JP6301581B2 - 発酵法による目的物質の製造法 - Google Patents
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Description
微生物における糖を初めとする炭水化物の取り込み機構については研究が進んでおり、いくつかの種類に分類されることが知られており、それらのなかで特に主要な糖をリン酸化して取り込む輸送体として、ホスホエノールピルビン酸:糖リン酸転移系(以下、PTS又はフォスフォトランスフェラーゼ系ともいう)があげられる(非特許文献1)。
基質特異的なEIIは生物によって種類は異なるが、研究の進んでいる腸内細菌や、コリネ型細菌ではその主要なものについては同定されつつあり、そのうち、フラクトース特異的なEIIはFruA(PtsF)によってコードされることが知られている(非特許文献5)。
物質生産において、PTS系を改変することで生産性を向上させている例がいくつか知られている。 例えば、ptsG遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸製造法(特許文献1)やptsH,ptsI,及びptsGと同様の働きをするcrr遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸の製造法(特許文献2)が知られている。
また、グルコースの取り込み系であるPTS系を破壊し、別経路によって取り込ませることで糖の代謝経路を変化させ、目的物質の生産性を上げることができることが知られている(特許文献4)。また、フラクトースの取り込み系を破壊し、外来のフラクトキナーゼを導入することで糖の代謝経路を変化させ、生産性を上げることができることも知られている(非特許文献5)。
(1)親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該培養物中から該目的物質を採取することを特徴とする該目的物質の製造法。
(2)親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌が、親株の染色体DNA上にある該蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失したコリネ型細菌であることを特徴とする上記(1)の製造法。
(3)フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質が、FruK蛋白質およびFruA蛋白質を含む蛋白質である上記(1)または(2)の製造法。
(4)コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである上記(1)〜(3)のいずれか1つの製造法。
(5)目的物質がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である上記(1)〜(4)のいずれか1つの製造法。
(6)アミノ酸がL−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンからなる群より選ばれるアミノ酸である上記(1)〜(5)のいずれか1つの製造法。
本発明に用いられるコリネ型細菌は、親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネ型細菌であり、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌である。
親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネ型細菌は、染色体DNA上に存在する変異が入っていない野生型のフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、(a)親株に比べ、フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下したコリネ型細菌、および(b)親株に比べ、該遺伝子の転写量またはフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の生産量が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下したコリネ型細菌をあげることができる。より好ましくはFruK蛋白質またはFruA蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損したコリネ型細菌をあげることができる。
[1]配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子
[3]配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
[4]配列番号2で表されるアミノ酸配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有し、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
[5]配列番号3で表される塩基配列を有する遺伝子
[6]配列番号4で表される塩基配列を有する遺伝子
[7]配列番号3で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号2で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子、および
[8]配列番号2で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
などをあげることができる。
転写調節領域としては、染色体DNA上におけるコーディング領域の5’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるDNAをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるDNAである。プローブとして用いられるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAをあげることができ、プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAをあげることができる。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号3または4で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
目的物質を生産することができるコリネ型細菌としては、親株が当該性質を元来有している場合はその性質が強化されたコリネ型細菌、親株が当該性質を有していない場合は、当該性質を人工的に付与したコリネ型細菌をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)、コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)、コリネバクテリウム・メラセコラ(Corynebacterium melassecola)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)等をあげることができ、具体的には、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13060、Corynebacterium glutamicum ATCC13826(旧属種Brevibacterium flavum)、Corynebacterium glutamicum ATCC14020(旧属種Brevibacterium divaricatum)、Corynebacterium glutamicum ATCC13869(旧属種Brevibacterium lactofermentum)、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806、Corynebacterium callunae ATCC15991、Corynebacterium herculis ATCC13868、Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes ATCC9244等をあげることができる。
