JP2012513760A - ジオールの生産方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、脂肪族ジオールの生物生産のために遺伝的に改変された微生物を培養することを含んでなるジオールの生物学的生産のための新規な方法に関し、該微生物は２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を用いてヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物を脱炭酸するための代謝経路を含んでなり、該脱炭酸工程から得られる産物は対応する脂肪族ジオールへとさらに還元され、該微生物は該ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の生産が改良されるように遺伝的に改変されている。本発明はまた脂肪族ジオールの生産のために改変された微生物に関する。
Description
本発明は、脂肪族ジオールの生物生産（bioproduction）のために遺伝的に改変された微生物（該微生物は、２つの酵素：２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素とヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を用いてヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物を脱炭酸するための代謝経路を含んでなる）を培養することを含んでなる、ジオールの生物学的生産のための新規な方法に関する。本発明はまた、脂肪族ジオールの生産のための改変微生物に関する。
背景
ジオールを産生する微生物を培養することによるジオールの発酵生産は、ジオールの改良生産のために遺伝的に改変された微生物の発酵生産をはじめとして、当技術分野で公知である。このようなジオールの生産は、とりわけ以下の文献：ＷＯ１９９６／０３５７９６、ＷＯ２００１／０１２８３３、ＷＯ２００４／０３３６４６、ＵＳ７２６７９７２に記載されている。特に、１，３−プロパンジオールの生産がすでに記載されているが、ビタミンＢ１２依存性酵素を含み、それにより生産プロセスが極めて高価である。
ジオールを産生する微生物を培養することによるジオールの発酵生産は、ジオールの改良生産のために遺伝的に改変された微生物の発酵生産をはじめとして、当技術分野で公知である。このようなジオールの生産は、とりわけ以下の文献：ＷＯ１９９６／０３５７９６、ＷＯ２００１／０１２８３３、ＷＯ２００４／０３３６４６、ＵＳ７２６７９７２に記載されている。特に、１，３−プロパンジオールの生産がすでに記載されているが、ビタミンＢ１２依存性酵素を含み、それにより生産プロセスが極めて高価である。
目下のところ、改変微生物に関する別の解決策には、再生可能な炭素源からジオールを生産するか、特にビタミンＢ１２非依存性経路によってジオールの生産を改良する可能性を有するかのいずれか、またはその双方が必要である。これらの技術的改良は、このような生産に必要なエネルギーに基づいて生産される生産物の総収量、ひいては産物の単離ならびにその出荷およびさらなる使用のために具体的に制御される不純物および副産物のレベルに対するものであり得る。
発明の概要
本発明は、脂肪族ジオールの生物生産のために遺伝的に改変された微生物に関し、該微生物は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を用いてヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物を脱炭酸するための代謝経路を含んでなり、該脱炭酸工程から得られた産物は、さらに、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を用いて対応する脂肪族ジオールへ還元され、その微生物は該ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の生産が改良されるように遺伝的に改変されている。
本発明は、脂肪族ジオールの生物生産のために遺伝的に改変された微生物に関し、該微生物は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を用いてヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物を脱炭酸するための代謝経路を含んでなり、該脱炭酸工程から得られた産物は、さらに、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を用いて対応する脂肪族ジオールへ還元され、その微生物は該ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の生産が改良されるように遺伝的に改変されている。
本発明の微生物は一般に細菌、酵母または真菌からなる群から選択される。特に、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バシラス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)から選択される。
第一の実施形態によれば、微生物は２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性をコードする内因性遺伝子を含んでなる。該微生物は好ましくはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)（Ｐｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、Ａｒｏ１０、Ｔｈｉ３）；乳酸連鎖球菌(Lactococcus lactis)（Ｋｉｖｄ）；クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)（Ｐｄｃ）；アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)（Ｐｄｃ２、Ｐｄｃ３）；ピチア・スティピティス(Pichia stipitis)（Ｐｄｃ１、Ｐｄｃ２、Ａｒｏ１０）；ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)（Ｐｄｃ）；結核菌（Mycobacterium tuberculosis)から選択される。内因性の２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するこの微生物は、２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする内因性遺伝子の発現を増強するようにさらに改変することができる。
本発明の別の実施形態によれば、微生物は２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする内因性遺伝子を含まない。このような内因性２−ケト酸デカルボキシラーゼを欠く微生物は好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)または枯草菌(Bacillus subtilis)から選択される。このような微生物では、本発明の微生物は２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする異種遺伝子を含んでなる。
別の実施形態によれば、微生物はヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性をコードする内因性遺伝子を含んでなる。該微生物は好ましくは大腸菌(Escherichia coli)（ｙｑｈＤ、ｆｕｃＯ、ｄｋｇＡ、ｄｋｇＢ）；サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２…）；およびアルデヒドレダクターゼ活性またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を有するあらゆる生物から選択される。内因性ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有するこの微生物は、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼをコードする内因性遺伝子の発現を増強するようにさらに改変することができる。
本発明の微生物を用いて生産される脂肪族ジオールは、２〜６個の炭素原子、好ましくは２、３または４個の炭素原子を含んでなる直鎖または分枝アルキル鎖を有する脂肪族ジオールである。
好ましい実施形態では、脂肪族ジオールはエチレン−グリコールであり、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物はヒドロキシピルビン酸である。
別の好ましい実施形態では、脂肪族ジオールは１，３−プロパンジオールであり、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物は４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸である。
別の好ましい実施形態では、脂肪族ジオールは１，４−ブタンジオールであり、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物は５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸である。
本発明はまた、
上記および下記のような本発明の微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地上で培養する工程と、
その培養培地から脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、脂肪族ジオールの生物生産のための方法に関する。
上記および下記のような本発明の微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地上で培養する工程と、
その培養培地から脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、脂肪族ジオールの生物生産のための方法に関する。
本発明の好ましい実施形態によれば、ジオールはさらに精製される。
発明の詳細な説明
微生物
本発明の微生物は、遺伝的に改変されているか、または遺伝的に操作されている微生物である。これは、これらの用語の通常の意味によれば、本発明の微生物は天然には見られず、新たな遺伝子エレメントの導入または欠失のいずれかによって改変されている。それはまた、指定突然変異誘発と特定の選択圧下での進化を組み合わせることにおいて新たな代謝経路の発達と進化を課すことによって形質転換させることもできる（例えば、ＷＯ２００４／０７６６５９参照）。
微生物
本発明の微生物は、遺伝的に改変されているか、または遺伝的に操作されている微生物である。これは、これらの用語の通常の意味によれば、本発明の微生物は天然には見られず、新たな遺伝子エレメントの導入または欠失のいずれかによって改変されている。それはまた、指定突然変異誘発と特定の選択圧下での進化を組み合わせることにおいて新たな代謝経路の発達と進化を課すことによって形質転換させることもできる（例えば、ＷＯ２００４／０７６６５９参照）。
本発明によれば、「微生物」とは、細菌、酵母または真菌を表す。優先的には、微生物は腸内細菌科、クロストリジウム科、バシラス科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリウム科から選択される。より優先的には、微生物はエシェリキア属(Escherichia)、クロストリジウム属(Clostridium)、バシラス科(Bacillus)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそより優先的には、微生物は大腸菌またはコリネバクテリウム・グルタミカムまたはクロストリジウム・アセトブチリカムまたは枯草菌種のいずれかである。
微生物は、外因性遺伝子がその微生物に、宿主微生物でのそれらの発現を可能とするエレメントとともに導入される場合には、これらの遺伝子を発現することができる。微生物を外因性ＤＮＡで形質転換することは当業者には慣例の作業である。
外因性遺伝子は宿主ゲノムに組み込むこともでき、あるいはプラスミドまたはベクターによって染色体外で発現させることもできる。複製起点および細胞内でのコピー数の異なる種々のタイプのプラスミドが当業者に知られている。
遺伝子の発現を制御するための重要なエレメントがプロモーターである。本発明の好ましい実施形態では、誘導型であり得る種々の長さのプロモーターを用いて遺伝子を発現させることができる。これらのプロモーターは同種であっても異種であってもよい。当業者ならば、最も便宜なプロモーターをどのようにして選択するかを知っており、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、ＰｌａｃまたはλプロモーターｃＩが広く用いられる。
特定の実施形態では、内因性遺伝子はまた、それらの遺伝子産物を改変するためにコード配列にいずれかの突然変異を導入することにより、または内因性調節エレメントに加えて、もしくはその代わりに異種配列を導入することにより、それらの発現および／または活性を調整するように改変することもできる。内因性遺伝子の調整は、一方で遺伝子産物の活性をアップレギュレートかつ／もしくは増強するか、または他方で内因性遺伝子産物の活性をダウンレギュレートかつ／もしくは低減する両方法をとることができる。
