BRPI0808970B1 - microrganismos e métodos de produção de 1,2-propanodiol e acetol - Google Patents

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Relatório Descrito da Patente de Invenção para: "MICRORGANISMOS E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE 1,2-PROPANODIOL E ACETOL" INTRODUÇÃO A presente invenção se refere a um microrganismo modificado e ao seu uso para a preparação de 1,2-propanodiol e/ou acetol. 1.2- propanodiol ou propilenoglicol, um dialcool C3, é uma substância química amplamente utilizada. Ele é um componente das resinas de poliéster insaturadas, detergentes líquidos, refrigerantes, anticongelantes e fluidos descongelantes para aeronaves. Propilenoglicol tem sido cada vez mais usado desde 1993 - 1994 como um substituto dos derivados de etileno, os quais são reconhecidos como sendo mais tóxicos do que os derivados de propileno. 1.2- propanodiol é atualmente produzido por meios químicos usando um processo de hidratação de óxido de propileno que consome grandes quantidades de água. Óxido de propileno pode ser produzido por qualquer um dentre dois processos, um usando epicloridrina e o outro hidroperóxido. Ambas as vias usam substâncias altamente tóxicas. Além disso, a via do hidroperóxido gera subprodutos tais como terc-butanol e 1-feniletanol. Para que a produção de propileno se torne lucrativa, um uso deve ser encontrado para esses subprodutos. A via química geralmente produz 1,2-propanodiol racêmico, sendo que cada um dos dois estereosiômero (R)1,2-propanodiol e (S)1,2-propanodiol são de interesse para certas aplicações (por exemplo, materiais de partida quirais para produtos farmacêuticos e substâncias químicas peculiares).

Acetol ou hidroxiacetona (l-hidróxi-2-propanona) é um cetoálcool C3. Esse produto é utilizado em um processo de tintura em tanque na indústria têxtil como um agente redutor. Ele pode substituir vantajosamente agentes redutores tradicionais contendo enxofre para diminuir o conteúdo de enxofre em águas de rejeito, prejudiciais ao meio ambiente. Acetol também é um material de partida para a indústria química, usado, por exemplo, para fazer polióis ou moléculas heterocíclicas. Ele também possui propriedades quelantes e de solvente interessantes.

Acetol é atualmente produzido principalmente por oxidação catalítica ou desidratação de 1,2-propanodiol. Novos processos a partir de matérias-primas renováveis como glicerol são atualmente propostas (ver DE4128692 e WO 2005/095536). Atualmente, o custo de produção do acetol por processos químicos reduz suas aplicações industriais e comercializações.

As desvantagens dos processos químicos para a produção de 1,2-propanodiol e/ou acetol tornam a síntese biológica uma alternativa atraente. Duas vias foram caracterizadas para a produção natural desses produtos a partir dos açúcares por microrganismos.

Na primeira via, açúcares β-desóxi (por exemplo, L-ramnose ou L-fucose) são clivados em fosfato de diidroxiacetona e (S)-lactaldeído, os quais podem ser ainda reduzidos em (S)-1,2-propanodiol (Badia et al., 1985). Esta via é funcional E. coli, porém não pode produzir um processo economicamente viável devido ao custo elevado das desoxiexoses. A segunda via é o metabolismo dos açúcares comuns (por exemplo, glicose ou xilose) através da via da glicose seguido pela via do metilglioxal. Diidroxiacetona fosfato é convertido em metilglioxal que pode ser reduzido ou a lactaldeído ou a acetol. Esses dois compostos podem então sofrer uma segunda reação de redução produzindo 1,2-propanodiol. Esta via é utilizada por produtores naturais de (R)-1,2-propanodiol, tais como Clostridium sphenoides e Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum. Clostridium sphenoides tem sido usada para produzir 1,2-propanodiol em um título de 1,58 g/L sob condições de fosfato limitadas (Tran Din e Gottschalk, 1985). Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum também foram investigados em relação à produção de 1,2-propanodiol (Cameron e Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987). Os melhores desempenhos obtidos foram um titulo de 9 g/L e um rendimento de glicose de 0,2 g/g. Entretanto, a melhoria dos desempenhos obtidos com esses organismos parece ser limitada devido à falta das ferramentas genéticas disponíveis.

TÉCNICA ANTERIOR E. coli tem as capacidades genéticas para produzir naturalmente 1,2-propanodiol e acetol. A via biossintética para o 1,2-propanodiol inicia no intermediário da glicólise diidroxiacetona fosfato. Esse intermediário metabólico pode ser convertido em metilglioxal pela metilglioxal sintase codificada pelo gene mgsA (Cooper, 1984, Tõtemeyer et al, 1998). Metilglioxal é um eletrófilo extremamente tóxico que pode reagir com centros nucleofílicos de macromoléculas tais como DNA, RNA e proteínas. Isto pode inibir o crescimento bacteriano e causar a morte celular em concentrações muito baixas (0,3 a 0,7 mM) . Por esta razão, as vias existentes para a destoxificação de metilglioxal foram investigadas (Ferguson et al., 1998). Três vias foram identificadas em bactérias, e especialmente em E. coli: - A primeira é o sistema glioxalase I-II dependente de glutationa (codificada pelos genes gloA e gloB) os quais convertem metilglioxal em D-lactato em duas etapas. - A segunda é a enzima glioxalase III independente de glutationa a qual catalisa a conversão de metilglioxal em D-lactato. - A terceira é um sistema que engloba a degradação de metilglioxal por metilglioxal redutases.

Este último sistema é relevante para a produção de 1,2-propanodiol. Metilglioxal e um cetoaldeido C3, com um aldeido em Cl e uma cetona em C2. Essas duas posições podem ser reduzidas para álcool, produzindo respectivamente acetol (ou hidroxiacetona), uma molécula não-quiral e lactaldeido, uma molécula quiral a qual pode existir na forma L ou D (ver Figura 1) . Essas 3 moléculas, acetol, L-lactaldeído e D-lactaldeído podem ser subsequentemente reduzidas na outra produção para produzir 1,2-propanodiol quiral.

As vias preferivelmente usadas em E. coli não são claramente estabelecidas neste momento. Uma metilglioxal redutase, usando preferivelmente NADPH como co-fator, foi purificada e parcialmente caracterizada em E. coli (Saikus et al., 1987). 0 produto dessa reação foi demonstrado como sendo lactaldeido. Misra et al (1996) descreveram a purificação de duas atividades metilglioxal redutase produzindo o mesmo produto acetol. Uma atividade dependente de NADH poderia ser uma atividade de álcool desidrogenase, enquanto que a atividade dependente de NADPH poderia ser uma aldeido redutase não-especifica. Altaras e Cameron (1999) demonstraram que a glicerol desidrogenase (GldA) codificada pelo gene gldA de E. coli é ativa na redução de metilglioxal para (R)-lactaldeido, e também na conversão de acetol em 1,2-propanodiol. 0 gene yghZ foi clonado de E. coli, expresso e a proteína foi caracterizada (Grant, 2003) . Ele exibiu uma atividade específica elevada para o metilglioxal com NADPH como um cofator, porém o produto reacional não foi caracterizado. Quando superexpresso, esse gene conferiu resistência à toxicidade de metilglioxal.

Ko et al (2005) investigaram sistematicamente as 9-aldocetorredutases de E. coli como candidatas para a conversão de metilglioxal em acetol. Eles demonstraram que as 4 enzimas purificadas, YafB, YqhE, YeaE e YghZ foram capazes de converter metilglioxal em acetol na presença de NADPH. De acordo com seus estudos, as metilglioxal redutases YafB, YeaE e YghZ poderíam ser as mais relevantes para o metabolismo do metilglioxal ín vivo em termos de destoxificação. Di Luccio et al (2006) mostraram que o produto do gene ydjG de E. coli é ativo no metilglioxal com NADH, porém a caracterização do produto da reação não foi feita. Várias investigações para as modificações genéticas de E. coli para obter um produtor de 1,2-propanodiol usando fontes de carbono simples foram feitas pelo grupo de Cameron (Cameron et al, 1998, Altaras e Cameron, 1999, Altaras e Cameron, 2000) e pelo grupo de Bennett (Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003) . Estes estudos se baseiam na expressão dos vários genes codificando as atividades enzimáticas na via a partir de diidroxiacetona fosfato em 1,2-propanodiol. Cameron et al (1998) demonstraram que a superexpressão ou do gene codificando aldose redutase do cristalino de rato ou do gene gldA resultou na produção menor do que 0,2 g/L de 1,2-propanodiol. A melhoria deste titulo pode ser obtida pela co-expressão de dois genes de E. coli, mgsA e gldA. Com esta combinação, um titulo de 0,7 g/L de 1,2-propanodiol pode ser obtido (Altaras e Cameron, 1999). Outras melhorias nos títulos e rendimento foram obtidas durante a expressão de uma via de 1,2-propanodiol completa em E. coli (Altaras e Cameron, 2000) . Três genes, mgsA, gldA e fucO foram superexpressos em uma cepa sem o gene codificando a lactato desidrogenase {ldhA). Com esta combinação, os melhores resultados obtidos pelo grupo de Cameron são a produção de 1,4 g/L de 1,2-propanodiol em cultura em frasco anaeróbico com um rendimento de 0,2 g/g de glicose consumida. Quando extrapolada em fermentador de alimentação em lote anaeróbico, a produção foi de 4,5 g/L de 1,2-propanodiol com um rendimento de 0,19 g/g de glicose. Os resultados obtidos com a mesma abordagem, porém com títulos e rendimentos menores também estão descritos nas patentes US 6.087.140, ÜS 6.303.352 e WO 98/37204. O grupo de Bennett também utilizou uma cepa hospedeira de E. coli sem ldhA para a superexpressão do gene mgs de Clostridium acetobutylicum e do gene gldA de E. coli. Culturas em frasco sob condições anaeróbicas produziram um título de 1,3 g/L e um rendimento de 0,12 g/g, enquanto culturas microaeróbicas produzem um título de 1,4 g/L com um rendimento de 0,13 g/g.

Neste estágio, todos estes resultados não são melhores do que aqueles obtidos com as espécies T. thermosaccharolyticum.

Até agora, o uso de atividades endógenas a partir de microrganismos, e particularmente de E. coli, convertendo metilglioxal em acetol não foi ainda descrito.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere a um microrganismo modificado com uma atividade de redutase de metilglioxal reduzida e seu uso para a preparação de 1,2-propanodiol e/ou acetol. A enzima metilglioxal redutase é o produto de um gene dos microrganismos. 0 aumento da atividade de metilglioxal redutase é obtido pela superexpressão de um ou mais genes envolvidos na conversão de metilglioxal em acetol, preferivelmente selecionados dentre yqhD, yafB, yccM, yqhE, yeaE, yghZ, yaj0, tas, ydjG e ydbC.

Em outro aspecto da invenção, a atividade da metilglioxal sintase também é aumentada pela superexpressão do gene mgsA.

Em outro aspecto da invenção, a via de Entner-Doudoroff é eliminada pela anulação do gene edd, do gene eda ou de ambos. Além disso, a síntese de subprodutos indesejados é atenuada pela diminuição da expressão dos genes codificando as enzimas envolvidas na síntese de lactato a partir de metilglioxal (tal como gloA, aldA, aldB) , lactato a partir de piruvato (ldhA) , formato (pflA, pflB), etanol {adhE) e acetato (ackA, pta, poxB).

Preferivelmente, metade da glicose é metabolizada em diidroxiacetona fosfato e eventualmente em 1,2-propanodiol e/ou acetol pela anulação do gene tpiA. Opcionalmente, com um gene tpiA ativo, a atividade do gliceraldeído 3-fosfato é reduzida para redirecionar uma parte do gliceraldeído 3-fosfato disponível para a síntese de 1,2-propanodiol e/ou acetol. Em um aspecto da invenção, a eficiência da importação de açúcar é aumentada, seja pelo uso da importação de açúcar dependente do fosfoenolpiruvato (PEP) como aquele codificado por galP, ou pelo fornecimento de mais PEP ao sistema de açúcar-fosfotransferase. Isto é obtido pela anulação das vias consumindo piruvato quinases tipo PEP (codificadas pelos genes pykA e pykE) e/ou pela promoção da síntese de PEP, por exemplo, pela superexpressão de gene ppsA codificando a síntese de PEP.

Especificamente para a produção de 1,2-propanodiol, o microrganismo é opcionalmente modificado para aumentar outras enzimas conversoras da diidroxiacetona fosfato em 1,2-propanodiol, como a glicerol desidrogenase (codificada por gldA) e 1,2-propanodiol oxidorredutase (codificada por fucO) . Adicionalmente, é precioso para a enzima conversora de piruvato em acetil-CoA ser resistente às altas concentrações de NADH encontradas sob condições anaeróbicas. Isto pode ser obtido por uma mutação específica no gene lpd. Finalmente, para poupar NADH para a redução de acetol em 1,2-propanodiol, os genes arcA e ndh podem ser eliminados. 0 microorganismo usado para o preparo de 1,2-propanodiol é selecionado dentre bactérias, leveduras e fungos, porém é preferivelmente Escherichia coli ou Clostridium acetobutylicum. A presente invenção fornece um processo para a produção de 1,2-propanodiol pelo cultivo do microrganismo modificado em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples ou complexa e pela recuperação e purificação do 1,2-propanodiol produzido.

Especificamente para a produção do acetol, o gene codificando glicerol desidrogenase é atenuado ou anulado, evitando a formação de 1,2-propanodiol. 0 microrganismo usado para a preparação de acetol é selecionado dentre bactérias, leveduras e fungos, porém é preferivelmente ou Escherichia coli ou Klebsiella pneumoniae. Outro objeto da presente invenção é um processo para a produção de acetol, pelo cultivo do referido microrganismo modificado em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples e pela recuperação e purificação do acetol produzido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos associados que são incorporados em e constituem uma parte deste relatório descritivo exemplificam a invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios dessa invenção. A Figura 1 demonstra a engenharia genética do metabolismo central no desenvolvimento de um sistema de produção de 1,2-propanodiol a partir de carboidratos. A Figura 2 mostra o perfil de eluição de três proteínas YQHD, YDHF e GLDA em uma coluna de cromatografia de troca aniônica em pH 7.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada a um microrganismo modificado útil para a produção de 1,2-propanodiol e/ou acetol a partir de uma fonte de carbono, em que o referido microrganismo é caracterizado por uma atividade da metilglioxal redutase aumentada, codificado por um ou mais genes dos microrganismos.

Conforme aqui utilizados, os termos a seguir podem ser usados para a interpretação das reivindicações e relatório descritivo.

De acordo com a invenção, os termos "cultura", "crescimento" e "fermentação" são usados de maneira intercambiável para denotar o crescimento de bactérias em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples. 0 termo "microrganismo modificado" denota um microrganismo tal como uma bactéria, uma levedura ou um fungo que tenha sido modificado para aumentar a atividade da metilglioxal redutase. Tal modificação inclui meios usuais para transformar microrganismos com elementos genéticos, incluindo substituição gênica ou introdução de vetores para a expressão dos genes envolvidos na redução do metilglioxal. Ela também inclui mutagêneses aleatórias ou direcionadas do microrganismo sob condições comuns para induzir tal mutagênese. Ela também inclui métodos para a evolução de um microrganismo, tal como o método de evolução revelado em WO 2004/076659. O termo "útil para a produção" denota que o microrganismo produz os produtos de interesse por fermentação. Fermentação é um processo clássico que pode ser efetuado sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas. O termo "fonte de carbono", de acordo com a presente invenção, denota qualquer fonte de carbono que possa ser usada pelas pessoas versadas na técnica para manter o crescimento normal de um microrganismo, e a qual pode ser hexoses, pentoses, monossacarideos, dissacarideos, oligossacarideos, amido ou seus derivados, hemiceluloses, glicerol e suas combinações.

Uma "atividade enzimática aumentada" significa que a atividade é superior à atividade da enzima do tipo selvagem, conforme medido pelo mesmo microrganismo antes de qualquer modificação. O microrganismo não-modifiçado correspondente é um microrganismo com as mesmas características do microrganismo modificado, exceto pela modificação da atividade da metilglioxal redutase. A atividade da metilglioxal redutase pode ser medida por meios comuns, tais como os métodos revelados por Misra et al (Molecular and Cellular Biochemistry 156: 117-124 (1996)) ou Ko et al (J. Bacterid. 187: 5782-5789 (2005)).

Vantajosamente, a atividade da metilglioxal redutase é aumentada em pelo menos 50%, preferivelmente por pelo menos 100% em comparação com a atividade da metilglioxal redutase do microrganismo não-modifiçado correspondente.

Preferivelmente, o aumento da atividade da metilglioxal sintase é obtido pela superexpressão de pelo menos um gene envolvido na redução do metilglioxal. O termo "expressão" se refere à transcrição e tradução de uma sequência gênica que leva à geração da proteína correspondente, produto do gene.

Para obter uma superexpressão de um gene de interesse, a pessoa versada na técnica conhece diferentes métodos, tais como, por exemplo: 1. Substituição do promotor natural de um gene com um promotor induzindo um nível maior de expressão do referido gene de interesse.

Um nível maior de expressão pode ser obtido pela substituição do promotor natural de um gene com um promotor conhecido por induzir uma expressão de gene forte no microrganismo selecionado. Tais promotores para E. coli são, por exemplo, os promotores Ptrc, Ptac, Plac, o promotor lambda cl ou outros promotores conhecidos pelo especialista na técnica. Para outras espécies de microrganismos, as pessoas versadas na técnica são capazes de determinar os promotores que podem ser usados. 2. Introdução de múltiplas cópias do referido gene de interesse envolvidas na redução dimetilglioxal no microrganismo pela: - introdução de um vetor de expressão carregando e expressando o referido gene de interesse. - introdução de cópias adicionais do gene no cromossomo do microrganismo.

Em uma modalidade especifica da invenção, pelo menos um dos genes a seguir é superexpresso: yqhD, yafB, ydhF, yccM, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG e ydbC. Os referidos genes são codificantes das enzimas capazes de converter metilglioxal em acetol. Preferivelmente, o gene yqhD é superexpresso sozinho ou em combinação com outros genes.

Em outra modalidade da invenção o microrganismo com uma atividade metilglioxal aumentada é adicionalmente modificado.

Preferivelmente, o microrganismo de acordo com a invenção apresenta uma atividade da metilglioxal sintase que é aumentada. Vantajosamente, isto é obtido por um aumento da expressão do gene mgsA, codificando a metilglioxal sintase envolvida na conversão de DHAP em metilglioxal.

Outra forma de obter esta atividade enzimática aumentada é introduzir no gene mgsA uma mutação especifica que permita a tradução de um produto gênico apresentando uma atividade maior do que a proteína natural.

Preferivelmente, no microrganismo de acordo com a invenção, pelo menos um gene envolvido na via Entner-Doudoroff é atenuado. A via Entner-Doudoroff fornece uma via alternativa para degradar glicose em gliceraldeído 3-fosfato e piruvato, além de glicólise. A atenuação da via Entner-Doudoroff assegura que a maior parte ou, na melhor das hipóteses, toda a glicose seja degradada via glicólise e seja utilizada para a produção de 1,2-propanodiol.

Preferivelmente, a expressão de pelo menos um dos genes a seguir é atenuada: edd, eda. 0 termo "atenuação da atividade de uma enzima" se refere a um decréscimo na atividade da enzima de interesse, em comparação com a atividade observada no mesmo microrganismo antes de qualquer modificação. A pessoa versada na técnica conhece várias formas de obter este resultado e, por exemplo: - Introdução de uma mutação no gene, reduzindo o nível de expressão desse gene, ou o nível de atividade da proteína codificada. - Substituição do promotor natural do gene por um promotor de baixa força, resultando em uma expressão mais baixa. - Uso dos elementos que desestabilizam o RNA mensageiro correspondente ou a proteína. - Anulação do gene se a expressão não mais for necessária. 0 termo "atenuação da expressão de um gene", de acordo com a invenção, denota a supressão parcial ou completa da expressão de um gene, o qual é então dito como sendo "atenuado". Esta supressão da expressão pode ser ou uma inibição da expressão do gene, ou uma anulação de toda ou parte da região promotora necessária para a expressão gênica, ou uma anulação na região codificadora do gene. Preferivelmente, a atenuação de um gene é essencialmente a anulação completa daquele gene, cujo gene pode ser substituído por um gene marcador de seleção que facilita a identificação, isolamento e purificação das cepas de acordo com a invenção. Um gene é inativado preferivelmente pela técnica de recombinação homóloga (Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 6640-6645).

Em outra modalidade da invenção, a atividade de pelo menos uma enzima envolvida na conversão de metilglioxal em lactato é atenuada. 0 propósito desta atenuação é que o metilglioxal disponível é usado pela engrenagem celular essencialmente para a síntese de 1,2-propanodiol (ver Figura 1).

Os genes envolvidos na conversão de metilglioxal em lactato são, particularmente: - o gene gloA codificando a glicosilase I, catalisando a síntese de lactil glutationa a partir de metilglioxal, - os genes aldk e aldB codificando a lactaldeído desidrogenase (catalisando a síntese de (S) lactato a partir de (S) lactaldeído.

Um ou mais desses genes são vantajosamente atenuados no microrganismo. Preferivelmente, o gene gloA é atenuado ou completamente eliminado.

No microrganismo da invenção, é preferível que pelo menos uma enzima envolvida na síntese de subprodutos tais como lactato, etanol e formato seja atenuada.

Particularmente, é vantajoso atenuar o gene ldhA que codifica a lactato desidrogenase que catalisa a síntese de lactato a partir de piruvato, e o gene adhE codificando a álcool-aldeído desidrogenase catalisando a síntese de etanol a partir de acetil-CoA.

Semelhantemente, é possível forçar o microrganismo a usar o complexo da piruvato desidrogenase para produzir acetil-CoA C02 e NADH a partir de piruvato, ao invés de acetil-CoA e formato. Isto pode ser conseguido pela atenuação dos genes pflA e pflB que codificam a piruvato formato liase.

Em outra modalidade específica da invenção, a síntese do subproduto acetato é evitada pela atenuação de pelo menos uma enzima envolvida na sua síntese. É preferível evitar tal síntese de acetato para aperfeiçoar a produção de 1,2-propanodiol.

Para prevenir a produção de acetato, vantajosamente pelo menos um gene selecionado dentre ackA, pta e poxB é atenuado. Todos esses genes codificam enzimas envolvidas nas diferentes biossínteses de acetato (ver figura 1).

Em uma modalidade específica da invenção, a atividade da triose fosfato isomerase é atenuada. Preferivelmente, este resultado é conseguido pela atenuação da expressão do gene tpiA. 0 gene tpiA codifica a enzima "triose fosfato isomerase", a qual catalisa a conversão de DHAP em gliceraldeído 3-fosfato (ver Figura 1) . A atenuação da expressão desse gene assegura que metade da glicose metabolizada é convertida em 1,2-propanodiol e/ou acetol.

Em uma modalidade especifica da invenção, a atividade da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase é atenuada. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, também denominada GAPDH, é uma das enzimas chaves envolvidas na conversão glicolitica da glicose em ácido pirúvico. A atenuação da enzima resultou no redirecionamento de parte de GA3P para a síntese de 1,2-propanodiol e/ou acetol. 0 rendimento de 1,2-propanodiol em relação à glicose pode ser maior do que 1 mol/mol. Vantajosamente, a atividade da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é aproximadamente menor do que 30% da atividade usual de uma GADPH do tipo selvagem, mais preferivelmente menor do que 10%.

Preferivelmente, a expressão do gene GAPA codificando GAPDH é atenuada.

Preferivelmente, no microrganismo de acordo com a invenção, a eficiência da importação de açúcar é aumentada? Uma forte atenuação da expressão do gene GAPA resultante em um decréscimo do fluxo de carbono na reação GAPDH em mais de 50%, isto resultando na síntese de menos de 1 mol de PEP por mol de glicose importada. PEP é requerido pelo sistema de açúcar-fosfotransferase (PTS) normalmente usado para a importação de açúcares simples na célula, uma vez que a importação está acoplada a uma fosfotransferência de PEP para glicose, produzindo glicose-6-fosfato. Deste modo, a redução da quantidade de PEP irá impactar negativamente na importação de açúcar.

Em uma modalidade especifica da invenção, o açúcar deve ser importado no microrganismo por um sistema de importação de açúcar independentemente do fosfoenolpiruvato. 0 simportador da galactase-próton codificado pelo gene galP que não envolve a fosforilação pode ser utilizado.

Neste caso, a glicose importada tem que ser fosforilada pela atividade da glicose quinase codificada pelo gene glk. Para promover esta via, a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre galP e glk é aumentada. Como resultado, o PTS se torna dispensável, ele pode ser eliminado pela atenuação de pelo menos um gene selecionado dentre ptsH, ptsl ou crr.

Em outra modalidade especifica da invenção, a eficiência do sistema açúcar-fosfotransferase (PTS) é aumentada pela disponibilidade do metabólito fosfoenolpiruvato. Devido à atenuação da atividade GAPA e do fluxo de carbono reduzido para o piruvato, a quantidade de PEP na cepa modificada da invenção podería estar limitada, levando a uma menor quantidade de glicose transportada para a célula. Vários meios existentes podem ser usados para aumentar a disponibilidade de PEP em uma cepa de microrganismo. Particularmente, uma forma é atenuar a reação PEP -» piruvato. Preferivelmente, pelo menos um gene selecionado dentre pykA e pykF, codificando a enzima piruvato quinase, é atenuado na referida cepa para obter este resultado. Outra forma de aumentar a disponibilidade de PEP é favorecer a reação piruvato —» PEP, catalisada pela fosfoenolpiruvato sintase pelo aumento da atividade dessa enzima. Essa enzima é codificada pelo gene ppsA.

Consequentemente, preferivelmente no microrganismo, a expressão do gene ppsA é preferivelmente aumentada. Ambas as modificações podem estar presentes no microrganismo simultaneamente.

Em uma modalidade específica da invenção, o microrganismo modificado é designado para produzir principalmente 1,2-propanodiol. Este resultado é conseguido pelo favorecimento da conversão de acetol e outros precursores (por exemplo, lactaldeído) em 1,2-propanodiol. Isto inclui: - aumento da atividade da glicerol desidrogenase. Preferivelmente a expressão do gene gldA é aumentada. - aumento da atividade da 1,2-propanodiol oxidorredutase, preferivelmente pelo aumento da expressão do gene fucO.

Especialmente sob condições anaeróbicas ou microaeróbicas, é vantajoso que a enzima que favorece o metabolismo do piruvato em acetil CoA (particularmente do complexo piruvato desidrogenase) tenha baixa sensibilidade à inibição por NADH. Uma sensibilidade mais baixa é definida com referência à sensibilidade da enzima tipo selvagem. Tal característica pode ser obtida por uma mutação específica no gene lpd (codificando a subunidade da lipoamida desidrogenase de PDC) resultando na substituição da alanina 55 na sequência proteica da enzima pelo resíduo de valina.

Sob condições anaeróbicas ou micraeróbicas, a disponibilidade de NADH para a redução dos precursores em 1,2-propanoiol é vantajosamente aumentada. Isto é obtido pelo alívio da repressão no ciclo do ácido tricarboxílico mediada pelo regulador global arcA (codificado pelo gene arcA) . A concentração de NADH na célula pode também ser aumentada pela inativação da NADH desidrogenase II codificada pelo gene ndh. Consequentemente, preferivelmente, a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre arcA e ndh é atenuada.

Preferivelmente, o microrganismo designado para produzir principalmente 1,2-propanodiol é selecionado dentre bactérias, leveduras ou fungos. Mais preferivelmente, o microrganismo é selecionado dentre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae. Ainda mais preferivelmente, o microrganismo é ou das espécies Escherichia coli ou das espécies Clostridium acetobutylicum.

Em outra modalidade especifica da invenção, o microrganismo modificado é projetado para produzir principalmente acetol. Preferivelmente, este resultado é conseguido pela atenuação da atividade de pelo menos uma enzima envolvida na conversão de acetol em 1,2-propanodiol. Preferivelmente, a expressão do gene gldh é atenuada.

Vantajosamente, o microrganismo projetado para produzir principalmente acetol é uma bactéria, uma levedura ou um fungo. Mais preferivelmente, o microrganismo é selecionado dentre as espécies: Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae e Corynebacteriaceae. Ainda mais preferivelmente, o microrganismo é ou das espécies Escherichia coli ou Klebsiella pneumoniae. A invenção também está relacionada com um método para preparar 1,2-propanodiol, em que um microrganismo de acordo com a invenção cresce em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono, e o 1,2-propanodiol produzido é recuperado. A produção de 1,2-propanodiol é efetuada sob condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas.

Em uma modalidade, um microrganismo das espécies Escherichia coli cresce em um meio e crescimento apropriado contendo uma amostra de carbono simples.

Em outra modalidade, um microrganismo das espécies Clostridium acetobutylicum cresce em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples ou complexa.

Vantajosamente, o 1,2-propanodiol recuperado é adicionalmente purificado. A invenção também está relacionada com um método para preparar acetol, em que um microrganismo de acordo com a invenção cresce em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples e o acetol produzido é recuperado. A produção de acetol é efetuada sob condições aeróbicas o microaeróbicas, preferivelmente sob condições aeróbicas Vantajosamente, o acetol recuperado é adicionalmente purificado.

As condições de cultivo para o processo de fermentação pode ser prontamente definida pelas pessoas versadas na técnica. Particularmente, bactérias são fermentadas entre 20°C e 55°C, preferivelmente entre 25°C e 40°C, e preferivelmente em cerca de 35°C para C. acetbutylicum e em cerca de 37°C para E. coli e K. pneumoniae.

Esse processo pode ser efetuado ou em um processo em lote, em um processo de alimentação de lote ou em um processo continuo. "Sob condições aeróbicas" significa que oxigênio é fornecido à cultura pela dissolução do gás na fase liquida. Isto poderia ser obtido pela (1) pulverização de gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) na fase liquida, ou (2) agitação do frasco contendo o meio de cultura para transferir o oxigênio contido no espaço de cabeça na fase liquida. Vantagens da fermentação sob condições aeróbicas ao invés de condições anaeróbicas é que a presença de oxigênio como um aceptor de elétrons melhora a capacidade da cepa de produzir mais energia na forma de ATP para processos celulares. Consequentemente, a cepa tem seu metabolismo de modo geral melhorado.

Condições microaeróbicas são definidas como condições de cultivo em que porcentagens baixas de oxigênio (por exemplo, usando uma mistura de gás contendo entre 0,1 e 10% de oxigênio, completada até 100% de nitrogênio) são dissolvidas na fase liquida.

Condições anaeróbicas são definidas como condições de cultivo em que nenhum oxigênio é fornecido no meio de cultivo. Condições estritamente anaeróbicas são obtidas pulverizando um gás inerte como nitrogênio no meio de cultura para remover traços de outros gases. Nitrato pode ser usado como um aceptor de eletros para melhorar a produção de ATP pela cepa e melhorar o seu metabolismo. 0 termo "meio de crescimento apropriado", de acordo com a invenção, denota um meio de composição molecular conhecida adaptado ao crescimento do microrganismo. Por exemplo, um meio de cultura mineral de composição estabelecida conhecida adaptado ao uso por bactérias, contendo pelo menos uma fonte de carbono. Particularmente, o meio de crescimento mineral para E. coli ou K. pneumoniae pode deste modo ser de composição idêntica ou similar ao meio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 32:120-128), meio M63 (Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) ou um meio tal como definido por Schaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 8896) , e particularmente o meio de cultura mínimo chamado de MPG descrito abaixo: Ο ρΗ do meio é ajustado para 7,4 com hidróxido de sódio.

Solução de elementos traço*: ácido cítrico 4,37 g/L, MnS04 3 g/L, CaCl2 1 g/L, CoCl2 . 2 H20 0,1 g/L, ZnS04.7H20 0,10 g/L, CuS04.5H20 10 mg/L, H3BO3 10 mg/L, Na2Mo04 8,31 mg/L. A fonte de carbono usada para o cultivo de E. coli ou K. pneumoniae é preferivelmente uma fonte de carbono simples e pode ser arabinose, frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose ou xilose. Uma fonte de carbono especialmente preferida é a glicose. O meio de crescimento para C. acetobutylicum pode ser então de composição idêntica ou similar ao Meio de Crescimento de Clostridio (CGM, Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol. , 54 : 2717- 2722) ou um meio de crescimento mineral conforme apresentado por Monot et al. (Appl. Environm. Microbiol., 44: 1318-1324) ou Vasconcelos et al. (J. Bacterid., 176 : 1443-1450). A fonte de carbono para a cultura de C. acetobutylicum é uma amostra ou um carbono complexo. A fonte de carbono simples pode ser arabinose, frutose, galactose, glicose, lactose, maltose, sacarose ou xilose. Uma fonte de carbono simples especialmente preferida é a glicose. A fonte de carbono complexa pode ser amido ou hemicelulose. Uma fonte de carbono complexa especialmente preferida é o amido. A invenção é descrita acima, abaixo e nos Exemplos em relação à E. coli. Deste modo os genes podem ser atenuados, eliminados ou superexpressos para as cepas iniciais e evoluídas de acordo com a invenção são principalmente definidas usando a denominação dos genes de E. coli. Entretanto, esta designação tem um significado mais genérico de acordo com a invenção, e cobre os genes correspondentes nos outros microrganismos, usando as referências do GenBank dos genes de E. coli, as pessoas versadas na técnica podem determinar genes equivalentes em outros organismos diferentes de E. coli.

Os meios de identificação das sequências homólogas e de suas homologias de porcentagem são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e incluem particularmente os programas BLAST que podem ser usados no sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ com os parâmetros predefinidos indicados naquele sitio. As sequências obtidas podem ser exploradas (alinhadas) usando, por exemplo, os programas CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/), com os parâmetros predefinidos indicados nesses sitios. 0 bando de dados PFAM (banco de dados das famílias proteicas dos alinhamentos e modelos Markov escondidos http://www.sanqer.ac.uk/Software/Pfam/) é uma grande coletânea de alinhamentos de sequências proteicas. Cada PFAM torna possível a visualização de alinhamentos múltiplos, visualizar domínios proteicos, avaliar distribuições dentre os organismos, ganhar acesso a outros bancos de dados e visualizar estruturas proteicas conhecidas. COGs (clusters de grupos ortólogos de proteínas http://www.ncbi.nlm.nih,gov/COG) são obtidos pela comparação das sequências proteicas derivadas de 66 genomas unicelulares totalmente sequenciados representando 44 principais linhagens filogenéticas. Cada COG é definido a partir de pelo menos três linhagens, tornando possível a identificação de velhos domínios conservados. REFERÊNCIAS na ordem de citação no texto 1. Badia J, Ros J, Aguilar J (1985), J. Bacteriol 161: 435-437 . 2. Tran Din K e Gottschalk G (1985), Arch. Microbiol. 142: 87-92. 3. Cameron DC e Cooney CL (1986), Bio/Technology, 4: 651-654. 4. Sanchez-Rivera F, Cameron DC, Cooney CL (1987), Biotechnol. Lett. 9: 449-454. 5. Cooper RA (1984), Annu. Rev. Microbiol. 38: 49-68. 6. Tõtemeyer S, Booth NA, Nichols WW, Dunbar B, Booth IR (1998), Mol. Microbiol. 27: 553-562. 7. Ferguson GP, Tõtemeyer S, MacLean MJ, Booth IR (1998), Arch. Microbiol. 170: 209-218. 8. Saikusa T, Rhee HI, Watanabe K, Murata K, Kimura A (1987), Agric. Biol. Chem. 51: 1893-1899. 9. Misra K, BanerjeeAB, Ray S, Ray M (1996), Mol. Cell. Biochem. 156: 117-124. 10. Altaras NE e Cameron DC (1999), Appl. Environ. Microbiol. 65: 1180-1185. 11. Grant AW, Steel G, Waugh H, Ellis EM (2003), FEMS Microbiol. Lett. 218: 93-99. 12. Di Luccio E, Elling RA, Wilson DK (2006), Biochem. J. 400: 105-114. 13. Ko J, Kim I, Yoo S, Min B, Kim K, Park C (2005), J. Bacteriol. 187: 5782-5789.

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EXEMPLOS

Exemplo 1: Extração, purificação e identificação de enzimas envolvidas na redução do metilglioxal na cepa de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, ldhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd cultivada em quimiostato. a) Processo de purificação das enzimas dependentes de NADH ou NADPH envolvidas na redução de metilglioxal: O processo de purificação global projetado para purificar as enzimas dependentes de NADH ou NADPH envolvidas na redução de metil é composto de cinco passos. Em cada passo, as enzimas alvo foram detectadas por ensaios de atividade enzimática. Duas atividades enzimáticas foram medidas: 1) Redução de metilglioxal dependente de NADPH, 2) Redução de metilglioxal dependente de NADH. 1) Biomassa microbiana foi coletada de culturas quimiostato de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, ldhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (para a construção da cepa ver WO 2005/073364)efetuado ou sob condições estritamente anaeróbicas o sob condições microaeróbicas. 2) As células foram coletadas por centrifugação, lavadas duas vezes com tampão HEPES 50 mM pH 7,5 com DTT 5 mM, ressuspensas no mesmo tampão antes do armazenamento a -20°C. 3) As células foram rompidas por ultra-som (a 0°C, sob condições anaeróbicas, em quatro ciclos de 30 s com intervalos de 2 minutos entre cada ciclo na presença de inibidores da protease). Os fragmentos celulares foram eliminados por centrifugação e os ácidos nucleicos presentes no homogenato celular foram precipitados por tratamento com sulfato de estreptomicina ou hidrolisados por um tratamento enzimático (benzonase) (tabela I).

Tabela 1: Influência dos tratamentos com benzonase ou sulfato de estreptomicina (negrito) do homogenato celular nas atividades enzimáticas envolvidas na redução do metilglioxal: De acordo com a Tabela 1, o tratamento com sulfato de estreptomicina é mais eficiente, levando a uma atividade especifica superior. Isto permite a remoção dos contaminantes (ácidos nucleicos e proteínas indesejáveis) enquanto mantém as atividades biológicas da enzima de interesse. 4) 0 homogenato celular tratado com sulfato de estreptomicina foi centrifugado e aplicado a uma coluna cromatográfica trocadora de ânions (Ressource Q, Amersham Bioscience) em conexão com um sistema purificador AKTA e equilibrado com tampão HEPES 50 mM com DTT 5 mM. A separação proteica foi feita em pH 7 ou 7,5 ou 8. As proteínas foram eluídas por um gradiente de KC1 continuo (2%) e coletadas como frações separadas. 5) As frações de eluição contendo atividades enzimáticas foram reunidas e aplicadas em uma coluna cromatográfica de interação hidrofóbica (Hitrap phenyl sepharose, Amersham Biosciences) equilibrada com tampão HEPES 50 mM com DTT 5 mM.

