ES2549003T3 - Método para la preparación de dioles - Google Patents

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Abstract

Microorganismo genéticamente modificado para la bioproducción de un diol alifático seleccionado de entre etilenglicol, 1,3-propanodiol y 1,4-butanodiol, en el que el microorganismo comprende una vía metabólica para la descarboxilación de un metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático seleccionado de entre hidroxipiruvato, 4-hidroxi-2-cetobutirato y 5-hidroxi-2-cetopentanoato, respectivamente, con una enzima codificada por el gen kivD de Lactococcus lactis, siendo además el producto obtenido a partir de dicha etapa de descarboxilación reducido en el diol alifático correspondiente con una enzima codificada por el gen yqhD de Escherichia coli, y en el que el microorganismo es modificado genéticamente para la producción mejorada de dicho metabolito de ácido hidroxi-2-ceto-alifático.

Description

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sitios de restricción (BamHI, HindIII, EcoRV) (SEC ID nº 1): ggatccatgcaagcttatgcgatatc promotor Ptrc01 (SEC ID nº 2): gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaggaggtataac secuencia del gen kivDll optimizada para E. coli (CAG34226.) (SEC ID nº 3):
imagen11
10 secuencia de terminador T7Te (ref: Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci USA. 24 de abril de 2001;98(9):5019-24.) (SEC ID nº 4): attacgtagaAGATCTtcctggctcaccttcgggtgggcctttctg
sitios de restricción (SmaI, BamHI, EcoRI) (SEC ID nº 5):ccccgggatgcggatccatgcgaattc
15 Para la expresión de un vector de bajo número de copias el plásmido pME101 fue construido como se expone a continuación. El plásmido pCL1920 fue amplificado por PCR usando los oligonucleótidos PME101F y PME101R y el fragmento BstZ17I-XmnI del vector pTRC99A que contiene el gen lacI y el promotor Ptrc fue insertado en el vector amplificado. El vector resultante fue restringido por NcoI y BamHI y el vector que contenía el gen kivDll fue restringido por AflIII y BamHI. El fragmento que contenía kivDll fue después clonado en el vector pME101: El
20 plásmido resultante fue nombrado pME101-kivDll-TT07
PME101F (SEC ID nº 6): ccgacagtaa gacgggtaag cctg PME101R (SEC ID nº 7): agcttagtaa agccctcgct ag
25 1.2 Construcción de un plásmido pME101-kivDll-yqhD-TT07 para la sobreexpresión de kivD de Lactococcus lactis que codifica alfa-cetoisovalerato descarboxilasa y yqhD de Escherichia coli que codifica metilglioxal reductasa
El vector pME101 y el vector que incluye los genes kivDll fueron restringidos por SnaBI y BglII y el fragmento que contiene yqhD fue clonado en el vector pME101, el plásmido resultante fue nombrado pME101-kivDll-yqhD-TT07.
30 El gen yqhD fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico de la cepa de E. coli MG1655 con los oligonucleótidos yqhD F y yqhD R:
yqhD F(SECIDnº8) TTACGTAcccagcaaagggagcaagtaatgaacaac
35 -una región para adición de un sitio de restricción SnaBI (letra mayúscula itálica negrita) -una región (letra minúscula) homóloga a la región E. coli MG1655 yqhD de 3153357 a 3153385
yqhD R(SECIDnº9) aagatcttcTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC
40 -una región (letra mayúscula) homologa a la región E. coli MG1655 yqhD de 3154540 a 3154518 -una región para adición de un sitio de restricción BglII (letra minúscula itálica negrita).
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El fragmento amplificado por PCR fue cortado con las enzimas de restricción SnaBI y BglII y clonado en los sitios SnaBI-BglII del vector pME101-kivDll-TT07 dando por resultado el vector pME101-kivDll-yqhD-TT07.
