FI113665B - Rakennettu DNA, sitä sisältävä ekspressiovektori ja solu sekä menetelmä seriinin ja seriiniperäisten tuotteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

113665 5

Rakennettu DNA, sitä sisältävä ekspressiovektori ja solu sekä menetelmä seriinin ja seriiniperäisten tuotteiden valmistamiseksi I. Keksinnön tausta Tämän keksinnön kohteena on yleisesti seriinin ja seriinille lähisukuisten tuotteiden, erityisesti tryptofaanin, biosynteesi ja tässä biosynteesissä käytetyt menetelmät ja 10 materiaalit.

Seriini on tärkein välituote monien erilaisten solumetaboliittien, mukaanlukien sellaisten taloudellisesti tärkeiden yhdisteiden, kuten koliinin, glysiinin, kysteiinin ja tryptofaanin, biosynteesissä. Seriini toimii lisäksi yhden hiilen donorina ja vastaa 15 60 - 75 % solun Cryksiköiden kokonaistarpeesta, kun 5,10-metyleenitetrahydrofo- laattia tuotetaan tetrahydrofolaatista. Näitä Cryksiköitä käytetään hyvin erilaisissa biosynteettisissä reiteissä, mukaanlukien metioniinin, inosiinimonofosfaatin, muiden puriinien ja eräiden pyrimidiinien (esimerkiksi tymidiini ja hydroksimetyylisytidiini) synteesissä.

20

Kuviossa 1 esitetty seriinin biosynteesireitti on yleensä monien erilaisten kudosten ja <;. j mikro-organismien käytettävissä. Tämän reitin ensimmäisessä vaiheessa muunne- • ‘ ·,, taan 3-fosfo-D-glyseriinihappo (PGA) 3-fosfohydroksipalorypälehapoksi (PHA) 3-fosfoglyseraattidehydrogenaasi (PGD)-entsyymin avulla. PGD:a koodaava geeni • · • ·. 25 on kloonattu ja sekvensoitu ja PGD-alayksikön aminohapposekvenssi on johdettu.

:'' · 1. Tobey ja Grant, J. Biol. Chem. 261:12179-12183 (1980).

• ·♦ Solun seriinipitoisuudet inhiboivat villityyppisen PGD:n aktiivisuutta prokaryooteissa »Ml (erityisesti bakteereissa) ja hiivan tapaisissa mikro-organismeissa mutta ei korkeam- ; / ^ 30 missä eukaryooteissa. Tätä inhibitiota on tutkittu kineettisesti ja sen on raportoitu • · etenevän allosteerisessa aineessa. Tobey ja Grant, • ’ J. Biol. Chem.. 261:12179-12183 (1986); Dubrow ja Pizer, ; J. Biol. Chem. 252: 1527-1551 (1977); McKitrickja Pizer, " : J. Bacteriol. 141:235-245 (1980).

2 113665

Tosa ja Pizer, J. Bacteriol. 106:972-982 (1971) ovat tutkineet normaalisti toksisen seriinianalogin, L-seriini-hydroksamaatin, vaikutusta E. coli-kantaan. Selektointi tätä analogia sisältävällä kasvualustalla antoi seriiniresistenttejä mutantteja. Joillakin mutanteilla osoitettiin muutos PGD:n liittymättömässä seryyli-tRNA syntetaasient-5 syymissä. Yhden mutantin puhdistamattomassa uutteessa esiintyi PGD-aktiivisuutta, jolla oli alentunut herkkyys seriinille (kts. J. Bacteriol. 106:972-982 (1971); kuvio 5; taulukko 6; ja kts. s. 973 vasen palsta alhaalla, s. 977 vasen palsta alhaalla).

II. Yhteenveto keksinnöstä 10

Keksinnön yhden osan kohteena on yleisesti DNA, joka koodaa 3-fosfoglyseraatti-dehydrogenaasia (PDG), jolla on villityyppiseen PGD:n verrattuna alentunut herkkyys seriinin aiheuttamalle inhibitiolle, so. DNA koodaa PGD:a, joka omaa ainakin jonkin verran biosynteesille hyödyllistä entsymaattista aktiivisuutta ja joka säilyttää 15 tämän aktiivisuutensa korkeammissa seriinipitoisuuksissa kuin villityyppinen (modifi-oimaton) PGD.

Suositelluissa suoritusmuodoissa villityyppinen PGD on mikrobi- tai hiiva-PGD. Lisäksi on suositeltavaa, että rakennettu DNA koodaa PGD:a, joka sisältää muutoksen 20 villityyppisen PGD:n C-terminaalisessa 25 %:ssa, mieluummin 50 C-terminaalisessa *, · J aminohapossa. Rakennettu DNA voi esimerkiksi koodata PGD:a, joka sisältää delee- ; · j tion osassa C-päätä tai siinä kokonaisuudessaan. Suositeltavaa on myös, että raken- •' ,, nettu DNA koodaa PGD:a, jossa on insertti C-päässä (esimerkiksi VAL363:n ja :: ASN364:n välissä tai ALA392:n ja GLN394:n välissä) edellä kuvatun deleetion lisäksi ·;. 25 tai erillisenä muutoksena.

• * · * 1 ·

Keksinnön kohteena ovat myös: a) PGD, jolla on edellä kuvatun rakennetun DNA:n - ·. aminohapposekvenssi; b) ekspressiovektorit, jotka sisältävät rakennetun DNA:n ja : ”'; säätely-DNA:n rakennetun DNA: n isäntäekspressointisysteemissä ekspressoimiseen . Λ t 30 sopivassa paikassa ja orientaatiossa; c) näitä ekspressointivektoreita sisältävät so- I · ‘! lut; ja d) menetelmät, joilla valmistetaan näitä soluja viljelemällä seriiniä tai seriini- » · ’·' peräistä tuotetta. Mitä tulee edellä mainittuun kohtaan c), solusta on mieluummin ' · ’ ' deletoitu villityyppinen serA.

3 113665

Keksinnön eräs toinen suoritusmuoto koskee yleisesti solua, joka on rakennettu (esimerkiksi se sisältää geneettisen rekombinanttirakenteen) tuottamaan PGD:a koodaavaa mRNA-transkriptiä, jonka 3-päätä on muutettu ja jonka solu translatoi niin, että saadaan PGD:a, jolla villityyppiseen PGD:an verrattuna on alentunut herk-5 kyys seriinin aiheuttamalle inhibitiolle.

Keksintö tuo esiin tavan poistaa säätely tärkeästä biosynteesin kontrollikohdasta. Tällä tavoin tehostetaan tästä kohdasta myötävirtaan sisältävien lukuisten yhdisteiden, erityisesti seriinin ja seriiniperäisten tuotteiden, kuten tryptofaanin, tuottoa.

10 Muihin seriiniperäisiin solumetaboliitteihin (so. seriini on primäärinen välituote niiden biosynteesissä) kuuluvat koliini, glysiini, kysteiini ja Ci-donori-alisteiset yhdisteet, kuten metioniini, inosiinimonofosfaatti, puriinit ja eräät pyrimidiinit (esimerkiksi ty-midiini ja hydroksimetyyliksytosiini).

15 III. Suositeltujen suoritusmuotojen kuvaus A. Piirustukset

Kuvio 1 kuvaa L-seriinin biosynteesivaiheita glukoosista.

20

Kuvio 2 on Tobey'n ja Granfin (viitattu edellä) raportoima E. coli serA-geenin sek- ·;···; venssi ja tästä geenistä johdettu aminohapposekvenssi.

• · • · ·

Kuvio 3 kuvaa L-seriinin ja tetrahydrofolaatin biokonversiota glysiiniksi ja NS,IM10- • · ··· 25 metyleenitetrahydrofolaatiksi.

• t · # • · * • ♦ · * B. Seriinille epäherkän PGD:n valmistaminen 1. Geneettisesti rakennetut konstruktiot 30 ’···_ Keksinnön suositeltujen suoritusmuotojen kohteena on seriinin ja seriinisukuisten tuotteiden - esimerkiksi edellä kuvattujen, seriinistä biosynteesillä saatujen tuottei-* den, biosynteesi. Keksinnön mukaisesti näiden yhdisteiden biosynteesin ensimmäi- •«· I » • » 4 113665 nen vaihe on seriinille epäherkän PGD:n valmistaminen. Tätä on tarkasteltu jäljempänä.

Olemme todenneet, että PGD:ssa on spesifinen seriinin takaisinkytkentäalue, jota 5 muuttamalla voidaan alentaa herkkyyttä seriinille ja samalla säilyttää hyödylliset PGD-aktiivisuustasot. Kuviossa 2 on esitetty yksi PGD:n geeni-ja aminohapposekvenssi, jota voidaan käyttää referenssinä seuraavassa tarkastelussa. Kuvion 2 sekvenssi sisältää 410 aminohappoa (mukaanlukien alku-Met, joka pilkotaan pois kypsästä proteiinista). PGD-domeeni, joka voi alentaa herkkyyttä seriinille PGD-aktiivi-10 suutta tuhoamatta, on molekyylin C-terminaalisessa 25 %:ssa, kaikkein mieluummin 50 C-terminaalisessa ryhmässä.

Esimerkkejä keksinnön piiriin kuuluvista PGD:n modifikaatioista ovat joidenkin 42 C-terminaalisen aminohapon tai näiden kaikkien deleetiot tai insertiot tai substituutiot 15 alueella, joka alentaa herkkyyttä seriinille ja samalla säilyttää hyödyllisen PGD:n toiminnan. Esimerkiksi aminohapporyhmien insertointi Vai 363:n ja Asn 364:n väliin suurentaa PGD:n Krarvon villityypin arvoa korkeammaksi ja samalla säilyttää PGD:n aktiivisuuden.

20 Kj-arvoja voidaan nostaa dramaattisemmin deletoimalla joitakin C-terminaalisia ·· aminohapporyhmiä tai deletoimalla ne kaikki. Esimerkiksi, kun C-terminaaliset ·· CTIRARLLY-ryhmät deletoidaan ja korvataan ASLD:lla, K, kasvaa useita •' ·.. suuruusluokkia ja samalla säilytetään PGD:n aktiivisuustaso hyödyllisenä. Muita :‘: keksinnön piiriin sisältyviä insertioita ovat insertiot Ala392:n ja Gln394:n väliin.

’·:· 25 • ♦ · · I *; Muihin hyödyllisiin modifikaatioihin kuuluvat deleetiot C-päästä edellä käsiteltyjen insertioiden ja modifikaatioiden lisäksi.

Edellä kuvattuja seriinille epäherkkiä PGD:a koodaavia geenejä voidaan rakentaa ;·[·. 30 geenitekniikoilla, joissa muutetaan C-terminaalisia aminohappoja koodaavan koo- » · ’ · · *. dausalueen 3’-pää ja sen jälkeen isäntäkanta transformoidaan vehikkelillä, joka eks- • · pressoi muutetun PGD-entsyymin. Ehdokkaista muutetuiksi entsyymeiksi seulotaan v ' (kuten jäljempänä on kuvattu) seriiniaffiniteetti (Kj) ja PGD-aktiivisuus jäljempänä I · · » · yleisesti tarkastelluilla menetelmillä.

5 113665 2. Geneettisesti rakennettujen konstruktioiden seulonta

Seuraavia PGD-aktiivisuuden ja seriiniherkkyyden määrityksiä käytetään, kun seulotaan edellä kuvatuilla menetelmillä valmistettuja geneettisiä konstruktioita.

5

Olematta keksinnölle kriittinen tarvitaan yleensä PGD-aktiivisuuden määritysmenetelmä, jotta voitaisiin selvittää muutetun entsyymin seriiniherkkyyden voimakkuus. Alalla on yleisesti tunnettua, että entsyymiaktiivisuus on entsyymimolekyylien kokonaismäärän ja kunkin molekyylin katalyyttisen aktiivisuuden funktio. Kun PGD:n 10 feedback-muunnosten katalyyttistä aktiivisuutta verrataan, on siten tyydyttävä toimenpiteisiin, joilla riittävästi kontrolloidaan PGD-molekyylien suhteellista määrää näytteissä, joiden suhteellista katalyyttistä aktiivisuutta tullaan vertaamaan. Tämä voidaan toteuttaa monella tavalla. Kuitenkin, koska on vaikeaa todeta riittävän hyvin geenin ekspressiotaso katkaistuilla serA-geeneillä transformoiduissa soluissa (pie-15 nemmästä viabiliteetistä johtuen), kaikkein sopivin tapa verrata eri rakenteiden ja villityypin tuottamaa PGD-aktiivisuutta on integroida normaalit säätelyelementit sisältävä, muutettu serA-geeni kromosomaalisesti yhteen ainoaan kopioon, minkä jälkeen transformantit kerätään ja määritetään suhteellinen katalyyttinen aktiivisuus verrattuna villityyppisten solujen PGD-aktiivisuuteen.

20 *: · PGD-aktiivisuuden mittaamiseen voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa menetelmää.

•: ’ · - PGD-aktiivisuus voidaan mitata detektoimalla joko reaktio eteenpäin tai taaksepäin seuraavalla menetelmällä: McKitrick, John C. ja Lewis I. Pizer. (1980) J. Bacteriol. 141 235-245.

• ·;· 25 • * · ·

Edellä kuvattu entsymaattinen määritys sopii seriiniherkkyyden määrittämiseen mille tahansa PGD-entsyymille, mukaanlukien niille, joissa on kemiallisesti modifioitu C- ··· pää. Määritys suoritetaan eri seriinipitoisuuksien läsnäollessa. Katalyyttistä aktiivi- : suutta seriinin läsnäollessa verrataan katalyyttiseen aktiivisuuteen ilman seriiniä ja :v. 30 lasketaan K,.

· • · ,;, Useimmissa tapauksissa on suositeltavaa alentaa seriiniherkkyyttä muuttamatta • · » *' ] merkitsevästi PGD:n katalyyttistä aktiivisuutta. Joissakin toisissa suoritusmuodoissa voi olla toivottavaa alentaa sekä feedback-herkkyyttä että katalyyttistä aktiviisuutta.

6 113665

Voidaan käyttää konstruktioita, joissa on taulukossa 1 luetellut (kuvattu jäljempänä) 3-fosfoglyseraattidehydrogenaasien C-terminaalinen aminohapposekvenssi, 7 113665 :rd :0

M

Μ ιηΜ<<ιη<<<<<,ί •H o o o \ \ — (Λ · · Z 2 2 2 2 2 2 2

V

_>1________ e Μοοοαοοσοοοο

C ^ OOQ · O O O O O O

J "Ή ΟγΗΜΜΜΜι-ΙΜΜΗΜ K V Λ Λ Λ ΛΛΛΛΛΛ S* X X X X > J .J J o o

11 ^ lD iJ J O O

« cc oi cc a cc S < < < < < < 2 os oi os cc o: a

w M M M M M

> i Q ι i < < < "aj * i i i cc os

m ^ CO E" Eh O CO CO

o o < u o o > o i

p| CC Oi CL, Oi CL CL 1 I

Dj JJ MM M M M M l l Ά < < <<<<11

O iC i>C S*S 2S -x. X I I

c SS S S S S I I

'e < < <<<<11 5 o o o a σ σ i i

Il I CC I I I I

15 JJ 11 I CO >0 I 1 I I

(/) iJlJ »J O C} C3 |J 1 |_3 • H << <<<<<!< m x ie rc * se χ χ i *

<ö Wta CdWCdWCUlW

S >> >>>>>!> .h aa a a a a a i o ^ g ωω «ωωωωιω o φ aa a a a a a i a λ: jj << <<<<<i< ^ | « ω κωωωωιω 20 2 a mmmhmim

Γ) ö i2QQ QQQQQIQ

. flfl φ rt MM M M M M M l M

EH -H g > > >>>>>!> UI S > > >>>>>!> * <0 m S (Ö ,¾ >> X >j X χ > | χ

Ci UJ O O O U O U O I U

;·. ai SS S S S S S l S

tji CV CV O Of O' O O' I O' o ,·. : n << <<<<</< • ·· ·Η coco cocococotoico ** r>i E-1 E-· E-1 E-* E-< E-1 E-1 I £-· 25 λ cv o a cv c* cv cv i cv φ nÖ »-3 < >-3 »D »_3 l ,0

.. -H XX XXXXXIX

,’ · v o a cv o cv cv o i a +j << <<<<<(< <ö Φ << <<<<<!<

, MM MMMMM1M

!· Φ Z2S Z Z Z Z Z I Z

.. w li <111111 · 5x

ιΗ II OS I I I I I I

*·· O' I 1 > CO l l I 1 l l • nn O II iJ D O I I I I I l ;·.·. jU ή >>>>>>>>>>>

. . M

· o uoooooooooo

fa OfOOfOfOfCVOfOOfOfO

• · I UldWtCMUmtlUMw *,“ oi <<<<<<<<<<< . < ifiOLxaocnoMcMO.-.

• j * · * l-j f-ιηιηοοΟΜ,-ι·—inm (UZ^r-^minininininusin CO 1—I 1—1 i—| H ,—i i—| i—i r-t I—t ,—< 8 113665

Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluu myös muita 3'-päissä modifioituja rakenteita, koska on yksinkertainen asia valmistaa koekonstruktioita ja transformoida soluja esillä olevan keksinnön mukaisesti ja testata niistä PGD:n aktiivisuuden inhibitio se-riinin vaikutuksesta.

5

Mikä tahansa vektori, jolla voidaan ekspressoida PGD-proteiini, jolta puuttuu herkkyys seriinin aiheuttamalle inhibitiolle, liittyy esillä olevaan keksintöön. Kun seriini-kaivo puuttuu, yleensä tulisi kuitenkin välttää takaisinkytkemättömän PGD:n korkeita ekspressiotasoja, koska aiheutuvat seriinin tai seriiniperäisten metaboliittien korkeat 10 pitoisuudet sytoplasmassa voivat olla solulle toksisia. Siten yleensä millä tahansa konstruktiolla, joka koodaa feedbackin inhiboimaa PGD:a, jolla on normaali katalyyttinen aktiivisuus ja samanlaiset ekspressiotasot kuin natiivilla geenillä, transfor-mantti johtaa todennäköisesti korkeisiin PGD:n ekspressiotasoihin ja alentuneeseen solujen viabiliteettiin. Korkeiden tuotettujen seriinitasojen toksisuus voi itse asiassa 15 selektoida mutantteja, joiden PGD:n ekspressio on alentunut. Siten, vaikkakin eräissä suoritusmuodoissa transformointi käyttämällä monikopioisia plasmideja voi olla hyödyllinen konstruktien alkuseulonnassa, on suositeltavaa integroida serA-konst-ruktit kromosomaalisesti yksinä ainoina kopioina genomiin. Jäljempänä kuvattu kromosomaalinen integrointi helpottaa lisäksi PGD:n, josta takaisinkytkentä on dele-20 toitu, aktiivisuuden mittaamista. Siten useimmissa suoritusmuodoissa, joissa on odo- • * * tettavissa tai toivottavaa voimakas katalyyttinen aktiivisuus, käytetään mieluummin •; ; vektoreita, jotka sopivat yksikopioiseen kromosomaaliseen integrointiin. Monet täl- •' .. laiset vektorit ja niiden käyttöstrategiat ovat alalla tunnettuja. Kts. esimerkiksi :*·. j Backman, U.S.S.N 07/091,837, jätetty 1.9.1987, joka tässä yhteydessä mainitaan • · «· · 25 viitteenä. Voidaan tehdä lukuisia hyödyllisiä vektoreita ja konstrukteja, joilla voidaan :' · ‘: menestyksellisesti transformoida ja ekspressoida entsyymi sopivassa isännässä ja tuottaa haluttua tuotetta.

* * » « : ’": Keinot, joilla näihin tavoitteisiin päästään, ovat alan ammattimiesten yleisesti tunte- : v, 30 mia, eivätkä ne ole tälle keksinnölle keskeisiä. Muutettua PGD:a koodaavan DNA:n • · . · ·, lisäksi ekspressointivektori sisältää jäljempänä kuvattuja erilaisia muita elementtejä.

* * > · a • * '·* ’ Ensinnäkin vektorissa oleviin koodaaviin sekvensseihin liittyvät sopivat säätelyele- mentit, joita tarvitaan koodaavien sekvenssien kyseeseen tulevaan ekspressio- 9 113665 tasoon, mukaanlukien promoottorit, ribosomien sitoutumiskohdat ja terminaatiosek-venssit. Natiivit serA:n säätelysekvenssit ovat useimmissa tapauksissa suositeltu lähde molekyylin katalyyttisesti aktiiviselle osalle, vaikkakin voidaan käyttää monia muita alan tuntemia säätelysekvenssejä tai ei vielä löydettyjä sekvenssejä.

5

Toiseksi on suositeltavaa, että vektorissa on myös mukana kyseisten säätelyele-menttien lisäksi sekvenssejä, jotka koodaavat selektiivisiä markkereita ja/tai rapor-tointigeenejä. Tällaisten selektiivisten markkereiden ekspressio on hyödyllinen trans-formantteja identifioitaessa. Kyseeseen tuleviin selektiivisten markkereiden geenei-10 hin kuuluvat geenit, jotka koodaavat ampisilliiniä, tetrasykliiniä ja kloramfenikolia.

Kolmanneksi replikaation alkukohdan toivottavuus plasmidivektorissa riippuu suuresti siitä, halutaanko geenit ylläpitää kromosomaalisesti tai ekstrakromosomaalisesti. Alan ammattimiehet tuntevat erilaisia strategioita, joiden avulla replikaation alku-15 kohdan puuttumisen avulla voidaan edistää integraatiota kromosomiin. Kts. esimerkiksi Backman et ai., US-patentti 4,743,546, joka tässä yhteydessä on mainittu viitteenä.

Kun ekspressointivektori on rakennettu, sopiva isäntävektori voidaan transformoida 20 vektorilla, joka sisältää seriinille epäherkkää PGD-proteiinia koodaavan transkriptio- • ·· yksikön.

# at·*· l · ·* ,, Useimmissa tapauksissa on hyödyllistä käyttää soluja, joille seriinin tiedetään inhi- * : * , · boivan endogeenistä PGD-proteiinia ja joissa endogeeninen serA-geeni on deletoitu · · 25 ja korvattu keksinnön mukaisella muutetulla geenillä. Tällaiset solusysteemit ovat I I I t *.*: hyödyllisiä seriinisukuisten metaboliittien ylituotossa. Prokaryootit ja hiivat ovat solu ja, joiden tiedetään sisältävän seriinille herkkiä proteiineja.

* • ** > < · · ; ‘": Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä sitä kuitenkaan rajoittamatta.

30 I * • a at* • * a · • t t • taa a · a * a a a a a 10 1 13665

Esimerkki 1

Feedback-resistantteia 3-fosfoalvseraattidehvdroaenaaseia koodaavien serA-aeeni-alleelien rakentaminen 5 E. coli K12 serA-geeni eristettiin 6,4 Kb DNA-fragmenttiin, joka oli saatu pTR264:n BclI-kohtaan kloonatusta Sau3A-osadigestistä. Kts. Backmann et ai., U.S.S.N. 07/285,128, jätetty 12/16/88 ja Roberts et ai., Gene 12:123 (1980). Tälle plasmidil-le annettiin nimeksi pKB1302. pKB1321 muodostettiin kloonaamalla pUC19-plasmi-10 diin serA-geenin sisältävä pKB1302 DNA: n 3 Kb Sall-SphI-fragmentti. pKB1370 muodostettiin kloonaamalla pBR322-plasmidiin serA-geenin sisältävä 3 Kb Hindlll-Sall-fragmentti.

serA:n alleelit, jotka koodaavat feedback-resistenttejä 3-fosfoglyseraattidehydroge-15 naaseja, muodostettiin insertoimalla Xbal-linkkerit restriktiokohtiin serA-geenin 3-alueella. pKB1321-plasmidin osittainen pilkkominen Hincir.lla tuotti tasapäät kohtaan 1793, jolloin linkkerit insertoimalla saatiin: a) pKB1459, joka koodaa katkaistua 3-fosfoglyseraattidehydrogenaasia; b) pKB1507, joka koodaa katkaistua 3-fosfo-glyseraattidehydrogenaasia; ja c) pKB1508, joka koodaa 3-fosfoglyseraattidehydro-20 genaasia, jossa on neljän aminohapporyhmän insertti. pKB 1321:n pilkkominen • | Pstl:lla antaa ylipitkän 3'-pään kohtaan 1888. Tasapäät muodostettiin DNA polyme- : raasi I:n Klenow'in fragmentin avulla. Linkkerit ligatoitiin tasapäisiin fragmentteihin.

