TWI521062B

TWI521062B - 製造１，２-丙二醇及丙酮醇之微生物及方法

Info

Publication number: TWI521062B
Application number: TW097110002A
Authority: TW
Inventors: 蘇凱利; 梅妮爾; 佛爾克; 菲萊納
Original assignee: 代謝探索公司
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2016-02-11
Also published as: IL200660A; BRPI0808970A2; PL2126101T3; EP2126101B1; CN101641444A; CN101641444B; DK2126101T3; US20110201070A1; ES2550361T3; IL200660A0; WO2008116853A1; MX2009010224A; BRPI0808970B1; JP2010521959A; EP2126101A1; CA2688450C; CA2688450A1; AR066197A1; KR20160067228A; US9051588B2

Description

製造1,2－丙二醇及丙酮醇之微生物及方法

本發明係有關一種經改造之微生物，及其於製備1,2－丙二醇與/或丙酮醇上之用途。

1,2－丙二醇或丙二醇(即C3二元醇)為一種常用之化學物質。其係不飽和聚醋樹脂、液態清潔劑、著色劑、防凍劑與飛機之防結冰劑液體之成份。自從1993－1994，丙二醇即用於替代被認為毒性高於丙烯衍生物之乙烯衍生物。

1,2－丙二醇之目前製法係採用化學方法，使用消耗大量水之氧化丙烯水合法進行。氧化丙烯有兩種製法，其中一種使用表氯醇，另一種使用過氧化氫。這兩種途徑均使用高毒性物質。此外，過氧化氫途徑會產生如：第三丁醇與1－苯基乙醇之副產物。若想在丙烯之生產上穫利，必需想辦法利用此等副產物。該化學途徑通常產生消旋性1,2－丙二醇，而這兩種立體異構物(R )1,2－丙二醇與(S )1,2－丙二醇均可用於某些用途(例如：作為特殊化學物質與醫藥產品之對掌性起始物)。

丙酮醇或羥基丙酮(1－羥基－2－丙酮)為一種C3酮基醇。此產物在紡織工業之大染缸之染織過程中作為還原劑使用。傳統之含硫還原劑宜撒換，以減少廢水中有害環境之硫含量。丙酮醇亦為化學工業之起始物，其可用於例如：製造多元醇或雜環分子。其亦具有有利之螯合與溶劑性質。

丙酮醇目前主要利用1,2－丙二醇之催化性氧化或脫水反應製備。現已提出一種由可再生之原料(如：甘油)為起始物之製法(參見DE4128692與WO 2005/095536)。目前化學製法中丙酮醇之生產成本降低了其工業用途與市場。

製造1,2－丙二醇與/或丙酮醇之化學製法之缺點促使生物合成法成為吸引人之替代方案。已知有兩種利用微生物，由糖類自然生產此等產物之途徑。

第一種途徑為裂解6－去氧糖類(例如：L－鼠李糖或L－岩藻糖)形成二羥基丙酮磷酸鹽與(S)－乳醛，其再還原成(S)－1,2－丙二醇(Badia等人之1985)。此途徑在大腸桿菌(E.coli )中進行，但由於去氧六碳糖之成本提高，因此無法在經濟上有效生產。

第二種途徑為由一般糖類(例如：葡萄糖或木糖)經由糖原酵解法後，進行甲基乙二醛途徑之新陳代謝法。轉化二羥基丙酮磷酸鹽所形成之甲基乙二醛可還原成乳醛或丙酮醇。這兩種化合物可再進行第二種還原反應，產生1,2－丙二醇。(R)－1,2－丙二醇之天然生產者，如：楔形梭菌(Clostridium sphenoides) 與熱糖解高溫厭氧菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum) 即採用此途徑。已利用楔形梭菌在限制磷酸鹽條件下製造1,2－丙二醇，其效價為1.58克/升(Tran Din與Gottschalk，1985)。已有研究利用熱糖解高溫厭氧菌來製造1,2－丙二醇(Cameron與Cooney，1986；Sanchez－Rivera等人，1987)。所得之最佳效價為9克/升，且由葡萄糖得到之產量為0.2 克/克。然而，使用此等微生物所改善之效能同樣受到遺傳工具短缺之限制。

大腸桿菌具有天然製造1,2－丙二醇與丙酮醇之遺傳能力。形成1,2－丙二醇之生物合成途徑始自糖原酵解中間物二羥基丙酮磷酸鹽。此代謝中間物可利用mgs A基因所編碼之甲基乙二醛合成酶轉化成甲基乙二醛(Cooper，1984、Ttemeyer等人，1998)。甲基乙二醛為一種可與巨型分子(如：DNA、RNA與蛋白質)之親核性中心反應之極毒性親電子物。其可抑制細菌生長，在極低濃度(0.3至0.7 mM)下即可導致細胞死亡。因此，目前已有人探討排除甲基乙二醛毒性之途徑(Ferguson等人之1998)。已於細菌中鑑別出二種途徑，尤指大腸桿菌：－第一種途徑為依賴穀胱甘肽之乙二醛酶I－II系統(由glo A與glo B基因編碼)，其分兩步驟轉化甲基乙二醛形成D－乳酸鹽。

－第二種途徑為不依賴穀胱甘肽之乙二醛酶III酵素，其催化甲基乙二醛轉化成D－乳酸鹽。

－第三種系統包括由甲基乙二醛還原酶降解甲基乙二醛。該最後一個系統與1,2－丙二醇之製造有關。甲基乙二醛為一種C3酮基醛，在C1帶有醛基且在C2帶有酮基。這兩個位置均可還原成醇，分別產生丙酮醇(或羥基丙酮)、非對掌性分子與乳醛，係可呈L－或D－型之對掌性分子(參見圖1)。這3個分子：丙酮醇、L－乳醛與D－乳醛隨後可在其他位置還原，產生對掌性1,2－丙二醇。

此時，大腸桿菌優先使用之途徑尚未清楚建立。優先使用NADPH作為輔因子之甲基乙二醛還原酶已經純化，且在大腸桿菌中部份鑑別出(Saikusa等人之1987)。已知此反應之產物為乳醛。Misra等人(1996)說明兩種甲基乙二醛還原酶活性之純化結果產生相同產物丙酮醇。其中一種依賴NADH之活性可為醇脫氫酶活性，而依賴NADPH之活性則為非專一性醛還原酶。Altaras與Cameron(1999)證實大腸桿菌之gld A基因所編碼之甘油脫氫酶(GldA)有活性還原甲基乙二醛形成(R)－乳醛，且亦可轉化丙酮醇形成1,2－丙二醇。

基因ygh Z係自大腸桿菌中選殖出，且已鑑別其表現與蛋白質(Grant，2003)。其以NADPH為輔因子時，對形成甲基乙二醛具有高度比活性，但反應產物則尚未鑑別出。當此基因過度表現時，則會對甲基乙二醛毒性產生抗性。

Ko等人(2005)全面探討大腸桿菌之9種醛－酮還原酶作為轉化甲基乙二醛形成丙酮醇之候選物。其顯示，有4種純化酵素：YafB、YqhE、YeaE與YghZ可在NADPH之存在下轉化甲基乙二醛形成丙酮醇。依據其研究，甲基乙二醛還原酶：YafB、YeaE與YghZ在活體內之去毒性方面，與甲基乙二醛之代謝作用相關性最高。Di Luccio等人(2006)顯示大腸桿菌之基因ydj G之產物在使用NADH下，對甲基乙二醛具有活性，但尚未鑑別出其反應產物。