Ejemplo 2
Construcción de cepas con flujo de vía de etilenglicol incrementado: MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF Ptrc18gpmA Ptrc18-gpmB (pME101-kivDll-yqhD-TT07)
2.1 Construcción de la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB
Para eliminar el gen sdaA gene, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permitió la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o un casete de resistencia a kanamicina, mientras eliminaba la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito los siguientes oligonucleótidos fueron usados:
∆sdaAF (SEC ID nº 10)
imagen12
con -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (1894941-1895020) y el gen sdaA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), -una región (letra mayúscula en negrita) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), ∆sdaAR (SEC ID nº 11)
imagen13
con
-una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (1896336-1896254) del gen sdaA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
-una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos ∆sdaAF y ∆sdaAR fueron usados para amplificar el casete de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido fue luego introducido mediante electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina fueron seleccionados y la inserción del casete de resistencia fue verificada por medio de análisis PCR con los oligonucleótidos sdaAF y sdaAR definidos a continuación. La cepa retenida fue designada MG1655 ∆sdaA::Km. sdaAF (SEC ID nº 12): cagcgttcgattcatctgcg (homóloga a la secuencia de 1894341 a 1894360). sdaAR (SEC ID nº 13):GACCAATCAGCGGAAGCAAG (homóloga a la secuencia de 1896679 a 1896660).
Los transformantes resistentes a kanamicina fueron después seleccionados y ∆sdaA::Km se verificó mediante análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos sdaAF y sdaAR. La cepa retenida fue designada MG1655 ∆sdaA::Km. Luego DsdaB::Cm se introdujo en la cepa MG1655 ∆sdaA::Km mediante transducción. MG1655 ∆sdaB::Cm se construyó primero usando el mismo método como se describe previamente con los siguientes oligonucleótidos:
∆sdaBF (SEC ID nº 14)
imagen14
con -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (2927627-2927705) del gen sdaB (secuencia de
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referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), -una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), ∆sdaBR (SEC ID nº 15)
imagen15
10 con
-una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (2928960-2928881) del gen sdaB (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
15 -una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos ∆sdaBF y ∆sdaBR fueron usados para amplificar el casete de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido fue a continuación introducido por medio de electroporación en la 20 cepa MG1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a cloranfenicol fueron después seleccionados y la inserción del casete de resistencia fue verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos sdaBF y sdaBR definidos a continuación. La cepa retenida es designada MG1655 ∆sdaB::Cm. sdaBF (SEC ID nº 16): Gcgtaagtacagcggtcac (homóloga a la secuencia de 2927450 a 2927468). sdaBR (SEC ID nº 17): CGATGCCGGAACAGGCTACGGC (homóloga a la secuencia de 2929038 a 2929017). Para transferir ∆sdaB::Cm, se usó el método de transducción con
25 el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 ∆sdaB::Cm se usó para la transducción en la cepa MG1655 ∆sdaA::Km.
Los transformantes resistentes a cloranfenicol fueron después seleccionados y ∆sdaB::Cm se verificó por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos sdaBF y sdaBR. La cepa retenida fue designada 30 MG1655 ∆sdaA::Km ∆sdaB::Cm. Los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol fueron después eliminados. El plásmido pCP20 que lleva FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol fue después introducido en los sitios recombinantes mediante electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol fue verificada por medio de un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron previamente (sdaAF/sdaAR y
35 sdaBF/sdaBR). La cepa retenida fue designada MG1655 DsdaA ∆sdaB.
2.2 Construcción de la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF6
Para eliminar el gen pykF, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000).
40 Esta estrategia permitió la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o un casete de resistencia a kanamicina, mientras eliminaba la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos:
∆pykFF (SEC ID nº 18) 45
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con
50 -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (1753689-1753766) de la región pykF (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), 55 ∆pykFR (SEC ID nº 19)
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-una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (1755129-1755051) de la región pykF (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos ∆pykFF y ∆pykFR fueron usados para amplificar el casete de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido fue luego introducido por medio de electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina fueron después seleccionados y la inserción del casete de resistencia fue verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos pykFF y pykFR definidos más adelante. La cepa retenida fue designada MG1655 ∆pykF::Km. pykFF (SEC ID nº 20): gcgtaaccttttccctggaacg (homóloga a la secuencia de 1753371 a 1753392). pykFR (SEC ID nº 21): gcgttgctggagcaacctgccagc (homóloga a la secuencia de 1755518 a 1755495).
Para transferir ∆pykF::Km, se usó el método de transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 ∆pykF::Km se usó para la transducción en la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB.
Los transformantes resistentes a kanamicina fueron después seleccionados y ∆pykF::Km se verificó por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos pykFF y pykFR. La cepa retenida fue designada MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF::Km.
El casete de resistencia a kanamicina fue después eliminado. El plásmido pCP20 portador de FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT del casete de resistencia a kanamicina fue después introducido en los sitios recombinantes mediante electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los casetes de resist encia a kanamicina fue verificada por medio de un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron anteriormente (sdaAF/sdaAR, sdaBF/sdaBR y pykFF/pykFR). La cepa retenida fue designada MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF.