Uma etapa final de cromatográfia de permeação em gel pode ser adicionada, caso seja necessário.

Os rendimentos e o fator de purificação foram determinados depois de cada passo. Depois do último passo de purificação, as proteínas remanescentes nas frações ativas foram separadas em um SDS-gel de poliacrilamida. A proteína de interesse foi identificada pela correlação da atividade da fração com o tamanho das manchas. A mancha proteica foi cortada, lavada e digerida com uma protease específica (digestão com tripsina) e submetida À espectrometria de massa (LC-MS/MS e MALDI) para ser identificada. b) Identificação de enzimas envolvidas na redução do metilglioxal em E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, ldhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd crescida sob condições anaeróbicas: 0 processo de purificação usando uma cromatografia de troca aniônica em pH 7, seguido por cromatografia de interação hidrofóbica resultou na identificação de duas enzimas dependentes de NADPH que reduzem o metilglioxal: YQHD (42 KDa) codificada pelo gene yqhD e YDHF (33 KDa) codificada pelo gene ydhF (figura 2) . Uma terceira enzima foi descoberta (a glicerol desidrogenase) codificada pelo gene gldA) a ser ativo na redução do metilglioxal dependente de NADH e NADPH.

Quando a cromatografia de troca aniônica foi efetuada em ρΗ 8 e seguida por uma cromatograf ia de interação hidrofóbica e um passo final de cromatografia de permeação em gel, outra enzima dependente de NADPH que reduz o metilglioxal foi identificada: a 2,5-diceto-D-gliconato redutase B (29 KDa) codificada pelo gene dkgB (yafB). c) Identificação das enzimas envolvidas na redução de metilglioxal em E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, ldhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd crescida sob condições microaeróbicas: 0 processo de purificação designado usando uma cromatografia de troca aniônica em pH 7,5 resultou na identificação de uma proteína de 36 KDa chamada de YCDW codificada pelo gene ycdW catalisando a redução dependente de NADPH do metilglioxal.

Quando a cromatografia de troca aniônica foi feita em pH 7,5 seguido por uma cromatografia de interação hidrofóbica, duas outras enzimas dependentes de NADPH catalisando a redução de metilglioxal foram identificadas: YQHD (42 KDa) codificada pelo gene yqhD (já purificado a partir das células crescidas sob condições anaeróbicas) e a 2,5-diceto-D-gliconato redutase A (31 KDa) codificada pelo gene dkgA (yqhE).

Exemplo 2: Introdução das eliminações AyqhO , AyafB , AydhF e AycdW na cepa de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, ldhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd para avaliar o envolvimento dos genes na redução do metilglioxal a) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, ldhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd 0 cassete de resistência ao clorafenicol foi eliminado na cepa de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, ldhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd::cm de acordo com o protocolo 1.

Protocolo 1: Anulação dos cassetes de resistência Os cassetes de resistência ao cloranfenicol e/ou canamicina foram eliminados de acordo com a técnica a seguir. 0 plasmideo pCP20 carregando a recombinase FLP atuando nos sitios FRT dos cassetes de resistência do cloranfenicol e/ou canamicina foi introduzido na cepa por eletroporação. Depois de uma cultura em série a 42°C, a perda dos cassetes de resistência a antibióticos foi verificada por análise de PR com os oligonucleotideos dados na Tabela 2. A presença das modificações previamente construídas na cepa foi verificada usando os oligonucleotideos dados na Tabela 2. A cepa obtida foi nomeada E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, IdhA::km, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd.

Tabela 2: Oligonucleotideos usados para verificar a inserção de um cassete de resistência ou a perda de um cassete de resistência. b) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd Para eliminar o cassete de resistência à canamicina e para inativar o gene ldhA, o cassete de resistência ao clorafenicol foi inserido no gene ldhA eliminando a maior parte dos genes envolvidos de acordo com o Protocolo 2.

Protocolo 2: Introdução de um produto de PCR para recombinação e seleção dos recombinantes.

Os oligonucleotideos escolhidos e dados na Tabela 3 para substituição de um gene ou uma região intergênica foram usados para amplificar ou o cassete de resistência ao clorafenicol do plasmideo pKD3 ou o cassete de resistência à canamicina do plasmideo pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)). O produto de PCR obtido foi então introduzido por eletroporação na cepa receptora com o plasmideo pKD46 na qual o sistema λ Red (γβ, exo) expresso favorece bastante a recombinação homóloga. Os transformantes resistentes a antibiótico foram então selecionados e a inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos apropriados dados na Tabela 2.

As outras modificações da cepa foram verificadas com os oligonucleotideos dados na Tabela 2. A cepa resultante foi chamada de E. coli MG1655 Ipd*, AldhA::cmAtpiA, ApflAB, AadhE, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd. Tabela 3: Oligonucleotideos usados para a substituição de uma região cromossomal por recombinação com um produto de PCR na cepa de E. coli MG1655.

c) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 lpd* , AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldBr Aeddr AyqhD 0 gene yqhO foi inativado na cepa de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e eliminando a maior parte do gene envolvido usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotideos dados na Tabela 3. A cepa resultante foi nomeada de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AyqhD::km.

As outras modificações da cepa foram verificadas com os oligonucleotideos dados na Tabela 2.

Os cassetes de resistência ao clorafenicol e à canamicina foram então eliminados de acordo com o Protocolo 1. A cepa obtida foi nomeada de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AyqhD.

d) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AyafB 0 gene yafB foi inativado na cepa de E. coli MG1655 pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e pela anulação da maior parte do gene envolvido usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotideos dados na Tabela 3. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 AyafB::km. A anulação do gene yafB por substituição do gene por um cassete de resistência à canamicina na cepa de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldBr Aedd foi efetuada pela técnica de transdução com o fago Pl.

Protocolo 3: Transdução com o fago Pl para anulação de um gene A anulação do gene escolhido por substituição do gene por um cassete de resistência (canamicina ou cloranfenicol) na cepa de E. coli receptora foi efetuada pela técnica de transdução com o fago Pl. 0 protocolo se deu em dois passos, (i) a preparação do fago lisato na cepa MG1655 com um único gele eliminado e (ii) a transdução da cepa receptora por este lisato de fago.

Preparação do lisato de fago - Semeadura com 100 μΐι de uma cultura de um dia para o outro da cepa MG1655 com um único gene eliminado de 10 mL de LB + Cm 30 μg/mL + glicose 0,2% + CaCl2 5 mM. - Incubação por 30 min a 37°C com agitação. - Adição de 100 μΙ; de lisato de fago Pl preparado na cepa de tipo selvagem MG1655 (aprox. 1 x 109 fago/mL). - Agitação a 37°C por 3 horas até todas as células serem lisadas. - Adição de 200 μΐ de clorofórmio, e submissão a vórtex. -Centrifugação por 10 min a 4500 g para eliminar os fragmentos celulares. - Transferência do sobrenadante em um tubo estéril e adição de 200 μΐ de clorofórmio. - Armazenamento do lisato a 4°C.

Transdução - Centrifugação por 10 min a 1500 g de 5 mL de uma cultura de um dia para o outro da cepa receptora de E. coli em meio LB. - Suspensão do pélete celular em 2,5 mL de MgS04 10 mM, CaCl2 5 mM. - Tubos de controle: 100 μΤ de células 100 μύ de fagos PI da cepa MG1655 com um único gene eliminado. - Tubo de teste: 100 μΐ de células + 100 μύ de fagos PI da cepa MG1655 com um único gene eliminado. - Incubação por 30 min a 30°C sem agitação. - Adição de 100 μΐ de citrato de sódio 1 M em cada tubo, e submissão a vórtex. - Adição de 1 mL de LB. - Incubação por 1 hora a 37°C com agitação. - Plaqueamento em placas LB + Cm 30 μς/ηΛ depois da centrifugação dos tubos por 3 min a 7000 rpm. - Incubação a 37°C de um dia para o outro.