本発明による「遺伝子の減弱」とは、遺伝子発現の部分的なまたは完全な抑制を表し、その後は「減弱された」と言われる。この発現の抑制は遺伝子発現の阻害、遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全部もしくは一部の欠失、遺伝子のコード領域の欠失、または野生型プロモーターの、より弱い天然プロモーターもしくは合成プロモーターによる置換のいずれかであり得る。優先的には、遺伝子の減弱はその遺伝子の本質的に完全な欠失であり、これを本発明による系統の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子により置換することができる。遺伝子は優先的には相同組換えの技術(Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)により不活性化される。
本発明の他の実施形態では、内因性配列はまた、新たな代謝経路に有利となるようにノックアウトまたは欠失させてもよい。
微生物を形質転換させるためのあらゆる技術および本発明のタンパク質の生産を増強するために用いられる調節エレメントは当技術分野で周知であり、その内容が引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ２００８／０５２９７３、ＷＯ２００８／０５２５９５、ＷＯ２００８／０４０３８７、ＷＯ２００７／１４４３４６、ＷＯ２００７／１４１３１６、ＷＯ２００７／０７７０４１、ＷＯ２００７／０１７７１０、ＷＯ２００６／０８２２５４、ＷＯ２００６／０８２２５２、ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００５／０７３３６４、ＷＯ２００５／０４７４９８、ＷＯ２００４／０７６６５９をはじめ、種々の微生物における生合成経路の改変に関する出願者らの所有特許出願を含む文献で入手可能である。
遺伝子および酵素活性
本発明の記載において、酵素活性はこのような活性を有する酵素をコードする遺伝子を参照して表される。特に断りのない限り、遺伝子およびタンパク質は一般に大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて特定される。しかしながら、これらの名称の使用は、本発明によればより一般的な意味を持ち、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総て、該遺伝子およびタンパク質の機能的ホモログ、機能的変異体および機能的断片を包含する。
本発明の記載において、酵素活性はこのような活性を有する酵素をコードする遺伝子を参照して表される。特に断りのない限り、遺伝子およびタンパク質は一般に大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて特定される。しかしながら、これらの名称の使用は、本発明によればより一般的な意味を持ち、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総て、該遺伝子およびタンパク質の機能的ホモログ、機能的変異体および機能的断片を包含する。
本願で特定される遺伝子を、それらの受託番号とともに図４に挙げる。
当業者ならば、既知の酵素活性に対するＩＵＢＭＢ酵素命名法の参照を用いて、他の生物、細菌株、酵母、真菌などにおける同じ酵素活性を同定することができる。この慣例作業は、他の微生物に由来するタンパク質との配列アラインメントを行うことにより同定することができるコンセンサス配列を用いて行うのが有利である。
２つのタンパク質配列間の相同性パーセンテージを決定する方法は当業者に公知である。例えば、それはウェブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/clustalw/で利用可能なソフトウエアＣＬＵＳＴＡＬＷをそのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いることによる配列アライメントの後に行うことができる。そのアライメントから、同一性パーセンテージの算出は、総残基数に対する、同じ位置にある同一残基の数を記録することによって容易に行うことができる。あるいは、例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で利用可能なＢＬＡＳＴプログラムをそのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いることにより自動算出を行うこともできる。
ＰＦＡＭ(protein families database of alignments and hidden Markov models; http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列アラインメントの大きなコレクションである。各ＰＦＡＭは、複数のアライメントを可視化し、タンパク質ドメインを検査し、生物における分布を評価し、他のデータベースにアクセスし、既知のタンパク質構造を可視化することを可能とする。
ＣＯＧ(clusters of orthologous groups of proteins; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)は、３０の主要な系統発生的な系統に相当する、完全に配列決定された６６のゲノムからのタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは少なくとも３系統から定義され、先の保存ドメインの同定が可能となる。
挙げられているタンパク質と相同性を有するタンパク質は、他の微生物に由来するものである可能性、または天然タンパク質の変異体もしくは機能的断片である可能性がある。
「機能的変異体または機能的断片」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列は天然に見られる配列に厳密に制限されるものではなく、付加的アミノ酸を含んでもよいことを意味する。「機能的断片」とは、そのポリペプチド配列が、元の配列よりも少ないアミノ酸であるが、参照の元の配列の酵素活性を与えるになお十分なアミノ酸を含み得ることを意味する。ポリペプチドがその酵素活性を保持しつつ１以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加により改変可能であることは当技術分野で周知である。例えば、タンパク質の機能的特性に影響を及ぼさない化学的に等価なアミノ酸による、所定の位置での１個のアミノ酸置換が一般的である。本発明の目的では、置換は以下の群：
・小さな脂肪族、非極性またはやや極性のある残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
・極性、負電荷を有する残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
・極性、正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
・大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
・大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
のうちの１つの中での交換と定義される。
・小さな脂肪族、非極性またはやや極性のある残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
・極性、負電荷を有する残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
・極性、正電荷を有する残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
・大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
・大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
のうちの１つの中での交換と定義される。
負電荷を有するある残基を別のもので（例えばアスパラギン酸をグルタミン酸で）または正電荷を有するある残基を別のもので（例えばアルギニンをリシンで）置換することにより起こる変化は、機能的に等価な産物を生産すると予測できる。
アミノ酸が改変される位置およびそのアミノ酸配列に改変を受けるアミノ酸の数は特に制限されない。当業者ならば、タンパク質の活性に影響を与えずに導入することができる改変を認識することができる。例えば、タンパク質のＮ末端部分またはＣ末端部分における改変は、ある特定の状況下ではタンパク質の活性を変化させないと予測される。
「変異体」とは、元の酵素活性をなお保持しつつ、上記で定義されたような改変を受けたポリペプチドを意味する。
「コードする(encoding)」または「コードする(coding)」とは、それによりポリヌクレオチドが転写および翻訳の機構を介してアミノ酸配列を生成するプロセスを意味する。このプロセスは、ＤＮＡの塩基配列とタンパク質のアミノ酸配列との間の関係である遺伝コードによって可能となる。この遺伝コードの１つの主要な特徴はそれが縮重していることである、これは１つのアミノ酸が１を超える塩基トリプレット（１つの「コドン」）によってコードされ得ることを意味する。その直接的な結果は、同じアミノ酸配列が異なるポリヌクレオチドによってコードされ得るということである。当業者ならば、生物によってコドンの使用が異なり得ることをよく知っている。同じアミノ酸をコードするコドンのうちいくつかがある微生物によって優先的に用いられている場合がある。従って、特定の微生物において対応するタンパク質の発現を至適化するためにこの生物のコドン使用に適合したポリヌクレオチドを設計することに注目することができる。
いくつかの例では、遺伝子または酵素は活性の名称によって表すことができる。他のいくつかの例では、「活性」という場合には、所望の活性を組み合わせて持つ２以上の酵素の組合せを意味する場合もある。このような場合、その組合せの各酵素は異なる調節エレメントの制御下にある異なる遺伝子または同じオペロンの制御下にある遺伝子の組合せによりコードされている場合がある。
２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性をコードする遺伝子は、様々な種に由来するＰｄｃ遺伝子、より詳しくは、サッカロミセス・セレビシエ由来のＰｄｃ１、Ｐｄｃ５、Ｐｄｃ６、Ａｒｏ１０およびＴｈｉ３遺伝子；乳酸連鎖球菌由来のｋｉｖＤ遺伝子；クロストリジウム・アセトブチリカム由来のｐｄｃ遺伝子；アラビドプシス・サリアナ由来のＰｄｃ２およびＰｄｃ３遺伝子；ピチア・スティピティス由来のＰｄｃ１、Ｐｄｃ２およびＡｒｏ１０遺伝子；ザイモモナス・モビリス由来のｐｄｃ遺伝子をはじめ、当技術分野で周知である。大腸菌由来の遺伝子ｓｕｃＡによりコードされる２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ複合体の第一のサブ単位ならびに大腸菌の遺伝子ｄｘｓによりコードされている酵素もまた２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する。該遺伝子およびタンパク質の機能的ホモログ、機能的変異体および機能的断片もこの定義に包含される。
大腸菌由来のｙｑｈＤ、ｆｕｃＯ、ｄｋｇＡ、ｄｋｇＢ遺伝子、サッカロミセス・セレビシエ由来のＡＤＨ１およびＡＤＨ２遺伝子をはじめ、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性をコードする遺伝子も当技術分野で周知である。該遺伝子およびタンパク質の機能的ホモログ、機能的変異体および機能的断片もこの定義に包含される。
発酵生産
本発明はまた、
微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養する工程と
その培養培地から脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、脂肪族ジオールの発酵生産に関する。
本発明はまた、
微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養する工程と
その培養培地から脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、脂肪族ジオールの発酵生産に関する。
発酵は一般に、少なくとも１つの単純炭素源と必要であれば補助基質とを含有する、使用微生物に適合した適当な培養培地の入った発酵槽で行う。
「適当な培養培地」とは、炭素源または炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム；リン源、例えば、リン酸一カリウムまたはリン酸二カリウム；微量元素（例えば、金属塩）、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩および／またはマンガン塩；ならびにアミノ酸、ビタミン、成長プロモーターのような増殖因子などの、細胞の維持および／または増殖に必須または有益な栄養素を含んでなる培地（例えば、無菌液体培地）を表す。
大腸菌用の既知の培養培地の例として、この培養培地はＭ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されている培地と同じまたは類似のものであり得る。
Ｃ．グルタミカム用の培養培地の別の例として、この培養培地はＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)により記載されているような培地と同じまたは類似のものであり得る。