2.3 Construcción de la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF Ptrc18-gpmA Ptrc18-gpmB
Para incrementar el nivel de 3-fosfoglicerato, los mutantes Ptrcl8-gpmA y Ptrcl8-gpmB son construidos. Primero, para reducir la expresión del gen fosfoglicerato mutasa gpmA, el promotor es reemplazado por un promotor trc constitutivo modificado con actividad débil. El Ptrc18-gpmA es transferido a la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF por medio de transducción.
La cepa MG1655 Ptrcl8-gpmA::Km es primero construida usando el mismo método que se describe anteriormente con los siguientes oligonucleótidos:
Ptrcl8-gpmAF (SEC ID nº 22)
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con -una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (786771-786819) del gen gpmA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), -una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), -una región (letra mayúscula en cursiva) para la secuencia de promotor trc donde las cajas -35 y -10 están subrayadas. Ptrcl8-gpmAR (SEC ID nº 23)
imagen19
con
-una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (786903-786819) de la región hacia 5' del gen gpmA (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
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imagen21
con
5 -una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (4631414-4631366) del gen gpmB (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
-una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97:6640-6645), 10 -una región (letra mayúscula en cursiva) para la secuencia de promotor trc donde las cajas -35 y -10 están subrayadas.
Ptrcl8-gpmBF (SEC ID nº 27) 15
imagen22
con
20 -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (4631280-4631365) de la región hacia 5' del gen gpmB (secuencia de referencia en el sitio web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/),
-una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
25 Los oligonucleótidos Ptrcl8-gpmBF y Ptrcl8-gpmBR se usan para amplificar el casete de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido es después introducido mediante electroporación en la cepa MG1655 (pKD46), en la cual la enzima recombinasa Red expresada, permite la recombinación homóloga. Los transformantes resistentes a cloranfenicol son luego seleccionados y la inserción del casete de resistencia es
30 verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos gpmBF y gpmBR definidos a continuación. La cepa retenida es designada MG1655 Ptrcl8-gpmB::Cm gpmBF (SEC ID nº 28): ccttacgaccaatctcatcaataccgg (homóloga a la secuencia de 4630906 a 4630932). gpmBR (SEC ID nº 29): GCAATACCATGACTCACCAGC (homóloga a la secuencia de 4631823 a 4631803).
35 Para transferir la modificación Ptrcl8-gpmB::Cm, se usa transducción con el fago Pl. El lisado de fago de la cepa MG1655 Ptrcl8-gpmB::Cm se usa para la transducción en la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF Ptrcl8-gpmA::Km. Los transformantes resistentes a cloranfenicol son seleccionados luego y Ptrcl8-gpmB::Cm se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos gpmBF y gpmBR. La cepa retenida es designada MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF Ptrcl8-gpmA::Km Ptrcl8-gpmB::Cm. Los casetes de resistencia a kanamicina y
40 cloranfenicol pueden ser entonces eliminados. El plásmido pCP20 portador de FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es después introducido en los sitios recombinantes por medio de electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es verificada mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos usados anteriormente (gpmAF/gpmAR y gpmBF/gpmBR). La cepa retenida es designada MG1655 ∆sdaA ∆sdaB
45 ∆pykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB.
2.4 Construcción de la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF Ptrc18-gpmA Ptrc18-gpmB (pME101-kivDll-yqhD-TT07)
El plásmido pME101-kivDll-yqhD-TT07 es después introducido en la cepa MG1655 ∆sdaA ∆sdaB ∆pykF Ptrcl850 gpmA Ptrcl8-gpmB.
Ejemplo 3
Construcción de cepas con flujo de vía de 1,3-propanodiol incrementado: MG1655 ∆metA ∆pykF 55 ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1 (pME101-kivDll-yqhD-TT07) (pMA-aaoro)
3.1 Construcción de la cepa MG1655 ∆metA
Para eliminar el gen metA, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). 60 Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o un casete de resistencia a
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kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos:
∆metAF (SEC ID nº 30):
imagen23
con
10 -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (4212310-4212389) de la región metA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), 15 ∆metAR (SEC ID nº 31):
imagen24
20 con
-una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (4213229-4213150) de la región metA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
25 -una región (letra mayúscula) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos ∆metAF y ∆metAR se usaron para amplificar el casete de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido fue después introducido mediante electroporación en la cepa MG 1655
30 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina fueron luego seleccionados y la inserción del casete de resistencia fue verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos ∆metAF y ∆metAR definidos a continuación. La cepa retenida fue designada MG1655 ∆metA::Km. metAF (SEC ID nº 32): tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc (homóloga a la secuencia de 4212203 a 4212232). metAR (SEC ID nº 33): ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt (homóloga a la secuencia de 4213301 a 4213272).
