ES2252593T3 - Procedimiento para la preparacion por fermentacion de aminoacidos y derivados de aminoacidos de la familia de los fosfogliceratos. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion por fermentacion de aminoacidos y derivados de aminoacidos de la familia de los fosfogliceratos.Info
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Abstract
Cepa de microorganismos, que es apropiada para la preparación por fermentación de O-acetil-L-serina, N-acetil-L-serina o L-cisteína, que contiene un alelo de cysE que codifica una O-acetil-transferasa de serina, que presenta una disminuida inhibición de la retroacción por L-cisteína, y que se puede preparar a partir de una cepa de partida, caracterizada porque presenta una expresión del gen yfiK o de un homólogo del yfiK, aumentada con respecto a la de la cepa de partida.
Description
Procedimiento para la preparación por
fermentación de aminoácidos y derivados de aminoácidos de la
familia de los fosfogliceratos.
El invento se refiere a un procedimiento para la
preparación de los aminoácidos
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina y
L-cisteina mediante fermentación.
La preparación de los veinte aminoácidos
proteinógenos naturales se realiza hoy en día predominantemente por
fermentación de microorganismos. En este contexto, se aprovecha el
hecho de que los microorganismos disponen de correspondientes vías
de biosíntesis para la síntesis de los aminoácidos naturales.
Tales vías de biosíntesis están sujetas, sin
embargo, en las cepas de tipos salvajes a un estricto control, que
garantiza que los aminoácidos se preparen solamente para el consumo
propio de la célula. Una importante premisa para procesos eficientes
de producción es, por lo tanto, el hecho de que estén disponibles
microorganismos apropiados que, al contrario que los organismos de
tipo salvaje, presenten un rendimiento de producción drásticamente
aumentado para la preparación del deseado aminoácidos.
Tales microorganismos, que producen en exceso
aminoácidos, se pueden generar por clásicos procedimientos de
mutación / selección y/o por modernas técnicas recombinantes
planificadas ("metabolic engineering" = ingeniería metabólica).
En el caso de esta última se identifican primeramente genes o
alelos, que, mediante su modificación, activación o desactivación,
dan lugar a una producción en exceso (sobreproducción). Estos genes
/ alelos se incorporan o desactivan luego mediante técnicas de
biología molecular en una cepa de microorganismos, de manera tal
que se consigue una sobreproducción óptima. Con frecuencia, sin
embargo, tan solo la combinación de varias medidas diferentes
conduce a una producción realmente eficiente.
La familia de los fosfogliceratos de aminoácidos
está definida por el hecho de que se trata de aminoácidos, que en
su biosíntesis se derivan del ácido
3-fosfoglicérico. La ruta natural del metabolismo
conduce en tal caso primeramente, pasando por los compuestos
intermedios 3-fosfohidroxipiruvato y
3-fosfo-L-serina, a
la L-serina. La L-serina se puede
convertir ulteriormente en glicina o bien, pasando por la
O-acetil-L-serina,
en L-cisteína.
Para la preparación por fermentación de
aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos, en particular
de
L-serina y L-cisteína, ya se conocen en el estado de la técnica algunos genes / alelos, cuyos empleos conducen a una sobreproducción de aminoácidos:
L-serina y L-cisteína, ya se conocen en el estado de la técnica algunos genes / alelos, cuyos empleos conducen a una sobreproducción de aminoácidos:
- -
- alelos serA tal como se describen en los documentos de patentes europeas EP0620853B1 o EP0931833A2.
- Estos alelos serA codifican 3-fosfoglicerato deshidrogenasas, que están sujetas a una disminuida inhibición de la retroacción por L-serina. Con esto, la formación de 3-hidroxipiruvato se desacopla ampliamente del nivel de serina en la célula.
- -
- alelos cysE, tal como se describen en el
- -
- documento de solicitud de patente internacional WO97/15673, o en las citas de
- -
- Nakamori S. y colaboradores, 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611, o de
- -
- Takagi H. y colaboradores, 1999, FEBS Lett. 452: 323-327,
- se incorporan en una cepa de microorganismos.
- Estos alelos cysE codifican O-acetil-transferasas de serina, que están sujetas a una disminuida inhibición de la retroacción por L-cisteína. Con esto, la formación de O-acetil-L-serina o bien de L-cisteína se desacopla ampliamente del nivel de cisteína de la célula.
- -
- genes de eflujo, tal como se describen en el documento EP0885962A1.
