JPWO2012108493A1

JPWO2012108493A1 - 発酵法による目的物質の製造法

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Publication number: JPWO2012108493A1
Application number: JP2012556925A
Authority: JP
Inventors: 哲朗氏原; 阿部　哲也; 哲也阿部; 誠矢ケ崎
Original assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Current assignee: KYOUWA HAKKO BIO CO.,LTD
Priority date: 2011-02-09
Filing date: 2012-02-09
Publication date: 2014-07-03
Anticipated expiration: 2032-02-09
Also published as: EP2674499A1; ES2790661T3; JP2017023147A; WO2012108493A1; US9567616B2; EP2674499B1; CN103384723A; EP2674499A4; JP6301581B2; BR112013020216B1; US20130323784A1; BR112013020216A2; CN103384723B

Abstract

親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該培養物中から該目的物質を採取することにより、該目的物質を効率よく製造することができる。

Description

本発明は、親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を用いた、該目的物質の製造方法に関する。

発酵法による目的物質の製造法において、その生産性を向上させる方法の一つとして、原料である糖の取り込み能力を改変する方法をあげることができる。
微生物における糖を初めとする炭水化物の取り込み機構については研究が進んでおり、いくつかの種類に分類されることが知られており、それらのなかで特に主要な糖をリン酸化して取り込む輸送体として、ホスホエノールピルビン酸：糖リン酸転移系（以下、ＰＴＳ又はフォスフォトランスフェラーゼ系ともいう）があげられる（非特許文献１）。

ＰＴＳ系は基質に依存しない共通系ＥＩ（ｐｔｓＩによってコードされる）、ＨＰｒ（ｐｔｓＨによってコードされる）と基質特異的な構成成分ＥＩＩからなる（非特許文献２〜４）。
基質特異的なＥＩＩは生物によって種類は異なるが、研究の進んでいる腸内細菌や、コリネ型細菌ではその主要なものについては同定されつつあり、そのうち、フラクトース特異的なＥＩＩはＦｒｕＡ(ＰｔｓＦ)によってコードされることが知られている（非特許文献５）。

フラクトースのＰＴＳ系による取り込みには、フラクトースを外部から取り込んでフラクトース１リン酸に変換するＦｒｕＡのほかに、フラクトース１リン酸を解糖系の重要な中間体であるフラクトース１，６ビスリン酸に変換するＦｒｕＫ（ＰｆｋＢ）が必要であることが知られている（非特許文献６及び７）。
物質生産において、ＰＴＳ系を改変することで生産性を向上させている例がいくつか知られている。例えば、ｐｔｓＧ遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸製造法（特許文献１）やｐｔｓＨ，ｐｔｓＩ，及びｐｔｓＧと同様の働きをするｃｒｒ遺伝子を強化したエシェリヒア属細菌を用いたアミノ酸の製造法（特許文献２）が知られている。

さらに、主要な糖、すなわちグルコースなどの取り込み系であるＰＴＳ系を破壊することでペントースなどのＰＴＳ系を経由しない糖の取り込み、代謝を促進する方法が知られている（特許文献３）。
また、グルコースの取り込み系であるＰＴＳ系を破壊し、別経路によって取り込ませることで糖の代謝経路を変化させ、目的物質の生産性を上げることができることが知られている（特許文献４）。また、フラクトースの取り込み系を破壊し、外来のフラクトキナーゼを導入することで糖の代謝経路を変化させ、生産性を上げることができることも知られている（非特許文献５）。

しかしながら、特定の糖のPTS取り込み系を破壊することで、他の糖のPTS系による取り込み能力を向上させ、目的物質を効率よく製造できることは知られていなかった。また、ＰＴＳ取り込み系と取り込み後の代謝系を同時に破壊した際に、他の糖の取り込み能力が上昇するということは知られていなかった。特にグルコースは糖取り込み制御の中核を担うため、単純に取り込み系を強化しても細胞内グルコース濃度の上昇に伴って取り込み速度が低下するなどの問題があり、グルコース消費速度の向上は困難であることが予想されていた（非特許文献８）。