35 El casete de resistencia a kanamicina fue después eliminado. El plásmido pCP20 portador de FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT del casete de resistencia a kanamicina fue después introducido en los sitios recombinantes mediante electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida del casete de resistenci a a kanamicina fue verificada por medio de un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos que se usaron
40 anteriormente (metAF/metAR). La cepa retenida fue designada MG1655 ∆metA.
3.2 Construción de la cepa MG1655 ∆metA ∆pykF
Para transferir ∆pykF::Km, se usó transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 45 ∆pykF::Km (descrita anteriormente) se usó para la transducción en la cepa MG1655 ∆metA.
Los transformantes resistentes a kanamicina son después seleccionados y ∆pykF::Km se verificó por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos pykFF y pykFR. La cepa retenida fue designada MG1655 ∆metA DpykF::Km.
50
3.3 Construcción de la cepa MG1655 DmetA DpykF DthrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1
Para incrementar la expresión del alelo resistente a retroalimentación de la aspartocinasa/homoserina deshidrogenasa, thrA*1, se construyeron los siguientes plásmidos: pSB1 para obtener thrA*1 y pSB2 para 55 reemplazar el operón thrLABC por el alelo Ptrc-thrA*1.
El plásmido pSB1 se obtiene del plásmido pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631) y contiene el alelo thrA* de la aspartocinasa/homoserina con resistencia a retroalimentación reducida a treonina (Lee et al. 2003 J. Bacteriol. 185, 18 pp. 5442-5451) expresado a partir del promotor Ptrc. Para la construcción de pSB1, thrA fue
60 amplificado por PCR a partir de ADN genómico usando los siguientes oligonucleótidos:
BspHIthrA (SEC ID nº 34): TTATCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc con
5
15
25
35
45
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-una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (341-371) del gen thrA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción BspHI y bases extra,
SmaIthrA (SEC ID nº 35): TTACCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc con
-una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (2871-2841) del gen thrA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción SmaI y bases extra.
El fragmento amplificado por PCR fue cortado con las enzimas de restricción BspHI y SmaI y clonado en los sitios NcoI/SmaI del vector pTRC99A (Stratagene). Para la expresión a partir de un vector de bajo número de copias el plásmido pME101 fue construido como se expone a continuación. El plásmido pCL1920 fue amplificado por PCR usando los oligonucleótidos PME101F y PME101R y el fragmento BstZ17I-XmnI del vector pTRC99A que contiene el gen lacI y el promotor Ptrc fue insertado en el vector amplificado. El vector resultante y el vector que contiene el gen thrA fueron restringidos por ApaI y SmaI y el fragmento que contiene thrA fue clonado en el vector pME101. Para liberar ThrA de inhibición de retroalimentación la mutación thrAS345F fue introducida por mutagénesis dirigida en el sitio (Stratagene) usando los oligonucleótidos ThrA SF for y ThrA SF rev, dando por resultado el vector pSB1.
PME101F (SEC ID nº 36) ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R (SEC ID nº 37) agcttagtaaagccctcgctag
ThrA SF for (SEC ID nº 38)
imagen25
ThrA SF rev (SEC ID nº 39)
imagen26
Para eliminar el operón thrLABC y reemplazarlo por el alelo Ptrc-thrA*1, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o un casete de resistencia a kanamicina pero también de ADN adicional, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se construyó el siguiente plásmido, pSB2.
El plásmido pSB2 se obtiene del plásmido pUC18 (Norrander et al., Gene 26 (1983), 101-106) y contiene el casete de resistencia a cloranfenicol asociado al alelo Ptrc-thrA*1, clonado entre la región hacia 5’ de thrL y la región hacia 3’ de thrC.
Para la construcción de pSB2, la región hacia 5’ de thrL y la región hacia 3’ de thrC fueron amplificadas por PCR a partir de ADN genómico usando los siguientes oligonucleótidos:
HpaIupthrLF (SEC ID nº 40) CGTAGTTAACGAATTCccaactagttgcatcatacaactaataaacgtgg con
-una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (4638698-4638731) de la región thrL (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción HpaIy EcoRI y bases extra.
