ES2550361T3

ES2550361T3 - Microorganismos y procedimientos para la producción de 1,2-propanodiol y acetol

Info

Publication number: ES2550361T3
Application number: ES08714209.7T
Authority: ES
Inventors: Philippe Soucaille; Isabelle Meynial-Salles; François VOELKER; Rainer Figge
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2007-03-23
Filing date: 2008-03-21
Publication date: 2015-11-06
Anticipated expiration: 2028-03-21
Also published as: TWI521062B; IL200660A; BRPI0808970A2; PL2126101T3; EP2126101B1; CN101641444A; CN101641444B; DK2126101T3; US20110201070A1; IL200660A0; WO2008116853A1; MX2009010224A; BRPI0808970B1; JP2010521959A; EP2126101A1; CA2688450C; CA2688450A1; AR066197A1; KR20160067228A; US9051588B2

Abstract

Procedimiento para preparar 1,2-propanodiol en el que una Escherichia coli modificada, útil para la producción del 1,2-propanodiol, caracterizada por que presenta: - una actividad de metil glioxal reductasa aumentada, obtenida mediante la sobreexpresión del gen yqhD a partir de Escherichia coli, - la eliminación de por lo menos uno de los genes edd, eda implicados en la ruta de Entner-Doudoroff, se hace crecer en un medio de crecimiento adecuado que contiene una fuente de carbono, y el 1,2-propanodiol producido es recuperado.

Description

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Las condiciones microaerobias se definen como las condiciones de cultivo en las que se disuelven bajos porcentajes de oxígeno (por ejemplo, utilizando una mezcla de gas que contiene entre 0,1 y 10% de oxígeno, completado con nitrógeno hasta llegar al 100%) en la fase líquida.

5 Las condiciones anaerobias se definen como las condiciones de cultivo en las que no se proporciona oxígeno al medio de cultivo. Las condiciones estrictamente anaerobias se logran rociando un gas inerte como el nitrógeno en el medio de cultivo para extraer rastros de otros gases. Se puede utilizar el nitrato como un aceptor de electrones para mejorar la producción de ATP de la cepa y mejorar su metabolismo.

10 El término “medio de crecimiento apropiado” según la invención indica un medio de composición molecular conocida adaptado al crecimiento del microorganismo. Por ejemplo: un medio de cultivo mineral de composición conocida adaptado a las bacterias utilizadas, conteniendo al menos una fuente de carbono. En particular, el medio de crecimiento mineral para la E. coli o K. pneumoniae puede, de esta manera, tener una composición idéntica o similar al medio M9 (Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 32:120-128), medio M63 (Miller, 1992; A Short Course in

15 Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) o un medio como el definido por Schaefer y col. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96) y, en particular, el medio de cultivo mínimo denominado MPG descrito a continuación:

K2HPO4: 1,4 g/l

Ácido nitrilo triacético: 0,2 g/l

Solución de oligoelementos*: 10 ml/l

(NH4)2SO4: 1 g/l

NaCl: 0,2 g/l

NaHCO3: 0,2 g/l

MgSO4: 0,2 g/l

Glucosa: 20 a 100 g/l

NaNO3: 0,424 g/l

Tiamina: 10 mg/l

FeSO4, 7H2O: 50 mg/l

Extracto de levadura: 4 g/l

20 El pH del medio se ajusta a 7,4 con hidróxido de sodio.

*solución de oligoelementos: 4,37 g/L de ácido cítrico, 3 g/L de MnSO4, 1 g/L de CaCl2, CoCl2, 0,1 g/L de 2H2O, ZnSO4, 0,10 g/L de 7H2O, CuSO4, 10 mg/L de 5H2O, 10 mg/L de H3BO3, 8,31 mg/L de Na2MoO4.

25 La fuente de carbono utilizada para el cultivo de E. coli es, preferentemente, una fuente de carbono simple y puede ser arabinosa, fructosa, galactosa, glucosa, lactosa, maltosa sacarosa o xilosa. Una fuente de carbono simple especialmente preferida es la glucosa.

La invención se describe anteriormente, a continuación y en los ejemplos relacionados respecto a la E. coli. De este

30 modo, los genes que se pueden atenuar, eliminar o sobreexpresar para las cepas iniciales y evolucionadas según la invención se definen principalmente utilizando la denominación de los genes de la E. coli.