Os transformantes resistentes a antibióticos foram então selecionados e a inserção da anulação foi verificada por uma análise de PCR com os oligonucleotideos apropriados dados na Tabela 1.

As outras modificações da cepa foram verificadas com os oligonucleotideos dados na Tabela 2. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA:: cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, Ay a fB: : km.

Os cassetes de clorafenicol e canamicina foram então eliminados de acordo com o Protocolo 1. A cepa obtida foi chamada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AyafB.

e) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AydhF 0 gene ydhF foi inativado na cepa de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e pela anulação da maior parte dos genes envolvidos usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotideos dado na Tabela 3. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AydhF::km.

As outras modificações da cepa foram verificadas com os oligonucleotideos dados na Tabela 2.

Os cassetes de resistência ao clorafenicol e canamicina foram a seguir eliminados de acordo com o Protocolo 1. A cepa obtida foi nomeada E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AydhF.

f) Construção de uma cepa modificada de E. coli MG1655 lpd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AycdW 0 gene ycdW foi inativado na cepa de E. coli MG1655 pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina e pela anulação da maior parte dos genes envolvidos usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotideos dados na Tabela 3. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 AycdW:: km. A anulação do gene ycdW pela substituição do gene por um cassete de resistência à canamicina na cepa de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd foi efetuada pela técnica de transdução com o fago PI descrito no Protocolo 3. 0 lisato do fago PI foi obtido na cepa E. coli MG1655 AycdW: :km e a transdução da cepa de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd foi efetuada usando este lisato de fago. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA::cm, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AycdW: :km.

As outras modificações da cepa foram verificadas com os oligonucleotideos dados na Tabela 2.

Os cassetes de resistência ao clorafenicol e à canamicina foram então eliminados de acordo com o Protocolo 1. A cepa obtida foi nomeada de E. coli MG1655 Ipd*, AtpiA, ApflAB, AadhE, AldhA, AgloA, AaldA, AaldB, Aedd, AycdW. f) Cultivo das cepas com as anulações nos genes codificando as metilglioxal redutases identificadas As quatro cepas com as anulações AyqhD, AyafB, AydhF e AycdW foram cultivadas em frascos de erlenmeyer usando condições microaeróbicas em meio MPG em pH 6,7 e a 37°C.

Depois de 72 h de cultivo, a produção de acetol e 1,2-propanodiol foi medida por HPLC no sobrenadante das culturas. Os resultados estão dados na Tabela 4.

Tabela 4: Produção de 1,2-propanodiol e acetol na cepa com as anulações nos genes codificando as metilglioxal redutases (cada valor é uma média de dois valores de duas culturas diferentes).

Os resultados mostraram que todas as metilglioxal redutases identificadas estão envolvidas na conversão de metilglioal em acetol e ainda em 1,2-propanodiol. A anulação de yqhD resultou em uma forte inibição de crescimento possivelmente devido ao acúmulo de metilglioxal. As anulações de yafB e ydhF também são um impacto principal na produção de acetol e 1,2-propanodiol. Exemplo 3. Construção das cepas modificadas de E. coli MG1655 (pMElOlVBOl-yqhD-mgsA-gldA) , E. coli MG1655 (pMElOlVBOl-yafB-mgsA-gldA) e de E. coli MG1655 (pMElOlVBOl-yqhE-mgsA-gldA) Para aumentar a produção de 1,2-propanodiol diferentes combinações dos genes foram expressas a partir do plasmídeo pMElOlVBlOl usando o promotor trc. a) Construção do plasmídeo pMElOlVBOl O plasmídeo pMElOlVBOl foi derivado do plasmídeo pMElOl e abrigou um sítio de clonagem múltiplo contendo sequências do sítio de reconhecimento específicas para as endonucleases de restrição raras Nhel, SnaBI, PacI, BglII, Avrll, SacII e Agel seguido pelo terminador de transcrição ade de Clostridium acetobutylicum ATCC824.

Para a expressão de um vetor de cópia baixo o plasmídeo pMElOl foi construído da seguinte forma. O plasmídeo pCL1920 (Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 - GenBank AX085428) foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos PME10F e PME101R e o fragmento BstZ17I-Xmnl do vetor pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) abrigando o gene lacl e o promotor trc foi inserido no vetor amplificado. PME101F (SEQ ID NO 55): ccgacagtaagacgggtaagcctg PME101R (SEQ ID NO 56): agcttagtaaagccctcgctag Um ligante de ácido nucleico de fita dupla sintético compreendendo o sitio de multiclonagem e o terminador transcricional ade foi usado para gerar pMElOlVBOl. Dois oligonucleotideos com 100 bases que flanqueiam o complemento pelos sítios de restrição digeridos Ncol ou HindIII foram anelados. O produto de par com 100 bases foi subclonado no plasmídeo pMElOl digerido NcoI/HindIII para gerar pMElOlVBOl. pMElOlVBO 1, consistindo de 100 bases (SEQ ID NO: 57): catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAA ATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca pMElOlVBOl 2, consistindo de 100 bases (SEQ ID NO 58): agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTT Aaccggtgagctccctagqaqatctttaattaatacqtaqctaqcc com: - uma região (letras minúsculas sublinhadas) correspondendo ao sítio de multiclonagem - uma região (letras maiúsculas) correspondendo à terminação de transcrição ade (sequência 179847 a 179814) de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 pSOLl (NC_001988). b) Construção dos plasmídeos para a expressão de diferentes combinações dos genes da via biossintética de 1,2-propanodiol (pMElOlVBOl-yqhD-mgsA-gldA, pME101VB01-yaf\B-mgsA-gldA e pMElOlVBOl-yqhE-mgsA-gldA) Os genes diferentes foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico de E. coli MG1655 usando os oligonucleotideos dados na Tabela 1.

Tabela 5: oligonucleotideos usados para a amplificação dos genes da via do 1,2-propanodiol.

Os fragmentos amplificados por PCR foram cortados com as enzimas de restrição mencionadas na Tabela 5 e clonados nos sítios de restrição do plasmídeo pMElOlVBOl. Os plasmídeos a seguir foram construídos: pMElOlVBOl-yghD-mgsA-gldA, pMElOlVBOl-yafB-mgsA-gldA e pMElOlVBOl-yghE-mgsA-gldA.

Os plasmídeos foram a seguir introduzidos na cepa de E. coli MG1655.

Exemplo 4: Construção das cepas modificadas de E. coli MG1655 Ptrcll6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF (pMElOlVBOl-yqhD-mgsA-gldA), (pJBl37-PgapA-ppsA), E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF (pMElOlVBOl-yafB-mgsA-gldA) , (pJBl37-PgapA-ppsA) e E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA , Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF (pMElOlVBOl-yqhE-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA) capazes de produzir 1,2-propanodiol com alto rendimento A substituição do promotor GAPA natural com o promotor Ptrclô curto sintético (SEQ ID NO: 69: qagctgttgacqattaatcatccqqctcqaataatgtgtgg) na cepa de E. coli MG1655 foi feita pela substituição e 225 pb da sequência GAPA à montante com FRT-CmR-FRT e um promotor projetado usando a técnica descrita no Protocolo 2 com o oligonucleotideos dados na Tabela 3. A inserção do cassete de resistência foi verificada por análise de PCR com os oligonucleotideos dados na Tabela 2. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ptrclô-gapA::cm.

Os genes edd-eda foram inativados pela cepa de E. coli MG1655 pela inserção de um cassete de resistência de antibiótico de canamicina e anulando a maior parte dos genes envolvidos usando a técnica descrita no Protocolo 2 com os oligonucleotideos dados na Tabela 3. A cepa obtida foi nomeada E. coli MG1655 Aedd-eda::km. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA::cm, Aedd-eda::km.