Cameron之研究團隊(Cameron等人1998、Altaras與 Cameron，1999、Altaras與Cameron，2000)與Bennett之研究團隊(Huang等人，1999、Berrios－Rivera等人，2003)已使用單純碳源進行大腸桿菌之遺傳改造法之許多研究，以得到1,2－丙二醇製造者。此等研究依賴二羥基丙酮磷酸鹽形成1,2－丙二醇之途徑中酵素活性之一種或多種編碼基因之表現。Cameron等人(1998)顯示，編碼大鼠水晶體醛糖還原酶基因或gld A基因之過度表現會使得1,2－丙二醇之產量低於0.2克/升。藉由兩種大腸桿菌基因：mgs A與gld A之共同表現，即可改善此效價。採用此組合可得到0.7克/升之1,2－丙二醇效價(Altaras與Cameron，1999)。當大腸桿菌中表現完整之1,2－丙二醇途徑時，可進一步改善效價與產量(Altaras與Cameron，2000)。有三種基因：mgs A、gld A與fuc O在缺失編碼乳酸鹽脫氫酶基因(ldh A)之菌株中過度表現。Cameron研究團隊採用此組合在厭氧性燒瓶培養物中，在每消耗1克葡萄糖產生0.2克之產量下所得最佳1,2－丙二醇製造量為1.4克/升。當外推至厭氧性分批進料之發酵槽中時，在每消耗1克葡萄糖產生0.19克之產量下之1,2－丙二醇製造量為4.5克/升。在專利案US 6,087,140、US 6,303,352與WO 98/37204中亦說明採用相同方法得到之結果，但其效價與產量均較低。Bennett團隊亦使用缺失ldh A之大腸桿菌宿主菌株，使來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) 之mgs 基因與來自大腸桿菌之gld A基因過度表現。在厭氧條件之燒瓶培養物得到效價1.3克/升與產量0.12克/克，而微好氧培養物則得到效價1.4克/升，產量0.13克/克。

在此階段之所有此等結果均未優於彼等由熱糖解高溫厭氧菌(T.thermosaccharolyticum) 菌株得到之結果。

迄今尚無人說明以來自微生物，特定言之大腸桿菌之內因性活性來轉化甲基乙二醛形成丙酮醇之用法。

本發明係有關具有提高之甲基乙二醛還原酶活性之經改造之微生物，及其於製備1,2－丙二醇與/或丙酮醇上之用途。甲基乙二醛還原酶酵素為微生物基因之產物。當涉及甲基乙二醛轉化成丙酮醇之一種或多種基因(較佳係選自：yqh D、yaf B、ycd W、yqh E、yea E、ygh Z、yaj O、tas 、ydj G與ydb C)過度表現時，即提高甲基乙二醛還原酶活性。

本發明另一態樣中，甲基乙二醛合成酶活性亦因mgs A基因之過度表現而提高。

本發明另一態樣中，因刪除edd 或eda 基因或二者而消失了恩特－朵夫途徑。此外，藉由減弱涉及由甲基乙二醛合成乳酸鹽之酵素之編碼基因(如：glo A、ald A、ald B)、由丙酮酸鹽(ldh A)、甲酸鹽(pfl A、pfl B)、乙醇(adh E)與乙酸鹽(ack A、pta 、pox B)合成乳酸鹽之酵素之編碼基因之表現而減少合成不要之副產物。

較佳者，藉由刪除tpi A基因將使得一半葡萄糖代謝成二羥基丙酮磷酸鹽，最終形成1,2－丙二醇與/或丙酮醇。可視需要藉由活性tpiA基因降低甘油醛3磷酸鹽活性，以使一部份可利用之甘油醛3磷酸鹽重新導向合成1,2－丙二醇與/或丙酮醇。本發明一態樣中，藉由使用不依賴磷酸烯醇丙酮酸鹽(PEP)之糖輸入系統(如：由gal P編碼者)或藉由提供更多PEP給糖－磷酸轉化酶系統，來提高糖輸入之效率。此點可藉由消除消耗PEP之途徑(如：丙酮酸鹽激酶(由pyk A與pyk F基因編碼者))與/或促進合成PEP(例如：由編碼PEP合成酶之pps A基因過度表現)來達成。

針對1,2－丙二醇之製造，可視需要改造微生物，以增加其他轉化二羥基丙酮磷酸鹽形成1,2－丙二醇之酵素，如：甘油脫氫酶(由gld A編碼)與1,2－丙二醇氧化還原酶(由fuc O編碼)。此外，轉化丙酮酸鹽形成乙醯基－coA之酵素應需抵抗出現在厭氧條件下之高濃度NADH。此點可由lpd 基因之特異性突變達成。最後，為了減少用於還原丙酮醇形成1,2－丙二醇之NADH，可刪除arc A與ndh 基因。用於製備1,2－丙二醇之微生物係選自細菌、酵母與真菌，但以大腸桿菌(Escherichia coli) 或丙酮丁醇梭菌較佳。本發明提供一種製造1,2－丙二醇之方法，其係由經改造微生物於含單純或複合碳源之適當生長培養基中培養，回收及純化所產生之1,2－丙二醇。

針對丙酮醇之製造，需減弱或刪除編碼甘油脫氫酶之基因，防止形成1,2－丙二醇。用於製備丙酮醇之微生物係選自：細菌、酵母與真菌，但以大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 較佳。本發明另一項目的在於製造丙酮醇之方法，其係由該經改造微生物於含單純碳源之適當生長培養基中培養，回收與純化所製造之丙酮醇。

本發明係有關一種適用於由碳源製造1,2－丙二醇與/或丙酮醇之經改造之微生物，其中該微生物之特徵在於提高由來自微生物之一種或多種基因編碼之甲基乙二醛還原酶活性。

本文所採用之下列名詞可用於說明申請專利範圍與說明書。

依據本發明，‘培養’、‘生長’與‘發酵’等名詞可交換用於代表細菌於含單純碳源之適當生長培養基中之生長。

“經改造之微生物”一詞代表已經改造可提高甲基乙二醛還原酶活性之微生物，如：細菌、酵母或真菌。此等改造作用包括常用於利用遺傳元素轉形微生物之方法，包括基因置換法或導入用於涉及甲基乙二醛還原作用之基因表現之載體。其亦包括微生物在常用於誘發此等誘變之條件下進行之隨機或定向誘變法。其亦包括微生物之演化方法，如：WO 2004/076659所揭示之演化法。

“適用於製造”一詞代表該微生物利用發酵法產生所需產物。發酵法為可於好氧、微好氧或厭氧條件下進行之傳統製法。

根據本發明之“碳源”一詞代表任何可由習此相關技藝之人士用於維持微生物正常生長之碳源，其可為六碳糖、五碳糖、單醣、雙醣、寡醣、澱粉或其衍生物、半木纖維素、甘油與其組合。

“提高之酵素活性”意指該活性高於相同微生物在改造前所測定野生型酵素之活性。相應之未改造微生物為與經改造微生物具有相同特性，但已改造其甲基乙二醛還原酶活性之微生物。該甲基乙二醛還原酶活性可利用一般方式測定，如：由Misra等人(Molecular and Cellular Biochemistry 156：117－124(1996))或Ko等人(J.Bacteriol.187：5782－5789(2005))揭示之方法。

相較於相應之未改造微生物之甲基乙二醛還原酶活性，該甲基乙二醛還原酶活性宜提高至少50%，較佳為至少100%。

較佳者，所提高之甲基乙二醛還原酶活性係藉由涉及甲基乙二醛還原作用之至少一種基因之過度表現達成。

"表現"一詞係指由可產生相應蛋白質(基因產物)之基因序列進行之轉錄與轉譯。為了得到所需基因之過度表現，習此相關技藝之人士習知各種不同方法，例如：1－以可誘發該所需基因更高度表現之啟動子置換該基因之天然啟動子。

以已知可在特定微生物中誘發高度基因表現之啟動子置換該基因之天然啟動子，可得到更高度表現。用於大腸桿菌之此等啟動子為例如：啟動子Ptrc、Ptac,、Plac、λ－啟動子cI或習此相關技藝之人士已知之其他啟動子。習此相關技藝之人士可針對其他微生物菌種決定可使用之啟動子。

2－藉由下列方法在微生物中導入涉及甲基乙二醛還原作用所需基因之多套複本：－導入帶有且表現該所需基因之表現載體。

－導入基因之另一套複本至微生物染色體中。

本發明之明確具體實施例中，過度表現至少一種下列基因：yqh D、yaf B、ydh F、ycd W、yqh E、yea E、ygh Z、yaj O、tas 、ydj G與ydb C。該基因編碼可以轉化甲基乙二醛形成丙酮醇之酵素。較佳者，yqh D基因係單獨過度表現或組合其他基因過度表現。

本發明另一項具體實施例中，進一步改造已具有提高之甲基乙二醛活性之微生物。

較佳者，依據本發明微生物展現提高之甲基乙二醛合成酶活性。此點宜藉由提高涉及轉化DHAP形成甲基乙二醛之甲基乙二醛合成酶之mgsA 編碼基因之表現達成。

另一種達到此提高之酵素活性之方法為在mgs A基因中導入專一性突變，使得基因產物之轉譯作用得以展現高於天然蛋白質之活性。

較佳者，在根據本發明之微生物中，減弱至少一種涉及恩特－朵夫(Entner－Doudoroff)途徑之基因。除了糖原酵解法外，該恩特－朵夫途徑提供另一種降解葡萄糖形成甘油醛－3－磷酸鹽與丙酮酸鹽之方式。減弱該恩特－朵夫途徑可確保大多數或最好所有葡萄糖均經由糖原酵解法降解，並用於製造1,2－丙二醇。

最好減弱下列至少一種基因之表現：edd、eda 。

“減弱酵素活性”一詞意指相較於相同微生物在進行任何改造之前所觀察到之活性，降低所需酵素活性。習此相關技藝之人士已知多種可得到此結果之方式，例如：－在基因中導入突變，降低此基因之表現程度或所編碼蛋白質之活性程度。

－以低強度之啟動子置換天然啟動子，以得到較低表現。

－使用破壞相應信使RNA或蛋白質穩定度之元素。

－刪除完全不需要其表現之基因。

依據本發明“減弱基因表現”一詞係指部份或完全壓抑基因之表現，然後則可稱為“減弱”。此壓抑表現法可為抑制基因表現、刪除基因表現所必需之所有或部份啟動子區，或刪除基因之編碼區。較佳者，減弱基因基本上為完全刪除該基因，該基因可被有助於鑑別、單離及純化根據本發明菌株之選拔標記物基因置換。最好利用同系物重組技術去除基因活性(Datsenko,K.A.& Wanner,B.L.(2000)“於大腸桿菌K－12中使用PCR產物去除染色體基因活性之單步驟法(One－step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K－12 using PCR products)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640－6645)。

本發明另一項具體實施例中，減弱至少一種涉及轉化甲基乙二醛形成乳酸鹽之酵素活性。此減弱目的為促使1,2－丙二醇合成法所必需之細胞結構使用可利用之甲基乙二醛(參見圖1)。

涉及轉化甲基乙二醛形成乳酸鹽之基因特定言之為：－編碼乙二醛酶I之gloA 基因，其催化由甲基乙二醛合成乳醯基胺穀胱甘肽。

－編碼乳醛脫氫酶之aldA 與aldB 基因(其催化由(S )乳醛合成(S )乳酸鹽)。

宜減弱微生物中一種或多種此等基因。較佳者，宜減弱或完全刪除基因gloA 。

本發明微生物中，最好減弱至少一種涉及副產物合成(如：乳酸鹽、乙醇與甲酸鹽)之酵素。

特定言之，宜減弱催化丙酮酸鹽合成乳酸鹽之乳酸鹽脫氫酶之編碼基因ldhA ，與催化乙醯基－CoA合成乙醇之醇－醛脫氫酶之編碼基因adhE 。

同樣地，可迫使微生物利用丙酮酸鹽脫氫酶複合物，改由丙酮酸鹽製造乙醯基－CoA CO₂ 與NADH，而非乙醯基－CoA與甲酸鹽。此點可藉由減弱編碼丙酮酸鹽甲酸鹽裂解酶之基因pflA 與pflB 達成。

本發明另一項明確具體實施例中，藉由減弱至少一種涉及乙酸鹽副產物合成之酵素來防止該副產物之合成。最好避免合成此等乙酸鹽，以達到最佳之1,2－丙二醇生產。

為了防止產生乙酸鹽，宜減弱至少一種選自：ack A、pta 與pox B之基因。此等基因均編碼涉及不同乙酸鹽生合成途徑之酵素(參見圖1)。

本發明一項明確具體實施例中，減弱三碳糖磷酸鹽異構酶活性。較佳者，其係藉由減弱tpiA 基因之表現而達成此結果。tpiA基因編碼酵素‘三碳糖磷酸鹽異構酶’，其催化DHAP轉化成甘油醛3-磷酸鹽(參見圖1)。減弱此基因表現可確保所代謝之半數葡萄糖轉化成1,2-丙二醇與/或丙酮醇。

本發明一項明確具體實施例中，減弱甘油醛3磷酸鹽脫氫酶活性。甘油醛3-磷酸鹽脫氫酶亦稱為GAPDH，為一種涉及糖原酵解葡萄糖轉化成丙酮酸之關鍵酵素。減弱酵素之結果使得一部份GA3P重新導向合成1,2-丙二醇與/或丙酮醇。1,2-丙二醇與葡萄糖之產量比將可超過1莫耳/莫耳。甘油醛3-磷酸鹽脫氫酶之活性宜為野生型GADPH之一般活性之約30%以下，較佳為10%以下。

較佳者，減弱編碼GAPDH之gapA基因表現。

較佳者，在根據本發明微生物中，提高糖輸入之效率。大幅減弱gapA基因表現之結果造成GAPDH反應中之碳流入量下降超過50%，其結果導致每輸入一莫耳葡萄糖，所合成之PEP即少於1莫耳。糖-磷酸轉化酶系統(PTS)所需之PEP通常用於輸入單純糖類至細胞中，因為該輸入過程亦偶聯PEP之磷酸轉移至葡萄糖之作用，產生葡萄糖-6-磷酸鹽。因此減少PEP用量將對糖輸入產生負面影響。

本發明一項明確具體實施例中，糖可藉由不依賴磷酸烯醇丙酮酸鹽之糖輸入系統輸入微生物中。可利用未涉及磷酸化反應之由基因galP編碼之半乳糖酶-質子同向共同運輸子。此時，輸入之葡萄糖必需經glk基因所編碼之葡萄糖激酶活性進行磷酸化。為了促進此途徑，提高選自galP 與glk 之至少一種基因之表現。由於可省卻PTS，因此可藉由減弱至少一種選自pts H、pts I或crr 之基因而消除。

本發明另一項明確具體實施例中，藉由提高代謝物磷酸烯醇丙酮酸鹽之可利用度來提高糖－磷酸轉化酶系統(PTS)之效率。由於減弱gapA 活性及降低流向丙酮酸鹽之碳流入量，因此限制了本發明之經改造菌株中PEP含量，因而降低運送至細胞中之葡萄糖量。

已有多種不同方式可用於提高微生物菌株中PEP之可利用度。特定言之，有一種方式為減弱PEP→丙酮酸鹽之反應。較佳者，減弱該菌株中編碼丙酮酸鹽激酶酵素之至少一種選自pyk A與pyk F之基因，以達成此結果。另一種方式為提高PEP之可利用度，以利於丙酮酸鹽→PEP之反應，其係藉由提高磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶酵素活性而催化。此酵素係由pps A基因編碼。因此，最好在微生物中優先提高pps A基因表現。兩種改造法均可同時於微生物中進行。

本發明一項明確具體實施例中，經改造微生物之設計係用於主要生產1,2－丙二醇。可藉由傾向轉化丙酮醇與其他前體(例如：乳醛)形成1,2－丙二醇來達成此結果。其包括：－提高甘油脫氫酶活性。最好提高gld A基因表現。

－提高1,2－丙二醇氧化還原酶活性，最好提高fucO 基因表現。

尤其在厭氧性或微好氧條件下，其優點在於該酵素有利於代謝丙酮酸鹽形成乙醯基coA(特定言之，丙酮酸鹽脫氫酶複合物)，其對NADH之抑制作用敏感度低。較低敏感度係參考野生型酵素之敏感度加以定義。此等特性係藉由lpd 基因(編碼PDC之亞單位脂醯胺脫氫酶)之專一性突變導致酵素之蛋白質序列中丙胺酸55被纈胺酸殘基置換而得。

在厭氧性或微好氧條件下，有利於提高NADH之利用度，用於還原前體形成1,2－丙二醇。此點係藉由減緩回復總調節物ArcA(由arc A基因編碼)所媒介三羧酸循環而得。細胞中NADH濃度亦可藉由去除基因ndh 所編碼NADH脫氫酶II之活性而得。因此，最好減弱至少一種選自arcA 與ndh 之基因表現。

設計用於主要產生1,2－丙二醇之微生物最好選自細菌、酵母或真菌。更佳者，該微生物係選自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、鏈黴菌科(Streptomycetaceae)與棒桿菌科(Corynebacteriaceae)。甚至更佳者，該微生物係來自大腸桿菌或丙酮丁醇梭菌。

本發明另一項明確具體實施例中，經改造微生物之設計係用於主要產生丙酮醇。較佳者，此結果係藉由減弱涉及轉化丙酮醇形成1,2－丙二醇之至少一種酵素活性來達成。較佳者，減弱gld A基因表現。

設計用於主要產生丙酮醇之微生物宜為細菌、酵母或真菌。更佳者，該微生物係選自下列菌種：腸桿菌科、芽孢桿菌科、鏈黴菌科與棒桿菌科。甚至更佳者，該微生物係選自大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌。

本發明亦有關一種製備1,2－丙二醇之方法，其中根據本發明微生物係於含碳源之適當生長培養基中生長，並回收所製造之1,2－丙二醇。1,2－丙二醇之製造係在好氧、微好氧或厭氧條件下進行。

一項具體實施例中，由大腸桿菌 微生物於含單純碳源之適當生長培養基中生長。

另一項具體實施例中，由丙酮 丁醇梭菌微生物於含單純或複合碳源之適當生長培養基中生長。

宜進一步純化所回收之1,2－丙二醇。

本發明亦有關一種製備丙酮醇之方法，其中由根據本發明微生物於含單純碳源之適當生長培養基中生長，並回收所產生之丙酮醇。丙酮醇之製造係在好氧或微好氧條件下進行，以好氧條件下較佳。

宜進一步純化所回收之丙酮醇。

該發酵法之培養條件很容易由習此相關技藝之人士界定。特定言之，由細菌在20℃至55℃之溫度間發酵，較佳為25℃至40℃之間，且丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum) 以約35℃較佳，大腸桿菌與肺炎克雷伯氏菌則以約37℃較佳。

此製法係依分批法、分批進料法或連續法進行。

‘在好氧條件下’意指供給培養物之氧氣係由氣體溶於液相中之方式提供。此作法為(1)將含氧氣體(例如：空氣)通入液相中或(2)使含培養基之容器振盪，以使上方空間所含氣氣得以進入液相中。改用好氧條件替代厭氧條件下之發酵法之優點在於所含之氧可作為電子受體，以改善菌株以ATP型式製造更多能量供給細胞處理之能力。因此，可改善菌株之一般代謝作用。

微好氧條件所定義之培養條件為使低百分比之氧氣(例如：使用含0.1至10%氧氣，其餘以氮氣補充至100%所得之氣體混合物)溶於液相中。

厭氧條件所定義之培養條件為其中不提供氧氣給培養基。嚴格之厭氧條件為在培養基中通入惰性氣體(如：氮氣)，以排除微量之其他氣體。可使用硝酸鹽作為電子受體，以改善菌株之ATP產量，並改善其代謝作用。

根據本發明‘適當生長培養基’一詞意指配合微生物生長之已知分子組成之培養基。例如：可配合所使用之細菌使用含有至少一種碳源之已知分子組成之礦物培養基。特定言之，用於大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌之礦物生長培養基之組成可與M9培養基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32 ：120－128)、M63培養基(Miller,1992；細菌遺傳學速成：大腸桿菌與相關細菌之實驗指南與手冊(A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)或如：Schaefer等人所定義之培養基(1999,Anal. Biochem.270：88-96)相同或相似，特定言之，該最基本培養基稱為MPG，說明如下：

使用氫氧化鈉調整培養基之pH至7.4。

* 微量元素溶液： 檸檬酸4.37克/升、MnSO₄ 3克/升、CaCl₂ 1克/升、CoCl₂,2H₂O 0.1克/升、ZnSO₄,7H₂O 0.10克/升、CuSO₄,5H₂O 10毫克/升、H₃BO₃ 10毫克/升、Na₂MoO₄ 8.31毫克/升。

大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌之培養基所使用之碳源以單純碳源較佳，且可為阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖。特別佳之單純碳源為葡萄糖。

丙酮丁醇梭菌之生長培養基之組成可與梭菌生長培養基(CGM,Wiesenborn等人，Appl.Environm.Microbiol.,54：2717-2722)或由Monot等人提供之礦物生長培養基(Appl.Environm.Microbiol.,44：1318-1324)或Vasconcelos et al.(J.Bacteriol.,176：1443-1450)相同或相似。

丙酮丁醇梭菌之培養基所使用之碳源可為單純或複合碳源。單純碳源可為阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖。特別佳之單純碳源為葡萄糖。複合碳源可為澱粉或半木纖維素。特別佳之複合碳源可為澱粉。

上文、下文及實例中以大腸桿菌為例說明本發明。因此，可供根據本發明初始及衍化之菌株減弱、刪除或過度表現之基因主要採用來自大腸桿菌之基因名稱來界定。然而，根據本發明之此命名法具有更一般之定義，且涵蓋其他微生物中之相應基因。習此相關技藝之人士可採用來自大腸桿菌基因之基因銀行(GenBank)參考物來決定大腸桿菌以外之其他微生物中之等效基因。

鑑別同質性序列與其同質性百分比之方式係習此相關技藝之人士習知者，特定言之包括可於網頁http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上應用之BLAST程式，預設參數已出示在該網頁上。可採用例如：CLUSTALW程式(http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/)探討(定位)所得序列，預設參數已出示在該網頁上。

PFAM資料庫(排列與隱馬爾可夫模式(hidden Markov model)之蛋白質家族資料庫http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)收集大量蛋白質序列之排列。各PFAM可以看到多重排列，檢視蛋白質功能部位、評估其在生物體中之分佈、與其他資料庫交流及檢視已知蛋白質結構。

COGs(異種蛋白質群集http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)係由衍生自代表44種主要分類細胞系之66種完全定序之單細胞基因組之蛋白質序列進行比對而得。各COG由至少三種細胞系界定，因此可鑑別古老之保留功能部位。

參考文獻，依據內文之摘錄順序排列

1. Badia J,Ros J,Aguilar J(1985),J.Bacteriol .161 ： 435－437.

2. Tran Din K and Gottschalk G(1985),Arch.Microbiol .142 ：87－92

3. Cameron DC and Cooney CL(1986),Bio/Technology ,4 ： 651－654

4. Sanchez－Rivera F,Cameron DC,Cooney CL(1987), Biotechnol.Lett .9 ：449－454

5. Cooper RA(1984),Annu.Rev.Microbiol .38 ：49－68

6. Ttemeyer S,Booth NA,Nichols WW,Dunbar B,Booth IR(1998),Mbl.Microbiol .27 ：553－562

7. Ferguson GP,Ttemeyer S,MacLean MJ,Booth IR (1998),Arch.Microbiol .170 ：209－218

8. Saikusa T,Rhee HI,Watanabe K,Murata K,Kimura A (1987),Agric.Biol.Chem .51 ：1893－1899

9. Misra K,BanerjeeAB,Ray S,Ray M(1996),Mol.Cell. Biochem .156 ：117－124

10. Altaras NE and Cameron DC(1999),Appl.Environ. Microbiol .65 ：1180－1185

11. Grant AW,Steel G,Waugh H,Ellis EM(2003),FEMS Microbiol.Lett .218 ：93－99

12. Di Luccio E,Elling RA,Wilson DK(2006),Biochem.J .400 ：105－114

13. Ko J,Kim I,Yoo S,Min B,Kim K,Park C(2005),J.Bacteriol .187 ：5782－5789

14. Cameron DC,Altaras NE,Hoffman ML,Shaw AJ(1998),Biotechnol.Prog .14 ：116－125

15. Altaras NE and Cameron DC(2000),Biotechnol.Prog .16 ：940－946

16. Huang K,Rudolph FB,Bennett GN(1999),Appl.Environ.Microbiol .65 ：3244－3247

17. Berrios－Rivera SJ,San KY,Bennett GN(2003),J.Ind.Microbiol.Biotechnol .30 ：34－40

18. Datsenko KA and Wanner BL(2000),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97 ：6640－6645

19. Anderson EH(1946),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32 ：120－128

20. Miller(1992),A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbook forEscherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York

21. Schaefer U,Boos W,Takors R,Weuster－Botz D(1999),Anal.Biochem .270 ：88－96

22. Wiesenborn DP,Rudolph RB,Papoutsakis ET(1987),Appl.Environ.Microbiol .,54 ：2717－2722

23. Monot F,Martin JR,Petitdemange H,Gay R(1982),Appl.Environ.Microbiol .44 ：1318－1324

24. Vasconcelos I,Girbal L,Soucaille P(1994),J.Bacteriol .176 ：1443－1450

實例 實例1：在恆化器中培養之大腸桿菌菌株MG1655 lpd ^＊ 、 △tpiA、 △pflAB、 △adhE、ldhA ：：km、 △gloA、 △aldA、 △aldB、 △edd中 涉及甲基乙二醛還原作用之酵素之萃取法、純化法與鑑別法

a)涉及還原甲基乙二醛之NADH－或NADPH－依賴性酵素之純化法： 設計用於純化涉及甲基之還原作用之NADH－或NADPH－依賴性酵素之整體純化法包括5個步驟。每一步驟均以酵素活性分析法檢測目標酵素。測定兩種酵素活性：1)NADPH－依賴性甲基乙二醛還原作用，2)NADH－依賴性甲基乙二醛還原作用。

1)自於嚴格厭氧或微好氧條件之恆化器進行之大腸桿菌MG1555 lpd ^＊ 、△tpiA、△pflAB、△adhE、ldhA ：：km、△gloA、△aldA、△aldB、△edd (用於構築菌株，參見WO 2005/073364)培養物中收集微生物生質。

2)離心收集細胞，以50 mM HEPES緩衝液pH 7.5(含5 mM DTT)洗滌，再懸浮於相同緩衝液中後，才儲存於－20℃下。

3)細胞於音波處理下瓦解(0℃，厭氧條件下，每次30秒，每次循環之間間隔2分鐘，共循環4次，在蛋白酶抑制劑之存在下進行)。離心排除細胞碎片，細胞均質液中之核酸則利用鏈黴素硫酸鹽處理而沉澱，或使用酵素處理法(benzonase；核酸酶)水解)(表I)。

依據表1，鏈黴素硫酸鹽處理法可較有效率地達到較高比活性。可以排除雜質(核酸與不要之蛋白質)，同時保留所需酵素之生物活性。

4)取經過鏈黴素硫酸鹽處理之細胞均質物離心，加至已連接AKTA純化系統且經50 mM HEPES緩衝液(含5 mM DTT)平衡之陰離子交換層析管柱(Ressource Q,Amersham Bioscience)上。於pH 7或7.5或8分離蛋白質。以連續KC1梯度(2%)溶離蛋白質，並分段收集溶離份。

5)集合含酵素活性溶離份，並加至已經過50 mM HEPES緩衝液(含5 mM DTT)平衡之疏水性交互作用層析管柱(Hitrap苯基賽弗洛斯(sepharose),Amersham Biosciences)上。

若需要時，可增加最後一個凝膠滲析層析步驟。在每一步驟之後測定產量及純化因數。最後一個純化步驟後，留在活性溶離份中之蛋白質再於SDS－聚丙烯醯胺凝膠上分離。由溶離份之活性與溶離點大小之相關性鑑別所需蛋白質。切下蛋白質溶離點，經洗滌，以專一性蛋白酶(胰蛋白酶分解法)分解，以質譜儀(LC－MS/MS與MALDI)鑑別。

b)於壓氧條件下生長之大腸桿菌MG1655 lpd ^＊ 、△tpiA、△pflAB、△adhE、ldhA ：：km、△gloA、△aldA、△aldB、△edd中涉及甲基乙二醛還原作用之酵素之鑑別法： 該純化法採用陰離子交換層析法，於pH 7下進行後，經疏水性交互作用層析法純化，鑑別出兩種會還原甲基乙二醛之NADPH依賴性酵素：由yqhD 基因編碼之YQHD(42KDa)與由ydhF 基因編碼之YDHF(33KDa)(圖2)。已發現第三種酵素(由gldA 基因編碼之甘油脫氫酶)在NADH與NADPH依賴性甲基乙二醛還原作用中具有活性。

當於pH 8下進行陰離子交換層析法後，接著進行疏水性交互作用層析法及最後一個凝膠滲析層析法時，鑑別出另一種可還原甲基乙二醛之NADPH依賴性酵素：由dkgB (yafB )基因編碼之2.5－二酮基－D－葡糖酸鹽還原酶B(29KDa)。

c)於微好氧條件下生長之大腸桿菌MG1655 lpd ^＊、 △tpiA、△pflAB、△adhE、ldhA：：km、△gloA、△aldA、△aldB、△edd中涉及甲基乙二醛還原作用之酵素之鑑別法：

所設計之純化法係採用陰離子性交換層析法，於pH 7.5下進行，鑑別出一種稱為YCDW之36KDa蛋白質，其係由ycdW基因編碼，其催化NADPH依賴性還原甲基乙二醛。

當於pH 7.5下進行陰離子交換層析法後，接著進行疏水性交互作用層析法時，鑑別出其他兩種催化NADPH依賴性還原甲基乙二醛之酵素：由yqhD基因編碼之YQHD(42KDa)(已自厭氧條件下生長之細胞中純化)與由dkgA(yqhE)基因編碼之2.5-二酮基-D-葡糖酸鹽還原酶A(31KDa)。

實例2：在大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd中刪除△yqhD、△yafB、△ydhF與△ycdW，評估該等基因於甲基乙二醛還原作用中之涉及程度 a)經改造之大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、ldhA：：Km、△gloA、△aldA、△aldB、△edd之構築法

依據製程1消去大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、ldhA：：km、△gloA、△aldA、△aldB、△edd：：cm之氯黴素抗性區段。

製程1：抗性區段之消去法

依據下列技術消去氯黴素(chloramphenicol)與/或康黴素(kanamycin)抗性區段。利用電穿孔法，將帶有作用在氯黴素與/或康黴素抗性區段中FRT位置之FLP重組酶之質體pCP20導入菌株。於42℃下進行一系列培養後，採用表2所示之寡核苷酸進行PCR分析法，檢測抗生素抗性區段。

採用表2所示之寡核苷酸檢測先前已於菌株中建構之改造。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、ldhA：：km、△gloA、△aldA、△aldB、△edd。

b)經改造之大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd之構築法

為了消去康黴素抗性區段及去除ldhA基因之活性，依據製程2，將氯黴素抗性區段嵌入已刪除大多數相關基因之ldhA基因中。

製程2：供重組及選拔重組體之PCR產物之導入法

採用選自表3所示供置換基因或基因間區域之寡核苷酸來擴增來自質體pKD3之氯黴素抗性區段或來自質體pKD4之康黴素抗性區段(Datsenko,K.A.& Wanner,B.L.(2000))。所得PCR產物再利用電穿孔法導入帶有質體pKD46之受體菌株中，其中系統λ Red(γβ，exo)之表現極有利於同質性重組作用。然後選拔抗生素抗性轉化體，並採用表2所示之適當寡核苷酸進行PCR分析法，檢測所嵌入之抗性區段。

採用表2所示之寡核苷酸檢測菌株之其他改造。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△ldhA：：cm△.tpiA、△pflAB、△adhE、△gloA、△aldA、△aldB、△edd。

c)經改造之大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△yqhD之構築法

採用製程2說明之技術，採用表3所示之寡核苷酸，於大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd中，藉由嵌入康黴素抗生素抗性區段，並刪除大部份相關基因，以去除基因yqhD之活性。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△yqhD：：km。

採用表2所示寡核苷酸檢測菌株之其他改造。

然後依據製程1消去氯黴素與康黴素抗性區段。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△yqhD。

d)經改造之大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△yafB之構築法

採用製程2說明之技術，使用表3所示寡核苷酸，於大腸桿菌菌株MG1655中，藉由嵌入康黴素抗生素抗性區段，並刪除大部份相關基因，以去除基因yafB之活性。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 △yafB：：km。

採用噬菌體P1進行轉導技術，於大腸桿菌菌株 MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd中，以康黴素抗性區段置換基因法，來刪除基因yafB。

製程3：使用噬菌體P1進行轉導作用來刪除基因

採用噬菌體P1進行轉導技術，於受體大腸桿菌菌株中，以抗性區段(康黴素或氯黴素)置換基因法，來刪除所選用之基因。該製程分兩步驟(i)於刪除單一基因之菌株MG1655上製備噬菌體溶胞物，與(ii)以此噬菌體溶胞物轉導受體菌株。

噬菌體溶胞物製法

- 接種100微升含已刪除單一基因之菌株MG1655之隔夜培養物之10毫升LB+Cm 30微克/毫升+葡萄糖0.2%+CaCl₂ 5mM。

- 於37℃下振盪培養30分鐘。

- 添加100微升於野生型菌株MG1655上製備之噬菌體溶胞物P1(約1 x 10⁹個噬菌體/毫升)。

- 於37℃下振盪3小時，直到所有細胞均溶解為止。

- 添加200微升氯仿並渦轉混合。

- 於4500g下離心10分鐘，以排除細胞碎片。

- 取上清液移至無菌管中，添加200微升氯仿。

- 溶胞物保存在4℃下。

轉導法

- 取5毫升含於LB培養基之大腸桿菌受體菌株之隔夜培養物於1500g下離心10分鐘。

- 取細胞集結塊懸浮於2.5毫升MgSO₄ 10mM、CaCl₂ 5mM中。

- 對照組試管：100微升細胞

- 100微升已刪除單一基因之菌株MG1655之噬菌體P1。

- 試驗組試管：100微升細胞+100微升已刪除單一基因之菌株MG1655之噬菌體P1。

- 於30℃且不振盪下培養30分鐘。

- 在各試管中添加100微升1M檸檬酸鈉，並渦轉混合。

- 添加1毫升LB。

- 於37℃與振盪下培養1小時。

- 試管於7000rpm下離心3分鐘後，塗覆在培養皿LB+Cm 30微克/毫升上。

然後選拔抗生素抗性轉化體，並採用表1所示之適當寡核苷酸進行PCR分析法，檢測嵌入之刪除基因。

採用表2所示寡核苷酸檢測菌株之其他改造。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△a1dA、△a1dB、△edd、△yafB：：km。

依據製程1消去氯黴素與康黴素抗性區段。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△yafB。

e)經改造之大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△ydhF之構築法

採用製程2說明之技術及表3所示之寡核苷酸，於大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd中嵌入康黴素抗生素抗性區段並刪除相關基因，以去除基因ydhF之活性。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△ydhF：：km。

採用表2所示之寡核苷酸檢測菌株之其他改造。

然後依據製程1消去氯黴素與康黴素抗性區段。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△ydhF。

f)經改造之大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△ycdW之構築法

採用製程2說明之技術及表3所示之寡核苷酸，於大腸桿菌菌MG1655中嵌入康黴素抗生素抗性區段，並刪除相關基因，以去除基因ycdW之活性。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 △ycdW：：km。

採用製程3所述之噬菌體P1進行轉導技術，以大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd之康黴素抗性區段置換基因法來刪除基因ycdW。

於菌株MG1655△ycdW：：km上取得噬菌體P1溶胞物，並採用此噬菌體溶胞物轉導大腸桿菌菌株MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA：：cm、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△ycdW：：km。

採用表2所示之寡核苷酸檢測菌株之其他改造。

然後依據製程1消去氯黴素與康黴素抗性區段。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 lpd*、△tpiA、△pflAB、△adhE、△ldhA、△gloA、△aldA、△aldB、△edd、△ycdW。

f)已刪除編碼已鑑別出之甲基乙二醛還原酶之基因之菌株培養法

於錐形瓶中，在微好氧條件下，使用MPG培養基，pH 6.7與37℃下培養已刪除△yqhD、△yafB、△dhF與△ycdW之四種菌株。

培養72小時後，由HPLC測定培養物上清液中之丙酮醇與1,2-丙二醇產量。其結果示於表4。

其結果顯示，所有已鑑別出之甲基乙二醛還原酶均涉及轉化甲基乙二醛形成丙酮醇，且進一步形成1,2-丙二醇。刪除yqhD之結果會強力抑制生長，可能因甲基乙二醛累積所致。刪除yafB與ydhF亦對丙酮醇與1,2-丙二醇之生產有重大影響。

實例3：經改造之大腸桿菌菌株 MG1655(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)、大腸桿菌MG1655(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)與大腸桿菌MG1655(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)之構築法

為了提高1,2-丙二醇產量，由質體pME101VB01使用trc啟動子表現不同基因組合。

a)質體pME101VB01之構築法

質體pME101VB01係衍生自質體pME101且具有多重選殖位置，其中包含針對稀有之限制內切核酸酶NheI、SnaBI、PacI、BglII、AvrII、SacII與AgeI之辨認位置序列，接續為丙酮丁醇梭菌ATCC824之adc轉錄終結子。

由低套數複本載體進行表現時，依下列方法構築質體pME101。由質體pCL1920(Lerner & Inouye,1990,NAR 18,15 p 4631-GenBank AX085428)使用寡核苷酸PME101F與PME101R進行PCR擴增法，且在擴增之載體中嵌入來自載體pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,N.J)且內含lacI基因與trc啟動子之BstZ17I-XmnI片段。

PME101F(SEQ ID NO 55)：ccgacagtaagacgggtaagcctg

PME101R(SEQ ID NO 56)：agcttagtaaagccctcgctag

採用包含多重選殖位置與adc轉錄終結子之合成性雙股核酸連接物形成pME101VB01。黏合兩個補體側接NcoI或HindIII分解之限制酶切割位置之100個鹼基寡核苷酸。次選殖該100個鹼基對產物至NcoI/HindIII分解質體pME101中，形成pME101VB01。

pME101VB01 1，由100個鹼基(SEQ ID NO 57)組成：

pME101VB01 2，由100個鹼基(SEQ ID NO 58)組成：

其具有：

- 相當於多重選殖位置之區域(以下加線之小字母表示)。

- 相當於丙酮丁醇梭菌ATCC 824 pSOL1(NC_001988)之adc轉錄終結子(序列179847至179814)之區域(以大字母表示)。

b)用於表現1,2-丙二醇之生合成途徑之不同基因組合之質體(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA與pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)之構築法

採用表1所示寡核苷酸，由大腸桿菌MG1655之基因組DNA為不同基因進行PCR擴增法。

採用表5所述之限制酶酵素切割PCR擴增之片段，並選殖至質體pME101VB01之限制酶切割位置中。建構下列質體：pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA、pME101VB01-yafB-mgsA-gldA與pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA。

然後將質體導入大腸桿菌菌株MG1655。

實例4：可以產生高產量1,2-丙二醇之經改造之大腸桿菌菌株MG1655 Ptrc16-gapA、△edd-eda、△gloA、△pykA、△pykF(pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA)、(pJB137-PgapA-ppsA)、大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA、△edd-eda、△gloA、△pykA、△pykF(pME101VB01-yafB-mgsA-gldA)、(pJB137-PgapA-ppsA)與大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA、△edd-eda、△gloA、△pykA、△pykF(pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)、(pJB137-PgapA-ppsA)之構築法

在大腸桿菌菌株MG1655中，使用合成之短型Ptrc16啟動子(SEQ ID NO 69：gagctg ttgacg attaatcatccggctcg aataat gtgtgg)置換天然gapA啟動子之作法為採用製程2說明之技術及表3所示之寡核苷酸，以FRT-CmR-FRT與經工程處理之啟動子置換上游gapA序列之225pb。

採用表2所示之寡核苷酸進行PCR分析法，檢測嵌入之抗性區段。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA：：cm。

採用製程2說明之技術及表3所示之寡核苷酸，在大腸桿菌菌株MG1655中嵌入康黴素抗生素抗性區段，並刪除大部份相關基因，以去除基因edd-eda之活性。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 △edd-eda：：km。

依據製程3將此刪除轉移至大腸桿菌菌株MG1655 Ptrc16-gapA：：cm中。

所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA：：cm,△edd-eda：：km。

然後依據製程1消去抗生素抗性區段。

依據製程2，使用表3所示寡核苷酸，建構菌株MG1655 △gloA：：cm，依據製程3將此刪除轉移至先前已建構之菌株中。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA、△edd-eda、△gloA：：cm。

依據製程2，使用表3所示寡核苷酸，在先前之菌株中嵌入康黴素抗生素抗性區段，以去除基因pykA之活性。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA、△edd-eda、△gloA：：cm、△pykA：：km。

然後依據製程1消去抗生素抗性區段。

依據製程2，使用表3所示寡核苷酸，嵌入氯黴素抗生素抗性區段，以去除基因pykF之活性。所得菌株稱為大腸桿菌MG1655 Ptrc16-gapA、△edd-eda,、△gloA,、△pykA、△pykF：：cm。

然後依據製程1消去抗生素抗性區段。

每一個步驟均採用表3所示之寡核苷酸檢測先前建構之所有刪除結果。

為了提高磷酸烯醇丙酮酸鹽之產量，由質體pJB137使用gapA啟動子表現ppsA基因。構築質體pJB137-PgapA-ppsA時，採用下列寡核苷酸，由大腸桿菌MG1655之基因組DNA進行PCR，擴增基因ppsA：

1. gapA-ppsAF，由65個鹼基(SEQ ID NO 70)組成ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC其中含：- 與基因ppsA(1785136至1782758)之序列(1785106-1785136)具有同質性之區域(以大字母表示)，其參考序列示於網頁http：//genolist.pasteur.fr/Colibri/)，及- 與gapA啟動子(1860794-1860761)具有同質性之區域(以小字母表示)。

2. ppsAR，由43個鹼基(SEQ ID NO 71)組成aatcgcaagctt GAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC其中含：－與基因ppsA 區域(1785136至1782758)之序列(1782758－1782780)具有同質性之區域，－限制酶切割位置Hind III(以下加線字母表示)

同時採用下列寡核苷酸擴增大腸桿菌基因gap A之gap A啟動子區域：1. gapA－ppsAR，由65個鹼基(SEQ ID NO 72)組成GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg其中含：－與基因ppsA (1785136至1782758)之序列(1785106－1785136)具有同質性之區域(以大字母表示)，及－與gap A啟動子(1860794 －1860761)具有同質性之區域(以小字母表示)。

2. gapAF，由33個鹼基(SEQ ID NO 73)組成ACGTCCCGGG caagcccaaaggaagagtgaggc其中含：－與gap A啟動子(1860639－1860661)具有同質性之區域(以小字母表示)。－限制酶切割位置Sma I(以下加線字母表示)。