国際公開第０３／０４６７０国際公開第０３／０４６７４特開平５−４９４４１号公報米国特許出願公開第２００９/０１４２８４３明細書

Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５，６９９（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７，５４３（１９９３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，１４３３（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，３３，２２０（２００５）ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２４４，２５９（２００５）Ａｄｖａｎ，ＥｎｚｙｍｅＲｅｇｕｌ．４２，３４９，（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４，９６（１９９８）ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３２，８９１（２００８）

本発明は、コリネ型細菌を用いて発酵法により有用物質を生産するに際し、糖消費速度を向上させることを課題とする。

本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該培養物中から該目的物質を採取することを特徴とする該目的物質の製造法。
（２）親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌が、親株の染色体ＤＮＡ上にある該蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失したコリネ型細菌であることを特徴とする上記（１）の製造法。
（３）フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質が、ＦｒｕＫ蛋白質およびＦｒｕＡ蛋白質を含む蛋白質である上記（１）または（２）の製造法。
（４）コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである上記（１）〜（３）のいずれか１つの製造法。
（５）目的物質がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である上記（１）〜（４）のいずれか１つの製造法。
（６）アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンからなる群より選ばれるアミノ酸である上記（１）〜（５）のいずれか１つの製造法。

本発明により、発酵法を用いて目的物質を効率よく製造することができる。

１．本発明に用いられるコリネ型細菌
本発明に用いられるコリネ型細菌は、親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネ型細菌であり、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌である。
親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネ型細菌は、染色体ＤＮＡ上に存在する変異が入っていない野生型のフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下したコリネ型細菌、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子の転写量またはフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下したコリネ型細菌をあげることができる。より好ましくはＦｒｕＫ蛋白質またはＦｒｕＡ蛋白質をコードする遺伝子の一部または全部が欠損したコリネ型細菌をあげることができる。

ＦｒｕＡ蛋白質をコードする遺伝子としては、フラクトースを取り込み、フラクトース１リン酸への反応を司るＦｒｕＡ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であればいずれでもよく、ＦｒｕＫ蛋白質をコードする遺伝子としては、フラクトース１リン酸からフラクトース１，６ビスリン酸への反応を司るＦｒｕＫ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の遺伝子、
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
［５］配列番号３で表される塩基配列を有する遺伝子
［６］配列番号４で表される塩基配列を有する遺伝子
［７］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子、および
［８］配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と供にフラクトース取り込み活性を示す蛋白質をコードする遺伝子
などをあげることができる。

本明細書において遺伝子とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域およびプロモーター領域などを含んでもよいＤＮＡである。
転写調節領域としては、染色体ＤＮＡ上におけるコーディング領域の５’末端より上流側100塩基、好ましくは50塩基からなるＤＮＡをあげることができ、プロモーター領域としては、-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。

フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入は、該蛋白質の活性を親株より低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、プロモーターおよび転写調節領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは全部の領域の欠失、コーディング領域は、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上、最も好ましくはコーディング領域全部の欠失をあげることができる。

塩基の置換としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる[An Introduction to Genetic Analysis 7th edition, W.H.Freeman (2000)]。

塩基の付加としては、コーディング領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のＤＮＡ断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの挿入をあげることができる。

アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] やFASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990) ］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。

フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が親株より低下、または喪失したコリネ型細菌であることは、例えば、フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質をコードする遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、またはフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較することにより確認することができる。

また、フラクトースを単一炭素源として含有する培地で培養したとき、親株に比べて生育が悪いか、生育しないことをもって、フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が親株より低下、または喪失したコリネ型細菌であることを確認することができる。
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。

また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うキットをあげることができる。

上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。

上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号３または４で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡをあげることができる。

目的物質を生産することができるとは、本発明に用いるコリネ型細菌を培地に培養したときに、目的物質を細胞または培地から回収できる程度に生産する能力をいう。
目的物質を生産することができるコリネ型細菌としては、親株が当該性質を元来有している場合はその性質が強化されたコリネ型細菌、親株が当該性質を有していない場合は、当該性質を人工的に付与したコリネ型細菌をあげることができる。

本発明で用いられるコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、またはミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属するコリネ型細菌をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）、コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）、コリネバクテリウム・メラセコラ（Corynebacterium melassecola）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）等をあげることができ、具体的には、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13060、Corynebacterium glutamicum ATCC13826（旧属種Brevibacterium flavum）、Corynebacterium glutamicum ATCC14020（旧属種Brevibacterium divaricatum）、Corynebacterium glutamicum ATCC13869（旧属種Brevibacterium lactofermentum）、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806、Corynebacterium callunae ATCC15991、Corynebacterium herculis ATCC13868、Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes ATCC9244等をあげることができる。

ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）、ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）等をあげることができ、具体的には、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium roseum ATCC13825、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240等をあげることができる。

ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）等をあげることができ、具体的には、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。
２．本発明のコリネ型細菌の製造法
本発明のコリネ型細菌は、目的物質を生産することができ、かつＦｒｕＫ蛋白質およびＦｒｕＡ蛋白質の活性（以下、ＦｒｕＫＡ活性と称することもある）を有するコリネ型細菌を親株とし、該親株のＦｒｕＫＡ活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術等による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等の、コリネ型細菌に変異を導入することができる方法、またはアンチセンス法等のＦｒｕＫ蛋白質およびＦｒｕＡ蛋白質をコードする遺伝子の発現を抑制できる方法等を用いて、低下または喪失させることにより得ることができる。

親株は、目的物質を生産する能力を有しており、かつＦｒｕＫＡ活性を有するコリネ型細菌であれば、野生株であってもよいし、該野生株から人工的に育種された育種株であってもよい。
コリネ型細菌に目的物質を生成する能力を人工的に付与する方法としては、
（ａ）目的物質の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）目的物質の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）目的物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）目的物質の生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）野生型株に比べ、目的物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。

上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、又は組み合わせた方法による目的物質、特に目的物質がアミノ酸である場合、当該アミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 79, 1-35 (2003)、Agric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem.,39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092、特表2003-511086およびWO2006/001380など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生産する能力を有するコリネ型細菌を調製することができる。

上記方法によって調製することができるＬ−アルギニンを生産する能力を有するコリネ型細菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカム RB2631（WO2006/035831）など、Ｌ−リジンを生産する能力を有するコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム AHP-3（FERM BP-7382）などをあげることができる。
上記した目的物質を生産する能力を有するコリネ型細菌の調製に用いることができるコリネ型細菌としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法を適用することができるコリネ型細菌又は上記遺伝的形質を有するコリネ型細菌であればいずれであってもよく、好ましくは上記したコリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、またはミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属するコリネ型細菌をあげることができる。

突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、インビトロでＦｒｕＫ蛋白質およびＦｒｕＡ蛋白質をコードする遺伝子（以下、ＦｒｕＫＡ遺伝子とも称する）に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、相同組換え等により該遺伝子を親株の染色体に組み込み、さらに相同組換え等により染色体上に元来存在していたＦｒｕＫＡ遺伝子を置換する方法をあげることができる。

ＦｒｕＫＡ遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法としては、例えばMolecular cloning:a laboratory manual,3^rded., Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)〔以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す〕、Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley& Sons(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431(1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)等に記載されている部位特異的変異導入法に準ずる方法をあげることができる。

組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換は、J.Bacteriol., 182, 6884(2000)等に記載の方法に従って、ＦｒｕＫＡ遺伝子に変異を導入することにより行うことができる。
ＦｒｕＫＡ遺伝子は、公知のコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＦｒｕＫＡ遺伝子の塩基配列情報〔例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）アクセッション・ナンバーNC_006958 REGION: 2012568..2013560、NC_006958 REGION: 2013557..2015623〕に基づいて、ＰＣＲ法等により取得することができる。

該変異を導入されたＦｒｕＫＡ遺伝子（以下、変異体遺伝子と称す）を適当なプラスミドベクター等に挿入することにより、組換え体プラスミドを作製する。
プラスミドベクターとしては、例えば、親株中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢ［Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)］を有するプラスミドを用いることができる。

変異体ＤＮＡを有する組換え体プラスミドを親株へ導入する方法としては、コリネ型細菌へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法［Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)］やプロトプラスト法［J. Bacteriol., 159, 306(1984)］等をあげることができる。
該組換え体プラスミドは親株中で自律複製できないので、該組換え体プラスミドの有する抗生物質耐性マーカーに応じた抗生物質に耐性を示す株を取得することにより、該組換え体プラスミドが染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。

さらに、変異体遺伝子と共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼが自殺基質を生産することを利用した選択法［J. Bacteriol., 174, 5462(1992)］によって、親株の染色体上のＦｒｕＫＡ遺伝子が変異体遺伝子に置換された株を取得することができる。
以上の方法で、親株の染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、コリネ型細菌の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。

親株の染色体上のＦｒｕＫＡ遺伝子に置換、欠失、または付加を導入する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができ、例えば、相田浩ら編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法等をあげることができる。
変異を導入する塩基の数は、ＦｒｕＫＡ遺伝子の塩基の置換、欠失、または付加によって、ＦｒｕＫＡ活性を低下または喪失させることができる数であれば限定されない。変異を導入する部位は、該変異によってＦｒｕＫＡ活性を低下または喪失させることができる部位であれば必ずしもＦｒｕＫＡ遺伝子のコーディング領域の塩基配列中に限られず、ＦｒｕＫＡ遺伝子の転写・翻訳調節領域中であってもよいが、ＦｒｕＫＡ遺伝子のコーディング領域が好ましい。

塩基置換を導入してＦｒｕＫＡ活性を低下または喪失させる方法としては、例えばナンセンス変異の導入による方法があげられる。
ナンセンス変異を導入する方法としては、例えば、終止コドンを含むプライマーおよびＦｒｕＫＡ遺伝子を用いてＰＣＲを行い、得られたナンセンス変異が導入されたＦｒｕＫＡ遺伝子を用いて親株の染色体上のＦｒｕＫＡ遺伝子を置換する方法があげられる。

塩基配列の欠失を導入することによってＦｒｕＫＡ活性を低下または喪失させる方法としては、例えば、ＦｒｕＫおよびＦｒｕＡ遺伝子をそれぞれ制限酵素等で切断し、適当な数の塩基配列を削除した後に再結合させて得られる変異ＦｒｕＫＡ遺伝子を染色体に組み込む方法等をあげることができる。
ＦｒｕＫＡ活性が低下または喪失した株はフラクトースを単一炭素源として含有する培地で生育が遅延または生育不能であることを利用し、変異を導入したコリネ型細菌の中から、グルコースを単一炭素源とした場合は親株と同等の生育をするが、フラクトースを単一炭素源とした培地では生育しないか、親株に比べて極めて生育が悪くなった株を取得することで、ＦｒｕＫＡ活性が低下または喪失した株を得ることができる。

ＦｒｕＫＡ活性が低下または喪失したコリネ型細菌の選択方法は、糖消費速度が親株より向上した、より有用物質の製造に適したコリネ型細菌の選択方法としても用いることができる。
上記のようにして得られる、目的物質を生産する能力を有し、かつ親株に比べＦｒｕＫＡ活性が低下または喪失したコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取することにより、該目的物質を製造することができる。本発明で用いられるコリネ型細菌は、糖消費速度が向上したコリネ型細菌でもあり、目的物質を効率よく製造することができる。

コリネ型細菌の培養は、目的物質を生産する能力を有する細菌の通常の培養法によって行うことができる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを適量含有する培地であれば合成培地または天然培地いずれも使用できる。
炭素源としては、主にグルコースを用いることができる。グルコース以外のＰＴＳ系を経由する糖も用いることができるが、ＦｒｕＫＡ活性が低下または喪失しているため、スクロース、フラクトースの使用は好ましくない。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。

その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０〜４２℃が好適であり、さらに好ましくは３０℃〜４０℃である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。

培養期間は通常１〜６日間である。
培養終了後の培養物からの目的物質の採取は、特別な方法が必要とされることはない。すなわち、菌体外に蓄積した目的物質は、従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を、目的物質の種類に応じて組み合わせることにより採取することができる。また、菌体内に蓄積した目的物質は、菌体を物理的または酵素的に破壊し、目的物質の種類に応じて菌体破砕液又は膜画分から採取することができる。尚、目的物質によっては、目的物質を菌体中に存在したままの状態で、微生物触媒等として利用することもできる。

本発明により製造することができる有用物質は特に限定されないが、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質などをあげることができる。
アミノ酸としては、Ｌ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンなどをあげることができ、好ましくは、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、微生物の代謝経路上Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸またはピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸等をあげることができる。

Ｌ−アスパラギン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−メチオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、およびＬ−アスパラギン等をあげることができ、Ｌ−グルタミン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、およびＬ−プロリン等があげられる。ピルビン酸を経由して生合成されるＬ−アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、およびＬ−イソロイシン等があげられる。

ペプチドとしては、アラニルグルタミンおよびカルノシン等のジペプチド、グルタチオン等のトリペプチドをあげることができ、タンパク質としてはＧ−ＣＳＦ、エリスロポエチンおよびＨＧＦ等の生理活性ポリペプチドをあげることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（１）遺伝子破壊用プラスミドの構築
カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドｐＨＳＧ２９９〔Gene, 61, 63(1987)〕をＰｓｔＩで処理し、切断部位にBacillus subtilisに由来するレバンシュークラーゼ遺伝子ｓａｃＢを含む２．６キロベースペア（以下、ｋｂと略す）のＤＮＡ断片〔Mol.Microbiol., 6, 1195(1992)〕を連結し、プラスミドｐＥＳＢ３０を得た。
（２）ｆｒｕＫＡ遺伝子破壊株造成用プラスミドの構築
斎藤らの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)〕に準じてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡを調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号６で表される塩基配列からなるＤＮＡとの組み合わせ、および配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡの組み合わせをそれぞれプライマーセットとし、PrimeStarMaxDNAポリメラーゼ（タカラバイオ社製）および添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを行った。該ＰＣＲにより得られた２つの約０．５ｋｂのＰＣＲ産物をそれぞれアガロース・ゲル電気泳動し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega社製）を用いて抽出、精製した。

さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース・ゲル電気泳動した後、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出、精製し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片を制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ (タカラバイオ社製)および添付のバッファーを用いて制限酵素処理した。得られた制限酵素処理断片は、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up Systemを用いて抽出、精製した。

同時に、先に造成したｐＥＳＢ３０をＳｓｅ８３８７Ｉで処理しておき、得られた制限酵素処理断片と混和し、ライゲーションキットVer.1（タカラバイオ社製）を用い、リガーゼ反応を行った。反応産物を用い、常法によりEscherichia coli DH5α株（東洋紡社製）を形質転換した。該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地〔１０ｇのバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇの酵母エキス（ディフコ社製）、１０ｇの塩化ナトリウム、１６ｇのバクトアガー（ディフコ社製）を水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地〕上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地を用いて終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）によりプラスミドを調製した。このプラスミドをｐDｆｒｕＫＡと命名した。
（３）ＦｒｕＫＡ遺伝子破壊株の造成
（２）で調製したプラスミドｐDｆｒｕＫＡを用い、レストらの方法〔Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541(1999)〕に準じて電気穿孔法によりコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株を形質転換し、それぞれカナマイシン耐性株を選択した。カナマイシン耐性株では、それぞれの株の染色体にｐDｆｒｕＫＡがCampbellタイプの相同組換えにより組み込まれていると推測される。このような株では、染色体上に元来存在しているＦｒｕＫＡをコードするＤＮＡとｐＤｆｒｕＫＡ上のｆｒｕＫＡが破壊された構造のＤＮＡが染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。

ｓａｃＢがコードするレバンシュークラーゼはショ糖を自殺基質に転換するので、ｓａｃＢを有する微生物はショ糖を含有する培地において生育できない。しかし、元来染色体上に存在しているＦｒｕＫＡ遺伝子の周辺領域とｐＤｆｒｕＫＡ上のＦｒｕＫＡ遺伝子が破壊された構造のＤＮＡとの間で２回目の相同組換えが起こった株では、いずれかのＤＮＡがｓａｃＢとともに欠失するので、ショ糖を含有する培地においても生育することができる。このようにして、宿主微生物の染色体上に元来存在していたＦｒｕＫＡ遺伝子が欠失した微生物を取得することができる。

このことを利用して、上記形質転換株をＳｕｃ寒天培地〔１００ｇのショ糖、７ｇの肉エキス、１０ｇのペプトン、３ｇの塩化ナトリウム、５ｇの酵母エキス（ディフコ社製）、および１５ｇのバクトアガー（ディフコ社製）を水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して生育するコロニーを選択した。
このようにして得られたコロニーをフラクトースを単一炭素源とした培地〔塩化アンモニウム４ｇ、リン酸一カリウム１ｇ、リン酸二カリウム３ｇ、尿素２ｇ、ビオチン１００ｍｇ、チアミン塩酸塩５ｍｇ、ニコチン酸５ｍｇ、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ、硫酸亜鉛７水和物１ｍｇ、硫酸銅５水和物０．２ｍｇ、硫酸マンガン５水和物１ｍｇ、塩化カルシウム１０ｍｇ、フラクトース、１０ｇ、硫酸マグネシウム０．４ｇ及び１５ｇのバクトアガー(ディフコ社製)を水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調製した培地〕に植菌し、生育が悪化もしくは生育ができないコロニーを取得し、ＷＴΔｆｒｕＫＡ株と命名した。
（４）ＦｒｕＡ遺伝子破壊株の造成
ＦｒｕＫＡ遺伝子の破壊と同様の方法を利用して、Corynebacterium glutamicum ATCC13032株 (以下、ＷＴ株と称す)のＦｒｕＡ遺伝子のみを破壊した株もコントロールとして造成した。

ＦｒｕＡ遺伝子破壊用プラスミドの造成はＦｒｕＫＡ遺伝子破壊株の際と同様に行ったが、プライマーセットは配列番号６および配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡの代わりに、配列番号９および配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いた。
このようにして造成された菌株をフラクトースを単一炭素源とした培地に植菌し、生育が悪化もしくは生育ができないコロニーをＷＴΔｆｒｕＡ株と命名した。
（５）ＷＴΔｆｒｕＫＡ株、ＷＴΔｆｒｕＡ株の評価
取得したＷＴ株、ＷＴΔｆｒｕＡ株、ＷＴΔｆｒｕＫＡ株を種培地（グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム８０ｇ、リン酸一水素カリウム１２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物４ｇ、硫酸鉄７水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２０ｍｇ、硫酸銅２ｍｇ、塩化ニッケル６水和物２ｍｇ、塩化コバルト６水和物２ｍｇ、塩化カルシウム２水和物２００ｍｇ、七モリブデン酸六アンモニウム４水和物４０ｍｇ、βアラニン４０ｍｇ、ニコチン酸４０ｍｇ、チアミン塩酸塩４０ｍｇ、ビオチン０．４ｍｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地）３００ｍｌに炭酸カルシウム６ｇの入った２Ｌ三角フラスコに植菌して２８℃で２４時間培養した。この種培養液１００ｍｌを本培養培地（グルコース６０ｇ、コーンスティープリカー５ｇ、硫酸アンモニウム８０ｇ、リン酸一水素カリウム１２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物４ｇ、硫酸鉄７水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２０ｍｇ、硫酸銅２ｍｇ、塩化ニッケル６水和物２ｍｇ、塩化コバルト６水和物２ｍｇ、塩化カルシウム２水和物２００ｍｇ、七モリブデン酸六アンモニウム４０ｍｇ、βアラニン４０ｍｇ、ニコチン酸４０ｍｇ、チアミン塩酸塩４０ｍｇ、ビオチン０．４ｍｇを水１Ｌに含んだ培地）１１５０ｍｌの入ったジャーファーメンターに植菌し、３３℃で培養した。培養は、ｐＨ６．７に保たれるようにアンモニア水で調整しながら行った。培養はグルコースが消費されつくした時点で終了し、その時点での培養時間を計測した。