- El gen orf descrito codifica probablemente un sistema de eflujo, que es apropiado para dejar salir antibióticos y otras sustancias tóxicas, y que da lugar a la sobreproducción de L-cisteína, L-cistina, N-acetil-serina y/o derivados de tiazolidina
- -
- el gen cysB, tal como se describe en el documento de patente alemana DE19949579C1.
- El gen cysB codifica un regulador génico principal del metabolismo de azufre y desempeña por consiguiente un cometido decisivo en la puesta a disposición de sulfuro para la biosíntesis de cisteína.
A partir del estado de la técnica es asimismo
conocido que los procedimientos indicados pueden conducir también a
derivados de cisteina. Así, la LL-cistina puede
resultar durante la fermentación como un producto de oxidación de
L-cisteína o de ácido
2-metil-tiazolidina-2,4-dicarboxílico
como producto de condensación de L-cisteína y
piruvato. Puesto que la L-cisteína es el principal
donante de azufre de la célula, los procedimientos descritos pueden
usarse también como punto de partida para la preparación de los más
diferentes metabolitos que contienen azufre (p.ej.
L-metionina, (+)-biotina, tiamina, etc.), que se han de entender como derivados de L-cisteína en el sentido del presente invento.
L-metionina, (+)-biotina, tiamina, etc.), que se han de entender como derivados de L-cisteína en el sentido del presente invento.
Además, se describió que, en el caso de seguirse
un apropiado modo de proceder, también se pueden formar los
aminoácidos
N-acetil-L-serina
(documento EP-A1-0885962) o bien
O-acetil-L-serina
(documento de solicitud de patente alemana
DE-A-10107002) como principales
productos de fermentación. La L-serina, a su vez,
se puede obtener de acuerdo con el documento
DE-A-10219851 de una manera
relativamente sencilla a partir de caldos de fermentación que
contienen
N-acetil-L-serina.
El documento
EP-A-1016710 divulga en los Ejemplos
1 - 8 la producción de diferentes aminoácidos después de una
sobreexpresión de un plásmido, que contiene el gen yfiK, en el seno
de E. coli TG1.
NAKAMORI Y COLABORADORES: en "overproduction of
L-cysteine and L-cystine by
Escherichia coli strains with a genetically altered serine
acetyltransferase" [sobre-producción de
L-cisteína y L-cistina por cepas de
Escherichia coli con una acetiltranferasa de serina alterada
genéticamente], APPLIED AND ENVIROMENTAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON,
DC, EE.UU., tomo 64, nº 5, Mayo de 1998 (1998-05),
páginas 1607 - 1611, XPOO211563O ISSN: 0099-2240,
divulgan la preparación de L-cisteína y
L-cistina en el seno de E. coli mediante una
acetil-transferasa de serina mutada.
Es misión del presente invento poner a
disposición una cepa recombinante de microorganismos, que haga
posible una sobreproducción de
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteína. Una misión adicional es la de poner a
disposición un procedimiento de fermentación para la preparación de
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteína mediante la cepa recombinante de
microorganismos.
El problema planteado por la misión mencionada en
primer término se resuelve mediante una cepa de microorganismos,
que es apropiada para la preparación por fermentación de
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteína, que contiene un alelo cysE que codifica
que codifica una
O-acetil-transferasa de serina, que
presenta una disminuida inhibición de la retroacción por
L-cisteína, y que se puede preparar a partir de una
cepa de partida, la cual está caracterizada porque presenta una
expresión del gen yfiK o de un homólogo del yfiK, que ha sido
aumentada con respecto a la de la cepa de partida.
El gen yfiK de Escherichia coli fue
identificado dentro del marco de la secuenciación del genoma
(Blattner y colaboradores 1997, Science
277:1453-1462) como cuadro abierto de lectura, y
codifica una proteína con 195 aminoácidos. Hasta ahora no se pudo
asignar al gen yfiK ninguna función fisiológica. También una
investigación en bancos de datos para encontrar proteínas con
homologías entre secuencias (algoritmo FASTA de GCG Wisconsin
Package, Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin)
proporciona pocas conclusiones, puesto que solamente se indican
similaridades con proteínas, cuya función es asimismo desconocida.