本発明による「炭素源」または「炭素基質」または「炭素源」とは、六炭糖（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）、五炭糖、単糖、二糖、オリゴ糖（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、糖蜜、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびその組合せをはじめとする、微生物の通常の増殖を助けるために当業者が使用することができる任意の炭素源を表す。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。別の好ましい単純炭素源はスクロースである。
本発明のいくつかの実施形態では、培養培地は出発材料としてバイオマスを用いる別のプロセスの副産物、またはひいては機械的および／または化学的および／または酵素的、また、セルロース分解などのin vitroもしくはin vivoにおけるバイオマス分解の場合の産物である炭素源を含んでなる。
本発明の微生物は、有利には、培養培地で増殖するために唯一の炭素源として炭素源を用いるように選択され、かつ／または改変される。
特定の炭素源上で増殖するように選択された微生物は、該特定の炭素源上での増殖を可能とするために微生物に導入すべき改変とともに当技術分野で公知である。
当業者ならば、本発明による微生物のための培養条件を定義することができる。特に、２０℃〜５５℃の間、優先的には２５℃〜４０℃の間の温度、より具体的には、Ｃ．グルタミカムの場合には約３０℃、大腸菌の場合には約３７℃の温度で発酵される。
培養培地からの脂肪族ジオールの回収は、当業者には慣例の作業である。
本発明の一態様では、回収された脂肪族ジオールはさらに精製される。
本発明の一態様では、回収された脂肪族ジオールはさらに精製される。
培養培地からのジオールの回収およびその精製のための方法は当技術分野で公知であり、とりわけ以下の文献：２００８年１０月３日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６３２８７および２００７年１１月３０日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３０６８に開示されている。
特定の実施形態
本発明の他の実施形態を以下に記載する。これらの微生物は、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の生産と、同じヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の脱炭酸工程から得られる産物の対応する脂肪族ジオールへの変換の双方に都合のよいように改変される。
本発明の他の実施形態を以下に記載する。これらの微生物は、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の生産と、同じヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の脱炭酸工程から得られる産物の対応する脂肪族ジオールへの変換の双方に都合のよいように改変される。
内因性２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を欠く大腸菌に関して以下に記載する。従って、この該微生物には活性をコードする異種遺伝子が導入される。
ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物を産生するための経路を至適化するため、また、同じヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の脱炭酸段階から得られる産物を脂肪族ジオールに変換するための微生物の改変はまた、既知の代謝経路および大腸菌の内因性遺伝子に基づいてなされる。しかしながら、当業者ならば、同様の方法論を用いて、既知の遺伝子および経路を有する他の微生物において対応する遺伝子を導入するまたは欠失させることができる。
Ｉ．エチレングリコールの生産
本発明によるエチレングリコールの生産のための生合成経路は、３−ホスホヒドロキシピルビン酸前駆体（セリンの前駆体）の変換に始まる３つの酵素反応を含んでなる。まず、ホスファターゼ活性により、ホスホヒドロキシピルビン酸からヒドロキシピルビン酸の変換が可能となる。次に、ヒドロキシピルビン酸は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性によりグリコールアルデヒドへ変換される。最後に、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性により、グリコールアルデヒドからエチレングリコールへの変換が可能となる。エチレングリコールの生産の別の経路は前駆体としてのＬ−セリンから始まる。まず、トランスアミナーゼまたはアミノ酸オキシダーゼ活性により、セリンからヒドロキシピルビン酸への変換が可能となる。次の２つの段階は上記の第一経路と同様である。
本発明によるエチレングリコールの生産のための生合成経路は、３−ホスホヒドロキシピルビン酸前駆体（セリンの前駆体）の変換に始まる３つの酵素反応を含んでなる。まず、ホスファターゼ活性により、ホスホヒドロキシピルビン酸からヒドロキシピルビン酸の変換が可能となる。次に、ヒドロキシピルビン酸は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性によりグリコールアルデヒドへ変換される。最後に、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性により、グリコールアルデヒドからエチレングリコールへの変換が可能となる。エチレングリコールの生産の別の経路は前駆体としてのＬ−セリンから始まる。まず、トランスアミナーゼまたはアミノ酸オキシダーゼ活性により、セリンからヒドロキシピルビン酸への変換が可能となる。次の２つの段階は上記の第一経路と同様である。
生合成経路全体を図１に示す。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地からエチレングリコールを回収することを含んでなる、エチレングリコール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地からエチレングリコールを回収することを含んでなる、エチレングリコール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
好ましい実施形態では、該方法は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子とヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つの遺伝子を含む微生物、特に細菌を用いて行われる。これらの遺伝子は内因性でも外因性でもよく、染色体内または染色体外で発現され得る。
本発明のさらなる実施形態では、該方法は、中間体３−ホスホグリセル酸のアベイラビリティーが増強されている微生物、特に細菌を用いて行われる。好ましくは、この増強はホスホグリセル酸ムターゼをコードする遺伝子、特に、遺伝子ｇｐｍＡおよびｐｇｍＩの１つまたは双方の発現レベルを減弱することにより達成される。これは、これらの遺伝子の野生型プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることによるか、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントの使用により行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、すなわち、３−ホスホグリセル酸の高いアベイラビリティーを呈する微生物、特に細菌、特に、ホスホグリセル酸ムターゼをコードする遺伝子の発現、好ましくは遺伝子ｇｐｍＡおよびｐｇｍＩの１つまたは双方の遺伝子の発現が減弱されている微生物、優先的には細菌に関する。
別の実施形態では、該方法は、セリン生合成経路へのフラックスが刺激されている微生物、特に細菌を用いて行われる。これは、それぞれｓｅｒＡおよびｓｅｒＣ遺伝子によりコードされている３−ホスホグリセル酸デヒドロゲナーゼおよび／またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼの発現レベルを増強することにより達成することができる。３−ホスホグリセル酸デヒドロゲナーゼおよび／またはホスホセリンアミノトランスフェラーゼの発現レベルは、ｓｅｒＡおよび／もしくはｓｅｒＣ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、または対応するタンパク質の活性を増強するｓｅｒＡおよび／もしくはｓｅｒＣ遺伝子に突然変異を導入することにより達成することができる。ｓｅｒＡ遺伝子の発現はまた、野生型ｌｒｐ遺伝子（ロイシン応答性調節タンパク質をコードする）をｓｅｒＡ遺伝子転写の構成的活性化をもたらすｌｒｐ突然変異対立遺伝子（ｌｒｐタンパク質におけるＧＬＵ１１４ＡＳＰ置換に対応するｌｒｐ−１対立遺伝子など）に置き換えることにより増強するもできる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明の特定の実施形態では、ｓｅｒＡ遺伝子にフィードバック阻害剤セリンに対するＳｅｒＡタンパク質の感受性を低減する突然変異を導入することができ（フィードバック脱感作対立遺伝子）、これによりセリンの存在下での活性の増強が可能となる。脱感作対立遺伝子、すなわち、フィードバック非感受性対立遺伝子の例は、ＥＰ０９３１８３３（味の素）またはＥＰ０６２０８５３(Wacker)に記載されている。
別の実施形態では、該方法は、ヒドロキシピルビン酸生合成経路へのフラックスが刺激されている微生物、特に細菌を用いて行われる。このような結果は、セリントランスアミナーゼもしくはセリンオキシダーゼの発現レベルを増強することにより（前駆体としてセリンから始まる経路）、または３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼの発現を増強することにより達成することができる。セリンオキシダーゼの発現レベルの増強は、Ｒ．オパカス(R.opacus)由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を導入および過剰発現させることにより、またはその遺伝子の対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。セリントランスアミナーゼの発現の増強は、大腸菌のｓｅｒＣ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、またはｓｅｒＣ遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼの発現の増強は、大腸菌のｙｅａＢ遺伝子もしくはｓｅｒＢ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、またはｙｅａＢ遺伝子もしくはｓｅｒＢ遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼの発現の増強は、Ｓ．セレビシエ由来の遺伝子ＧＰＰ２を導入および過剰発現させることにより、またはＧＰＰ２遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、セリンのエチレングリコール以外の化合物への変換レベルが減弱されるように改変される。このような結果は、セリンデアミナーゼ（ｓｄａＡおよびｓｄａＢおよびｔｄｃＧによりコードされている）、セリントランスアセチラーゼ（ｃｙｓＥによりコードされている）、トリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＡＢによりコードされている）またはセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡによりコードされている）のようなセリン消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより低強度のプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより減弱することができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、ヒドロキシピルビン酸のグリコールアルデヒド以外の化合物への変換レベルが減弱されるように改変される。このような結果は、ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ｇｈｒＡのよりコードされている）またはヒドロキシピルビン酸イソメラーゼ（ｈｙｉによりコードされている）のようなヒドロキシピルビン酸消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより低強度のプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより減弱することができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、グリコールアルデヒドのエチレングリコール以外の化合物への変換レベルが減弱されるように改変される。これは、ヒドロキシトレオニンアルドラーゼ（ｌｔａＥによりコードされている）またはグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ、ａｌｄＢによりコードされている）のようなグリコールアルデヒド消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子の減弱化は、天然プロモーターをより低強度のプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明の一態様では、糖輸送効率は、グルコースを輸送することが知られているｇａｌＰのように、リン酸供与体(phosphordonor)としてのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に頼らない糖輸送系を使用するか、または糖−ホスホトランスフェラーゼ系により多くのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を供給するかのいずれかによって高められる。微生物においてＰＥＰのアベイラビリティーを高めるために使用可能な様々な手段が存在する。特に、これはＰＥＰ→ピルビン酸の反応を減弱することにより達成することができる。優先的には、このような結果を得るために前記の株において、ピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子が減弱される。ＰＥＰのアベイラビリティーを高める別法としては、ピルビン酸→ＰＥＰの反応に有利にすることである。これは、上記の反応を触媒するホスホエノールピルビン酸シンターゼの活性を増強することにより達成することができる。この酵素はｐｐｓＡ遺伝子によりコードされている。従って、微生物において、ｐｐｓＡ遺伝子の発現が優先的に増強される。双方の改変が微生物に同時に存在してもよい。
ＩＩ．１，３−プロパンジオールの生産
本発明による１，３−プロパンジオールの生産のための生合成経路は、Ｌ−ホモセリン前駆体（Ｌ−アスパラギン酸から得られる）の変換に始まる３つの酵素反応を含んでなる。まず、ホモセリントランスアミナーゼまたはホモセリンオキシダーゼ活性により、Ｌ−ホモセリンから４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸への変換が可能となる。次の２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性により、４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸から３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換が可能となる。その後、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドはヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性により１，３−プロパンジオールに変換される。
本発明による１，３−プロパンジオールの生産のための生合成経路は、Ｌ−ホモセリン前駆体（Ｌ−アスパラギン酸から得られる）の変換に始まる３つの酵素反応を含んでなる。まず、ホモセリントランスアミナーゼまたはホモセリンオキシダーゼ活性により、Ｌ−ホモセリンから４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸への変換が可能となる。次の２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性により、４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸から３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換が可能となる。その後、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドはヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性により１，３−プロパンジオールに変換される。
生合成経路全体を図２に示す。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地から１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなる１，３−プロパンジオール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地から１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなる１，３−プロパンジオール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
好ましい実施形態では、該方法は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子とヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つの遺伝子を含む微生物、特に細菌を用いて行われる。これらの遺伝子は内因性でも外因性でもよく、染色体内または染色体外で発現され得る。
別の実施形態では、該方法はオキザロ酢酸生合成経路におけるそのフラックスが刺激されている微生物、特に細菌を用いて行われ、このような結果は、ｐｐｃ遺伝子によりコードされているホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現レベルを増強することにより達成することができる。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現の増強は、ｐｐｃ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、またはｐｐｃ遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。中間生成物オキザロ酢酸のアベイラビリティーは、それぞれｐｃｋＡおよび／またはｍａｅＡおよび／またはｍａｅＢ遺伝子によりコードされている、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよび／またはリンゴ酸酵素をコードする遺伝子の発現レベルを減弱することによっても増強することができる。これは、これらの遺伝子の野生型プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントを用いることにより行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌、すなわち、オキザロ酢酸の高いアベイラビリティーを呈する微生物、特に細菌に関する。
別の実施形態では、該方法はホモセリン生合成経路へのフラックスが刺激されている微生物、特に細菌を用いて行われる。これは、それぞれｔｈｒＡおよびａｓｄ遺伝子によりコードされているアスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼおよび／またはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現を増強することにより達成することができる。アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼおよび／またはアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの発現の増強は、ｔｈｒＡおよび／もしくはａｓｄ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、またはｔｈｒＡおよび／もしくはａｓｄ遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明の特定の実施形態では、ｔｈｒＡ遺伝子にフィードバック阻害剤トレオニンに対するその感受性を低減する突然変異（フィードバック脱感作対立遺伝子）を導入することができ、これによりトレオニンの存在下での活性の増強が可能となる。
別の実施形態では、該方法は、４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸生合成経路へのフラックスが刺激されている微生物、特に細菌を用いて行われる。このような結果は、ホモセリントランスアミナーゼまたはホモセリンオキシダーゼの発現を増強することにより達成することができる。ホモセリンオキシダーゼの発現の増強は、Ｒ．オパカス由来のＬ−アミノ酸オキシダーゼをコードする遺伝子を導入および過剰発現させることにより、またはその遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。ホモセリントランスアミナーゼの発現レベルの増強は、大腸菌のｓｅｒＣ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、またはｓｅｒＣ遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、ホモセリンの１，３−プロパンジオール以外の化合物への変換レベルが減弱されるように改変される。このような結果は、ホモセリンキナーゼおよびトレオニンシンターゼ（ｔｈｒＢおよびｔｈｒＣによりコードされている）、ホモセリンＯ−トランススクシニラーゼ（ｍｅｔＡによりコードされている）またはジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡによりコードされている）のようなホモセリン消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより減弱することができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオール以外の化合物への変換レベル以が減弱されるように改変される。これは、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ、ａｌｄＢによりコードされている）のような３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより減弱することができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明の一態様では、糖輸送効率は、グルコースを輸送することが知られているｇａｌＰによりコードされているもののように、リン酸供与体(phosphordonor)としてのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に頼らない糖輸送系を使用するか、または糖−ホスホトランスフェラーゼ系により多くのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を供給するかのいずれかによって高められる。微生物においてＰＥＰのアベイラビリティーを高めるために使用可能な様々な手段が存在する。特に、これはＰＥＰ→ピルビン酸の反応を減弱することにより達成することができる。優先的には、このような結果を得るために前記の株において、ピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子が減弱される。ＰＥＰのアベイラビリティーを高める別法としては、ピルビン酸→ＰＥＰの反応に有利にすることである。これは、上記の反応を触媒するホスホエノールピルビン酸シンターゼの活性を増強することにより達成することができる。この酵素はｐｐｓＡ遺伝子によりコードされている。従って、微生物において、ｐｐｓＡ遺伝子の発現が優先的に増強される。双方の改変が微生物に同時に存在してもよい。
ＩＩＩ．１，４−ブタンジオールの生産
本発明による１，４−ブタンジオールの生産のための生合成経路は、２−ケトグルタル酸前駆体（クレブス回路の代謝産物）の変換に始まる５つの酵素反応を含んでなる。
本発明による１，４−ブタンジオールの生産のための生合成経路は、２−ケトグルタル酸前駆体（クレブス回路の代謝産物）の変換に始まる５つの酵素反応を含んでなる。
第一の活性、４−オキソグルタリル−ＣｏＡシンセターゼにより２−ケトグルタル酸から４−オキソグルタリル−ＣｏＡへの変換が可能となる。この化合物は次に、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)の遺伝子ａｄｈＥ２または大腸菌(Escherichia coli)のａｄｈＥによりコードされている第一のアルデヒドデヒドロゲナーゼと第二のアルコールデヒドロゲナーゼの２つの活性の組合せで５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸へと変換される。２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性により５−ヒドロキシ−２−オキソペンタン酸から４−ヒドロキシブチルアルデヒドへの変換が可能となり、これがヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性によって１，４−ブタンジオールへとさらに変換される。
生合成経路全体を図３に示す。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地から１，４−ブタンジオールを回収することを含んでなる、１，４−ブタンジオール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
本発明は、微生物、特に細菌を、炭素源を含んでなる適当な培養培地で培養することと、その培養培地から１，４−ブタンジオールを回収することを含んでなる、１，４−ブタンジオール、その誘導体または前駆体の発酵生産のための方法を提供する。
好ましい実施形態では、該方法は、２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子とヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つの遺伝子を含む微生物、特に細菌を用いて行われる。これらの遺伝子は内因性でも外因性でもよく、染色体内または染色体外で発現され得る。