隨後使用寡核苷酸ppsAR與gapAF(Horton et al.1989 Gene 77：61－68)稠合這兩個片段。使用限制酶切割酵素Hind III與Sma I切下PCR擴增之片段並選殖至載體pJB137 (EMBL登錄編號：U75326)之Hind III/Sma I位置，產生載體pJB137 －PgapA －ppsA。

取不同pME101VB01質體與pJB137－PgapA －ppsA 導入大腸桿菌菌株MG1655 Ptrc16－gapA、△edd －eda、△gloA、△pykA、△pykF 中。所得菌株分別稱為大腸桿菌MG1655 Ptrc16－gapA、△edd －eda、△gloA、△pykA、△pykF、 pME101VB01－yqhD －mgsA －gldA、 pJB137－PgapA －ppsA (菌株1)、大腸桿菌MG1655Ptrc16 －gapA、△edd －eda、△gloA、△pykA、△pykF、 pME101VB01－yafB －mgsA －gldA、 pJB137－PgapA －ppsA (菌株2)與大腸桿菌MG1655 Ptrc16－gapA、△edd －eda、△gloA、△pykA、△pykF、 pME101VB01－yqhE －mgsA －gldA、 pJB137－PgapA －ppsA (菌株3)。

實例5：不同菌株於好氧條件下之1,2－丙二醇產量之比較

取依實例4之說明製得之菌株(菌株1、2與3)與對照組菌株(對照組1：MG1655 pME101VB01－yqhD －mgsA －gldA ，對照組2：MG1655 pME101VB01－yafB －mgsA －gldA ，對照組3：MG1655 pME101VB01－yqhE －mgsA －gldA 與對照組4：MG1655 Ptrc16－gapA、△edd －eda、△gloA、△pykA、△pykF )於錐形瓶中，在好氧條件下，於最基本培養基中，使用葡萄糖作為碳源進行分析。於34℃或37℃下培養，並使用MOPS來緩衝培養基，維持pH。培養結束時，以HPLC分析發酵槽中1,2－丙二醇、丙酮醇與殘留葡萄糖含量，並計算相對於葡萄糖之1,2－丙二醇產量及相對於葡萄糖之1,2－丙二醇＋丙酮醇產量。

納入本文中且構成本說明書一部份之附圖係舉例說明本發明，且連同其說明共同解釋本發明之原理。

圖1出示用於發展由碳水化合物製造1,2－丙二醇之系統之中心代謝作用之遺傳工程法。

圖2出示三種蛋白質YQHD、YDHF與GLDA於陰離子交換層析管柱中，在pH 7下之溶離圖形。

<110> 代謝探索公司

<120> 製造1,2-丙二醇及丙酮醇之微生物及方法

<130> D25262

<140> 097110002

<141> 2008-03-21

<150> PCT/IB2007/001677

<151> 2007-03-23

<160> 73

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 2

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 3

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 7

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 8

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 9

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 10

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 11

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 12

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 13

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 14

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 15

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 17

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 18

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 19

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 22

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 23

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 25

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 26

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 27

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 28

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 29

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 30

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 31

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 32

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 33

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 34

<210> 35

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 35

<210> 36

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 36

<210> 37

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 37

<210> 38

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 38

<210> 39

<211> 99

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 39

<210> 40

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 40

<210> 41

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 41

<210> 42

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 42

<210> 43

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 43

<210> 44

<211> 99

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 44

<210> 45

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 45

<210> 46

<211> 79

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 46

<210> 47

<211> 102

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 47

<210> 48

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 48

<210> 49

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 49

<210> 50

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 50

<210> 51

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 51

<210> 52

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 52

<210> 53

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 53

<210> 54

<211> 101

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 54

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 55

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 56

<210> 57

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 57

<210> 58

<211> 100

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 58

<210> 59

<211> 79

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 59

<210> 60

<211> 43

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 60

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 61

<210> 62

<211> 29

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 62

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 63

<210> 64

<211> 26

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 專一性引子

<400> 64

<210> 65

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 65

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 66

<210> 67

<211> 31

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 67

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 68

<210> 69

<211> 41

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> 合成性啟動子

<400> 69

<210> 70

<211> 65

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 70

<210> 71

<211> 43

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 71

<210> 72

<211> 65

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 72

<210> 73

<211> 33

<212> DNA

<213> 人造

<220>

<223> PCR引子

<400> 73

Claims

一種製造1,2-丙二醇的方法，其中用於生產1,2-丙二醇之經改造的大腸桿菌(Escherichia coli)的特徵在於：- 藉由從大腸桿菌過度表現基因yqhD而得到提高的甲基乙二醛還原酶活性，- 刪除至少一種涉及恩特-朵夫(Entner-Doudoroff)途徑的基因edd、eda，於含有碳源的適當生長培養基中生長，並回收所製造的1,2-丙二醇，其中於經改造的大腸桿菌中，該過度表現係藉由置換涉及甲基乙二醛還原作用之基因yqhD的天然啟動子成可誘發至少一種該基因更高度表現的啟動子，或藉由導入涉及甲基乙二醛還原作用之基因yqhD之多套複本至該微生物而達成。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，甲基乙二醛合成酶活性藉由過度表現mgsA基因而被提高。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，至少一種涉及轉化甲基乙二醛形成乳酸鹽的下列基因表現被減弱：gloA、aldA、aldB。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，至少一種涉及合成乳酸鹽、甲酸鹽或乙醇的下列基因表現被減弱：ldhA、pflA、pflB、adhE。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，至少一種涉及合成乙酸鹽的下列基因表現被減弱：ackA、pta、poxB。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，甘油醛3磷酸鹽脫氫酶活性藉由減弱gapA基因的表現而被減弱。
根據申請專利範圍第6項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，糖之輸入效率藉由提高至少一種涉及不依賴磷酸烯醇丙酮酸鹽之糖輸入系統並選自galP與glk的基因表現而被提高。
根據申請專利範圍第7項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，糖-磷酸轉移酶系統效率藉由提高代謝物磷酸烯醇丙酮酸鹽之可利用度而被改善，其中：- 至少一種編碼丙酮酸鹽激酶並選自pykA與pykF的基因表現被減弱，- 編碼磷酸烯醇丙酮酸鹽合成酶的ppsA基因表現被提高。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中：- 甘油脫氫酶活性藉由提高gldA基因的表現而被提高及/或，- 1,2-丙二醇氧化還原酶活性藉由提高fucO基因的表現而被提高。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中，基因lpd具有定點突變，造成丙胺酸55被纈胺酸置換。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中於經改造的大腸桿菌中：- 三碳糖磷酸鹽異構酶活性藉由減弱tpiA的基因表現而被提高及/或，- 至少一種選自arcA與ndh的基因表現被減弱。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中所回收的1,2-丙二醇進一步被純化。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中丙酮醇進一步被回收及純化。
一種用於由碳源製造1,2-丙二醇與/或丙酮醇之經改造的大腸桿菌，其中該株之特徵在於：- 藉由從大腸桿菌過度表現基因yqhD而得到提高的甲基乙二醛還原酶活性，- 藉由過度表現mgsA基因而得到提高的甲基乙二醛合成酶活性，及- 刪除至少一種涉及恩特-朵夫(Entner-Doudoroff)途徑的基因edd、eda，其中於經改造的大腸桿菌中，該過度表現係藉由置換涉及甲基乙二醛還原作用之基因yqhD或mgsA基因的天然啟動子成可誘發至少一種該基因更高度表現的啟動子，或藉由導入涉及甲基乙二醛還原作用之基因yqhD或mgsA之多套複本至該微生物而達成。