El único punto de partida para una posible actividad del producto
del gen yfiK se puede encontrar en la cita de Aleshin y
colaboradores (Trends in Biol. Sci., 1999, 24:
133-135). Allí se postula un motivo estructural,
que debe caracterizar a una familia proteínica de proteínas de
eflujo de aminoácidos. Puesto que este débil motivo de consenso
también se presenta en la proteína YfiK, la proteína YfiK podría
constituir un sistema de eflujo para aminoácidos. Sin embargo, para
un experto en la especialidad es absolutamente imposible sacar de
esto conclusiones acerca de substratos concretos de aminoácidos de
la proteína YfiK. El hallazgo de que el producto del gen de YfiK en
el caso de la producción de aminoácidos de la familia de los
fosfogliceratos presta una contribución positiva, es sorprendente
en particular puesto que con el producto del gen de YdeD ya se
caracterizó en Escherichia coli una proteína de eflujo para
aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos (DaBler y
colaboradores Mol. Microbiol., 2000, 36: 1101-1112)
y es totalmente inesperada la existencia de un segundo sistema. De
manera interesante, no existe ninguna similaridad estructural entre
los productos de los genes yfiK e ydeD.
El gen yfiK y el producto del gen de YfiK
(proteína YfiK) son caracterizados por las secuencias SEQ ID No. 1
y respectivamente SEQ ID No. 2. Dentro del marco del presente
invento, se han de entender como homólogos del yfiK aquellos genes,
que en el caso de un análisis con el Algoritmo BESTFIT (GCG
Wisconsim Package, Genetics Computer Croup (GLG) Madison, Wisconsin)
presentan una identidad entre secuencias mayor que 30%. Se prefiere
especialmente una identidad entre secuencias mayor que 70%.
Asimismo, las proteínas con una identidad entre
secuencias mayor que 30% (algoritmo BESTFIT (GCG Wisconsim Package,
Genetics Computer Group (GLG) Madison, Wisconsin) se han de
entender como proteínas homólogas de la YfiK. Se prefiere
especialmente una identidad entre secuencias mayor que 70%.
Por consiguiente, han de entenderse como
homólogos del yfiK también todas las variantes alélicas del gen
yfiK, en particular variantes funcionales, que se derivan, por
supresión, inserción o sustitución de nucleótidos, a partir de la
secuencia representada en SEQ ID No. 1, conservándose sin embargo
la actividad enzimática del respectivo producto del gen.
Los microorganismos conformes al invento, que
presentan una expresión del producto del gen yfiK aumentada en
comparación con la de la cepa de partida, se pueden producir con
técnicas clásicas de la biología molecular.
Como cepas de partida son apropiados en principio
todos los organismos, que presentan la ruta de biosíntesis para
aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos, son accesibles a
procedimientos de recombinación y se pueden cultivar por
fermentación. Tales microorganismos pueden ser hongos, levaduras o
bacterias. De manera preferida, se trata de bacterias del grupo
filogenético de las Eubacterias. De modo especialmente preferido, se
trata de microorganismos de la familia de las enterobacteriaceas y
en particular de la especie Escherichia coli.
El número de copias del gen yfiK en un
microorganismo se puede elevar y/o mediante promotores apropiados
se puede aumentar la expresión del gen yfiK. Por una expresión
aumentada ha de entenderse en tal caso, preferiblemente, que el gen
yfiK es expresado por lo menos con una intensidad doble de la de la
cepa de partida.
La elevación del número de copias del gen yfiK en
un microorganismo se puede llevar a cabo con métodos conocidos
para un experto en la especialidad. Así, por ejemplo, el gen yfiK
se puede clonar en vectores plásmidos con un número múltiplo de
copias por célula (p.ej. pUC19, pBR322, pACYC184 para
Escherichia coli) e incorporar en el microorganismo.
Alternativamente, el gen yfiK se puede integrar múltiples veces en
el cromosoma de un microorganismo. Como procedimiento de
integración se pueden utilizar los sistemas conocidos con
bacteriófagos temperantes, plásmidos integrativos o la integración
a través de una recombinación homóloga (p.ej. Hamilton y
colaboradores, 1989, J. Bacteriol. 171:
4617-4622).
Se prefiere la elevación del número de copias por
medio de una clonación de un gen yfiK en vectores plásmidos bajo
el control de un promotor. Se prefiere especialmente la elevación
del número de copias en Escherichia coli por clonación de un
gen yfiK en un derivado pACYC tal como p.ej.
pACYC184-LH (depositado de acuerdo con el Tratado
de Budapest en la Colección Alemana para Microorganismos y Cultivos
Celulares = Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen,
Braunscheweig, el 18.8.95 bajo el número DSM 10172).