その結果、表１に示すように、ＦｒｕＫＡ遺伝子を破壊したＷＴΔｆｒｕＫＡ株において糖消費速度が速いことが示された。

Ｌ−アルギニンの製造
表１に示すとおり、野生株のＦｒｕＫＡ遺伝子を破壊することにより糖消費向上効果が得られたことから、有用物質の製造への応用を確認するため、Ｌ−アルギニン生産菌ＲＢ２６３１株（ＷＯ２００６／０３５８３１）のＦｒｕＫＡ遺伝子欠損株を造成し、そのＬ−アルギニン生産能を調べた。

実施例１に記載した方法と同様の手法により、ＲＢ２６３１株のＦｒｕＫＡ遺伝子欠損株であるＲＢ２６３１ΔｆｒｕＫＡ株、及びＦｒｕＡ遺伝子欠損株であるＲＢ２６３１ΔｆｒｕＡ株を造成した。
これらの株を実施例１に記載の条件と同条件でジャーファーメンターにて培養した。ただし培養温度は37℃とした。

その結果、表２に示すように、ＦｒｕＫＡ遺伝子を破壊したＲＢ２６３１ΔｆｒｕＫＡ株において、糖消費速度、及びＬ−アルギニン生産性が高いことが示された。

Ｌ−リジン生産菌を用いた検討
Ｌ−アルギニンとは異なる生合成経路を持つアミノ酸であるＬ−リジンの生産菌、ＡＨＰ−３株（ＦＥＲＭＢＰ−７３８２）のＦｒｕＫＡ遺伝子およびＦｒｕＡ遺伝子欠損株を造成し、そのＬ−リジン生産性を調べた。
実施例１に記載の方法と同様の手法により、ＡＨＰ−３株のＦｒｕＫＡ遺伝子欠損株であるＡＨＰ−３ΔｆｒｕＫＡ株、及びＦｒｕＡ遺伝子欠損株であるＡＨＰ−３ΔｆｒｕＡ株を造成した。

これらの株を実施例１に記載の条件と同条件でジャーファーメンターにて培養した。
その結果、表３に示すように、ＦｒｕＫＡ遺伝子を破壊したＡＨＰ−３ΔｆｒｕＫＡ株において、糖消費速度、及びＬ−リジン生産性が高いことが示された。

配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims

親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌を培地に培養し、培養物中に該目的物質を生成蓄積させ、該培養物中から該目的物質を採取することを特徴とする該目的物質の製造法。
親株に比べフラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質の活性が低下、または喪失しており、かつ目的物質を生産することができるコリネ型細菌が、親株の染色体ＤＮＡ上にある該蛋白質をコードする遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことにより、親株に比べ該蛋白質の活性が低下、または喪失したコリネ型細菌であることを特徴とする請求項１記載の製造法。
フラクトースの取り込みに係るPTS系蛋白質が、ＦｒｕＫ蛋白質およびＦｒｕＡ蛋白質を含む蛋白質である請求項１または２の製造法。
コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
目的物質がアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
アミノ酸がL-リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-シトルリン、L-グルタミン、L-プロリン、L-セリン、L-オルニチン、L-メチオニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、およびグリシンからなる群より選ばれるアミノ酸である請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造法。