2.本発明のコリネ型細菌の製造法
本発明のコリネ型細菌は、目的物質を生産することができ、かつFruK蛋白質およびFruA蛋白質の活性(以下、FruKA活性と称することもある)を有するコリネ型細菌を親株とし、該親株のFruKA活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等の、コリネ型細菌に変異を導入することができる方法、またはアンチセンス法等のFruK蛋白質およびFruA蛋白質をコードする遺伝子の発現を抑制できる方法等を用いて、低下または喪失させることにより得ることができる。
コリネ型細菌に目的物質を生成する能力を人工的に付与する方法としては、
(a)目的物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和又は解除する方法、
(b)目的物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、
(c)目的物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、
(d)目的物質の生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化又は遮断する方法、及び
(e)野生型株に比べ、目的物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記した目的物質を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製に用いることができるコリネ型細菌としては、上記(a)〜(e)の方法を適用することができるコリネ型細菌又は上記遺伝的形質を有するコリネ型細菌であればいずれであってもよく、好ましくは上記したコリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、またはミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属するコリネ型細菌をあげることができる。
組換えDNA技術による遺伝子置換法としては、インビトロでFruK蛋白質およびFruA蛋白質をコードする遺伝子(以下、FruKA遺伝子とも称する)に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、相同組換え等により該遺伝子を親株の染色体に組み込み、さらに相同組換え等により染色体上に元来存在していたFruKA遺伝子を置換する方法をあげることができる。
FruKA遺伝子は、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のFruKA遺伝子の塩基配列情報〔例えば、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)アクセッション・ナンバーNC_006958 REGION: 2012568..2013560、NC_006958 REGION: 2013557..2015623〕に基づいて、PCR法等により取得することができる。
プラスミドベクターとしては、例えば、親株中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子sacB[Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)]を有するプラスミドを用いることができる。
該組換え体プラスミドは親株中で自律複製できないので、該組換え体プラスミドの有する抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、コリネ型細菌の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
変異を導入する塩基の数は、FruKA遺伝子の塩基の置換、欠失、または付加によって、FruKA活性を低下または喪失させることができる数であれば限定されない。変異を導入する部位は、該変異によってFruKA活性を低下または喪失させることができる部位であれば必ずしもFruKA遺伝子のコーディング領域の塩基配列中に限られず、FruKA遺伝子の転写・翻訳調節領域中であってもよいが、FruKA遺伝子のコーディング領域が好ましい。
ナンセンス変異を導入する方法としては、例えば、終止コドンを含むプライマーおよびFruKA遺伝子を用いてPCRを行い、得られたナンセンス変異が導入されたFruKA遺伝子を用いて親株の染色体上のFruKA遺伝子を置換する方法があげられる。
FruKA活性が低下または喪失した株はフラクトースを単一炭素源として含有する培地で生育が遅延または生育不能であることを利用し、変異を導入したコリネ型細菌の中から、グルコースを単一炭素源とした場合は親株と同等の生育をするが、フラクトースを単一炭素源とした培地では生育しないか、親株に比べて極めて生育が悪くなった株を取得することで、FruKA活性が低下または喪失した株を得ることができる。
上記のようにして得られる、目的物質を生産する能力を有し、かつ親株に比べFruKA活性が低下または喪失したコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取することにより、該目的物質を製造することができる。本発明で用いられるコリネ型細菌は、糖消費速度が向上したコリネ型細菌でもあり、目的物質を効率よく製造することができる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを適量含有する培地であれば合成培地または天然培地いずれも使用できる。
炭素源としては、主にグルコースを用いることができる。グルコース以外のPTS系を経由する糖も用いることができるが、FruKA活性が低下または喪失しているため、スクロース、フラクトースの使用は好ましくない。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に20〜42℃が好適であり、さらに好ましくは30℃〜40℃である。培地のpHは5〜9の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地のpHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、pH緩衝液などを用いて行う。
培養終了後の培養物からの目的物質の採取は、特別な方法が必要とされることはない。すなわち、菌体外に蓄積した目的物質は、従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を、目的物質の種類に応じて組み合わせることにより採取することができる。また、菌体内に蓄積した目的物質は、菌体を物理的または酵素的に破壊し、目的物質の種類に応じて菌体破砕液又は膜画分から採取することができる。尚、目的物質によっては、目的物質を菌体中に存在したままの状態で、微生物触媒等として利用することもできる。
