fr) | Procede pour produire de la l-arginine par fermentation | |
| AU773173B2 (en) | Process for preparing non-proteinogenic L-amino acids | |
| HU225826B1 (en) | Process for the fermentative production of o-acetyl-serin | |
| US20060234359A1 (en) | Method for the production or r-a-lipoic acid by fermentation | |
| US7195900B2 (en) | Cloning and expression of D-amino acid oxidase from arthrobacter protophormiae | |
| ITMI952432A1 (it) | Procedimento migliorato per la preparazione di d-alfa-amminoacidi | |
| MXPA98004927A (en) | Microorganisms and procedures for the fermentative obtaining of l-cysteine, l-cistine, n-acetyl-serine or derivatives of tiazolid | |
| JP3873512B2 (ja) | Ｄ−３−（２−ナフチル）アラニンの製造方法 | |
| JP3473985B2 (ja) | Ｄ−プロリンの製造法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| WO2006080409A1 (ja) | ５－置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ－カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| JPH0630572B2 (ja) | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 | |
| JPH0349555B2 (hu) | ||
| JPS59120091A (ja) | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20050706 |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: WACKER CHEMIE AG, DE Free format text: FORMER OWNER(S): CONSORTIUM FUER ELEKTROCHEMISCHE INDUSTRIE GMBH., DE |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |