KR20160067228A - 1,2-프로판디올 및 아세톨의 제조를 위한 미생물 및 방법 - Google Patents

1,2-프로판디올 및 아세톨의 제조를 위한 미생물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증가된 메틸글리옥살 리덕타제 활성을 갖는 변형 미생물, 및 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 증가된 메틸글리옥살 리덕타제 활성은 미생물로부터의 특이적 유전자의 발현을 증가시킴으로써 달성된다. 또한, 본 발명은 증가된 메틸글리옥살 리덕타제 활성을 갖는 미생물의 발효에 의해 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

1,2-프로판디올 및 아세톨의 제조를 위한 미생물 및 방법 {MICROORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCTION OF 1,2-PROPANEDIOL AND ACETOL}
본 발명은 변형 미생물, 및 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
C3 디알콜인 1,2-프로판디올 또는 프로필렌 글리콜은 널리 사용되는 화학물질이다. 이는 불포화 폴리에스테르 수지, 액체 세제, 냉각제, 부동제 및 비행기용 제빙액의 성분이다. 프로필렌 글리콜은 1993-1994년부터, 프로필렌 유도체보다 독성이 강한 것으로 알려져 있는 에틸렌 유도체의 대체물로서 점증적으로 사용되었다.
현재, 1,2-프로판디올은 다량의 물이 소모되는 프로필렌 옥시드 수화 공정을 이용한 화학적 방법에 의해 제조된다. 프로필렌 옥시드는 2가지 공정, 즉 에피클로르히드린을 이용한 공정 및 히드로퍼옥시드를 이용한 공정 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 두 경로 모두에서 독성이 높은 물질이 사용된다. 또한, 히드로퍼옥시드 경로는 tert-부탄올 및 1-페닐 에탄올과 같은 부산물을 생성한다. 프로필렌의 제조가 유익하기 위해서는 이들 부산물이 유용해야 한다. 일반적으로, 화학적 경로에서는 라세미 1,2-프로판디올이 생성되며, 두 입체이성질체, 즉 (R)1,2-프로판디올 및 (S)1,2-프로판디올은 각각, 특정 용도에 유익하다(예를 들어, 특수 화학물질 및 의약품을 위한 키랄 출발 물질).
아세톨 또는 히드록시아세톤(1-히드록시-2-프로파논)은 C3 케토 알콜이다. 이 생성물은 섬유 공업의 건염 염색 공정에서 환원제로서 사용된다. 이는 환경에 유해한 폐수 중의 황 함량을 감소시키기 위해 전통적인 황-함유 환원제를 유리하게 대체할 수 있다. 또한, 아세톨은 화학 공업용 출발 물질이며, 예를 들어 폴리올 또는 헤테로시클릭 분자의 제조를 위해 사용된다. 아세톨은 흥미로운 킬레이팅 및 용매 특성도 보유한다.
현재, 아세톨은 주로 1,2-프로판디올의 촉매적 산화 또는 탈수화에 의해 제조된다. 글리세롤과 같은 재생가능한 원료로부터 출발하는 새로운 공정이 제안되되었다(DE 4128692 및 WO 2005/095536 참조). 현재, 화학적 공정에 의한 아세톨의 제조 비용으로 인해 아세톨의 산업적 효용 및 시장이 감소되고 있다.
1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 화학적 제조 방법의 단점은 생물학적 합성법을 매력적인 대체법으로 만든다. 하기 2가지 경로는 당으로부터 미생물에 의해 이들 생성물을 천연적으로 생산하는 것을 특징으로 한다.
제1 경로에서, 6-데옥시 당(예를 들어, L-람노스 또는 L-푸코스)은 디히드록시아세톤 포스페이트 및 (S)-락트알데히드로 분해되고, 이는 추가로 (S)-1,2-프로판디올로 환원될 수 있다(문헌[Badia et al., 1985]). 이 경로는 이. 콜라이(E. coli)에서 실용적이지만, 데옥시헥소스의 상승된 비용으로 인해 경제적으로 가능한 공정을 달성할 수 없다.
제2 경로는, 당분해(glycolysis) 경로 및 이어서 메틸글리옥살 경로를 통한 통상적인 당(예를 들어, 글루코스 또는 크실로스)의 대사이다. 디히드록시아세톤 포스페이트는 메틸글리옥살로 전환되고, 이는 락트알데히드 또는 아세톨로 환원될 수 있다. 이후, 상기 두 화합물은 2차 환원 반응을 통해 1,2-프로판디올을 생성할 수 있다. 이러한 경로는 (R)-1,2-프로판디올의 천연 생산자, 예컨대 클로스트리듐 스페노이데스(Clostridium sphenoides) 및 써모안에어로박터 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)에 의해 이용된다. 클로스트리듐 스페노이데스는 포스페이트 제한 조건 하에 1.58 g/L의 역가로 1,2-프로판디올을 생성하는 데 사용되었다(문헌[Tran Din and Gottschalk, 1985]). 또한, 1,2-프로판디올의 제조를 위해 써모안에어로박터 써모사카롤리티쿰이 연구되었다(문헌[Cameron and Cooney, 1986]; [Sanchez-Rivera et al., 1987]). 얻어진 최대 성과는 9 g/L의 역가 및 글루코스 1 g 당 0.2 g의 수율이었다. 그러나, 상기 유기체에 의해 얻어지는 성과의 개선은 이용가능한 유전자 도구의 부족으로 인해 제한되는 경향이 있다.
이. 콜라이는 1,2-프로판디올 및 아세톨을 천연적으로 생산하는 유전적 능력을 갖는다. 1,2-프로판디올로의 생합성 경로는 당분해 중간체인 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 출발한다. 상기 대사 중간체는 mgsA 유전자에 의해 코딩되는 메틸글리옥살 신타제에 의해 메틸글리옥살로 전환될 수 있다(문헌[Cooper, 1984]; [Toetemeyer et al., 1998]). 메틸글리옥살은 DNA, RNA 및 단백질과 같은 거대분자의 친핵성 중심과 반응할 수 있는 극독성 친전자체이다. 메틸글리옥살은 박테리아 성장을 억제하여 매우 낮은 농도(0.3 내지 0.7 mM)에서 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 이러한 이유로, 메틸글리옥살의 해독화를 위한 기존의 경로가 연구되었다(문헌[Ferguson et al., 1998]). 박테리아, 구체적으로는 이. 콜라이에서 다음과 같은 3가지 경로가 확인되었다.
- 제1 경로는, 메틸글리옥살이 두 단계로 D-락테이트로 전환되는 것인 글루타티온 의존성 글리옥살라제 I-II 시스템(gloA 및 gloB 유전자에 의해 코딩됨)이다.
- 제2 경로는 메틸글리옥살이 D-락테이트로 전환되는 것에 대해 촉매 작용하는 글루타티온 비의존성 글리옥살라제 III 효소이다.
- 제3 시스템은 메틸글리옥살 리덕타제에 의한 메틸글리옥살 분해를 포함한다.
제3 시스템은 1,2-프로판디올의 생성과 관련이 있다. 메틸글리옥살은 C1에서 알데히드 및 C2에서 케톤을 갖는 C3 케토알데히드이다. 상기 두 위치는 알콜로 환원되어 비-키랄 분자인 아세톨(또는 히드록시아세톤), 및 L- 또는 D-형태로 존재할 수 있는 키랄 분자인 락트알데히드를 각각 생성할 수 있다(도 1 참조). 이어서, 상기 3종의 분자, 즉 아세톨, L-락트알데히드 및 D-락트알데히드가 다른 위치에서 환원되어 키랄 1,2-프로판디올을 생성한다.
당시에는 이. 콜라이에서 우선적으로 이용되는 경로가 명확하게 확립되지 않았다. 메틸글리옥살 리덕타제(보조인자로서 NADPH가 우선적으로 사용됨)가 정제되었고, 이. 콜라이에서 부분적으로 특성 분석되었다(문헌[Saikusa et al., 1987]). 이 반응의 생성물은 락트알데히드인 것으로 밝혀졌다. 문헌[Misra et al. (1996)]에는 2종의 메틸글리옥살 리덕타제 활성을 정제하여 동일한 생성물인 아세톨을 생성하는 것이 기재되어 있다. 하나의 NADH 의존성 활성은 알콜 데히드로게나제 활성일 수 있었고, NADPH 의존성 활성은 비-특이적 알데히드 리덕타제일 수 있었다. 문헌[Altaras and Cameron (1999)]는 이. 콜라이의 gldA 유전자에 의해 코딩되는 글리세롤 데히드로게나제(GldA)가, 메틸글리옥살을 (R)-락트알데히드로 환원시키고 아세톨을 1,2-프로판디올로 전환시키는 데 있어서 활성이 있음을 입증하였다.
yghZ 유전자가 이. 콜라이로부터 클로닝되어 발현되고, 그 단백질이 특성 분석되었다(문헌[Grant, 2003]). 상기 단백질은 보조인자로서의 NADPH와 함께 메틸글리옥살에 대한 높은 비활성을 나타냈으나, 반응 생성물은 특성 분석되지 않았다. 과발현되는 경우, 상기 유전자는 메틸글리옥살 독성에 대한 내성을 부여하였다.
문헌[Ko et al. (2005)]에서는 메틸글리옥살을 아세톨로 전환시키기 위한 후보로서 이. 콜라이의 9종의 알도-케토 리덕타제가 체계적으로 연구되었다. 상기 문헌은 4종의 정제된 효소, 즉 YafB, YqhE, YeaE 및 YghZ가 NADPH의 존재 하에 메틸글리옥살을 아세톨로 전환시킬 수 있음을 보였다. 상기 연구에 따르면, 메틸글리옥살 리덕타제 YafB, YeaE 및 YghZ는 해독화의 측면에서 생체내 메틸글리옥살 대사와 관련성이 가장 높을 것이다. 문헌[Di Luccio et al. (2006)]에서는, 이. 콜라이의 ydjG 유전자의 생성물이 NADH와 함께 메틸글리옥살에 대한 활성을 갖는 것으로 나타났으나, 반응 생성물의 특성 분석은 수행되지 않았다.
카메론(Cameron) 그룹(문헌[Cameron et al., 1998]; [Altaras and Cameron, 1999]; [Altaras and Cameron, 2000]) 및 베네트(Bennett) 그룹(문헌[Huang et al., 1999]; [Berrios-Rivera et al., 2003])은 단일 탄소 공급원을 이용하는 1,2-프로판디올 생산자를 얻기 위해 이. 콜라이의 유전자 변형에 대한 여러 연구를 수행하였다. 이들 연구는, 디히드록시아세톤 포스페이트로부터 1,2-프로판디올을 생성하는 경로에서 효소적 활성을 코딩하는 1종 이상의 유전자의 발현에 의존한다. 문헌[Cameron et al (1998)]에서는, 래트 수정체 알도스 리덕타제를 코딩하는 유전자 또는 gldA 유전자의 과발현이 0.2 g/L 미만의 1,2-프로판디올을 생성하는 것으로 나타났다. 이러한 역가의 개선은 2종의 이. 콜라이 유전자, 즉 mgsA 및 gldA를 공동 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 조합에 의해 0.7 g/L의 1,2-프로판디올 역가가 얻어질 수 있다(문헌[Altaras and Cameron, 1999]). 이. 콜라이에서 완전한 1,2-프로판디올 경로가 발현되는 경우에 보다 개선된 역가 및 수율이 얻어졌다(문헌[Altaras and Cameron, 2000]). 3가지 유전자, 즉 mgsA, gldA 및 fucO가 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자(ldhA)가 결핍된 균주에서 과발현되었다. 이러한 조합에 의해 카메론 그룹에서 얻어진 최상의 결과는, 혐기성 플라스크 배양시 1.4 g/L의 1,2-프로판디올 생성율 및 소모된 글루코스 1 g 당 0.2 g의 수율이다. 혐기성 유가식(fed-batch) 발효기에서 외삽시, 생성율은 4.5 g/L 1,2-프로판디올이고, 수율은 글루코스 1 g 당 0.19 g이었다. 또한, US 6,087,140, US 6,303,352 및 WO 98/37204에는 역가 및 수율이 낮다는 점을 제외하고는 그와 동일한 접근법에 의해 얻어진 결과가 기재되어 있다. 또한, 베네트 그룹은 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)으로부터의 mgs 유전자 및 이. 콜라이로부터의 gldA 유전자의 과발현을 위해, ldhA가 결여된 이. 콜라이 호스트 균주를 사용하였다. 혐기성 조건 하에서의 플라스크 배양에서는 1.3 g/L의 역가 및 0.12 g/g의 수율이 얻어졌으며, 미호기성(microaerobic) 배양의 경우에는 1.4 g/L의 역가 및 0.13 g/g의 수율이 얻어졌다.
이러한 측면에서, 모든 결과는 티. 써모사카롤리티쿰(T. thermosaccharolyticum) 종으로부터 얻어진 결과보다 우수하지 않다.
지금까지, 미생물, 특히 이. 콜라이로부터의 내인성 활성을 이용하여 메틸글리옥살을 아세톨로 전환시키는 것은 기술된 바 없다.
본 발명은 변형 미생물, 및 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 증가된 메틸글리옥살 리덕타제 활성을 갖는 변형 미생물, 및 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다. 메틸글리옥살 리덕타제 효소는 미생물로부터의 유전자의 생성물이다. 메틸글리옥살 리덕타제 활성의 증가는 메틸글리옥살이 아세톨로 전환되는 것에 관여하는 1종 이상의 유전자(바람직하게는 yqhD, yafB, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG 및 ydbC로부터 선택됨)을 과발현시킴으로써 달성된다.
본 발명의 또다른 측면에서, 메틸글리옥살 신타제 활성은 또한, mgsA 유전자를 과발현시킴으로써 증가된다.
본 발명의 또다른 측면에서, 엔트너-두도로프(Entner-Doudoroff) 경로는 edd 또는 eda 유전자 또는 둘 다를 결실시킴으로써 제거된다. 또한, 원하지 않는 부산물의 합성은 메틸글리옥살로부터의 락테이트 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자(예컨대, gloA, aldA, aldB), 피루베이트로부터의 락테이트 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 포르메이트 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자(pflA, pflB), 에탄올 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자(adhE), 및 아세테이트 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자(ackA, pta, poxB)의 발현을 감쇠시킴으로써 감소된다.
글루코스의 절반이 디히드록시아세톤 포스페이트로 대사되고 tpiA 유전자의 결실에 의해 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨로 최종적으로 대사되는 것이 바람직하다. 선택적으로는, 이용가능한 글리세르알데히드 3 포스페이트의 일부를 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 합성쪽으로 돌리기 위해 활성 tpiA 유전자를 이용하여 글리세르알데히드 3 포스페이트 활성을 감소시킨다. 본 발명의 한 측면에서, galP에 의해 코딩되는 것과 같은 포스포에놀피루베이트(PEP)에 의존하지 않는 당 도입을 이용하거나 더 많은 양의 PEP를 당-포스포트랜스퍼라제 시스템에 제공함으로써 당 도입 효율이 증가된다. 이는, PEP-유사 피루베이트 키나제(pykA 및 pykF 유전자에 의해 코딩됨)를 소모하는 경로를 제거하고/거나(예를 들어, PEP 신타제를 코딩하는 ppsA 유전자를 과발현시킴으로써) PEP의 합성을 촉진함으로써 달성된다.
1,2-프로판디올의 제조에 관하여 구체적으로는, 디히드록시아세톤 포스페이트를 1,2-프로판디올로 전환시키는 여타 효소, 예컨대 글리세롤 데히드로게나제(gldA에 의해 코딩됨) 및 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제(fucO에 의해 코딩됨)를 증가시키기 위해 미생물을 임의로 변형시킨다. 또한, 피루베이트를 아세틸-coA로 전환시키는 효소가 혐기성 조건 하에 나타나는 고농도의 NADH를 견뎌내는 것이 유용하다. 이는 lpd 유전자에서의 특이적 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 최종적으로, 아세톨을 1,2-프로판디올로 환원시키기 위한 NADH를 절약하기 위해 arcA 및 ndh 유전자를 결실시킬 수 있다. 1,2-프로판디올의 제조에 사용되는 미생물은 박테리아, 효모 및 진균으로부터 선택되지만, 우선적으로는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰이다. 본 발명은, 단일 또는 복합 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 변형 미생물을 배양하고 생성된 1,2-프로판디올을 회수 및 정제함으로써 1,2-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.
아세톨의 제조에 관하여 구체적으로는, 글리세롤 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 감쇠 또는 결실시켜 1,2-프로판디올의 형성을 방지한다. 아세톨의 제조에 사용되는 미생물은 박테리아, 효모 및 진균으로부터 선택되지만, 우선적으로는 에셰리키아 콜라이 또는 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)이다. 본 발의 또다른 목적은, 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 상기 변형 미생물을 배양하고 생성된 아세톨을 회수 및 정제함으로써 아세톨을 제조하는 방법이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 탄소 공급원으로부터 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨을 생성하는 데 유용하며 미생물로부터의 1종 이상의 유전자에 의해 코딩되는 증가된 메틸 글리옥살 리덕타제 활성을 특징으로 하는 변형 미생물에 관한 것이다.
본원에서 사용된 하기 용어는 청구의 범위 및 명세서의 해석을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "배양", "성장" 및 "발효"는 상호 교환적으로 사용되어, 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지 상에서의 박테리아 성장을 의미한다.
"변형 미생물"은, 메틸 글리옥살 리덕타제 활성의 증가를 위해 변형된 미생물, 예컨대 박테리아, 효모 및 진균을 의미한다. 상기 변형은, 미생물을 유전 요소로 형질전환시키기 위한 통상적인 수단, 예를 들어 메틸 글리옥살 환원에 관여하는 유전자의 발현을 위한 유전자 치환 또는 벡터의 도입을 포함한다. 상기 변형에는 무작위적이거나 의도된 돌연변이 생성을 유도하기 위한 통상적인 조건 하에서의 돌연변이 생성도 포함된다. 상기 변형에는 미생물의 진화 방법, 예컨대 WO 2004/076659에 개시된 진화 방법도 포함된다.
"제조에 유용한"이란 용어는, 미생물이 발효에 의해 관심 생성물을 생성하는 것을 의미한다. 발효는 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행될 수 있는 전통적인 공정이다.
본 발명에 따른 용어 "탄소 공급원"은 당업자가 미생물의 정상적인 성장을 지원하기 위해 사용할 수 있는 임의의 탄소 공급원이며, 6탄당, 5탄당, 단당류, 이당류, 올리고당류, 전분 또는 그의 유도체, 헤미셀룰로스, 글리세롤 및 이들의 조합일 수 있다.
"증가된 효소적 활성"이란, 임의 변형 전의 동일한 미생물에서 측정시에 그 활성이 야생형 효소의 활성보다 우수한 것을 의미한다. 상응하는 비-변형 미생물은, 메틸 글리옥살 리덕타제 활성이 변형된 점을 제외하고는 변형 미생물과 동일한 특성을 갖는 미생물이다. 메틸 글리옥살 리덕타제 활성은 통상적인 방법, 예컨대 문헌[Misra et al., Molecular and Cellular Biochemistry 156:117-124 (1996)] 또는 [Ko et al., J. Bacteriol. 187:5782-5789 (2005)]에 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다.
유리하게는, 메틸 글리옥살 리덕타제 활성은 상응하는 비-변형 미생물의 메틸 글리옥살 리덕타제 활성에 비해 50％ 이상, 바람직하게는 100％ 이상 증가된다.
우선적으로는, 메틸 글리옥살 환원에 관여하는 1종 이상의 유전자를 과발현시킴으로써 메틸 글리옥살 리덕타제 활성의 증가가 달성된다.
"발현"이란 용어는 유전자 서열로부터의 전사 및 번역이 상응하는 단백질, 즉 유전자 생성물을 생성하는 것을 나타낸다.
당업자는 관심 유전자의 과발현을 달성하기 위한 다양한 방법, 예를 들어 다음과 같은 방법을 알고 있다.
1. 유전자의 천연 프로모터를, 상기 관심 유전자의 보다 강력한 수준의 발현을 유도하는 프로모터로 치환한다.
유전자의 천연 프로모터를, 선별된 미생물에서 강력한 유전자 발현을 유도하는 것으로 알려져 있는 프로모터로 치환함으로써 보다 강력한 수준의 발현이 달성될 수 있다. 이. 콜라이를 위한 프로모터로는, 예를 들어 프로모터 Ptrc, Ptac, Plac, 람다 프로모터 cI, 또는 전문가에게 알려져 있는 여타 프로모터가 있다. 다른 미생물 종의 경우, 당업자는 사용될 수 있는 프로모터를 결정할 수 있다.
2. 메틸 글리옥살 환원에 관여하는 상기 관심 유전자의 다수개의 카피를
- 상기 관심 유전자를 보유 및 발현하는 발현 벡터에 도입하고,
- 추가 카피의 유전자를 미생물의 염색체에 도입함으로써
미생물에 도입한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 다음 유전자 중 1종 이상이 과발현된다: yqhD, yafB, ydhF, ycdW, yqhE, yeaE, yghZ, yajO, tas, ydjG 및 ydbC. 상기 유전자들은 메틸글리옥살을 아세톨로 전환시킬 수 있는 효소를 코딩한다. 우선적으로는, yqhD 유전자는 단독으로 과발현되거나 다른 유전자와 함께 과발현된다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 증가된 메틸 글리옥살 활성을 갖는 미생물이 추가로 변형된다.
우선적으로는, 본 발명에 따른 미생물은 증가된 메틸 글리옥살 신타제 활성을 제공한다. 유리하게는, 이는 DHAP가 메틸글리옥살로 전환되는 것에 관여하는 메틸글리옥살 신타제를 코딩하는 mgsA 유전자의 발현의 증가에 의해 달성된다.
증가된 효소적 활성을 달성하기 위한 또다른 방법은, 천연 단백질보다 높은 활성을 제공하는 유전자 생성물의 번역을 가능하게 하는 특이적 돌연변이를 mgsA 유전자에 도입하는 것이다.
우선적으로는, 본 발명에 따른 미생물에서, 엔트너-두도로프 경로에 관여하는 1종 이상의 유전자가 감쇠된다. 당분해 이외에도, 엔트너-두도로프 경로는 글루코스를 글리세르알데히드-3-포스페이트 및 피루베이트로 분해하는 또다른 방식을 제공한다. 엔트너-두도로프 경로의 감쇠는, 대부분 또는 모든 글루코스가 당분해를 통해 분해되어 1,2-프로판디올의 생성을 위해 사용되는 것을 보장한다.
바람직하게는, 다음 유전자들 중 1종 이상의 발현이 감쇠된다: edd, eda.
"효소 활성의 감쇠"란 용어는, 관심 효소의 활성이 임의 변형 전의 동일한 미생물에서 관측된 활성에 비해 감소된 것임을 나타낸다. 당업자는 이러한 결과를 달성하기 위한 수많은 방법, 예를 들어 다음과 같은 방법을 알고 있다.
- 돌연변이를 유전자에 도입하여 이 유전자의 발현 수준 또는 코딩된 단백질의 활성 수준을 감소시킨다.
- 유전자의 천연 프로모터를 낮은 강도의 프로모터로 치환하여 저수준의 발현을 일으킨다.
- 상응하는 전령 RNA 또는 단백질을 불안정화시키는 요소를 사용한다.
- 발현이 전혀 필요하지 않다면, 그 유전자를 결실시킨다.
본 발명에 따른 용어 "유전자 발현의 감쇠"란, 유전자 발현의 부분 또는 완전 억제를 의미하며, 이에 따라 "감쇠된" 것으로 표현된다. 이러한 발현 억제는 유전자 발현의 억제, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 일부의 결실, 또는 유전자의 코딩 영역에서의 결실일 수 있다. 우선적으로는, 유전자의 감쇠는 필수적으로 그 유전자의 완전한 결실이며, 이러한 유전자는 본 발명에 따른 균주의 식별, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선별 마커 유전자로 치환될 수 있다. 유전자는 우선적으로는 상동성 재조합 기술에 의해 불활성화된다(문헌[Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645]).
본 발명의 또다른 실시양태에서는, 메틸글리옥살이 락테이트로 전환되는 것에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성이 감쇠된다. 이러한 감쇠의 목적은, 이용가능한 메틸글리옥살이 주로 1,2-프로판디올의 합성을 위해 세포 기전에 의해 사용되는 것이다(도 1 참조).
메틸글리옥살이 락테이트로 전환되는 것에 관여하는 유전자는 특히,
- 메틸글리옥살로부터의 락토일 글루타티온 합성에 대해 촉매 작용하는 글리옥살라제 I를 코딩하는 gloA 유전자,
- 락트알데히드 데히드로게나제 [(S) 락트알데히드로부터의 (S) 락테이트 합성에 대해 촉매 작용함]를 코딩하는 aldA 및 aldB 유전자
이다.
상기 유전자들 중 1종 이상은 유리하게는 미생물에서 감쇠된다. 우선적으로는, gloA 유전자가 감쇠되거나 완전히 결실된다.
본 발명의 미생물에서, 락테이트, 에탄올 및 포르메이트와 같은 부산물의 합성에 관여하는 1종 이상의 효소가 감쇠되는 것이 바람직하다.
특히, 피루베이트로부터의 락테이트 합성에 대해 촉매 작용하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 ldhA 유전자, 및 아세틸-CoA로부터의 에탄올 합성에 대해 촉매 작용하는 알콜-알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 adhE 유전자를 감쇠시키는 것이 유리하다.
이와 유사하게, 피루베이트 데히드로게나제 복합체를 사용하여 미생물이 피루베이트로부터 아세틸-CoA 및 포르메이트 대신에 아세틸-CoA CO2 및 NADH를 생성하도록 강제할 수 있다. 이는 피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 pflA 및 pflB 유전자를 감쇠시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 아세테이트 부산물의 합성은 그 합성에 관여하는 1종 이상의 효소를 감쇠시킴으로써 방지된다. 1,2-프로판디올의 생성을 최적화하기 위해 아세테이트 합성을 피하는 것이 바람직하다.
아세테이트의 생성을 방지하기 위해, ackA, pta 및 poxB로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 감쇠시키는 것이 유리하다. 이들 유전자는 모두, 다양한 아세테이트 생합성 경로에 관여하는 효소를 코딩한다(도 1 참조).
본 발명의 특정 실시양태에서는, 트리오스 포스페이트 이소머라제 활성이 감쇠된다. 우선적으로는, tpiA 유전자의 발현을 감쇠시킴으로써 상기 결과가 달성된다. tpiA 유전자는 DHAP가 글리세르알데히드 3-포스페이트로 전환되는 것에 대해 촉매 작용하는 "트리오스 포스페이트 이소머라제" 효소를 코딩한다(도 1 참조). 상기 유전자 발현의 감쇠는 대사된 글루코스의 절반이 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨로 전환되는 것을 보장한다.
본 발명의 특정 실시양태에서는, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 활성이 감쇠된다. GAPDH로도 지칭되는 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제는, 글루코스가 피루브산으로 당분해 전환되는 것에 관여하는 핵심 효소들 중 하나이다. 효소가 감쇠되면, GA3P의 일부가 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 합성 쪽으로 돌려진다. 이에 따라, 글루코스에 대한 1,2-프로판디올 수율이 1 mol/mol을 초과할 수 있다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제의 활성이 야생형 GADPH의 일반적인 활성의 약 30％ 미만, 보다 바람직하게는 10％ 미만인 것이 유리하다.
우선적으로는, GAPDH를 코딩하는 gapA 유전자의 발현이 감쇠된다.
우선적으로는, 본 발명에 따른 미생물에서, 당 도입 효율이 증가된다. gapA 유전자 발현의 강력한 감쇠는 GAPDH 반응에서 탄소 유동량을 50％ 넘게 감소시키고, 이로써 도입된 글루코스 1 mol 당 1 mol 미만의 PEP가 합성될 것이다. PEP는 단당류가 세포에 도입되는 데 통상적으로 사용되는 당-포스포트랜스퍼라제 시스템(PTS)에서 요구된다(상기 도입은 PEP → 글루코스 포스포-전달에 의한 글루코스-6-포스페이트의 생성과 연결되어 있기 때문임). 따라서, PEP 양의 감소는 당 도입에 부정적인 영향을 미칠 것이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 당은 포스포에놀피루베이트에 의존하지 않는 당 도입 시스템에 의해 미생물에 도입될 수 있다. 인산화에 관여하지 않는 galP 유전자에 의해 코딩되는 갈락타제-양성자 공동수송체(symporter)가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 도입된 글루코스는 glk 유전자에 의해 코딩되는 글루코스 키나제 활성에 의해 인산화되어야 한다. 상기 경로를 촉진하기 위해서는, galP 및 glk로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다. 그 결과, PTS가 없어도 무방해지며(dispensable), 이는 ptsH, ptsI 또는 crr로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 감쇠시킴으로써 제거될 수 있다.
본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 당-포스포트랜스퍼라제 시스템(PTS)의 효율은 대사물질인 포스포에노피루베이트의 이용률을 증가시킴으로써 증가된다. gapA 활성의 감쇠 및 피루베이트로의 하위 탄소 유동량의 감쇠로 인해 본 발명의 변형 균주에서의 PEP 양이 제한될 수 있으며, 이에 따라 세포로 수송되는 글루코스의 양이 감소된다.
미생물 균주에서 PEP의 이용률을 증가시키기 위해 이용될 수 있는 다양한 방법이 존재한다. 특히, 한 방법은 PEP → 피루베이트 반응을 감쇠시키는 것이다. 우선적으로는, 피루베이트 키나제 효소를 코딩하는 pykA 및 pykF로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 상기 균주에서 감쇠시켜 상기 결과를 달성한다. PEP의 이용률을 증가시키기 위한 또다른 방법은 포스포에놀피루베이트 신타제 효소의 활성을 증가시킴으로써, 포스포에놀피루베이트 신타제가 촉매 작용하는 피루베이트 → PEP 반응을 촉진하는 것이다. 상기 효소는 ppsA 유전자에 의해 코딩된다. 따라서, 우선적으로는 미생물에서, ppsA 유전자의 발현이 우선적으로 증가된다. 상기 두 변형은 미생물에서 동시에 존재할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 변형 미생물은 1,2-프로판디올을 주로 생산하도록 설계된다. 이러한 결과는 아세톨 및 여타 전구체(예를 들어, 락트알데히드)가 1,2-프로판디올로 전환되는 것을 촉진함으로써 달성된다. 여기에는,
- 글리세롤 데히드로게나제 활성을 증가시키거나(우선적으로는, gldA 유전자의 발현이 증가됨),
- (바람직하게는 fucO 유전자의 발현을 증가시킴으로써) 1,2-프로판디올 옥시도리덕타제 활성을 증가시키는 것이 포함된다.
특히 혐기성 또는 미호기성 조건 하에서, 피루베이트가 아세틸 coA로 대사되는 것을 촉진하는 효소(특히, 피루베이트 데히드로게나제 복합체)가 NADH에 의한 억제에 대해 낮은 민감성을 갖는 것이 유리하다. 낮은 민감성은 야생형 효소의 민감성을 기준으로 정의된다. 이러한 특성은 (PDC의 서브-유닛 리포아미드 데히드로게나제를 코딩하는) lpd 유전자에서의 특이적 돌연변이(이에 따라, 효소의 단백질 서열에서의 알라닌 55가 발린 잔기로 치환됨)에 의해 달성될 수 있다.
혐기성 또는 미호기성 조건 하에, 전구체가 1,2-프로판디올로 환원되는 것을 위해 NADH 이용률이 증가되는 것이 유리하다. 이는, 광범위(global) 조절자인 ArcA(arcA 유전자에 의해 코딩됨)에 의해 매개되는 트리카르복실산 회로에 대한 억제를 완화시킴으로써 달성된다. 또한, 세포 중의 NADH 농도는 ndh 유전자에 의해 코딩되는 NADH 데히드로게나제 II를 불활성화시킴으로써 증가될 수 있다. 따라서, arcA 및 ndh로부터 선택된 1종 이상의 유전자의 발현이 감쇠되는 것이 바람직하다.
우선적으로는, 1,2-프로판디올을 주로 생산하도록 설계된 미생물은 박테리아, 효모 또는 진균으로부터 선택된다. 보다 우선적으로는, 미생물은 엔테로박테리아세아(Enterobacteriaceae), 바실라세아(Bacillaceae), 클로스트리디아세아(Clostridiaceae), 스트렙토마이세타세아(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아세아(Corynebacteriaceae)로부터 선택된다. 보다 더 우선적으로는, 미생물은 에셰리키아 콜라이 종 또는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 종으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 특정 실시양태에서, 변형 미생물은 아세톨을 주로 생산하도록 설계된다. 바람직하게는, 이러한 결과는 아세톨이 1,2-프로판디올로 전환되는 것에 관여하는 1종 이상의 효소의 활성을 감쇠시킴으로써 달성된다. 우선적으로는, gldA 유전자의 발현이 감쇠된다.
유리하게는, 아세톨을 주로 생산하도록 설계된 미생물은 박테리아, 효모 또는 진균이다. 보다 우선적으로는, 미생물은 엔테로박테리아세아, 바실라세아, 스트렙토마이세타세아 및 코리네박테리아세아 종으로부터 선택된다. 보다 더 우선적으로는, 미생물은 에셰리키아 콜라이 또는 클레브시엘라 뉴모니아 종으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 본 발명에 따른 미생물을 성장시키고 생성된 1,2-프로판디올을 회수하는 것인 1,2-프로판디올의 제조 방법에 관한 것이다. 1,2-프로판디올의 제조는 호기성, 미호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행된다.
한 실시양태에서, 에셰리키아 콜라이 종의 미생물은 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 성장한다.
또다른 실시양태에서, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰의 종의 미생물은 단일 또는 복합 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 성장한다.
회수된 1,2-프로판디올은 추가로 정제되는 것이 유리하다.
또한, 본 발명은 단일 탄소 공급원을 함유하는 적절한 성장 배지에서 본 발명에 따른 미생물을 성장시키고 생성된 아세톨을 회수하는 것인 아세톨의 제조 방법에 관한 것이다. 아세톨의 제조는 호기성 또는 미호기성 조건, 우선적으로는 호기성 조건 하에 수행된다.
회수된 아세톨은 추가로 정제되는 것이 유리하다.
발효 공정을 위한 배양 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 박테리아는 20 내지 55 ℃, 바람직하게는 25 내지 40 ℃의 온도, 바람직하게는 씨. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum)의 경우에 약 35 ℃, 이. 콜라이 및 케이. 뉴모니아(K. pneumoniae)의 경우에 약 37 ℃에서 발효된다.
상기 공정은 뱃치 공정, 유가식 공정 또는 연속식 공정으로 수행될 수 있다.
"호기성 조건 하에"란, 산소 기체를 액체 상에 용해시킴으로써 산소를 배양물에 공급하는 것을 의미한다. 이는 (1) 산소-함유 기체 (예를 들어, 공기)를 액체 상에 살포하거나, (2) 배양 배지를 함유하는 용기를 흔들어서 두부 공간에 함유된 산소를 액체 상에 전달함으로써 달성될 수 있다. 혐기성 조건이 아닌 호기성 조건 하에서의 발효의 이점은, 전자 수용체로서의 산소의 존재가 균주의 능력을 개선시켜 세포 과정을 위한 ATP 형태의 에너지가 더 많이 생성된다는 점이다. 따라서, 균주는 개선된 전체 대사를 갖게 된다.
미호기성 조건은 낮은 백분율의 산소(예를 들어, 0.1 내지 10％의 산소 (질소에 의해 100％가 달성됨)를 함유하는 기체의 혼합물이 사용됨)가 액체 상에 용해된 배양 조건으로서 정의된다.
혐기성 조건은 배양 배지에 산소가 전혀 제공되지 않은 배양 조건으로서 정의된다. 극혐기성 조건은 질소와 같은 불활성 기체를 배양 배지에 살포하여 미량의 다른 기체를 제거함으로써 달성된다. 균주에 의한 ATP 생성을 개선하고 그 대사를 개선하기 위해 니트레이트가 전자 수용체로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 "적절한 성장 배지"는, 미생물의 성장에 적합한 공지 분자 조성의 배지를 나타낸다. 예를 들어, 1종 이상의 탄소 공급원을 함유하는, 사용되는 박테리아에 적합한 공지된 설정 조성의 미네랄 배양 배지가 있다. 특히, 이. 콜라이 또는 케이. 뉴모니아를 위한 미네랄 성장 배지는 M9 배지(문헌[Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128]), M63 배지(문헌[Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]), 또는 문헌[Schaefer et al., 1999, Anal. Biochem. 270:88-96])에 정의된 배지, 특히 하기 기재된 최소 배양 배지(MPG로 지칭됨)와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다.
Figure pat00001

배지의 pH는 수산화나트륨에 의해 7.4로 조정된다.
* 미량 원소 용액 : 시트르산 4.37 g/L, MnSO4 3 g/L, CaCl2 1 g/L, CoCl2, 2H2O 0.1 g/L, ZnSO4, 7H2O 0.10 g/L, CuSO4, 5H2O 10 mg/L, H3BO3 10 mg/L, Na2MoO4 8.31 mg/L.
이. 콜라이 또는 케이. 뉴모니아의 배양에 사용되는 탄소 공급원은 우선적으로는 단일 탄소 공급원이고, 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 크실로스일 수 있다. 특히 바람직한 단일 탄소 공급원은 글루코스이다.
따라서, 씨. 아세토부틸리쿰을 위한 성장 배지는 클로스트리듐 성장 배지(CGM, 문헌[Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol., 54:2717-2722]), 또는 문헌[Monot et al., Appl. Environm. Microbiol., 44:1318-1324] 또는 [Vasconcelos et al., J. Bacteriol., 176:1443-1450]이 제공하는 미네랄 성장 배지와 동일하거나 유사한 조성의 배지일 수 있다.
씨. 아세토부틸리쿰의 배양에 사용되는 탄소 공급원은 단일 또는 복합 탄소 공급원이다. 단일 탄소 공급원은 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 크실로스일 수 있다. 특히 바람직한 단일 탄소 공급원은 글루코스이다. 복합 탄소 공급원은 전분 또는 헤미셀룰로스일 수 있다. 특히 바람직한 복합 탄소 공급원은 전분이다.
본 발명은 상기, 하기 및 실시예에서 이. 콜라이에 대해 기술하고 있다. 따라서, 본 발명에 따른 최초 및 변형 균주에서 감쇠, 결실 또는 과발현될 수 있는 유전자는 주로 이. 콜라이로부터의 유전자의 명칭을 사용하여 정의된다. 그러나, 이러한 정의는 본 발명에 따른 보다 일반적인 의미를 가지며, 다른 미생물에서의 상응하는 유전자를 포괄한다. 당업자는 이. 콜라이로부터의 유전자에 대한 진뱅크(GenBank) 관리번호를 이용하여 이. 콜라이 이외의 다른 유기체에서 동등한 유전자를 결정할 수 있다.
상동성 서열 및 그의 상동성(％)의 확인 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특히 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 상에서 이 웹사이트에 명시된 디폴트 파라미터와 함께 이용될 수 있는 BLAST 프로그램이 포함된다. 얻어진 서열은, 예를 들어 CLUSTALW 프로그램(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)을 상기 웹사이트에 명시된 디폴트 파라미터와 함께 이용하여 조사(정렬)할 수 있다.
PFAM 데이타베이스(정렬된 서열 및 은닉 마르코프 모델에 대한 단백질 군 데이타베이스, http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)는 정렬된 단백질 서열들의 거대한 모음집이다. 각 PFAM을 이용하여 다수의 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 보고, 유기체 사이의 분포를 평가하고, 다른 데이타베이스로의 접근을 획득하고, 공지된 단백질 구조를 가시화할 수 있다.
COG(단백질의 병렬상동(orthologous) 군의 클러스터, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)는, 44개의 주요 계통발생학적 계통을 나타내는 66개 전장 서열 단세포 게놈으로부터 유래된 단백질 서열들을 비교함으로써 얻어진다. 각 COG는 3개 이상의 계통으로부터 정의되며, 이에 따라 선조(ancient) 보존 도메인을 식별할 수 있다.
참고문헌 (명세서에서 인용된 순서에 따름)
Figure pat00002
본 발명은 변형 미생물, 및 1,2-프로판디올 및/또는 아세톨의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에 포함되어 그 일부를 구성하는 첨부된 도면은 본 발명을 예시하며, 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명한다.
도 1은 탄수화물로부터의 1,2-프로판디올 생산 시스템의 개발에 있어서 중추 대사의 유전자 조작을 도시한다.
도 2는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(pH 7) 상에서의 단백질 3종(YQHD, YDHF 및 GLDA)의 용출 프로파일을 도시한다.
실시예 1: 케모스타트(chemostat )에서 배양된 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 메틸글리옥살의 환원에 관여하는 효소의 추출, 정제 및 식별
a) 메틸글리옥살의 환원에 관여하는 NADH - 또는 NADPH -의존성 효소의 정제 공정
메틸의 환원에 관여하는 NADH- 또는 NADPH- 의존성 효소의 정제를 위해 설계된 전체 정제 공정은 5개 단계로 구성된다. 각 단계에서, 표적 효소는 효소 활성 분석에 의해 검출하였다. 2가지 효소 활성, 즉 1) NADPH-의존성 메틸글리옥살 환원 및 2) NADH-의존성 메틸글리옥살 환원을 측정하였다.
1) 극혐기성 또는 미호기성 조건 하에 배양된 이. 콜라이 MG1655 lpd* ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd (균주의 구축에 대해서는 WO 2005/073364 참조)의 케모스타트 배양물로부터 미생물 바이오매스를 수집하였다.
2) 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 50 mM HEPES 완충액 pH 7.5 + 5 mM DTT로 2회 세척하고, 동일한 완충액에 재현탁시킨 후에 -20 ℃에서 저장하였다.
3) 세포를 초음파 처리에 의해 파괴하였다(프로테아제 억제제의 존재 하에 0 ℃에서 혐기성 조건 하에 30초씩 4 사이클(각 사이클 사이에 2분 간격)). 세포 파편(cell debris)을 원심분리에 의해 제거하고, 세포 균질액 중에 존재하는 핵산을 스트렙토마이신 술페이트 처리에 의해 침전시키거나, 효소 처리(벤조나제)에 의해 가수분해하였다(하기 표 1).
세포 균질액의 벤조나제 또는 스트렙토마이신 술페이트(진한 부분) 처리가 메틸글리옥살 환원에 관여하는 효소 활성에 미치는 영향
평가된 활성 비활성
U/mg		 총 효소 활성
U
NADPH 의존성 메틸 글리옥살 환원 0.13 0.043 0.095 0.120
NADH 의존성 메틸 글리옥살 환원 0.285 0.149 0.209 0.408
표 1에 따르면, 더 높은 비활성을 유도하는 스트렙토마이신 술페이트 처리가 보다 효율적이다. 이로써 오염물질(핵산 및 바람직하지 않은 단백질)을 제거하면서 관심 효소의 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
4) 스트렙토마이신 술페이트-처리된 세포 균질액을 원심분리하고, AKTA 정제기 시스템과 연결되어 50 mM HEPES 완충액 + 5 mM DTT로 평형화된 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(리소스 Q(Ressource Q), 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))에 가했다. pH 7 또는 7.5 또는 8에서 단백질 분리를 수행하였다. 단백질을 연속 KCl 구배(2％)에 의해 용출시키고, 개별 분획으로서 수집하였다.
5) 효소 활성을 함유하는 용출 분획을 모으고, 50 mM HEPES 완충액 + 5 mM DTT로 평형화된 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼(힙트랩(Hitrap) 페닐 세파로스, 아머샴 바이오사이언시즈)에 가했다.
겔 투과 크로마토그래피의 최종 단계는 필요한 경우에 추가될 수 있다.
각 단계 후에 수율 및 정제 인자를 측정하였다. 최종 정제 단계 후, 활성 분획 중의 잔류 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 분획의 활성과 스팟(spot) 크기의 상호 관련성을 분석함으로써 관심 단백질을 식별하였다. 단백질 스팟을 절단하고, 세척하고, 특이적 프로테아제에 의해 분해하고(트립신 분해), 질량 분광법(LC-MS/MS 및 MALDI)을 통해 식별하였다.
b) 혐기성 조건 하에 성장한 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 메틸글리옥살 환원에 관여하는 효소의 식별:
pH 7에서의 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 정제 공정을 수행한 결과, 메틸글리옥살을 환원시키는 2종의 NADPH 의존성 효소, 즉 yqhD 유전자에 의해 코딩되는 YQHD(42KDa) 및 ydhF 유전자에 의해 코딩되는 YDHF(33KDa)가 식별되었다(도 2). 제3의 효소(gldA 유전자에 의해 코딩되는 글리세롤 데히드로게나제)가 NADH 및 NADPH 의존성 메틸글리옥살 환원에서 활성인 것으로 나타났다.
pH 8에서의 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 겔 투과 크로마토그래피의 최종 단계를 수행했을 때, 메틸 글리옥살을 환원시키는 또다른 NADPH 의존성 효소, 즉 dkgB(yafB) 유전자에 의해 코딩되는 2,5-디케토-D-글루코네이트 리덕타제 B(29KDa)가 식별되었다.
c) 미호기성 조건 하에 성장한 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 메틸글리옥살 환원에 관여하는 효소의 식별:
pH 7.5에서의 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 설계된 정제 공정을 수행한 결과, NADPH 의존성 메틸글리옥살 환원에 대해 촉매 작용하는, ycdW 유전자에 의해 코딩되는 YCDW로 지칭되는 36KDa 단백질이 식별되었다.
pH 7.5에서의 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행했을 때, 메틸글리옥살의 환원에 대해 촉매 작용하는 2종의 다른 NADPH 의존성 효소, 즉 yqhD 유전자에 의해 코딩되는 YQHD(42KDa)(혐기성 조건 하에 성장한 세포로부터 사전 정제됨) 및 dkgA(yqhE) 유전자에 의해 코딩되는 2,5-디케토-D-글루코네이트 리덕타제 A(31KDa)가 식별되었다.
실시예 2: 메틸글리옥살 환원에서의 유전자 관여를 평가하기 위한, 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 ΔyqhD , ΔyafB , ΔydhF 및 ΔycdW 결실의 도입
a) 변형 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE , ldhA ::Km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd의 구축
프로토콜 1에 따라, 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd::cm에서 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 카세트를 제거하였다.
프로토콜 1: 내성 카세트의 제거
클로람페니콜 및/또는 카나마이신(kanamycin) 내성 카세트를 다음과 같은 기술에 따라 제거하였다. 클로람페니콜 및/또는 카나마이신 내성 카세트의 FRT 부위에서 작용하는 FLP 재조합효소를 갖는 플라스미드인 pCP20을 전기천공법에 의해 균주에 도입하였다. 42 ℃에서의 연속 배양 후, 하기 표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 항생제 내성 카세트의 손실을 확인하였다.
균주에서 앞서 형성된 변형의 존재를 표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 확인하였다.
얻어진 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ldhA::km, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd로 명명하였다.
내성 카세트의 삽입 또는 내성 카세트의 손실을 확인하기 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드
영역 명칭 올리고 명칭 서열 번호 염색체 영역과의 상동성
tpiA 유전자
(결실)		 cdh
YIIQ		 1
2		 WO 2005073364 참조
pflAB 유전자 pflABF
pflABR		 3
4		 WO 2005073364 참조
adhE 유전자 ychGf
adhECr		 5
6		 WO 2005073364 참조
ldhA 유전자
(카세트 삽입)		 hsIJC
ldhAC2		 7
8		 WO 2005073364 참조
gloA 유전자 NemACd
Rnt Cr		 9
10		 WO 2005073364 참조
aldA 유전자 Ydc F C f
gapCCr		 11
12		 WO 2005073364 참조
aldB 유전자 aldB C f
YiaYCr		 13
14		 WO 2005073364 참조
edd 유전자 Eda d
Zwf r		 15
16		 WO 2005073364 참조
ldhA 유전자
(결실)		 ldhAF
ldhAR		 17
18		 1439724 - 1439743
1441029 - 1441007
yqhD 유전자 yqhDF
yqhDR		 19
20		 3153060 - 3153092
3154817 - 3154789
yafB 유전자 yafBF
yafBR		 21
22		 228785 - 228804
230296 - 230276
ydhF 유전자 ydhFF
ydhFR		 23
24		 1722394 - 1722423
1723920 - 1723890
ycdW 유전자 ycdWF
ycdWR		 25
26		 1096789 - 1096809
1098297 - 1098277
gapA 프로모터
(Ptrc16-gapA)		 yeaAF
gapAR		 27
28		 1860259 - 1860287
1861068 - 1861040
edd 및 eda 유전자 eddF
edaR		 29
30		 1932996 - 1932968
1929754 - 1929777
pykA 유전자 pykAF
pykAR		 31
32		 1935338 - 1935360
1937425 - 1937401
pykF 유전자 pykFF
pykFR		 33
34		 1753371 - 1753392
1755518 - 1755495
b) 변형 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE , ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd의 구축
카나마이신 내성 카세트를 제거하고 ldhA 유전자를 불활성화시키기 위해, 프로토콜 2에 따라 클로람페니콜 내성 카세트를 ldhA 유전자에 삽입하고, 관련 유전자의 대부분을 결실시켰다.
프로토콜 2: 재조합을 위한 PCR 생성물의 도입, 및 재조합체의 선별
유전자 또는 유전자간 영역의 치환을 위해 선택된 올리고뉴클레오티드(하기 표 3에 제시됨)를 사용하여 플라스미드 pKD3로부터의 클로람페니콜 내성 카세트 또는 플라스미드 pKD4로부터의 카나마이신 내성 카세트를 증폭시켰다(문헌[Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)]). 이후, 얻어진 PCR 생성물을, 플라스미드 pKD46을 함유하는 수용자 균주에 전기천공법에 의해 도입하였다(여기서, 발현된 시스템 λ 레드(Red) (γβ, exo)는 상동성 재조합을 매우 촉진함). 이후, 항생제-내성 형질전환물을 선별하고, 표 2에 제시된 적절한 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입 여부를 확인하였다.
표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주의 다른 변형을 확인하였다.
생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔldhA::cm, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd로 명명하였다.
균주 이. 콜라이 MG1655에서 염색체 영역을 PCR 생성물과의 재조합에 의해 치환하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드
영역 명칭 올리고 명칭 서열 번호 염색체 영역과의 상동성
ldhA 유전자 DldhAF
DldhAR		 35
36		 1440865 - 1440786
1439878 - 1439958
yqhD 유전자 DyqhDF
DyqhDR		 37
38		 3153369 - 3153448
3154532 - 3154452
yafB 유전자 DyafBF
DyafBR		 39
40		 229167 - 229245
229966 - 229887
ydhF 유전자 DydhFF
DydhFR		 41
42		 1722760 - 1722840
1723656 - 1723576
ycdW 유전자 DycdWF
DycdWR		 43
44		 1097074 - 1097150
1098047 - 1097969
gapA 프로모터
(Ptrc16-gapA)		 Ptrc-gapAF
Ptrc-gapAR		 45
46		 1860478 - 1860536
1860762 - 1860800
edd 및 eda 유전자 DeddF
DedaR		 47
48		 1932582 - 1932501
1930144 - 1930223
gloA 유전자 GLOAD f
GLOA D R		 49
50		 1725861 - 1725940
1726268 - 1726189
pykA 유전자 DpykAF
DpykAR		 51
52		 1935756 - 1935836
1937055 - 1937135
pykF 유전자 DpykFF
DpykFR		 53
54		 1753689 - 1753766
1755129 - 1755051
c) 변형 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE , Δ ldhA , ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔyqhD의 구축
yqhD 유전자는, 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 프로토콜 2에 기재된 기술(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다.
생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔyqhD::km으로 명명하였다.
표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주의 다른 변형을 확인하였다.
이후, 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다.
얻어진 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔyqhD로 명명하였다.
d) 변형 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE , Δ ldhA , ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔyafB의 구축
yafB 유전자는, 균주 이. 콜라이 MG1655에서 프로토콜 2에 기재된 기술(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 ΔyafB::km으로 명명하였다.
파지 P1을 이용한 형질도입 기술에 의해, 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 yafB 유전자를 카나마이신 내성 카세트로 치환함으로써 상기 유전자를 결실시켰다.
프로토콜 3: 유전자의 결실을 위한, 파지 P1을 이용한 형질도입
파지 P1을 이용한 형질도입 기술에 의해, 수용자인 이. 콜라이 균주에서 선택된 유전자를 내성 카세트(카나마이신 또는 클로람페니콜)로 치환함으로써 상기 유전자를 결실시켰다. 이 프로토콜은 두 단계, 즉 (i) 1개 유전자가 결실된 균주 MG1655 상에서 파지 용해물을 제조하는 단계; 및 (ii) 상기 파지 용해물에 의해 수용자 균주의 형질도입을 수행하는 단계로 구성되었다.
파지 용해물의 제조
- 10 mL의 LB + Cm 30 ㎍/mL + 글루코스 0.2％ + CaCl2 5 mM에 1개 유전자가 결실된 균주 MG1655의 철야 배양물 100 ㎕를 시딩하였다.
- 37 ℃에서 30분간 진탕시키면서 인큐베이션하였다.
- 야생형 균주 MG1655 상에서 제조된 파지 용해물 P1 100 ㎕ (대략 1 × 109개 파지/mL)를 첨가하였다.
- 모든 세포가 용해될 때까지 3시간 동안 37 ℃에서 진탕시켰다.
- 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하고, 볼텍싱하였다.
- 10분간 원심분리(4500 g)하여 세포 파편을 제거하였다.
- 상층액을 멸균 튜브에 옮기고, 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하였다.
- 용해물을 4 ℃에서 저장하였다.
형질도입
- LB 배지 중의 이. 콜라이 수용자 균주의 철야 배양물 5 mL를 10분간 원심분리하였다(1500 g).
- 세포 펠렛을 2.5 mL의 10 mM MgSO4 및 5 mM CaCl2에 현탁시켰다.
- 대조군 튜브: 세포 100 ㎕
1개의 유전자가 결실된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕
- 튜브 시험: 세포 100 ㎕ + 1개의 유전자가 결실된 균주 MG1655의 파지 P1 100 ㎕
- 30 ℃에서 30분간 진탕 없이 인큐베이션하였다.
- 각 튜브에 1 M 나트륨 시트레이트 100 ㎕를 첨가하고, 볼텍싱하였다.
- 1 mL의 LB를 첨가하였다.
- 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하면서 진탕시켰다.
- 튜브를 3분간 7000 rpm으로 원심분리한 후, LB + Cm 30 ㎍/mL 디쉬 상에 플레이팅하였다.
- 밤새 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
이후, 항생제-내성 형질전환물을 선별하고, 표 1에 제시된 적절한 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 결실 삽입 여부를 확인하였다.
표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주의 다른 변형을 확인하였다.
생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔyafB::km으로 명명하였다.
이후, 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다.
얻어진 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔyafB로 명명하였다.
e) 변형 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE , Δ ldhA , ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔydhF의 구축
ydhF 유전자는, 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 프로토콜 2에 기재된 기술(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔydhF::km으로 명명하였다.
표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주의 다른 변형을 확인하였다.
이후, 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다.
얻어진 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔydhF로 명명하였다.
f) 변형 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd * , Δ tpiA , Δ pflAB , Δ adhE , Δ ldhA , ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔycdW의 구축
ycdW 유전자는, 균주 이. 콜라이 MG1655에서 프로토콜 2에 기재된 기술(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 ΔycdW::km으로 명명하였다.
프로토콜 3에 기재된 파지 P1을 이용한 형질도입 기술에 의해, 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd에서 ycdW 유전자를 카나마이신 내성 카세트로 치환함으로써 상기 유전자를 결실시켰다.
균주 MG1655 ΔycdW::km 상에서 파지 P1의 용해물이 얻어졌고, 이 파지 용해물을 이용하여 균주 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd의 형질도입을 수행하였다.
생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA::cm, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔycdW::km으로 명명하였다.
표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 균주의 다른 변형을 확인하였다.
이후, 프로토콜 1에 따라 클로람페니콜 및 카나마이신 내성 카세트를 제거하였다.
얻어진 균주는 이. 콜라이 MG1655 lpd*, ΔtpiA, ΔpflAB, ΔadhE, ΔldhA, ΔgloA, ΔaldA, ΔaldB, Δedd, ΔycdW로 명명하였다.
g) 식별된 메틸글리옥살 리덕타제를 코딩하는 유전자에서 결실을 함유하는 균주의 배양
에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 중에서, ΔyqhD, ΔyafB, ΔydhF 및 ΔycdW 결실을 함유하는 4종의 균주를 MPG 배지(pH 6.7)에서 미호기성 조건 하에 37 ℃에서 배양하였다.
72시간 배양 후, 배양물의 상층액 중 아세톨 및 1,2-프로판디올의 생성량을 HPLC에 의해 측정하였다. 그 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다.
메틸글리옥살 리덕타제를 코딩하는 유전자에서 결실을 함유하는 균주에서의 1,2-프로판디올 및 아세톨의 생성량(각 값은 2가지 상이한 배양물로부터의 두 값의 평균값임)
생성물
(mM)		 ΔydhF
균주		 ΔycdW
균주		 ΔyafB
균주		 ΔyqhD
균주		 대조군
균주
1,2-프로판디올 10.7 16.3 8.1 0 16.7
아세톨 9.3 11.1 7.2 0 11.3
합계 20.0 27.4 15.3 0 28.0
상기 결과는, 식별된 모든 메틸글리옥살 리덕타제가 메틸글리옥살이 아세톨 및 나아가 1,2-프로판디올로 전환되는 것에 관여한다는 점을 나타낸다. yqhD의 결실은, 아마도 메틸글리옥살의 축적으로 인해 강력한 성장 억제를 일으켰다. 또한, yafB 및 ydhF의 결실은 아세톨 및 1,2-프로판디올의 생성에 큰 영향을 미친다.
실시예 3: 변형 균주 이. 콜라이 MG1655(pME101VB01 - yqhD - mgsA - gldA ), 이. 콜라이 MG1655(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA) 및 이. 콜라이 MG1655(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)의 구축
1,2-프로판디올의 생성량을 증가시키기 위해, trc 프로모터를 이용하여 플라스미드 pME101VB01로부터 다양한 조합의 유전자들을 발현시켰다.
a) 플라스미드 pME101VB01 의 구축
플라스미드 pME101VB01은 플라스미드 pME101로부터 유래되었고, 희귀 제한 엔도뉴클레아제인 NheI, SnaBI, PacI, BglII, AvrII, SacII 및 AgeI에 대해 특이적인 인식 부위 서열을 함유하는 다중 클로닝 부위에 이어서 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC824의 adc 전사 종결자를 함유하였다.
낮은 카피수의 벡터로부터의 발현을 위해, 플라스미드 pME101을 다음과 같이 구축하였다. 플라스미드 pCL1920(문헌[Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631] - 진뱅크 AX085428)을, 올리고뉴클레오티드 PME101F 및 PME101R을 이용하여 PCR 증폭시키고, lacI 유전자 및 trc 프로모터를 함유하는 벡터 pTrc99A(아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech), 미국 뉴 저지주 피스카타웨이)로부터의 BstZ17I-XmnI 단편을 증폭된 벡터에 삽입하였다.
PME101F (서열 55):
ccgacagtaagacgggtaagcctg
PME101R (서열 56):
agcttagtaaagccctcgctag
다중 클로닝 부위 및 adc 전사 종결자를 포함하는 합성 이중가닥 핵산 링커를 사용하여 pME101VB01을 생성하였다. NcoI 또는 HindIII 분해 제한 부위가 상보적으로 측면배치된(complement flanked) 2개의 100 염기 올리고뉴클레오티드를 어닐링하였다. 100 염기쌍 생성물을 NcoI/HindIII 분해 플라스미드 pME101 내로 서브클로닝하여 pME101VB01을 생성하였다.
100개 염기로 구성된 pME101VB01 1 (서열 57):
catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca
100개 염기로 구성된 pME101VB01 2 (서열 58):
agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctaggagatctttaattaatacgtagctagcc
[상기 서열은
- 다중 클로닝 부위에 상응하는 영역(밑줄친 소문자 부분)
- 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824 pSOL1 (NC_001988)의 adc 전사 종결자(서열 179847 내지 179814)에 상응하는 영역(대문자 부분)
을 포함함]
b) 1,2- 프로판디올의 생합성 경로의 다양한 유전자 조합의 발현을 위한 플라스미드(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pME101VB01-yafB-mgsA-gldA 및 pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)의 구축
표 1에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA로부터 여러가지 유전자를 PCR 증폭시켰다.
1,2-프로판디올 경로의 유전자의 증폭을 위해 사용되는 올리고뉴클레오티드
유전자 명칭 올리고 명칭 서열 번호 유전자와의 상동성 제한 부위
yqhD yqhDR2
yqhDF2		 59
60		 153369 - 3153400
3154544 - 3154475		 BspHI 추가됨
BspHI 제거됨
NheI 추가됨
mgsA mgsAF
mgsAR		 61
62		 1026268 - 1026248
1025780 - 1025800		 SnaBI 추가됨
BglII 추가됨
gldA gldAF
gldAR		 63
64		 4136631 - 4136612
4135512 - 4135530		 AvrII 추가됨
SacI 추가됨
yafB yafB F2
yafB R		 65
66		 229167 - 229190
229970 - 229950		 NcoI 추가됨
NheI 추가됨
yqhE yqhE F
yqhE R		 67
68		 3154641 - 3154661
3155464 - 3155444		 NcoI 추가됨
NheI 추가됨
PCR 증폭된 단편을 표 5에 언급된 제한 효소로 절단하고, 플라스미드 pME101VB01의 제한 부위 내로 클로닝하였다. 다음과 같은 플라스미드가 형성되었다: pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pME101VB01-yafB-mgsA-gldA 및 pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA.
이후, 플라스미드를 균주 이. 콜라이 MG1655에 도입하였다.
실시예 4: 1,2- 프로판디올을 높은 수율로 생성할 수 있는 변형 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA , Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA), 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yafB-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA), 및 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF (pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA)의 구축
균주 이. 콜라이 MG1655에서, 프로토콜 2에 기재된 기술(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 225 pb의 상류(upstream) gapA 서열을 FRT-CmR-FRT 및 유전자조작된 프로모터로 치환함으로써, 천연 gapA 프로모터를 합성 단 Ptrc16 프로모터(서열 69 : gagctg ttgacg attaatcatccggctcg aataat gtgtgg)로 치환하였다.
표 2에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 분석에 의해 내성 카세트의 삽입 여부를 확인하였다.
생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm으로 명명하였다.
edd-eda 유전자는, 이. 콜라이 MG1655 균주에서 프로토콜 2에 기재된 기술(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)을 이용하여 카나마이신 항생제 내성 카세트를 삽입하고 관련 유전자의 대부분을 결실시킴으로써 불활성화시켰다. 얻어진 균주는 이. 콜라이 MG1655 Δedd-eda::km으로 명명하였다.
상기 결실을 프로토콜 3에 따라 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm에 도입하였다.
생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA::cm, Δedd-eda::km으로 명명하였다.
이후, 프로토콜 1에 따라 항생제 내성 카세트를 제거하였다.
프로토콜 2(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)에 따라 균주 MG1655 ΔgloA::cm을 형성하고, 이러한 결실을 프로토콜 3에 따라 앞서 형성된 균주에 도입하였다. 생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA::cm으로 명명하였다.
프로토콜 2(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)에 따라 카나마이신 항생제 내성 카세트를 상기 균주에 삽입함으로써 pykA 유전자를 불활성화시켰다. 생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA::cm, ΔpykA::km으로 명명하였다.
이후, 항생제 내성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다.
프로토콜 2(표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드 사용)에 따라 클로람페니콜 항생제 내성 카세트를 삽입함으로써 pykF 유전자를 불활성화시켰다. 생성된 균주는 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF::cm으로 명명하였다.
이후, 항생제 내성 카세트를 프로토콜 1에 따라 제거하였다.
각 단계에서, 표 3에 제시된 올리고뉴클레오티드를 이용하여 앞서 형성된 모든 결실의 존재 여부를 확인하였다.
포스포에놀피루베이트의 생성량을 증가시키기 위해, gapA 프로모터를 이용하여 플라스미드 pJB137로부터 ppsA 유전자를 발현시켰다. 플라스미드 pJB137-PgapA-ppsA의 구축을 위해, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이. 콜라이 MG1655의 게놈 DNA로부터 ppsA 유전자를 PCR 증폭시켰다.
1. 65개 염기로 구성된 gapA-ppsAF (서열 70)
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
[상기 서열은
- 웹사이트 http://genolist.pasteur.fr/Colibri/의 기준 서열인, ppsA 유전자(1785136 - 1782758)의 서열(1785106 - 1785136)과 상동성인 영역(대문자 부분), 및
- gapA 프로모터(1860794 - 1860761)와 상동성인 영역(소문자 부분)
을 포함함]
2. 43개 염기로 구성된 ppsAR (서열 71)
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
[상기 서열은
- ppsA 유전자(1785136 - 1782758)의 영역의 서열(1782758 - 1782780)과 상동성인 영역(대문자 부분), 및
- 제한 부위 HindIII (밑줄친 부분)
을 포함함]
동시에, 다음과 같은 올리고뉴클레오티드를 이용하여 이. 콜라이 유전자 gapA의 gapA 프로모터 영역을 증폭시켰다.
1. 65개 염기로 구성된 gapA-ppsAR (서열 72)
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
[상기 서열은
- ppsA 유전자(1785136 - 1782758)의 서열(1785106 - 1785136)과 상동성인 영역(대문자 부분), 및
- gapA 프로모터(1860794 - 1860761)와 상동성인 영역(소문자 부분)
을 포함함]
2. 33개 염기로 구성된 gapAF (서열 73)
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
[상기 서열은
- gapA 프로모터(1860639 - 1860661)와 상동성인 영역(소문자 부분)
- 제한 부위 SmaI (밑줄친 부분)
을 포함함]
이어서, 올리고뉴클레오티드 ppsAR 및 gapAF를 사용하여 두 단편을 융합하였다(문헌[Horton et al. 1989 Gene 77:61-68]). PCR 증폭된 단편을 제한 효소인 HindIII 및 SmaI로 절단하고, 벡터 pJB137 (EMBL 기탁 번호: U75326)의 HindIII/SmaI 부위 내로 클로닝하여, 벡터 pJB137-PgapA-ppsA를 생성하였다.
상이한 pME101VB01 플라스미드 및 pJB137-PgapA-ppsA를 균주 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF에 도입하였다. 얻어진 균주는 각각, 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (균주 1), 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yafB-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (균주 2), 및 이. 콜라이 MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF, pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA, pJB137-PgapA-ppsA (균주 3)로 명명하였다.
실시예 5: 호기성 조건 하에서의 1,2- 프로판디올 생성을 위한 여러가지 균주의 비교
에를렌마이어 플라스크 중에서, 실시예 4에 기재된 바와 같이 얻어진 균주들(균주 1, 2 및 3) 및 대조군 균주들(대조군 1: MG1655 pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, 대조군 2: MG1655 pME101VB01-yafB-mgsA-gldA, 대조군 3: MG1655 pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA, 및 대조군 4: MG1655 Ptrc16-gapA, Δedd-eda, ΔgloA, ΔpykA, ΔpykF)을 최소 배지(탄소 공급원으로서의 글루코스 함유)에서 호기성 조건 하에 배양하였다. 34 ℃ 또는 37 ℃에서 배양을 수행하였고, 배양 배지를 MOPS로 완충시킴으로써 pH를 유지하였다. 배양이 끝났을 때, 발효액 중의 1,2-프로판디올, 아세톨 및 잔류 글루코스를 HPLC에 의해 분석하고, 글루코스에 대한 1,2-프로판디올 수율, 및 글루코스에 대한 1,2-프로판디올 + 아세톨 수율을 계산하였다.
Figure pat00003
SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> MICROORGANISMS AND METHODS FOR PRODUCTION OF 1,2-PROPANEDIOL AND ACETOL <130> D25262 <150> PCT/IB2007/001677 <151> 2007-03-23 <160> 73 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 1 ggtgatgata gttatcgccg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 2 cgtgccatcg acagcagtcc 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 3 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta 30 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 5 ggctcattgc accaccatcc ag 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 6 gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 7 gccatcagca ggcttagccg 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 8 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 9 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g 31 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 10 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g 31 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 11 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g 31 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 12 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c 31 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 13 catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 14 tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 15 ccccggaatc agaggaatag tccc 24 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 16 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 17 gccatcagca ggcttagcgc 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 18 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 19 ggcgtctcgc catacaacaa acgcacatcg ggc 33 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 20 gggctttgcc gacaccttct tcgttcttg 29 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 21 cctgacccca tgccgaactc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 22 cccgcttccc tcaatacctg g 21 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 23 gtggatcaag atgcccgcct gcggattccg 30 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 24 cccgtccaga gcccgtgccg gggaatttgc c 31 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 25 ggcggtgagg gggggattcg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 26 ccccatcaac cactcgcggc c 21 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 27 gccacagccg gaatcatact tggtttggg 29 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 28 cgtcaacacc aacttcgtcc catttcagg 29 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 29 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 30 ccacatgata ccgggatggt gacg 24 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 31 ggcaattacc ctcgacgtac cgg 23 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 32 ccgatggatg atctgttaga ggcgg 25 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 33 ggcaattacc ctcgacgtac cgg 23 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 34 ccgcctctaa cagatcatcc atcgg 25 <210> 35 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 35 gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga 60 gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 36 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 36 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt 60 agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 37 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 37 atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60 ggtttacgcg aacaaattcc tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 38 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 38 ttagcgggcg gcttcgtata tacggcggct gacatccaac gtaatgtcat gattttcgcc 60 cagttgggtc atgccgtgct ccatatgaat atcctcctta g 101 <210> 39 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 39 atggctatcc ctgcatttgg tttaggtact ttccgtctga aagacgacgt tgttatttca 60 tctgtgataa cggcgcttgt gtaggctgga gctgcttcg 99 <210> 40 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 40 tcccattcag gagccagacc ttccgggcta accaggcggt cgttgcaatc cagtgcggcg 60 atcgcttttt tatcttcggc catatgaata tcctccttag 100 <210> 41 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 41 ttacggtacg tcgtacccca gtgccgcttt acggatacga aaccattgtt gacgggtcat 60 tttcagtgtt tctgcttcga ctgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 42 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 42 atggttcagc gtattactat tgcgccgcaa ggcccggagt tttcccgttt tgtgatgggc 60 tactggcgat tgatggactg gcatatgaat atcctcctta g 101 <210> 43 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 43 atgagaataa atttcgcaca acgcttttcg ggagtcagta tggatatcat cttttatcac 60 ccaacgttcg atacccaatg gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 44 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 44 ttagtagccg cgtgcgcggt cgacttgccc gcagaccctc tccccttttt cgagctgggc 60 aatggtgcga gaaatgtacc atatgaatat cctccttag 99 <210> 45 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 45 agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga 60 tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210> 46 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 46 gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc 60 atatgaatat cctccttag 79 <210> 47 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 47 cgcgcgagac tcgctctgct tatctcgccc ggatagaaca agcgaaaact tcgaccgttc 60 atcgttcgca gttggcatgc ggtgtaggct ggagctgctt cg 102 <210> 48 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 48 gcttagcgcc ttctacagct tcacgcgcca gcttagtaat gcggtcgtaa tcgcccgctt 60 ccagcgcatc tgccggaacc catatgaata tcctccttag 100 <210> 49 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Specific primer <400> 49 atgcgtcttc ttcataccat gctgcgcgtt ggcgatttgc aacgctccat cgatttttat 60 accaaagtgc tgggcatgaa gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210> 50 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial 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Claims (1)

  1. 탄소 공급원으로부터 1,2-프로판디올, 아세톨 또는 양자 모두를 생성하는 데 유용한 변형 이. 콜라이(E. coli) 미생물의 용도.
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