BstZ17IupthrLR (SEC ID nº 41)
imagen27
con -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (87-60) de la región thrL (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), -una región (letra mayúscula negrita) para la secuencia de terminador transcripcional T7te (Harrington K.J.,
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Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci USA. 24 de abril de 2001;98(9):5019-24.), -una región (letra mayúscula) para el sitio de clonación múltiple que se compone de los sitios de restricción BstZ17I, BamHI, SfoIy SmaI. BamHIdownthrCF (SEC ID nº 42)
imagen28
10 con
-una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (5021-5049) de la región thrC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
15 -una región (letra mayúscula negrita) para la secuencia de terminador transcripcional T7te (Harrington K.J., Laughlin R.B. y Liang S. Proc Natl Acad Sci USA. 24 de abril de 2001;98(9):5019-24.),
-una región (letra mayúscula) para el sitio de clonación múltiple que se compone de los sitios de restricción BstZ17I, BamHI, SfoIy SmaI. 20 HpaIdownthrCR (SEC ID nº 43) CGTAGTTAACGAATTCgagaatgcccgagggaaagatctg con
-una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (6054-6031) de la región thrC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), 25 -una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción HpaIy EcoRI y bases extra.
Primero, los fragmentos “upthrL” y “downthrC” fueron amplificados por PCR a partir de ADN génomico MG1655 usando oligonucleótidos HpaIupthrLF/BstZ17IupthrLR y BamHIdownthrCF/HpaIdownthrCR, respectivamente.
30 Segundo, el fragmento “upthrL-downthrC” fue amplificado a partir de fragmentos PCR “upthrL” y “downthrC” (que posee una región superpuesta compuesta por un terminador transcripcional T7Te y el sitio de clonación múltiple compuesto por los sitios de restricción BstZ17I, BamHI, SfoIy SmaI) usando oligonucleótidos HpaIupthrLF/ HpaIdownthrCR. El fragmento PCR “upthrL-downthrC” fue cortado con la enzima de restricción HpaI y clonado en los sitios EcoRI/SfoI del vector pUC18, dando el plásmido pUC18-DthrLABC::TT07-SMC.
35 Después, el casete de resistencia a cloranfenicol fue amplificado por PCR a partir del vector pKD3 usando los siguientes oligonucleótidos:
BstZ17ICmF (SEC ID nº 44) GGGGTATACtgtaggctggagctgcttcg con 40 -una región (letra minúscula) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
-una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción BstZ17I y bases extra. 45 BamHICmR (SEC ID nº 45) CGCGGATCCcatatgaatatcctccttag con
-una región (letra minúscula) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), 50 -una región (letra mayúscula) para el sitio de restricción BamHI y bases extra.
El fragmento PCR fue cortado con las enzimas de restricción BstZ17I y BamHI y clonado en los sitios BstZ17I/BamHI del plásmido pUC18-∆thrLABC::TT07-SMC, dando el plásmido pUC18-∆thrLABC::TT07-SMC::Cm.
55 Por ultimo, el alelo Ptrc-thrA*1 fue cortado del plásmido pSB1 con las enzimas de restricción SfoIy SmaI y clonado en los sitios SfoI/SmaI del plásmido pUC18-∆thrLABC::TT07-SMC::Cm, proporcionando el plásmido pUC18∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm o pSB2.
60 El fragmento ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm fue obtenido cortando el plásmido pSB2 con la enzima de restricción EcoRI y después fue introducido por electroporación en la cepa MG1655 (pKD46), en la cual la enzima recombinasa Red permite la recombinación homóloga. Los transformantes resistentes a cloranfenicol son después seleccionados y la inserción del casete de resistencia es verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos thrA*1F y thrA*1R definidos a continuación. La cepa retenida es designada MG1655 ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm. thrA*1F
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(SEC ID nº 46): cgtgttgcgtgttaccaactcg (homóloga a la secuencia (4638276-4638297) de la región thrL (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/)). thrA*1R (SEC ID nº 47) cggaaactgacgcctccgcag (homóloga a la secuencia (6345-6325) de la región thrC (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/)).
5 Los plásmidos recombinantes fueron verificados mediante secuenciación de ADN.
Para transferir ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm, se usa transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm se usa para la transducción en la cepa MG1655 ∆metA DpykF::Km.