• ‘ ·,. Saadut plasmidit olivat pKB1509, joka koodaa 3-fosfoglyseraattidehydrogenaasia, :1·, j jossa on kahden aminohapon insertti, ja pKB1510, joka koodaa katkaistua 3-fosfo- • · ·:· 25 glyseraattidehydrogenaasia. pKB1370:n Kpnl-pala tehtiin tasapäiseksi DNA poly- meraasi I:n Klenow'in fragmentilla. Insertoidut linkkerit antoivat katkaistua 3-fosfo-glyseraattidehydrogenaasia koodaavat plasmidit pKB1455 ja pKB1512 tai kahden «· · aminohapporyhmän insertin sisältävää 3-fosfoglyseraattidehydrogenaasia koodaa- van plasmidin pKB1511. Deleetioplasmidit pKB1530 ja pKB1531 muodostettiin inser- • · · : V, 30 toimalla 0,8 Kb BamHI-Xbal-fragmentti plasmidista pKB1508 tai 0,9 Kb BamHI-Xbal-• fragmentti plasmidista pKB1509 pKB1511:n 5,8 Kb BamHI-Xbal-fragmenttiin.

• · I t • 1 · v | Seuraavassa taulukossa 2 on annettu yhteenveto tehdyistä eri konstrukteista.

» » 11 113665 3 3 3 3 3 3 3 P> +) +> -H -H +> ·Ρ +> -P -Ρ

Cfl W Cfl -P μ» M+JW-H-H

·Η ·Η -H -Ρ -Ρ -H +> -Η O O

S <ÖrtJ<tiPP<ÖPid-P.P

'J +»-P-P«>M-PW+»rHiH

Ρ <α(ϋίϋε;ρ<ϋε:(ϋΦΦ 5 H x x x h h ^ h ^ pp o u < < E-< E-< < < O O (J o < o < < u o o o u •h oe> < u < e> < }. <<UU<C3<0 m BE1<<<0<0< S ΟθυΕ*<Η<Ε-<

in k/ E-|E-|<OE-|U£-iO

10 m UO^EhOE^UE-'

-H <<UOHOBU

j E^E-E-iOUOUO

CJUUE-'OE-'UE-'

M

C M

a 15 * c i a o + x

‘H

-P MMM M +

44 MMM M

•H M M M M M M

p flj V V TS TJ

CSJ -PP» CCCCP>P>CCCP) ω λ o, ·η -h -h οι « a a ·η ω O <D 0 ΧΧΧΧίΙ,ΛΧΧΧα.

λ; «M

M

20 h 3 , <ö . Ϊ En co σι o o ,,,,; m tn 1 · rH T—i : *, ca cq : *· x x .·, : α α •. : + +

' 1 25 -H O·—IMMMMOOMM

··*· Ό r'CMCAlOJCMCMr-r-MM

ΜΜΜΜΜΠΜΟίηΐΠ

* 1 * E »“*^rHT-lrHr-4rHi—(rHrH

w

ro CQCQCQOQcQCQCQCQcacD

τ' xxxxxxxxxx ααο,αα&.ααα.α.

* · 30

;·; tnir>r»cocnOM040M

. . ιηιηοσοΜΜΜΜΜ ·*> 'ST'Tininmmioinirivn ! Ή mmmmmmmmmm

* * * 1“I

<φ <<<<<<<<<<

V · ^ P»-iPPPPPPPP

* φιΗ φφφφφοφφφφ ·:*·; com wcococococowcncocn 12 113665

Kaikille konstrukteille on annettu lähtövektori, käytetty restriktiokohta ja insertoidun linkkerin sekvenssi. Taulukossa 1 on annettu Ki-arvot seriinille sekä suhteellinen katalyyttinen aktiivisuus kolmelle näistä konstruktioista kromosomaalisen integraation jälkeen (kuvattu jäljempänä). N/A tarkoittaa, että konstruktiota ei integroitu kromo-5 somaalisesti ja että aktiivisuustasoa ei sen vuoksi standardisoitu.

3. Kemialliset modifikaatiot

Alan ammattimiehet tietävät, että villityyppisen PGD:n C-pään deleetiottai modifi-10 kaatiot voidaan tehdä entsymaattisesti tai kemiallisesti, esimerkiksi erilaisilla karbok-sipeptidaaseilla, mukaanlukien karboksipeptidaasi Y:llä tai laktoperoksidaasin välittämän jodauksen avulla.

4. Antisense mRNA:n käyttö 15

Seriiniherkkyyttä voidaan vaihtoehtoisesti alentaa in vivo muodostamalla 3'-päässä lyhennettyjä PGD:a koodaavia transkriptejä tuottamalla antisense mRNA-molekyy-lejä, jotka sisältävät nukleotidisekvenssejä, jotka ovat komplementtisiä natiivien tai transformoitujen PGD:a koodaavien sekvenssien 3'-koodaavan alueen osille.

20 • · C. Haluttujen yhdisteiden tuottaminen I Ml

Seriini on kuvion 3 mukaisesti glysiinin tuoton välituote. Se on myös välituote tuotet- * :' \ j taessa N5,N10-metyleenitetrahydrofolaattia, joka on metioniinin, puriinien (mukaan- • · • · · 25 lukien inosiinin) ja eräiden pyrmidiinien synteesissä oleellinen Ci:n yleisdonori. Serii- *1*1 nin ylituottaminen fosfoglyseraatista voi siten olla hyödyllistä hyvin erilaisissa bak- » teereiden tuottosysteemeissä, mukaanlukien koliinin, glysiinin, kysteiinin, metionii- • · nin, tryptofaanin ja kaikkien puriinien, mukaanlukien inosiinimonofosfaatin, tuotto- systeemeissä.