Como región de control para la expresión de un
gen yfiK codificado por un plásmido, puede servir la región
natural de promotor y de operador del gen.
La expresión aumentada de un gen yfiK se puede
efectuar sin embargo en particular también mediante otros
promotores. Correspondientes sistemas promotores, tales como por
ejemplo en Escherichia coli el promotor constitutivo GAPDH
del gen gapA o los promotores inducibles lac, tac, trc, lambda, ara
o tet, son conocidos para un experto en la especialidad (Makrides
S. C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538). Tales
construcciones artificiales se pueden utilizar de un modo de por sí
conocido en plásmidos, o cromosomalmente.
Por lo demás, una expresión aumentada se puede
conseguir mediante el recurso de que unas señales de comienzo de la
traducción, tales como p.ej. el sitio de fijación a ribosomas o el
codón de iniciación del gen, están presentes en una secuencia
optimizada en la respectiva construcción artificial, o de que a
medida del "uso de codones = codon usage" se pueden
intercambiar codones raros por codones que se presentan con mayor
frecuencia.
Las cepas de microorganismos con las mencionadas
modificaciones son formas preferidas de realización del
invento.
La clonación de un gen yfiK en vectores plásmidos
se efectúa, por ejemplo, por una amplificación específica mediante
la reacción en cadena de polimerasa (PCR) mediando empleo de
cebadores específicos, que abarcan el gen yfiK completo, y la
subsiguiente ligación con fragmentos de ADN de vectores.
Como vectores preferidos para la clonación de un
gen yfiK se utilizan plásmidos, que ya contienen promotores para
la expresión aumentada, por ejemplo el promotor constitutivo GAPDH
del gen gapA de Escherichia coli.
Además, son especialmente preferidos como
vectores los que ya contienen un gen / alelo, cuyo empleo conduce
a una sobreproducción de aminoácidos de la familia de los
fosfogliceratos, tales como por ejemplo el gen cysEX (véase el
documento W097/15673). Tales vectores hacen posible la producción
directa de cepas de microorganismos conformes al invento con una
alta sobreproducción de aminoácidos a partir de una cepa arbitraria
de microorganismos, puesto que un plásmido de este tipo también da
lugar a una disminución de la inhibición de la retroacción del
metabolismo de cisteína en un microorganismo.
El invento se refiere, por consiguiente, también
a un plásmido, que está caracterizado porque contiene un elemento
genético para la desregulación del metabolismo de cisteína, el cual
codifica una O-acetil-transferasa de
serina, que presenta una disminuida inhibición de la retroacción
por L-cisteína y contiene un gen yfiK con un
promotor.
Mediante un método habitual de transformación
(p.ej. una electroporación), los plásmidos que contienen el yfiK
se introducen en microorganismos y se seleccionan, por ejemplo
mediante la resistencia a antibióticos, en clones portadores de
plásmidos.
El invento se refiere, por consiguiente, también
a procedimientos para la producción de una cepa de microorganismos
conforme al invento, caracterizados porque en una cepa de partida se
introduce un plásmido conforme al invento.
La producción de los aminoácidos
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteína con ayuda de una cepa de microorganismos
conforme al invento, se efectúa en un fermentador de acuerdo con
procedimientos en y de por sí conocidos.
El invento se refiere por consiguiente también a
un procedimiento para la preparación de los aminoácidos
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteina, el cual está caracterizado porque se
emplea en una fermentación una cepa de microorganismos conforme al
invento, y el aminoácido producido se separa desde la tanda de
fermentación.
La cultivación de la cepa de microorganismos en
el fermentador se efectúa como un cultivo continuo, como un
cultivo discontinuo (batch) o preferiblemente como un cultivo
discontinuo y de alimentación (fed-batch). De
manera especialmente preferida, una fuente de C se añade
dosificadamente en régimen continuo durante la fermen-
tación.
tación.
Como fuente de C sirven preferiblemente azúcares,
alcoholes de azúcares o ácidos orgánicos. De manera especialmente
preferida, se emplean en el procedimiento conforme al invento, como
fuentes de C, glucosa, lactosa o gli-
cerol.
cerol.
Es preferida la adición dosificada de la fuente
de C en una forma que garantice que el contenido en cuanto a la
fuente de C en el fermentador se mantenga durante la fermentación
en un intervalo de 0,1 - 50 g/l. Es especialmente preferido un
intervalo de 0,5 - 10 g/l.
Como fuente de N se utilizan en el procedimiento
conforme al invento preferiblemente amoníaco, sales de amonio o
materiales hidrolizados de proteínas. En el caso de la utilización
de amoníaco como agente de corrección para la regulación del pH, se
añade dosificadamente de modo posterior durante la fermentación
regularmente esta fuente
de N.
de N.
Como aditivos adicionales a los medios se pueden
añadir sales de los elementos fósforo, cloro, sodio, magnesio,
nitrógeno, potasio, calcio, hierro y, en cantidades de vestigios
(es decir en unas concentraciones del orden de los pM
(micromoles)), sales de los elementos molibdeno, boro, cobalto,
manganeso, zinc y níquel.
Además, se pueden añadir al medio ácidos
orgánicos (p.ej. ácido acético, cítrico), aminoácidos (p.ej.
isoleucina) y vitaminas (p.ej. B1, B6).
Como fuentes complejas de materiales nutritivos
pueden pasar a emplearse p.ej. un extracto de levadura, un agua de
maceración de maíz, una harina de soja o un extracto de malta.
La temperatura de incubación para microorganismos
mesófilos es preferiblemente de 15 - 45ºC, de modo especialmente
preferido de 30 - 37ºC.
La fermentación se lleva a cabo preferiblemente
en unas condiciones aerobias de crecimiento. La introducción de
oxígeno en el fermentador se efectúa con aire comprimido o con
oxígeno puro.
El valor del pH del medio de fermentación está
situado durante la fermentación, de manera preferida, en el
intervalo de pH de 5,0 a 8,5, se prefiere especialmente un valor
del pH de 7,0. Si se desea la preparación conforme al invento de
O-acetil-L-serina,
el intervalo de pH especialmente preferido está situado entre 5,5 y
6,5.
Para la preparación de L-cisteína
y derivados de L-cisteína se debe alimentar durante
la fermentación una fuente de azufre. Preferiblemente, pasan a
emplearse en tales casos sulfatos o tiosulfatos.
Los microorganismos, que se fermentan de acuerdo
con el procedimiento descrito, segregan en un proceso discontinuo,
o discontinuo y de alimentación, después de una fase de crecimiento
inicial en un período de tiempo de 10 a 150 horas, los aminoácidos
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteína con alta eficiencia dentro del medio de
cultivo.
Los siguientes Ejemplos sirven para la
explicación adicional del invento.
El gen yfiK procedente de la cepa W3110 de
Escherichia coli se amplificó con ayuda de la reacción en
cadena de polimerasa. Como cebadores específicos sirvieron los
oligonucleótidos
yfiK-fw: (SEQ. ID. NO: 3)
5'-GGA ATT CAT TAA TGA TCC ATA
ACC CCA AAC CTA TC-3'
y
yfiK-rev: (SEQ. ID. NO: 4)
5'-GCC TTA ATT AAG TAG CAA GTT
ACT AAG CGG AAG-3'
El fragmento de ADN resultante se digirió con las
enzimas de restricción AsnI y PacI, se purificó con ayuda de una
electroforesis en gel de agarosa y se aisló (con el estuche de
extracción en gel Qiaquick de Qiagen, Hilden, Alemania). La
Clonación se efectuó mediante ligación con un vector
pACYC184-cysEX-GAPDH cortado
con
Ndel / PacI, que se había descrito detalladamente en el documento EP0885962A1. Este vector contiene un gen cysEX, que codifica una acetil-transferasa de serina con disminuida inhibición de la retroacción por L-cisteína y, situado en el lado 3' de ésta, el promotor constitutivo GAPDH del gen gapA. Mediante el modo de proceder indicado, el gen yfiK se colocó detrás del promotor GAPDH, de tal manera que a partir de allí se puede iniciar la transcripción. El vector resultante lleva la denominación pG13 y se muestra en la Figura 1 como dibujo de compendio. Después de la verificación de la construcción artificial, se transformó la cepa W3110 de Escherichia coli y se seleccionaron con tetraciclina correspondientes transformantes. La cepa bacteriana Escherichia coli W3110 / pGl3 se depositó en la DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) bajo el número DSM 15095 de acuerdo con el Tratado de Budapest, y se usó en los siguientes Ejemplos como cepa productora para la preparación de aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos. Como cepa comparativa para la demostración del efecto de la expresión elevada del gen yfiK se escogió la W3110 / pACYC184-cysEX, que también se describe detalladamente en el documento EP0885962A1, pero que, a diferencia de pGl3, no contiene ninguna secuencia de promotor
GAPDH de yfiK.