10 Los transformantes resistentes a kanamicina y cloranfenicol son seleccionados luego y ∆thrLABC::TT07-PtrcthrA*1::Cm se verifica mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos thrA*1F y thrA*1R. La cepa retenida es designada MG1655 ∆metA ∆pykF::Km ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1::Cm.
15 Los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol pueden ser entonces eliminados. El plásmido pCP20 portador de FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es después introducido en los sitios recombinantes por medio de electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es verificada mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos usados anteriormente (metAF/metAR, pykF/pykFR y thrA*1F/thrA*1R). La cepa
20 retenida es designada MG1655 ∆metA ∆pykF ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1.
3.4 Construcción del plásmido pMA-aaoro
Un gen sintético del gen Rhodococcus opacus aao que codifica la aminoácido oxidasa fue preparado por Geneart
25 (Alemania). El uso de codón y contenido de GC del gen fueron adaptados a Escherichia coli de acuerdo con la matriz del proveedor. La expresión del gen sintético fue impulsada por un promotor Ptrc constitutivo. La construcción fue clonada en el vector pMA del proveedor y verificada mediante secuenciación.
Ptrc01-aaoro:
30 sitios de restricción (KpnI, EcoRI, SmaI) (SEC ID nº 48): ggtaccgaattccccggg
promotor Ptrc01 y RBS (SEC ID nº 49): gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaaggatcccccgggtaaggaggttataa
35 secuencia del gen aaoro optimizada para E. coli (AY053450.) (SEC ID nº 50):
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40 sitios de restricción (BglII, EcoRV, PacI, SacI, XbaI, HindIII) (SEC ID nº 51): gatctgatatcttaattaagagctctctagaaagctt 5
15
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35
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3.5 Construcción de la cepa MG1655 ∆metA ∆pykF ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1 (pME101-kivDll-yqhD-TT07) (pMAaaoro)
Los plásmidos pME101-kivDll-yqhD-TT07 y pMA-aaoro son luego introducidos en la cepa MG1655 ∆metA ∆pykF ∆thrLABC::TT07-Ptrc-thrA*1.
Ejemplo 4
Construcción de cepas con flujo de vía de 1,4-butanodiol incrementado: MG1655 ∆sucCD ∆aceBAK ∆arcA ∆gdhA (pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02) (pME101-kivDll-yqhD-TT07)
4.1 Construcción de la cepa MG1655 ∆aceBAK ∆sucCD
Para eliminar los genes aceBAK, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o un casete de resistencia a kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos:
∆aceBAKF (SEC ID nº 52):
imagen30
con -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (4213531-4213610) de la región aceB (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), -una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), ∆aceBAKR (SEC ID nº 53):
imagen31
con
-una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (4218298-4218220) de la región aceK (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos ∆aceBAKF y ∆aceBAKR se usan para amplificar el casete de resistencia a kanamicina del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido es luego introducido mediante electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina son después seleccionados y la inserción del casete de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos aceBAKF y aceBAKR definidos a continuación. La cepa retenida es designada MG1655 ∆metA::Km. aceBAKF (SEC ID nº 54): cgttaagcgattcagcaccttacc (homóloga a la secuencia de 4213251 a 4213274). aceBAKR (SEC ID nº 55): aacgcattacccactctgtttaatacg (homóloga a la secuencia de 4218728 a 4218702).
Para eliminar los genes sucCD, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o un casete de resistencia a kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos:
∆sucCDF (SEC ID nº 56):
imagen32
con -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (762268-762347) de la región sucC (secuencia de
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referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), -una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), ∆sucCDR (SEC ID nº 57):
imagen33
10 con
-una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (764241-764168) de la región sucD (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
15 -una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a cloranfenicol (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos DsucCDF y DsucCDR se usan para amplificar el casete de resistencia a cloranfenicol a partir del plásmido pKD3. El producto PCR obtenido es después introducido mediante electroporación a la cepa MG 1655
20 (pKD46). Los transformantes resistentes a cloranfenicol son luego seleccionados y la inserción del casete de resistencia es verificada por medio de un análisis PCR con los oligonucleótidos sucCDF y sucCDR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 ∆sucCD::Cm. sucCDF (SEC ID nº 58): tcgcgaatccgtgggcttcctggtaacg (homóloga a la secuencia de 761887 a 761914). sucCDR (SEC ID nº 59: cctctgatgccaaccgaagagatgagccg (homóloga a la secuencia de 764555 a 764527).