別の実施形態では、該方法は、オキザロ酢酸生合成経路へのフラックスが刺激されている（クレブス回路の流入）微生物、特に細菌を用いて行われる。これは、ｐｐｃ遺伝子によりコードされているホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの発現を増強することにより達成することができる。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現の増強は、ｐｐｃ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを導入することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、またはｐｐｃ遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。中間生成物オキザロ酢酸のアベイラビリティーもまた、それぞれｐｃｋＡおよび／またはｍａｅＡおよび／またはｍａｅＢ遺伝子によりコードされている、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼおよび／またはリンゴ酸酵素をコードする遺伝子の発現レベルを減弱することにより増強することができる。これは、これらの遺伝子の野生型プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントを用いることにより行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌、すなわち、２−ケトグルタル酸の高いアベイラビリティーを呈する微生物、特に細菌に関する。
別の実施形態では、該方法は２−ケトグルタル酸生合成経路へのフラックスが刺激されている微生物、特に細菌を用いて行われる。これは、それぞれｇｌｔＡおよびｉｃｄ遺伝子によりコードされているクエン酸シンターゼおよび／またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼの発現を増強することにより達成することができる。クエン酸シンターゼおよび／またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼの発現の増強は、ｇｌｔＡおよび／またはｉｃｄ遺伝子の発現を駆動する人工プロモーターを増強することにより、または細胞においてそのコピー数を増やすことにより、またはｇｌｔＡおよび／またはｉｃｄ遺伝子に、対応するタンパク質の活性を増強する突然変異を導入することにより達成することができる。イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性は、ＡｃｅＫにより触媒される反応であるリン酸化または脱リン酸化により調整される。リン酸化はＩｃｄ酵素の活性を低下させ、脱リン酸化はＩｃｄ酵素を再活性化させる。従って、このＩｃｄ酵素の活性はまた、野生型ＡｃｅＫ酵素に比べてキナーゼ活性が低減されているか、またはホスファターゼ活性が増強されている突然変異体ａｃｅＫ遺伝子を導入することにより制御することもできる。ＡｃｅＫ活性のレベルはまた、ａｃｅＫ遺伝子の発現を減弱することによって低下させることもできる。これは、その遺伝子の野生型プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントを用いることにより行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。中間体２−ケトグルタル酸のアベイラビリティーはまた、それぞれｓｕｃＡＢもしくはｓｕｃＣＤおよび／またはａｃｅＡもしくはａｃｅＢ遺伝子によりコードされている２−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼもしくはスクシニル−ＣｏＡシンセターゼおよび／またはイソクエン酸リアーゼもしくはリンゴ酸シンターゼをコードする遺伝子の発現を減弱することにより増強され得る。これは、これらの遺伝子の野生型プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントを用いることにより行うことができる。クレブス回路におけるフラックスもまた、クレブス回路コード遺伝子を抑制するＡｒｃＡ（ａｒｃＡ遺伝子によりコードされている）の抑制を変更することにより増強することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌、すなわち、２−ケトグルタル酸の高いアベイラビリティーを呈する微生物、特に細菌に関する。
別の実施形態では、該方法は５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸生合成経路へのフラックスが刺激されている微生物、特に細菌を用いて行われる。これは、４−オキソグルタリル−ＣｏＡシンセターゼ（ｐｒｐＥ遺伝子によりコードされているものなどのＡＭＰ形成型、またはｓｕｃＣおよびｓｕｃＤ遺伝子によりコードされているものなどのＡＤＰ形成型）および／またはアルデヒドレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼの発現を増強することにより達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、２−ケトグルタル酸の１，４−ブタンジオール以外の化合物への変換レベルが減弱されるように改変される。これは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはグルタミン酸シンターゼ（ｇｄｈＡおよびｇｌｔＢによりコードされている）のような２−ケトグルタル酸消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより減弱することができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、４−ヒドロキシブチルアルデヒドの１，４−ブタンジオール以外の化合物への変換レベルが減弱されるように改変される。これは、４−ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ、ａｌｄＢによりコードされている）のような４−ヒドロキシブチルアルデヒド消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子は、天然プロモーターをより弱いプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより減弱することができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、嫌気性条件で１，４−ブタンジオールを生産するように改変される。前記の微生物においてこのような能力を達成するために、ＰＴＳ−糖輸送系を欠失させて、パーミアーゼ／キナーゼ輸送系を介して糖を代謝するようにする。嫌気性条件下で微生物の増殖に十分なＡＴＰを生産するためには、大腸菌のｐｃｋＡ遺伝子によりコードされているホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を介してホスホエノールピルビン酸からオキザロ酢酸を生産させる。これにより、生産されるオキザロ酢酸１モルにつき１モルのＡＴＰが生じる。同様に、２−オキソグルタル酸から４−オキソグルタリル−ＣｏＡへの変換は４−オキソグルタリル−ＣｏＡシンセターゼにより達成される。大腸菌のｓｕｃＣおよびｓｕｃＤ遺伝子によりコードされているものなどのＡＤＰ形成活性は、生産される４−オキソグルタリル−ＣｏＡ１モルにつき、消費するＡＴＰは１モルだけである。Ｄ−グルコースから１，４−ブタンジオールを生産するための記載の代謝経路は、特に嫌気性増殖条件に適合されている。このような経路の全体的な反応バランスは、Ｄ−グルコース＋ＡＤＰ＋Ｐｉ→１，４−ブタンジオール＋ギ酸＋ＣＯ２＋ＡＴＰ＋Ｈ２Ｏである。本発明のさらなる実施形態では、微生物、特に細菌は、アセチル−ＣｏＡの１，４−ブタンジオール以外の化合物への変換レベルが減弱されるように改変され、このような結果は、酢酸キナーゼおよびリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ａｃｋＡおよびｐｔａによりコードされている）のようなアセチル−ＣｏＡ消費酵素のレベルを減弱することにより達成することができる。これらの遺伝子の減弱化は、天然プロモーターをより低強度のプロモーターに置き換えることにより、または対応するメッセンジャーＲＮＡもしくはタンパク質を脱安定化させるエレメントにより行うことができる。必要であれば、対応するＤＮＡ配列を欠失させることにより、遺伝子の完全な減弱化も達成することができる。本発明はまた、本発明のこの特定の実施形態で用いる微生物、特に細菌に関する。
実施例１
２−ケト酸デカルボキシラーゼコード遺伝子およびヒドロキシアルデヒドレダクターゼコード遺伝子を発現する株の構築：ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）
１．１ α−ケト−イソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする乳酸連鎖球菌のｋｉｖＤの過剰発現のためのプラスミドｐＭ−Ｐｔｒｃ０１−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７の構築
α−ケト−イソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする乳酸連鎖球菌ｋｉｖＤの合成遺伝子はGeneart (Germany)により作製された。この遺伝子のコドン使用およびＧＣ含量は供給者のマトリックスに従って大腸菌に適合させた。この合成遺伝子の発現は構成的Ｐｔｒｃプロモーターにより駆動した。転写ターミネーターを遺伝子の下流に付加した。この構築物を供給者のｐＭベクターにクローニングし、配列決定により確認した。必要に応じて、この合成遺伝子をｐＭＥ１０１ベクター（このプラスミドはプラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)に由来する）にクローニングした後に、大腸菌株を形質転換させた。
２−ケト酸デカルボキシラーゼコード遺伝子およびヒドロキシアルデヒドレダクターゼコード遺伝子を発現する株の構築：ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）
１．１ α−ケト−イソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする乳酸連鎖球菌のｋｉｖＤの過剰発現のためのプラスミドｐＭ−Ｐｔｒｃ０１−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７の構築
α−ケト−イソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする乳酸連鎖球菌ｋｉｖＤの合成遺伝子はGeneart (Germany)により作製された。この遺伝子のコドン使用およびＧＣ含量は供給者のマトリックスに従って大腸菌に適合させた。この合成遺伝子の発現は構成的Ｐｔｒｃプロモーターにより駆動した。転写ターミネーターを遺伝子の下流に付加した。この構築物を供給者のｐＭベクターにクローニングし、配列決定により確認した。必要に応じて、この合成遺伝子をｐＭＥ１０１ベクター（このプラスミドはプラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)に由来する）にクローニングした後に、大腸菌株を形質転換させた。
Ｐｔｒｃ０１−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７：
制限部位（ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ）（配列番号１）：
Ｐｔｒｃ０１プロモーター（配列番号２）：
大腸菌（ＣＡＧ３４２２６．）に対して至適化されたｋｉｖＤｌｌ遺伝子配列（配列番号３）：
ターミネーター配列Ｔ７Ｔｅ（参照：Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.）（配列番号４）：
制限部位（ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ）（配列番号５）：
制限部位（ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ）（配列番号１）：
低コピーベクターからの発現のために、ｐＭＥ１０１プラスミドを次のように構築した。ｐＣＬ１９２０プラスミドを、オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１Ｒを用いてＰＣＲ増幅し、ｌａｃＩ遺伝子を担持するベクターｐＴＲＣ９９ＡからのＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片とＰｔｒｃプロモーターを増幅されたベクターに挿入した。得られたベクターをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ｋｉｖＤｌｌ遺伝子を担持するベクターをＡｆｌＩＩＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理した。次に、ｋｉｖＤｌｌ含有断片をベクターｐＭＥ１０１にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７と呼んだ。
ｐＭＥ１０１Ｆ（配列番号６）：
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号７）：
ｐＭＥ１０１Ｆ（配列番号６）：
１．２ α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼをコードする乳酸連鎖球菌のｋｉｖＤとメチルグリオキサールレダクターゼをコードする大腸菌のｙｑｈＤの過剰発現のためのプラスミドｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７の構築
ｐＭＥ１０１ベクターおよびｋｉｖＤｌｌ遺伝子を担持するベクターをＳｎａＢＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、ｙｑｈＤ含有断片をベクターｐＭＥ１０１にクローニングし、得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７と呼んだ。
ｐＭＥ１０１ベクターおよびｋｉｖＤｌｌ遺伝子を担持するベクターをＳｎａＢＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、ｙｑｈＤ含有断片をベクターｐＭＥ１０１にクローニングし、得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７と呼んだ。
ｙｑｈＤ遺伝子を大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡから、オリゴヌクレオチドｙｑｈＤ ＦおよびｙｑｈＤ Ｒ：
ｙｑｈＤ Ｆ（配列番号８）
・ＳｎａＢＩ制限部位の付加のための領域（斜体太字の大文字）
・３１５３３５７〜３１５３３８５の大腸菌ＭＧ１６５５ ｙｑｈＤ領域と相同な領域（小文字）
ｙｑｈＤ Ｒ（配列番号９）
・３１５４５４０〜３１５４５１８の大腸菌ＭＧ１６５５ ｙｑｈＤ領域と相同な領域（大文字）
・ＢｇｌＩＩ制限部位の付加のための領域（斜体太字の小文字）
を用いてＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＳｎａＢＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７のＳｎａＢＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローニングし、ベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７を得た。
ｙｑｈＤ Ｆ（配列番号８）
・３１５３３５７〜３１５３３８５の大腸菌ＭＧ１６５５ ｙｑｈＤ領域と相同な領域（小文字）
ｙｑｈＤ Ｒ（配列番号９）
・ＢｇｌＩＩ制限部位の付加のための領域（斜体太字の小文字）
を用いてＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＳｎａＢＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ＴＴ０７のＳｎａＢＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローニングし、ベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７を得た。
実施例２
エチレングリコール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）の構築
２．１ ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ株の構築
ｓｄａＡ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能であった。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｓｄａＡＦ（配列番号１０）
・ｓｄａＡ遺伝子の配列（１８９４９４１〜１８９５０２０）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｓｄａＡＲ（配列番号１１）
・ｓｄａＡ遺伝子の配列（１８９６３３６〜１８９６２５４）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
エチレングリコール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）の構築
２．１ ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ株の構築
ｓｄａＡ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能であった。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｓｄａＡＦ（配列番号１０）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｓｄａＡＲ（配列番号１１）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
オリゴヌクレオチドΔｓｄａＡＦおよびΔｓｄａＡＲを用いて、ｐＫＤ４プラスミドからカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入した（ｐＫＤ４６）。カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を以下に定義されるオリゴヌクレオチドｓｄａＡＦおよびｓｄａＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ：：Ｋｍと呼んだ。
ｓｄａＡＦ（配列番号１２）：
（１８９４３４１〜１８９４３６０の配列と相同）
ｓｄａＡＲ（配列番号１３）：
（１８９６６７９〜１８９６６６０の配列と相同）
ｓｄａＡＦ（配列番号１２）：
ｓｄａＡＲ（配列番号１３）：
次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｓｄａＡ：：Ｋｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドｓｄａＡＦおよびｓｄａＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ：：Ｋｍと呼んだ。次に、ＤｓｄａＢ：：ＣｍをＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ：：Ｋｍ株に形質導入により導入した。まず、ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＢ：：Ｃｍを、従前に記載したものと同じ方法を以下のオリゴヌクレオチド：
ΔｓｄａＢＦ（配列番号１４）
・ｓｄａＢ遺伝子の配列（２９２７６２７〜２９２７７０５）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｓｄａＢＲ（配列番号１５）
・ｓｄａＢ遺伝子の配列（２９２８９６０〜２９２８８８１）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
とともに用いて構築した。
ΔｓｄａＢＦ（配列番号１４）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｓｄａＢＲ（配列番号１５）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
とともに用いて構築した。
オリゴヌクレオチドΔｓｄａＢＦおよびΔｓｄａＢＲを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入した（ｐＫＤ４６）。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｓｄａＢＦおよびｓｄａＢＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＢ：：Ｃｍと呼んだ。
ｓｄａＢＦ（配列番号１６）：
（２９２７４５０〜２９２７４６８の配列と相同）
ｓｄａＢＲ（配列番号１７）：
（２９２９０３８〜２９２９０１７の配列と相同）
ΔｓｄａＢ：：Ｃｍを移入するために、ファージＰ１形質導入の方法を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ：：Ｋｍ株への形質導入のために、ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＢ：：Ｃｍ株のファージ溶解液の調製物を用いた。
ｓｄａＢＦ（配列番号１６）：
ｓｄａＢＲ（配列番号１７）：
ΔｓｄａＢ：：Ｃｍを移入するために、ファージＰ１形質導入の方法を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ：：Ｋｍ株への形質導入のために、ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＢ：：Ｃｍ株のファージ溶解液の調製物を用いた。
次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、ΔｓｄａＢ：：Ｃｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドｓｄａＢＦおよびｓｄａＢＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ：：Ｋｍ ΔｓｄａＢ：：Ｃｍと呼んだ。その後、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。次に、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションにより組換え部位に導入した。４２℃で一連の培養を行った後、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットの欠損を、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ｓｄａＡＦ／ｓｄａＡＲおよびｓｄａＢＦ／ｓｄａＢＲ）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ＤｓｄａＡ ΔｓｄａＢと呼んだ。
２．２ ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ６株の構築
ｐｙｋＦ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能であった。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｐｙｋＦＦ（配列番号１８）
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５３６８９〜１７５３７６６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｐｙｋＦＲ（配列番号１９）
・ｐｙｋＦ領域の配列（１７５５１２９〜１７５５０５１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ｐｙｋＦ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能であった。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｐｙｋＦＦ（配列番号１８）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｐｙｋＦＲ（配列番号１９）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
オリゴヌクレオチドΔｐｙｋＦＦおよびΔｐｙｋＦＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入した（ｐＫＤ４６）。次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｐｙｋＦＦおよびｐｙｋＦＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍと呼んだ。
ｐｙｋＦＦ（配列番号２０）：
（１７５３３７１〜１７５３３９２の配列と相同）
ｐｙｋＦＲ（配列番号２１）：
（１７５５５１８〜１７５５４９５の配列と相同）
ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍを移入するために、ファージＰ１形質導入の方法を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ株に形質導入するために、ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物を用いた。
ｐｙｋＦＦ（配列番号２０）：
ｐｙｋＦＲ（配列番号２１）：
ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍを移入するために、ファージＰ１形質導入の方法を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ株に形質導入するために、ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物を用いた。
次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドｐｙｋＦＦおよびｐｙｋＦＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍと呼んだ。