I » » 30 * · · * t | · ··, Seuraavat yksityiskohtaiset esimerkit havainnollistavat keksintöä.

»*

I I I

• · · » » · 13 1 13665

Esimerkki 2

Isäntäkannan valmistaminen 5 Plasmidin sisältämän serA-geenin sisäisiä sekvenssejä korvattiin kanamysiiniresis-tenttiyden antavalla geenillä. Tämän plasmidin avulla inaktivoitiin sen jälkeen isäntäkannan serA-geeni vaihtamalla alleellit seuraavasti: YMC9:n (ATCC33920) serA-alue kloonattiin Sau 3AI:lla osittain pilkotusta kromoso-10 maalisesta DNA:sta komplementoimalla PC1523 (arglöl, argF58, serA27, purA54, thr-25, tonA49, relAl, spoTl), joka oli saatu Coli Genetic Stock Center'ltä, Yale University, New Haven, CT. Plasmidiin pUC19 kloonattiin serA-geenin sisältävä 3 Kb fragmentti, jolloin saatiin plasmidi nimeltä pKB1321. Tästä plasmidista kloonattiin 3 Kb Sall-Hindlll-fragmentti uudelleen plasmidiin pBR322, jolloin saatiin plasmidi 15 pKB1370. serA-geenin 3-päässä oleva KPnl-kohta muunnettiin BamHI-kohdaksi linkkerillä ja saadun serA:n sisäinen BamHI-fragmentti korvattiin BamHI-fragmen-tilla, joka oli saatu Tn903 kanamysiiniresistenttiysgeenin sisältävästä pUC-4-KSAC.sta (Pharmacia). Tälle uudelle plasmidille annettiin nimeksi pKB1429. Muodostettiin pBR322-johdannainen nimeltä pKB 701 (ATCC 39772), (kts. USSN 20 06/757,019, joka mainitaan tässä yhteydessä viitteenä), jossa replikaation alkukoh taa reunustavat Mbol ja TThlll 1 oli muunnettu Kpnl-kohdiksi. pKB1429:sta saadun : serA::KanR:n sisältävä Sall-EcoRI-fragmentti kloonattiin plasmidiin pKB701, jolloin * · saatiin pKB1438. ori-alue poistettiin pKB1438:sta pilkkomalla Kpnl:lla. Ampisilliini- : resistenttiyttä koodaavaan alueen sekä serA::KanR:n sisältävä suuri fragmentti teh- * · .:. 25 tiin sirkulaariseksi ja sitä käytettiin YMC9:n CaCI2-transformoinnissa. Transformoin- . *: ’. nin jälkeen YMC9-isäntäsolut asetettiin ampisilliinin selektiopaineen alle. Näissä olo suhteissa kehittyy ampisilliinille resistenttejä klooneja, kun serA-geeniä ympäröiville alueille inkorporoituu sirkulaarista DNA:a homologisen rekombinaation kautta. Am-, ’ * ·. pisilliiniresistentin isolaatin kasvu ilman ampisilliinin selektiopainetta aiheuttaa ampi- II» 30 silliiniresistenttiysgeenin tuhoutumisen serA-geeniä ympäröivien alueiden toistose- • I « » · '.,; kvenssien homologisesta rekombinaatiosta johtuen. Tällaiset kannat identifioitiin ’!* β-laktamaasin tuottokyvyn häviämisen avulla käyttämällä AmpScreen:a (BRL) vai- I t » v * mistajan ohjeiden mukaisesti. Yksittäisten pesäkkeiden kaksoissively alustoille serii- ’ nin läsnäollessa ja ilman sitä paljasti ampisilliiniherkät kloonit, jotka tarvitsevat se- 14 113665 riiniä minimialustalla kasvaakseen ja jotka olivat myös resistenttejä kanamysiinille. Yksi tällainen isolaatti oli nimeltä KB875.

Esimerkki 3 5

Muutettujen serA-sekvenssien integrointi kromosomiin alleelivaihdon avulla serA1455-alleeli vietiin kromosomiin analogisemmalla menetelmällä kuin mitä käytettiin serA::KanR:n vientiin esimerkissä 2. Lyhyesti sanottuna plasmidiin pKB701 10 kloonattiin serA1455-alleelin sisältävä fragmentti (Sall-Hindlll). Plasmidin alkukohta poistettiin pilkkomalla Kpnl:lla. Ampisilliiniresistenttiyden transformoimiseen käytettiin sirkularisoitua DNA:a, jolloin saatiin haluttu kanta. Epäselektiivisen kasvun jälkeen eristettiin KB904 (serA1455) käyttämällä Ampscreen:a ja replikamaljausta ka-namysiinin suhteen. KB904:n osoitettiin olevan herkkä ampisilliinille ja kanamysiinil-15 le. Saatu serA1544-alleeli voidaan siirtää tuotantokantoihin Pl-transduktoimalla. Miller (1972) Experiments In Mol. Genetics Cold Spring Harbor Press, s. 201-205.