REFERENCIAS (en orden de aparición en el texto)

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35 Ejemplos

Ejemplo 1: Extracción, purificación e identificación de las enzimas que participan en la reducción del metilglioxal en la cepa de E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ldhA::km, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd cultivada en quimiostato

40 a) Proceso de purificación de las enzimas dependientes de NADH o NADPH que participan en la reducción del metilglioxal:

El proceso completo de purificación diseñado para purificar las enzimas dependientes de NADH o NADPH que

45 participan en la reducción del metil está formado por cinco etapas. En cada etapa, las enzimas diana se detectaron mediante ensayos de actividad enzimática. Se determinaron dos actividades enzimáticas: 1) Reducción del metilglioxal dependiente de NADPH, 2) Reducción del metilglioxal dependiente de NADH.

1) Se recolectó biomasa microbiana a partir de cultivos en quimiostato de la E. coli MG1655 lpd* ∆tpiA, ∆pflAB,

50 ∆adhE, ldhA::km, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd (para la construcción de la cepa, consultar el documento WO 2005/073364) llevados a cabo ya sea en condiciones estrictamente anaerobias o en condiciones microaerobias.

2) Las células se recogieron mediante centrifugación, se lavaron dos veces con un tampón HEPES 50 mM (pH 55 7,5) con 5 mM de DTT, resuspendidas en el mismo tampón antes de su almacenamiento a -20ºC.

3) Las células se fragmentaron mediante aplicación de ultrasonidos (a 0°C, en condiciones anaerobias, en cuatro ciclos de 30 s con intervalos de 2 minutos entre cada ciclo en presencia de inhibidores de proteasas). Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación y los ácidos nucleicos presentes en el

60 homogeneizado celular se precipitaron mediante un tratamiento con estreptomicina sulfato o se hidrolizaron mediante un tratamiento enzimático (benzonasa) (tabla I).

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Los casetes de resistencia al cloranfenicol y/o kanamicina se eliminaron según la siguiente técnica: El plásmido pCP20 que transporta la recombinasa FLP que actúa en los sitios FRT de los casetes de resistencia al cloranfenicol y/o kanamicina se introdujo en la cepa mediante electroporación. Después de un cultivo en serie a 42ºC, se 5 comprobó la pérdida de los casetes de resistencia al antibiótico mediante el análisis por PCR con los oligonucleótidos presentados en la tabla 2.

Se comprobó la presencia de las modificaciones anteriormente incorporadas en la cepa utilizando los oligonucleótidos presentados en la tabla 2.

10 La cepa obtenida se denominó E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ldhA::Km, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd.

Tabla 2: Oligonucleótidos utilizados para comprobar la inserción de un casete de resistencia o la pérdida del casete de resistencia

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Nombre de la región: Nombres de oligos Identificador de secuencia Homología con la región cromosómica

Gen tpiA (supresión): cdh YIIQ N°1 N°2 Véase WO2005073364

Gen pflAB: pflABF pflABR N°3 N°4 Véase WO2005073364

Gen adhE: ychGf adhECr N°5 N°6 Véase WO2005073364

Gen ldhA (inserción del casete): hsIJC ldhAC2 N°7 N°8 Véase WO2005073364

Gen gloA: NemACd Rnt Cr N°9 N°10 Véase WO2005073364

Gen aldA: Ydc F C f gapCCr N°11 N°12 Véase WO2005073364

Gen aldB: aldB C f YiaYCr N°13 N°14 Véase WO2005073364

Gen edd: Eda d Zwf r N°15 N°16 Véase WO2005073364

Gen ldhA (supresión): ldhAF ldhAR N°17 N°18 1439724 a 1439743 1441029 a 1441007

Gen yqhD: yqhDF yqhDR N°19 N°20 3153060 a 3153092 3154817 a 3154789

Gen yafB: yafBF yafBR N°21 N°22 228785 a 228804 230296 a 230276

Gen ydhF: ydhFF ydhFR N°23 N°24 1722394 a 1722423 1723920 a 1723890

Gen ycdW: ycdWF ycdWR N°25 N°26 1096789 a 1096809 1098297 a 1098277

Promotor gapA (Ptrc16-gapA): yeaAF gapAR N°27 N°28 1860259-1860287 1861068-1861040

Genes edd y eda: eddF edaR N°29 N°30 1932996-1932968 1929754-1929777

Gen pykA: pykAF pykAR N°31 N°32 1935338 a 1935360 1937425 a 1937401

Gen pykF: pykFF pykFR N°33 N°34 1753371 a 1753392 1755518 a 1755495

b) Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA::cm, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd

20 Para eliminar el casete de resistencia a la kanamicina y para inactivar el gen ldhA, se introdujo el casete de resistencia al cloranfenicol en el gen ldhA eliminando la mayor parte del gen en cuestión según el protocolo 2.