Os cassetes de resistência a antibiótico foram então eliminados de acordo com o Protocolo 1. A cepa MG1655 AgloA::cm foi construída de acordo com o Protocolo 2 com os oligonucleotideos dados na Tabela 3 e essa anulação foi transferida para a cepa previamente construída de acordo com o Protocolo 3. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA: : cm. O gene pykA foi inativado na cepa anterior pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico canamicina de acordo com o Protocolo 2 com os oligonucleotideos dados na Tabela 3. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA::cm, ApykA::km.

Os cassetes de resistência a antibiótico foram a seguir eliminados de acordo com o Protocolo 1. 0 gene pykF foi inativado pela inserção de um cassete de resistência ao antibiótico clorafenicol de acordo com o Protocolo 2 com os oligonucleotideos dados na Tabela 3. A cepa resultante foi nomeada E. coli MG1655 Ptrclõ-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF::cm. 0 cassete de resistência ao antibiótico foi a seguir eliminado de acordo com o Protocolo 1.

Em cada passo, a presença de todas as anulações anteriormente construídas foi verificada usando os oligonucleotideos dados na Tabela 3.

Para aumentar a produção do fosfoenolpiruvato o gene ppA foi expresso a partir do plasmideo pJB137 usando o promotor gapA. Para a construção do plasmideo pJB137-PgapA-ppsA, o gene ppsA foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico de E. coli MG1655 usando os seguintes oligonucleotideos: 1. GAPA-ppsAF, consistindo de 65 bases (SEQ ID NO: 70) ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGC TGGTGC com: - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (1785106-1785136) do gene ppsA (1785136 a 1782758), uma sequência de referência no sitio http://genolist.pasteur.fr/Colibri/) , e - uma região (letras minúsculas) homóloga ao promotor GAPA (1860794 - 1860761). 2. ppsAR, consistindo de 43 bases (SEQ ID NO: 71) aatcqcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC com - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (1782758-1782780) do gene ppsA (1785136 a 1782758), - um sitio de restrição HindIII (letras sublinhadas) Ao mesmo tempo, a região promotora gapA do gene gapA de E. coli foi amplificada usando os seguintes oligonucleotideos: 1. gapA-ppsAR, consistindo de 65 bases (SEQ ID NO: 72) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttag tgaataaaagg com: - uma região (letras maiúsculas) homóloga à sequência (1785106 - 1785136) do gene ppsA (1785136 a 1782758), e - uma região (letras minúsculas) homóloga ao promotor gapA (1860794 - 1860761). 2. gapAF, consistido de 33 bases (SEQ ID NO: 73). ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc com: - uma região (letras minúsculas) homóloga ao promotor gapA (1860639 - 1860661). - um sitio de restrição Smal (letras sublinhadas). Ambos os fragmentos foram subsequentemente fundidos usando os oligonucleotideos ppsAR egapAF (Horton et al. 1989 Gene 77:61-68). O fragmento amplificado de PCR foi cortado com as enzimas de restrição HindIII e Smal e clonado nos sítios HindIII/Smal do vetor pJB137 (Número de Acesso EMBL: U75326) originando o vetor pJBl37-PgapA-ppsA.

Os diferentes plasmídeos pMElOlVBOl e pJB137-PgapA-ppsA foram introduzidos na cepa de E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF. As cepas obtidas foram nomeadas respectivamente como E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF, pMElOlVBOl-yqhD-mgsA- gldA, pJB137-PgapA-ppsA (cepa 1) , E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF, pMElOlVBOl-yafB-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (cepa 2) e E. coli MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloAr ApykA, ApykF, pMElOlVBOl-yghE-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (cepa 3).

Exemplo 5: Comparação de diferentes cepas para a produção de 1,2-propanodiol sob condições aeróbicas.

As cepas obtidas conforme descrito no Exemplo 4 (cepas 1, 2 e 3) e as cepas de controle (controle 1: MG1655 pMElOlVBOl-yqhD-mgsA-gldA, controle 2 : MG1655 pMElOlVBOl-yafB-mgsA-gldA, controle 3: MG1655 pMElOlVBOl-yghE-mgsA- gldA e controle 4 : MG1655 Ptrcl6-gapA, Aedd-eda, AgloA, ApykA, ApykF) foram cultivadas em um ensaio em frasco de erlenmeyer sob condições aeróbicas em meio mínimo com glicose como fonte de carbono. 0 cultivo foi efetuado a 34°C ou 37°C e o pH foi mantido pelo tamponamento do meio de cultura com MOPS. No final do cultivo, 1,2-propanodiol, acetol e glicose residual no caldo de fermentação foram analisados por HPLC e os rendimentos de 1,2-propanodiol em relação à glicose e 1,2-propanodiol + acetol em glicose foram calculados.

Cepa Titulo de Título de Rendimento Rendimento 1,2- acetol de 1,2- de 1,2- REIVINDICAÇÕES

Claims (19)

1. Microrganismo Escherichia coli modificado útil para a produção de 1,2-propanodiol e/ou acetol a partir de uma fonte de carbono caracterizado pelo fato do microrganismo possuir: - a superexpressão do gene yqhD que codifica uma metilglioxal redutase; e - a deleção dos genes edd e/ou eda envolvidos na via Entner-Doudoroff ; - a superexpressão do gene mgsA que codifica uma metilglioxal sintase; - a superexpressão do gene gldA que codifica uma glicerol desidrogenase.

2. Microrganismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superexpressão do gene yqhD é obtida pela substituição do promotor natural do gene yqhD com um promotor induzindo um nivel mais forte de expressão do referido gene, ou através da introdução de múltiplas cópias do gene yqhD no referido microrganismo.

3. Microrganismo, de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de existir a superexpressão de pelo menos um dos seguintes genes que codificam uma metilglioxal redutase: yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG e ydbC.

4. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada: gloA que codifica uma glioxalase I, aldA que codifica uma lactaldeído desidrogenase, aldB que codifica uma lactaldeido desidrogenase.

5. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes é atenuada: ldhA que codifica uma lactato desidrogenase, pflA que codifica uma piruvato formato liase, pflB que codifica uma piruvato formato liase e adhE que codifica uma álcool-aldeido desidrogenase.

6. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um dos seguintes genes que codificam uma enzima envolvida na síntese de acetato é atenuada: ackA, pta, poxB.

7. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene tpiA que codifica uma triose fosfato isomerase é atenuada.

8. Microrganismo, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene gapA que codifica uma gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase é atenuada.

9. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre galP que codifica um simportador da galactose-próton e glk que codifica uma glicose quinase é aumentada.

10. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene que codifica uma piruvato quinase selecionado dentre pykA e pykF é atenuada.

11. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene ppsA que codifica uma fosfoenolpiruvato sintase é aumentada.

12. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene fucO que codifica uma 1,2-propanodiol oxidorredutase é aumentada.

13. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o gene lpd que codifica uma lipoamida desidrogenase tem uma mutação pontual que leva a uma substituição de alanina 55 por valina.

14. Microrganismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene selecionado dentre arcA que codifica um regulador global e ndh que codifica NADH desidrogenase II é atenuada.

15. Método para preparar 1,2-propanodiol caracterizado pelo fato de que um microrganismo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, cresce em um meio de cultura apropriado contendo uma fonte de carbono, e o 1,2-propanodiol produzido é recuperado.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é Escherichia coli e a fonte de carbono é uma fonte de carbono simples.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o 1,2-propanodiol recuperado é adicionalmente purificado.

18. Método para preparar acetol caracterizado pelo fato de que um microrganismo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, cresce em um meio de crescimento apropriado contendo uma fonte de carbono simples, e o acetol produzido é recuperado.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o acetol recuperado é adicionalmente purificado.