その後、カナマイシン耐性カセットを除去した。次に、カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションにより組換え部位に導入した。４２℃で一連の培養を行った後、カナマイシン耐性カセットの欠損を、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ｓｄａＡＦ／ｓｄａＡＲ、ｓｄａＢＦ／ｓｄａＢＲおよびｐｙｋＦＦ／ｐｙｋＦＲ）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦと呼んだ。
２．３ ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ株の構築
３−ホスホグリセル酸のレベルを高めるために、突然変異体Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡおよびＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＢを構築する。まず、ホスホグリセル酸ムターゼｇｐｍＡ遺伝子の発現を低減するために、プロモーターを活性の弱い改変型の構成的ｔｒｃプロモーターに置き換える。このＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＡを形質導入によりＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ株に導入する。
３−ホスホグリセル酸のレベルを高めるために、突然変異体Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡおよびＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＢを構築する。まず、ホスホグリセル酸ムターゼｇｐｍＡ遺伝子の発現を低減するために、プロモーターを活性の弱い改変型の構成的ｔｒｃプロモーターに置き換える。このＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＡを形質導入によりＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ株に導入する。
まず、ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株を、従前に記載したものと同じ方法を以下のオリゴヌクレオチド：
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡＦ（配列番号２２）
・ｇｐｍＡ遺伝子の配列（７８６７７１〜７８６８１９）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
・ｔｒｃプロモーター配列（−３５および−１０ボックスが下線で示される）の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡＲ（配列番号２３）
・ｇｐｍＡ遺伝子の上流領域の配列（７８６９０３〜７８６８１９）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
とともに用いて構築する。
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡＦ（配列番号２２）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
・ｔｒｃプロモーター配列（−３５および−１０ボックスが下線で示される）の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡＲ（配列番号２３）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
とともに用いて構築する。
オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＡＦおよびＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＡＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入し（ｐＫＤ４６）、ここで発現したＲｅｄリコンビナーゼ酵素により相同組換えが可能となる。次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｇｐｍＡＦおよびｇｐｍＡＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｇｐｍＡＦ（配列番号２４）：
（７８６６７３〜７８６６９５の配列と相同）
ｇｐｍＡＲ（配列番号２５）：
（７８７３５６〜７８７３３３の配列と相同）
ｇｐｍＡＦ（配列番号２４）：
ｇｐｍＡＲ（配列番号２５）：
この改変Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍを移入するために、ファージＰ１形質導入を用いる。以下のプロトコールを二段階で行い、まず、ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株のファージ溶解液を調製し、次に、ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ株に形質導入を行う。この株の構築は上記されている。
１−Ｐ１ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｋｍ ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭにＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株の一晩培養物１００μｌを接種する。振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ＭＧ１６５５株に１００μｌのファージ溶解液Ｐ１を加える（約１．１０９ファージ／ｍｌ）。
・３７℃で３時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｋｍ ５０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２ ５ｍＭにＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株の一晩培養物１００μｌを接種する。振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ＭＧ１６５５株に１００μｌのファージ溶解液Ｐ１を加える（約１．１０９ファージ／ｍｌ）。
・３７℃で３時間、総ての細胞が溶解するまで振盪する。２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
２−形質導入
・ＬＢ培地中、ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＣａＣｌ２に細胞ペレットを懸濁させる。対照試験管：細胞１００μｌ
・ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株のファージＰ１ １００μｌ−供試試験管：細胞１００μｌ＋ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株のファージＰ１ １００μｌ
・振盪せずに３００Ｃで３０分間インキュベートする。各試験間に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｋｍ５０μｇ／ｍｌのディッシュ上に拡げる。
・３７℃で一晩インキュベートする。
・ＬＢ培地中、ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、５ｍＭ ＣａＣｌ２に細胞ペレットを懸濁させる。対照試験管：細胞１００μｌ
・ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株のファージＰ１ １００μｌ−供試試験管：細胞１００μｌ＋ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株のファージＰ１ １００μｌ
・振盪せずに３００Ｃで３０分間インキュベートする。各試験間に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、ＬＢ＋Ｋｍ５０μｇ／ｍｌのディッシュ上に拡げる。
・３７℃で一晩インキュベートする。
３−株の確認
次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、プロモーターＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍの改変を、従前に記載したオリゴヌクレオチドｇｐｍＡＦおよびｇｐｍＡＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍと呼ぶ。次に、Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢを形質導入によりＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株に移入する。まず、従前に記載したものと同じ方法を以下のオリゴヌクレオチド：
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢＲ（配列番号２６）
・ｇｐｍＢ遺伝子の配列（４６３１４１４〜４６３１３６６）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
・ｔｒｃプロモーター配列（−３５および−１０ボックスが下線で示される）の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢＦ（配列番号２７）
・ｇｐｍＢ遺伝子の上流領域の配列（４６３１２８０〜４６３１３６５）（ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
とともに用いて構築する。
次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、プロモーターＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍの改変を、従前に記載したオリゴヌクレオチドｇｐｍＡＦおよびｇｐｍＡＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍと呼ぶ。次に、Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢを形質導入によりＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株に移入する。まず、従前に記載したものと同じ方法を以下のオリゴヌクレオチド：
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢＲ（配列番号２６）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
・ｔｒｃプロモーター配列（−３５および−１０ボックスが下線で示される）の領域（斜体の大文字）
Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢＦ（配列番号２７）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
とともに用いて構築する。
オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＢＦおよびＰｔｒｃ１８−ｇｐｍＢＲを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入し（ｐＫＤ４６）、ここで発現したＲｅｄリコンビナーゼ酵素により相同組換えが可能となる。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｇｐｍＢＦおよびｇｐｍＢＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ：：Ｃｍと呼ぶ。
ｇｐｍＢＦ（配列番号２８）：
（４６３０９０６〜４６３０９３２の配列と相同）
ｇｐｍＢＲ（配列番号２９）：
（４６３１８２３〜４６３１８０３の配列と相同）
ｇｐｍＢＦ（配列番号２８）：
ｇｐｍＢＲ（配列番号２９）：
改変Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ：：Ｃｍを移入するために、ファージＰ１形質導入を用いる。ＭＧ１６５５ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ：：Ｃｍ株のファージ溶解液を、ＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ株への形質導入に用いる。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ：：Ｃｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドｇｐｍＢＦおよびｇｐｍＢＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ：：Ｋｍ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ：：Ｃｍと呼ぶ。その後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去する。次に、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションにより組換え部位に導入する。４２℃で一連の培養を行った後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットの欠損を、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ｇｐｍＡＦ／ｇｐｍＡＲおよびｇｐｍＢＦ／ｇｐｍＢＲ）を用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢと呼ぶ。