Protocolo 2: Introducción de un producto de la PCR para la recombinación y selección de los recombinantes

25 Los oligonucleótidos seleccionados y presentados en la tabla 3 para la sustitución de un gen o una región intergénica se utilizaron para amplificar ya sea el casete de resistencia al cloranfenicol a partir del plásmido pKD3 o el casete de resistencia a la kanamicina a partir del plásmido pKD4 (Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000)). El producto de la PCR obtenido se introdujo posteriormente mediante electroporación en la cepa receptora con el

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El gen ydhF se inactivó en la cepa de E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA::cm, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd mediante la inserción de un casete de resistencia al antibiótico kanamicina y la supresión de la mayor parte del gen en cuestión utilizando la técnica descrita en el protocolo 2 con los oligonucleótidos presentados en la tabla 3. La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA::cm, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd, ∆ydhF::km.

Las otras modificaciones de la cepa se comprobaron con los oligonucleótidos presentados en la tabla 2.

Los casetes de resistencia al cloranfenicol y la kanamicina se eliminaron a continuación según el protocolo 1.

La cepa obtenida se denominó E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd, ∆ydhF.

f) Construcción de una cepa modificada de E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd, ∆ycdW

El gen ycdW se inactivó en la cepa de E. coli MG1655 mediante la inserción de un casete de resistencia a la kanamicina y la supresión de la mayor parte del gen en cuestión utilizando la técnica descrita en el protocolo 2 con los oligonucleótidos presentados en la tabla 3. La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 ∆ycdW::km.

La eliminación del gen ycdW mediante la sustitución del gen por un casete de resistencia a la kanamicina en la cepa de E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA::cm, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd se realizó mediante la técnica de la transducción con el fago P1 descrito en el protocolo 3.

Se obtuvo el lisado del fago P1 en la cepa MG1655 ∆ycdW::km y la transducción de la cepa de E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA::cm, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd se llevó a cabo utilizado este lisado del fago.

La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA::cm, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd, ∆ycdW::km.

La cepa obtenida se denominó E. coli MG1655 lpd*, ∆tpiA, ∆pflAB, ∆adhE, ∆ldhA, ∆gloA, ∆aldA, ∆aldB, ∆edd, ∆ycdW.

f) Cultivo de las cepas portadoras de las supresiones en los genes que codifican las metilglioxal reductasas identificadas

Se cultivaron las cuatro cepas portadoras de las supresiones ∆yqhD, ∆yafB, ∆ydhF y ∆ycdW en matraces de Erlenmeyer en condiciones microaerobias en el medio MPG a un pH de 6,7 y a 37ºC.

Después de 72 h de cultivo, se midió la producción de acetol y 1,2-propanodiol mediante HPLC en el sobrenadante de los cultivos. Los resultados se presentan en la tabla 4.

Tabla 4: Producción de 1,2-propanodiol y acetol en cepas portadoras de supresiones en los genes que codifican las metilglioxal reductasas (cada valor es una media de dos valores provenientes de dos cultivos diferentes)

Producto (mM): Cepa ∆ydhF Cepa ∆ycdW Cepa ∆yafB Cepa ∆yqhD Cepa de control

1,2-propanodiol: 10,7 16,3 8,1 0 16,7

Acetol: 9,3 11,1 7,2 0 11,3

Suma: 20,0 27,4 15,3 0 28,0

Los resultados demostraron que todas las metilglioxal reductasas identificadas tienen participación en la conversión del metilglioxal en acetol y, posteriormente, en 1,2-propanodiol. La supresión del yqhD dio lugar a una gran inhibición del crecimiento posiblemente debido a la acumulación de metilglioxal. Las supresiones de yafBy ydhF también tienen un importante impacto sobre la producción de acetol y 1,2-propanodiol.