Ndel / PacI, que se había descrito detalladamente en el documento EP0885962A1. Este vector contiene un gen cysEX, que codifica una acetil-transferasa de serina con disminuida inhibición de la retroacción por L-cisteína y, situado en el lado 3' de ésta, el promotor constitutivo GAPDH del gen gapA. Mediante el modo de proceder indicado, el gen yfiK se colocó detrás del promotor GAPDH, de tal manera que a partir de allí se puede iniciar la transcripción. El vector resultante lleva la denominación pG13 y se muestra en la Figura 1 como dibujo de compendio. Después de la verificación de la construcción artificial, se transformó la cepa W3110 de Escherichia coli y se seleccionaron con tetraciclina correspondientes transformantes. La cepa bacteriana Escherichia coli W3110 / pGl3 se depositó en la DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig) bajo el número DSM 15095 de acuerdo con el Tratado de Budapest, y se usó en los siguientes Ejemplos como cepa productora para la preparación de aminoácidos de la familia de los fosfogliceratos. Como cepa comparativa para la demostración del efecto de la expresión elevada del gen yfiK se escogió la W3110 / pACYC184-cysEX, que también se describe detalladamente en el documento EP0885962A1, pero que, a diferencia de pGl3, no contiene ninguna secuencia de promotor
GAPDH de yfiK.
Como cultivo preliminar para la fermentación, 20
ml de un medio LB (con 10 g/l de triptona, 5 g/l de un extracto de
levadura, 10 g/l de NaCl), que adicionalmente contenía 15 mg/l de
tetraciclina, se inocularon con la cepa
W3110 / pGl3 o bien W3110 / pACYC184-cysEX, y se incubaron a 30ºC y con 150 rpm en un aparato sacudidor. Después de siete horas, toda la tanda se transfirió a 100 ml de un medio SM1 (12 g/l de K_{2}HPO_{4}; 3 g/l de KH_{2}PO_{4}; 5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 0,3 g/l de MgSO_{4} x 7 H_{2}O; 0,015 g/l de CaCl_{2} x 2 H_{2}O; 0,002 g/l de FeSO_{4} x 7 H_{2}0; 1 g/l de Na_{3}citrato x 2 H_{2}O, 0,1 g/l de NaCl; 1 ml/l de una solución de oligoelementos, que consiste en 0,15 g/l de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O; 2,5 g/l de Na_{3}BO_{3}; 0,7 g/l de CoCl_{2} x 6 H_{2}O; 0,25 g/l de CuSO_{4} x 5 H_{2}O; 1,6 g/l de MnCl_{2} x 4 H_{2}O; 0,3 g/l de ZnSO_{4} x 7 H_{2}O), que se había suplementado con 5 g/l de glucosa, 0,5 mg/l de vitamina B_{1} y 15 mg/l de tetraciclina. La incubación ulterior se efectuó a 30ºC durante 17 horas a 150 rpm.
W3110 / pGl3 o bien W3110 / pACYC184-cysEX, y se incubaron a 30ºC y con 150 rpm en un aparato sacudidor. Después de siete horas, toda la tanda se transfirió a 100 ml de un medio SM1 (12 g/l de K_{2}HPO_{4}; 3 g/l de KH_{2}PO_{4}; 5 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}; 0,3 g/l de MgSO_{4} x 7 H_{2}O; 0,015 g/l de CaCl_{2} x 2 H_{2}O; 0,002 g/l de FeSO_{4} x 7 H_{2}0; 1 g/l de Na_{3}citrato x 2 H_{2}O, 0,1 g/l de NaCl; 1 ml/l de una solución de oligoelementos, que consiste en 0,15 g/l de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O; 2,5 g/l de Na_{3}BO_{3}; 0,7 g/l de CoCl_{2} x 6 H_{2}O; 0,25 g/l de CuSO_{4} x 5 H_{2}O; 1,6 g/l de MnCl_{2} x 4 H_{2}O; 0,3 g/l de ZnSO_{4} x 7 H_{2}O), que se había suplementado con 5 g/l de glucosa, 0,5 mg/l de vitamina B_{1} y 15 mg/l de tetraciclina. La incubación ulterior se efectuó a 30ºC durante 17 horas a 150 rpm.