25 Para transferir ∆aceBAK::Km, se usa el método de transducción con el fago Pl. La preparación del lisado de fago de la cepa MG1655 DaceBAK::Km se usa para la transducción en la cepa MG1655 ∆sucCD::Cm.
Los transformantes resistentes a kanamicina y cloranfenicol son seleccionados luego y ∆aceBAK::Km se verifica
30 mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos previamente definidos aceBAKF y aceBAKR. La cepa retenida es designada MG1655 ∆sucCD::Cm ∆aceBAK::Km.
Los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol pueden ser entonces eliminados. El plásmido pCP20 portador de FLP recombinasa que actúa en los sitios FRT de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol
35 es después introducido en los sitios recombinantes por medio de electroporación. Después de una serie de cultivos a 42°C, la pérdida de los casetes de resistencia a kanamicina y cloranfenicol es verificada mediante un análisis PCR con los mismos oligonucleótidos usados anteriormente (aceBAKF/aceBAKR, y sucCDF/sucCDR). La cepa retenida es designada MG1655 ∆sucCD ∆aceBAK.
40 4.2 Construcción de la cepa MG1655 ∆sucCD ∆aceBAK ∆arcA ∆gdhA
Para eliminar el gen arcA, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o un casete de resistencia a kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes
45 oligonucleótidos:
∆arcAF (SEC ID nº 60):
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con
-una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (4638322-4638245) de la región arcA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), 55 -una región (letra mayúscula negrita) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645),
∆arcAR (SEC ID nº 61): 60
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TT02) (pME101-kivDll-yqhD-TT07)
Los plásmidos pUC19-Ptrc01/OP01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02 y pME101-kivDll-yqhD-TT07 son después introducidos en la cepa MG1655 ∆sucCD ∆aceBAK ∆arcA ∆gdhA. 5
Ejemplo 5
Fermentación de cepas que producen etilenglicol en matraces Erlenmeyer
10 Los rendimientos de las cepas fueron evaluados en cultivos en matraz Erlenmeyer con deflectores de 500 ml usando medio M9 modificado (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128) que fue complementado con 10 g/l MOPS y 10 g/l glucosa y ajustado a pH 6,8. En caso de ser necesario se añadió espectinomicina a una concentración de 50 mg/l y/o cloranfenicol se añadió en caso de ser necesario a una concentración de 30 mg/l. Un precultivo de 24h se usó para inocular un cultivo de 50 ml a un OD600 nm de aproximadamente 0,3. Los cultivos
15 fueron mantenidos en un agitador a 37°C y 200 rpm h asta que la glucosa en el medio de cultivo se agotó. Al final del cultivo, la glucosa y productos principales fueron analizados mediante HPLC usando una columna Biorad HPX 97H para la separación y un refractómetro para la detección. La producción de etilenglicol fue confirmada por medio de cromatografía de gases /espectrometría de masa (GC/MS) con un cromatógrafo de gases Hewlett Packard serie 6890 acoplado a un detector selectivo de masa Hewlett Packard serie 5973 (EI) y una columna HP-INNOWax (25 m
20 de longitud, 0,20 mm i.d., grosor de película 0,20 micras). El tiempo de retención y espectro de masa de etilenglicol generado fueron comparados con aquel de etilenglicol auténtico.
La comparación de los rendimientos entre la cepa de producción y la cepa de referencia se da en el cuadro a continuación (ver a continuación para la construcción de la cepa de producción).
25
Ref del cultivo
Genotipo de la cepa [etilenglicol] (mM)
FbDI_0180
MG1655 DpykF nd
FbDI_0184
MG1655 DpykF (pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07) (pCC1BAC-serA) 0,63
nd: no detectado.
Ejemplo 6
30 Construcción de una cepa con flujo de vía de etilenglicol incrementado: MG1655 ∆pykF (pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07) (pCC1BAC-serA)
6.1 Construcción de un plásmido para la sobreexpresión del ácido hidroxi ceto descarboxilasa kivD de Lactococcus
35 lactis, los genes hidroxi aldehído reductasa yqhD y fosfohidroxi piruvato fosfatasa yeaB de Escherichia coli: plásmido pME101-kivDll-yqhD-yeaB-TT07
El fragmento que contiene yeaB fue restringido por XbaIy BglII y clonado en el vector pME101-kivDll-yqhD restringido por las mismas enzimas de restricción, el plásmido resultante fue llamado pME101-kivDll-yqhD-yeaB
40 TT07.
El gen yeaB fue amplificado por PCR a partir de ADN genómico de la cepa MG1655 de E. coli con los oligonucleótidos yeaB F y yeaB R:
45 yeaB F (SEC ID nº 72)
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-una región (letra mayúscula en cursiva negrita) para adición de los sitios de restricción BstZ17I, EcoRI y BglII. 50 -una región (letra minúscula subrayada) para adición de un sitio de unión de ribosoma.