Ejemplo 3: Construcción de cepas modificadas de E. coli MG1655 (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA), E. coli MG1655 (pME101VB01-yafB-mgsA-gldA) y E. coli MG1655 (pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA)

Para aumentar la producción de 1,2-propanodiol, se expresaron diferentes combinaciones de genes a partir del plásmido pME101VB01 utilizando el promotor trc.

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Los fragmentos amplificados por PCR se cortaron con las enzimas de restricción mencionadas en la tabla 5 y se clonaron en los sitios de restricción del plásmido pME101VB01. Se construyeron los siguientes plásmidos: pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA, pME101VB01-yafB-mgsA-gldA y pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA.

A continuación, los plásmidos se introdujeron en la cepa de E. coli MG1655.

Ejemplo 4: Construcción de cepas modificadas de E. coli MG1655 Ptrc16-gapA, ∆edd-eda, ∆gloA, ∆pykA, ∆pykF (pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA), E. coli MG1655 Ptrc16-gapA, ∆edd-eda, ∆gloA, ∆pykA, ∆pykF (pME101VB01-yafB-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA) y E. coli MG1655 Ptrc16-gapA, ∆edd-eda, ∆gloA, ∆pykA, ∆pykF (pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA), (pJB137-PgapA-ppsA) con capacidad para producir 1,2-propanodiol con alto rendimiento

Se sustituyó el promotor gapA natural por el promotor Ptrc16 corto sintético (identificador de secuencia Nº 69: gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg) en la cepa de E. coli MG1655 mediante la sustitución de 225 pb de la secuencia gapA en dirección 5' por FRT-CmR-FRT y un promotor genomanipulado utilizando la técnica descrita en el protocolo 2 con los oligonucleótidos presentados en la tabla 3.

Se comprobó la inserción del casete de resistencia mediante el análisis por PCR con los oligonucleótidos presentados en la tabla 2.

La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 Ptrc16-gapA::cm.

Los genes edd-eda se inactivaron en la cepa de E. coli MG1655 mediante la inserción de un casete de resistencia a la kanamicina y la supresión de la mayor parte de los genes en cuestión utilizando la técnica descrita en el protocolo 2 con los oligonucleótidos presentados en la tabla 3. La cepa obtenida se denominó E. coli MG1655 ∆edd-eda::km.

Esta supresión se transfirió en la cepa de E. coli MG1655 Ptrc16-gapA::cm según el protocolo 3.

La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 Ptrc16-gapA::cm, ∆edd-eda::km.

Los casetes de resistencia al antibiótico se eliminaron a continuación según el protocolo 1.

Se construyó la cepa MG1655 ∆gloA::cm según el protocolo 2 con los oligonucleótidos presentados en la tabla 3 y se transfirió esta supresión en la cepa anteriormente construida según el protocolo 3. La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 Ptrc16-gapA, ∆edd-eda, ∆gloA::cm.

El gen pykA se inactivó en la cepa anterior mediante la inserción de un casete de resistencia a la kanamicina según el protocolo 2 con los oligonucleótidos presentados en la tabla 3. La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 Ptrc16-gapA, ∆edd-eda, ∆gloA::cm, ∆pykA::km.

El gen pykF se inactivó mediante la inserción de un casete de resistencia al antibiótico cloranfenicol según el protocolo 2 con los oligonucleótidos presentados en la tabla 3. La cepa resultante se denominó E. coli MG1655 Ptrc16-gapA, ∆edd-eda, ∆gloA, ∆pykA, ∆pykF::cm.

El casete de resistencia al antibiótico se eliminó a continuación según el protocolo 1.

En cada etapa, se comprobó la presencia de todas las supresiones anteriormente construidas utilizando los oligonucleótidos presentados en la tabla 3.

Para aumentar la producción de fosfoenolpiruvato, el gen ppsA se expresó a partir del plásmido pJB137 utilizando el promotor gapA. Para la construcción del plásmido pJB137-PgapA-ppsA, el gen ppsA se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de la E. coli MG1655 utilizando los siguientes oligonucleótidos:

1. gapA-ppsAF, formado por 65 bases (identificador de secuencia Nº 70)

ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC

con:

-una región (letras mayúsculas) homóloga a la secuencia (1785106-1785136) del gen ppsA (1785136 a 1782758), una secuencia de referencia en la página Web http://genolist.pasteur.fr/Colibri/), y

-una región (letras minúsculas) homóloga al promotor gapA (1860794-1860761).

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Claims

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