Como fermentador sirvió un aparato Biostat M de
la entidad Braun Biotech (Melsungen, Alemania) con un volumen
máximo de cultivo de 2 l. Con el cultivo preliminar descrito en el
Ejemplo 2 (con una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 3),
el fermentador se inoculó con 900 ml de un medio SM1, que había
sido suplementado con 15 g/1 de glucosa, 0,1 g/l de triptona, 0,05
g/l de un extracto de levadura, 0,5 mg/l de vitamina B1 y 15 mg/l
de tetraciclina. Durante la fermentación se ajustó una temperatura
de 32ºC, y el valor del pH se mantuvo constante en un valor de 6,0
mediante adición dosificada de amoníaco al 25%. El cultivo se gaseó
con aire comprimido esterilizado a 1,5 vol/vol/min y se agitó con
un número de revoluciones del agitador de 200 rpm. Después de haber
hecho descender la saturación con oxígeno a un valor de 50%, el
número de revoluciones se aumentó a través de un aparato de control
hasta llegar a un valor de 1.200 rpm, con el fin de obtener una
saturación con oxígeno de 50% (determinada con una sonda de
pO_{2}, calibrada a una saturación de 100% a 900 rpm). Tan pronto
como el contenido de glucosa en el fermentador hubo disminuido
desde inicialmente 15 g/l hasta aproximadamente
5-10 g/l, se efectuó una adición dosificada de una
solución de glucosa al 56%. La alimentación se efectuó con un
caudal (= velocidad de flujo) de 6-12 ml/h, siendo
mantenida la concentración de glucosa en el fermentador a un valor
constante entre 0,5 y 10 g/l. La determinación de la glucosa se
llevó a cabo con el aparato analizador de glucosa de la entidad YSI
(Yellow Springs, Ohio, EE.UU). La duración de la fermentación fue
de 28 horas. Después de este período de tiempo, se tomaron muestras
y las células se separaron por centrifugación desde el medio de
cultivo. Los materiales sobrenadantes de cultivo resultantes se
analizaron mediante una HPLC (cromatografía de líquido de alto
rendimiento) de fase inversa en una columna LUNA
5 \mu C18 (2) (de Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un caudal de 0,5 ml/min. Como eluyente sirvió un ácido fosfórico diluido (0,1 ml de ácido fosfórico concentrado/ 1). La Tabla 1 muestra los contenidos conseguidos de los productos principales del metabolismo en el material sobrenadante de cultivo. Éstos son la O-acetil-L-serina y la
N-acetil-L-serina, que resulta, en unas condiciones desde neutras hasta alcalinas, crecientemente por isomerización a partir de la O-acetil-L-serina.
5 \mu C18 (2) (de Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un caudal de 0,5 ml/min. Como eluyente sirvió un ácido fosfórico diluido (0,1 ml de ácido fosfórico concentrado/ 1). La Tabla 1 muestra los contenidos conseguidos de los productos principales del metabolismo en el material sobrenadante de cultivo. Éstos son la O-acetil-L-serina y la
N-acetil-L-serina, que resulta, en unas condiciones desde neutras hasta alcalinas, crecientemente por isomerización a partir de la O-acetil-L-serina.
| Cepa | Contenido de aminoácidos [g/l] | |
| O-acetil-L-serina | N-acetil-L-serina | |
| W3110/pACYC184-cysEX | 1,8 | 1,5 |
| W3110/pGl3 (cysEX-yfiK) | 7,4 | 3,0 |
Para la preparación de
N-acetil-L-serina se
procedió exactamente igual que en los Ejemplos 2 y 3. Solamente
que el valor del pH en la fermentación se ajustó al valor de 7,0.
De esta manera se favorece la isomerización de
O-acetil-L-serina
para dar
N-acetil-L-serina y
se obtiene como producto principal
N-acetil-L-serina.