Esimerkki 4 20 Muutettujen serA-sekvenssien integrointi kromosomiin recD-alisteisen aeenikorvauk-sen avulla

» I

’ · t ♦ serA1508-alleelin siirtämiseen kromosomiin käytettiin toista lähestymistapaa. Kanta . : KB875 tehtiin recD:ksi Pl-transduktoimalla V220:sta (recD, argA:TnlO. Amundsen .25 et ai., (1986) Proc. Acad. Sei., U.S.A. 82 5558-5562) (DSM 6823). Eksonukleaasi V:n ; 1 :·. oleellisen kolmannen alayksikön geenillä saatiin JGP101. Plasmidi pKB1508 lineari- soitiin ja sillä transformoitiin JGP101 seriiniprototroopiksi oleellisesti ShevelPin et ai. kuvaamalla tavalla, (1988) J. Bacteriol. 170 3294-3296, jolloin saatiin JGP103. se- «1 · · ;; rA1508-alleeli voidaan sen jälkeen siirtää tuotantokantoihin Pl-transduktoimalla.

30 Miller et ai., Experiments in Mol. Genetics Cold Spring Harbor Lab., s. 201-205 (1972).

• · t · 1 • · · · is 113665

Ylituotettuien metaboliittien talteenotto

Seriinisukuisten metaboliittien ylituottoa varten voidaan valmistaa soluja, jotka tuottavat seriiniherkkyydeltään pienempää PGD:a. Näitä soluja voidaan kasvattaa fer-5 menttoreissa sopivissa olosuhteissa, useimmissa tapauksissa stationäärivaiheeseen asti. Sen jälkeen solut otetaan talteen ja lyysataan ja haluttu metaboliitti valmistetaan normaaleilla biokemiallisilla menetelmillä. Crueger ja Grueger (1982) (Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology) ja Herrmann ja Somerville (1983) (Amino Acids: Biosynthesis and Genetic Regulation), jotka on mainittu tässä yhtey-10 dessä viitteenä, antavat tietoja mikrobien kasvattamisen olosuhteista, periaatteista ja näitä koskevia viitteitä sekä tietoja spesifisten metaboliittien talteenotosta.

»·« 1 1 • ·

IMI

· • »

Claims (12)

1. Rakennettu DNA, joka koodaa 3-fosfoglyseraattidehydrogenaasia (PGD), jolla on villityyppiseen PGD:an verrattuna alentunut herkkyys seriinin aiheuttamalle inhibiti- 5 olle, tunnettu siitä, että mainittu DNA koodaa PGD:a, joka sisältää muutoksen villi-tyyppisen PGD:n C-terminaalisessa 25 %:ssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rakennettu DNA, tunnettu siitä, että DNA koodaa PGD:a, jossa on muutos villityyppisen PGD:n C-terminaalisissa 50 aminohapos- 10 sa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rakennettu DNA, tunnettu siitä, että DNA koodaa PGD:a, jossa on villityyppisen PGD:n C-terminaalinen deleetio.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rakennettu DNA, tunnettu siitä, että C-termi naalinen muutos on insertio villityyppisen PGD:n sekvenssiin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen rakennettu DNA, tunnettu siitä, että insertio on villityyppisen PGD:n VAL 363:n ja ASN 364:n välissä tai ALA 392:n ja GLN 394:n 20 välissä. IM

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rakennettu DNA, tunnettu siitä, että DNA koo- : ‘. daa PGD:a, jolla on jokin seuraavista aminohapposekvensseistä: .·. I AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL-QA MKAI PASL D; ' 25 AEQG VLV; ·;;; AEQG VL; : AEQG VCSR ΑΝΙΑ AQYL OTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL -QA MKAI PGT- -IRA RLLY; AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL SRQA MKAI PGT- -IRA RLLY; ·:. AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL L; .···. 30 AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL-QA MKAI PGT- AIR RLLY; T AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL-QA MKAI PVL, j’\: AEQG V— — ............ ..... — —................ -CSR AIRA RLLY; AEQG V— -NIA AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVAEKAL........... -SR AIRA RLLY; I I I '* ’ 35 villityyppisen PGD:n 52 C-terminaalisen aminohapon asemesta. > I 17 113665

7. Fosfoglyseraattidehydrogenaasi, jolla on jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukaisen rakennetun DNA:n koodaama aminohapposekvenssi.

8. Ekspressointivektori, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 5 1-6 mukaisen rakennetun DNA:n ja säätely-DNA:n asemaltaan ja orientaatioltaan niin, että se sopii rakennetun DNA:n ekspressoimiseen isäntäekspressiosysteemissä.

9. Solu, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukaisen rakennetun DNA:n ja säätely-DNA:n asemaltaan ja orientaatioltaan niin, että raken- 10 nettu DNA ekspressoituu mainitussa solussa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen solu, tunnettu siitä, että mainitusta solusta on deletoitu villityyppinen serA.

11. Menetelmä tuottaa haluttua tuotetta, joka on seriini tai seriiniperäinen tuote, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 9 mukaista solua ja otetaan haluttu tuote talteen.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuote on 20 seriini. t « 1 · • 1 M · t * · · « · · • · · » · · · • « · * · • · · • · % · · 1 1 • · » • » 1 ie 113665