アミノ酸としては、L−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンなどをあげることができ、好ましくは、L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸、微生物の代謝経路上L−アスパラギン酸、L−グルタミン酸またはピルビン酸を経由して生合成されるL−アミノ酸等をあげることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドpHSG299〔Gene, 61, 63(1987)〕をPstIで処理し、切断部位にBacillus subtilisに由来するレバンシュークラーゼ遺伝子sacBを含む2.6キロベースペア(以下、kbと略す)のDNA断片〔Mol.Microbiol., 6, 1195(1992)〕を連結し、プラスミドpESB30を得た。
(2)fruKA遺伝子破壊株造成用プラスミドの構築
斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)〕に準じてコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株の染色体DNAを調製し、該染色体DNAを鋳型とし、配列番号5で表される塩基配列からなるDNAと配列番号6で表される塩基配列からなるDNAとの組み合わせ、および配列番号7で表される塩基配列からなるDNAと配列番号8で表される塩基配列からなるDNAの組み合わせをそれぞれプライマーセットとし、PrimeStarMaxDNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)および添付のバッファーを用いて2種類のPCRを行った。該PCRにより得られた2つの約0.5kbのPCR産物をそれぞれアガロース・ゲル電気泳動し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega社製)を用いて抽出、精製した。
(3)FruKA遺伝子破壊株の造成
(2)で調製したプラスミドpDfruKAを用い、レストらの方法〔Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)〕に準じて電気穿孔法によりコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株を形質転換し、それぞれカナマイシン耐性株を選択した。カナマイシン耐性株では、それぞれの株の染色体にpDfruKAがCampbellタイプの相同組換えにより組み込まれていると推測される。このような株では、染色体上に元来存在しているFruKAをコードするDNAとpDfruKA上のfruKAが破壊された構造のDNAが染色体上に近接して存在しており、その間で2回目の相同組換えが起こりやすくなっている。
このようにして得られたコロニーをフラクトースを単一炭素源とした培地〔塩化アンモニウム4g、リン酸一カリウム1g、リン酸二カリウム3g、尿素2g、ビオチン100mg、チアミン塩酸塩5mg、ニコチン酸5mg、硫酸鉄7水和物10mg、硫酸亜鉛7水和物1mg、硫酸銅5水和物0.2mg、硫酸マンガン5水和物1mg、塩化カルシウム10mg、フラクトース、10g、硫酸マグネシウム0.4g及び15gのバクトアガー(ディフコ社製)を水1Lに含み、pH7.2に調製した培地〕に植菌し、生育が悪化もしくは生育ができないコロニーを取得し、WTΔfruKA株と命名した。
(4)FruA遺伝子破壊株の造成
FruKA遺伝子の破壊と同様の方法を利用して、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株 (以下、WT株と称す)のFruA遺伝子のみを破壊した株もコントロールとして造成した。
このようにして造成された菌株をフラクトースを単一炭素源とした培地に植菌し、生育が悪化もしくは生育ができないコロニーをWTΔfruA株と命名した。
(5)WTΔfruKA株、WTΔfruA株の評価
取得したWT株、WTΔfruA株、WTΔfruKA株を種培地(グルコース60g、コーンスティープリカー5g、硫酸アンモニウム80g、リン酸一水素カリウム12g、硫酸マグネシウム7水和物4g、硫酸鉄7水和物40mg、硫酸マンガン5水和物20mg、硫酸銅2mg、塩化ニッケル6水和物2mg、塩化コバルト6水和物2mg、塩化カルシウム2水和物200mg、七モリブデン酸六アンモニウム4水和物40mg、βアラニン40mg、ニコチン酸40mg、チアミン塩酸塩40mg、ビオチン0.4mgを水1Lに含みpH7.2に調整した培地)300mlに炭酸カルシウム6gの入った2L三角フラスコに植菌して28℃で24時間培養した。この種培養液100mlを本培養培地(グルコース60g、コーンスティープリカー5g、硫酸アンモニウム80g、リン酸一水素カリウム12g、硫酸マグネシウム7水和物4g、硫酸鉄7水和物40mg、硫酸マンガン5水和物20mg、硫酸銅2mg、塩化ニッケル6水和物2mg、塩化コバルト6水和物2mg、塩化カルシウム2水和物200mg、七モリブデン酸六アンモニウム40mg、βアラニン40mg、ニコチン酸40mg、チアミン塩酸塩40mg、ビオチン0.4mgを水1Lに含んだ培地)1150mlの入ったジャーファーメンターに植菌し、33℃で培養した。培養は、pH6.7に保たれるようにアンモニア水で調整しながら行った。培養はグルコースが消費されつくした時点で終了し、その時点での培養時間を計測した。
表1に示すとおり、野生株のFruKA遺伝子を破壊することにより糖消費向上効果が得られたことから、有用物質の製造への応用を確認するため、L−アルギニン生産菌RB2631株(WO2006/035831)のFruKA遺伝子欠損株を造成し、そのL−アルギニン生産能を調べた。
これらの株を実施例1に記載の条件と同条件でジャーファーメンターにて培養した。ただし培養温度は37℃とした。
L−アルギニンとは異なる生合成経路を持つアミノ酸であるL−リジンの生産菌、AHP−3株(FERMBP−7382)のFruKA遺伝子およびFruA遺伝子欠損株を造成し、そのL−リジン生産性を調べた。
実施例1に記載の方法と同様の手法により、AHP−3株のFruKA遺伝子欠損株であるAHP−3ΔfruKA株、及びFruA遺伝子欠損株であるAHP−3ΔfruA株を造成した。
その結果、表3に示すように、FruKA遺伝子を破壊したAHP−3ΔfruKA株において、糖消費速度、及びL−リジン生産性が高いことが示された。
本発明により、発酵法を用いて目的物質を効率よく製造することができる。
配列番号6−人工配列の説明:合成DNA
配列番号7−人工配列の説明:合成DNA
配列番号8−人工配列の説明:合成DNA
配列番号9−人工配列の説明:合成DNA
配列番号10−人工配列の説明:合成DNA
Claims (2)
- FruK蛋白質およびFruA蛋白質をコードする遺伝子のコーディング領域の塩基を欠失することによりFruK蛋白質およびFruA蛋白質の活性が喪失しており、グルコースを単一炭素源とした場合に該コーディング領域の塩基を欠失する前と同等の生育を示し、かつアミノ酸を生産することができるコリネ型細菌を、スクロースおよびフラクトースを含まず、かつグルコースを含む培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成蓄積させ、該培養物中からアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
- コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである請求項1に記載の製造法。
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