El período de tiempo de fermentación fue de 48 horas.
| Cepa | Contenido de aminoácidos [g/l] |
| N-acetil-L-serina | |
| W3110/pACYC184-cysEX | 5,8 |
| W3110/pG13 (cysEX-yfiK) | 9,2 |
Para la preparación de L-cisteína
se procedió exactamente igual que en los Ejemplos 2 y 3. Solamente
que el valor del pH en la fermentación se ajustó al valor de 7,0 y
se llevó a cabo una alimentación de tiosulfato. En tal caso,
después de dos horas, se llevó a cabo una adición dosificada de una
solución de tiosulfato de Na al 30% con un caudal de 3 ml/h. El
período de tiempo de fermentación fue de 48 horas. La producción de
L-cisteína se observó colorimétricamente con el
ensayo de Gaitonde (Gaitonde, M. K. (1967), Biochem. J. 104,
627-633). En tal caso hay que tomar en
consideración que el ensayo no discrimina entre
L-cisteina y el producto de condensación de
L-cisteína y piruvato (ácido
2-metil-tiazolidina-2,4-dicarboxílico)
que se describe en el documento EP 0885962 A1. La
LL-cistina, que se forma por oxidación a partir de
L-cisteína, se detecta en el ensayo, por medio de
una reducción con ditiotreitol (DTT) en una solución diluida a un
pH de 8,0, también como L-cisteína.
| Cepa | Contenido de aminoácidos [g/l] |
| L-cisteína + derivados | |
| W3110/pACYC184-cysEX | 4,6 |
| W3110/pG13 (cysEX-yfiK) | 7,5 |
<110> Consortium fuer elektrochemische
Industrie GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la preparación por
fermentación de aminoácidos y derivados de aminoácidos de la
familia de los fosfogliceratos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> yfiK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 750
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (110)..(694)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador para PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattcatt aatgatccat aaccccaaac ctatc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer for PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccttaatta agtagcaagt tactaagcgg aag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Cepa de microorganismos, que es apropiada
para la preparación por fermentación de
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteína, que contiene un alelo de cysE que
codifica una O-acetil-transferasa de
serina, que presenta una disminuida inhibición de la retroacción
por L-cisteína, y que se puede preparar a partir de
una cepa de partida, caracterizada porque presenta una
expresión del gen yfiK o de un homólogo del yfiK, aumentada con
respecto a la de la cepa de partida.
2. Cepa de microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque se trata de un hongo,
una levadura o una bacteria, preferiblemente de la familia de las
enterobacteriaceas, de modo particularmente preferido de la especie
Escherichia coli.
3. Cepa de microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque se ha elevado el
número de copias del gen yfiK en el microorganismo, o 1 la expresión
del gen yfiK se había aumentado por empleo de apropiados promotores
o de apropiadas señales de traducción.
4. Cepa de microorganismos de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizada porque el promotor se
selecciona entre el conjunto formado por el promotor constitutivo
GAPDH del gen gapA, y los promotores inducibles lac, tac, trc,
lambda, ara y tet.
5. Cepa de microorganismos de acuerdo con una de
las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque se trata
de una cepa de Escherichia coli, en la que la expresión
aumentada del gen yfiK se debe a la elevación del número de copias
del gen yfiK en un derivado pACYC (DSM10172).
6. Plásmido, caracterizado porque
contiene un elemento genético para la desregulación del metabolismo
de cisteína, que codifica una
O-acetil-transferasa de serina, que
presenta una disminuida inhibición de la retroacción por
L-cisteína, y contiene un gen yfiK con un promotor.
L-cisteína, y contiene un gen yfiK con un promotor.
7. Procedimiento para la producción de una cepa
de microorganismos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a
5, caracterizado porque en una cepa de partida se introduce
un plásmido de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Procedimiento para la preparación de
O-acetil-L-serina,
N-acetil-L-serina o
L-cisteína, caracterizado porque se emplea
en una fermentación una cepa de microorganismos de acuerdo con una
de las reivindicaciones 1 a 5, y el aminoácido producido se separa
desde la tanda de fermentación.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, caracterizado porque el microorganismo se
cultiva en un fermentador como un cultivo continuo, como un cultivo
discontinuo (batch) o preferiblemente como un cultivo discontinuo
y de alimentación (fed-batch).
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque se añade
dosificadamente en régimen continuo una fuente de C durante la
fermentación.
11. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque como fuente de
C sirven azúcares, alcoholes de azúcares o ácidos orgánicos.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la adición
dosificada de la fuente de C se efectúa en una forma que garantiza
que el contenido en cuanto a la fuente de C en el fermentador se
mantenga durante la fermentación en un intervalo de 0,1 - 50 g/l;
se prefiere especialmente un intervalo de
0,5 - 10 g/l.
0,5 - 10 g/l.
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque como fuente de
N se utilizan amoníaco, sales de amonio o materiales hidrolizados
de proteínas.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 8 a 13, caracterizado porque la
fermentación se efectúa en unas condiciones aerobias de
crecimiento.
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