-una región (letra mayúscula) homóloga a la región MG1655 yeaB de E. coli de 1894195 a 1894215 (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), 55 yeaB R (SEC ID nº 73)
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7.4.3 Ensayo de ácido hidroxi ceto descarboxilasa
La descarboxilación de ácidos hidroxi ceto fue medida a 30°C usando un ensayo enzimático acoplado. El ensayo de
actividad ácido hidroxi ceto descarboxilasa se llevó a cabo con regulador de pH de fosfato de potasio 50 mM pH 6,
5 NADH 0,2 mM, MgSO4 1 mM, difosfato de tiamina 0,5 mM, 72 unidades/ml alcohol deshidrogenasa de
Saccharomyces cerevisiae, ácido hidroxi ceto 10 mM neutralizado (ácido hidroxipirúvico o ácido 4-hidroxi-2
cetobutírico o ácido 5-hidroxi-2-cetopentanoico) y aproximadamente 40 µg de proteína purificada en un volumen total
de 1 ml. El consumo de NADH fue monitorizado a 340 nm en un espectrofotómetro. La actividad detectada en
ensayo de control, que carece del sustrato, fue sustraída de la actividad detectada en el ensayo con sustrato. Una 10 unidad de actividad ácido hidroxi ceto descarboxilasa es la cantidad de enzima requerida para catalizar la
descarboxilación de 1 µmol de ácido hidroxi ceto por minuto a 30°C. (Epsilon 340 nm = 6290 M-1 cm -1).
7.5 Actividad de enzima purificada
Actividad de enzima purificada (mUI/mg)
Ensayo de hidroxipiruvato descarboxilasa
79
Ensayo de 4-hidroxi-2-cetobutirato descarboxilasa
70
Ensayo de 5-hidroxi-2-cetopentanoato descarboxilasa
63
15
Ejemplo 8 Demostración de la actividad hidroxi aldehído reductasa codificada por el gen yqhD de Escherichia coli
20 8.1 Construcción de una cepa para caracterización de YqhD: MG1655 ∆pykF::Km (pTRC99A-yqhD)
8.1.1 Construcción de la cepa MG1655 ∆yqhD::Km
Para eliminar el gen yqhD, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko & Wanner (2000). 25 Esta estrategia permite la inserción de un casete de resistencia a cloranfenicol o kanamicina, mientras elimina la mayoría de los genes en cuestión. Para este propósito se usaron los siguientes oligonucleótidos:
∆yqhDF (SEC ID nº 78)
imagen42
con -una región (letra minúscula) homóloga a la secuencia (3153377 a 3153456) de la región yqhD (secuencia de 35 referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/), -una región (letra mayúscula) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645), 40 ∆yqhDR (SEC ID nº 79)
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con 45 -una región (letra mayúscula) homóloga a la secuencia (3154540 a 3154460) de la región yqhD (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/),
-una región (letra mayúscula) para la amplificación del casete de resistencia a kanamicina (secuencia de 50 referencia en Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645).
Los oligonucleótidos ∆yqhDF y ∆yqhDR se usan para amplificar el casete de resistencia a kanamicina a partir del plásmido pKD4. El producto PCR obtenido es después introducido por medio de electroporación en la cepa MG 1655 (pKD46). Los transformantes resistentes a kanamicina son luego seleccionados y la inserción del casete de
55 resistencia es verificada mediante un análisis PCR con los oligonucleótidos yqhDF y yqhDR definidos más adelante. La cepa retenida es designada MG1655 ∆yqhD::Km. yqhDF (SEC ID nº 80): ggcgtctcgccatacaacaaacgcacatcgggc (homóloga a la secuencia de 3153068 a 3153100). yqhDR (SEC ID nº 81): gggctttgccgacaccttcttcgttcttg (homóloga a la secuencia de 3154825 a 3154797).
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