２．４ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）株の構築
次に、ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７プラスミドをＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ株に導入する。
次に、ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７プラスミドをＭＧ１６５５ ΔｓｄａＡ ΔｓｄａＢ ΔｐｙｋＦ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＡ Ｐｔｒｃ１８−ｇｐｍＢ株に導入する。
実施例３
１，３−プロパンジオール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）（ｐＭＡ−ａａｏｒｏ）の構築
３．１ ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ株の構築
ｍｅｔＡ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｍｅｔＡＦ（配列番号３０）：
・ｍｅｔＡ領域の配列（４２１２３１０〜４２１２３８９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｍｅｔＡＲ（配列番号３１）：
・ｍｅｔＡ領域の配列（４２１３２２９〜４２１３１５０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
１，３−プロパンジオール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）（ｐＭＡ−ａａｏｒｏ）の構築
３．１ ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ株の構築
ｍｅｔＡ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｍｅｔＡＦ（配列番号３０）：
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｍｅｔＡＲ（配列番号３１）：
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
オリゴヌクレオチドΔｍｅｔＡＦおよびΔｍｅｔＡＲを用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入した（ｐＫＤ４６）。次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｍｅｔＡＦおよびｍｅｔＡＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ：：Ｋｍと呼んだ。
ｍｅｔＡＦ（配列番号３２）：
（４２１２２０３〜４２１２２３２の配列と相同）
ｍｅｔＡＲ（配列番号３３）：
（４２１３３０１〜４２１３２７２の配列と相同）
ｍｅｔＡＦ（配列番号３２）：
ｍｅｔＡＲ（配列番号３３）：
その後、カナマイシン耐性カセットを除去した。次に、カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションにより組換え部位に導入した。４２℃で一連の培養を行った後、カナマイシン耐性カセットの欠損を従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ｍｅｔＡＦ／ｍｅｔＡＲ）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡと呼んだ。
３．２ ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ株の構築
ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍを移入するために、ファージＰ１形質導入を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物（上記）を用いた。
ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍを移入するために、ファージＰ１形質導入を用いた。ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物（上記）を用いた。
次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドｐｙｋＦＦおよびｐｙｋＦＲを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ＤｐｙｋＦ：：Ｋｍと呼んだ。
３．３ ＭＧ１６５５ ＤｍｅｔＡ ＤｐｙｋＦ ＤｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ ＊ １株の構築
アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼのフィードバック耐性対立遺伝子ｔｈｒＡ＊１の発現を増強するために、以下のプラスミドを構築した：ｔｈｒＡ＊１を得るためのｐＳＢ１およびｔｈｒＬＡＢＣオペロンをＰｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１対立遺伝子により置き換えるためのｐＳＢ２。
プラスミドｐＳＢ１はプラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)に由来し、プロモーターＰｔｒｃから発現されたトレオニンに対するフィードバック耐性が低減された(Lee et al. 2003 J. Bacteriol. 185, 18 pp. 5442-5451)アスパルトキナーゼ／ホモセリンｔｈｒＡ＊対立遺伝子を担持する。ｐＳＢ１の構築のため、ｔｈｒＡを、以下のオリゴヌクレオチド：
ＢｓｐＨＩｔｈｒＡ（配列番号３４）：
・ｔｈｒＡ遺伝子の配列（３４１〜３７１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/)に参照配列）と相同な領域（小文字）
・ＢｓｐＨＩ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
ＳｍａＩｔｈｒＡ（配列番号３５）：
・ｔｈｒＡ遺伝子の配列（２８７１〜２８４１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/)に参照配列）と相同な領域（小文字）
・ＳｍａＩ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼのフィードバック耐性対立遺伝子ｔｈｒＡ＊１の発現を増強するために、以下のプラスミドを構築した：ｔｈｒＡ＊１を得るためのｐＳＢ１およびｔｈｒＬＡＢＣオペロンをＰｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１対立遺伝子により置き換えるためのｐＳＢ２。
プラスミドｐＳＢ１はプラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)に由来し、プロモーターＰｔｒｃから発現されたトレオニンに対するフィードバック耐性が低減された(Lee et al. 2003 J. Bacteriol. 185, 18 pp. 5442-5451)アスパルトキナーゼ／ホモセリンｔｈｒＡ＊対立遺伝子を担持する。ｐＳＢ１の構築のため、ｔｈｒＡを、以下のオリゴヌクレオチド：
ＢｓｐＨＩｔｈｒＡ（配列番号３４）：
・ＢｓｐＨＩ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
ＳｍａＩｔｈｒＡ（配列番号３５）：
・ＳｍａＩ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＳｍａＩで切断し、ベクターｐＴＲＣ９９Ａ(Stratagene)のＮｃｏＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングした。低コピーベクターからの発現のために、ｐＭＥ１０１プラスミドを次のように構築した。ｐＣＬ１９２０プラスミドを、オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１Ｒを用いてＰＣＲ増幅し、ｌａｃＩ遺伝子とＰｔｒｃプロモーターを担持するｐＴＲＣ９９ＡベクターからのＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片を増幅されたベクターに挿入した。得られたベクターとｔｈｒＡ遺伝子を担持するベクターをＡｐａＩおよびＳｍａＩで制限酵素処理し、ｔｈｒＡ含有断片をベクターｐＭＥ１０１にクローニングした。ＴｈｒＡをフィードバック阻害から解放するために、オリゴヌクレオチドＴｈｒＡ ＳＦ ｆｏｒおよびＴｈｒＡ ＳＦ ｒｅｖを用い、部位特異的突然変異誘発(Stratagene)により突然変異ｔｈｒＡＳ３４５Ｆを導入し、ベクターｐＳＢ１を得た。
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号３６）
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号３７）
ＴｈｒＡ ＳＦ ｆｏｒ（配列番号３８）
ＴｈｒＡ ＳＦ ｒｅｖ（配列番号３９）
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号３６）
ｔｈｒＬＡＢＣオペロンを欠失させ、それをＰｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１対立遺伝子で置き換えるために、Datsenko & Wanner (2000)のより記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともに、クロラムフェニコールまたはクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットだけでなく付加的ＤＮＡの挿入も可能となる。このために、以下のプラスミドｐＳＢ２を構築した。
プラスミドｐＳＢ２はプラスミドｐＵＣ１８(Norrander et al., Gene 26 (1983), 101- 106)に由来し、Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１対立遺伝子と結合したクロラムフェニコール耐性カセットを担持し、双方をｔｈｒＬの上流領域とｔｈｒＣの下流領域の間にクローニングした。
ｐＳＢ２の構築のために、ｔｈｒＬの上流領域およびｔｈｒＣの下流領域を、以下のオリゴヌクレオチド：
ＨｐａＩｕｐｔｈｒＬＦ（配列番号４０）
・ｔｈｒＬ領域の配列（４６３８６９８〜４６３８７３１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位と余分な塩基のための領域（大文字）
ＢｓｔＺ１７ＩｕｐｔｈｒＬＲ（配列番号４１）
・ｔｈｒＬ領域の配列（８７〜６０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列のための領域（太字の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｆｏＩおよびＳｍａＩ制限部位からなる多重クローニング部位のための領域（大文字）
ＢａｍＨＩｄｏｗｎｔｈｒＣＦ（配列番号４２）
・ｔｈｒＣ領域の配列（５０２１〜５０４９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列のための領域（太字の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｆｏＩおよびＳｍａＩ制限部位からなる多重クローニング部位のための領域（大文字）
ＨｐａＩｄｏｗｎｔｈｒＣＲ（配列番号４３）
・ｔｈｒＣ領域の配列（６０５４〜６０３１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位と余分な塩基のための領域（大文字）
を用い、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
ＨｐａＩｕｐｔｈｒＬＦ（配列番号４０）
・ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位と余分な塩基のための領域（大文字）
ＢｓｔＺ１７ＩｕｐｔｈｒＬＲ（配列番号４１）
・Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列のための領域（太字の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｆｏＩおよびＳｍａＩ制限部位からなる多重クローニング部位のための領域（大文字）
ＢａｍＨＩｄｏｗｎｔｈｒＣＦ（配列番号４２）
・Ｔ７ｔｅ転写ターミネーター配列のための領域（太字の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｆｏＩおよびＳｍａＩ制限部位からなる多重クローニング部位のための領域（大文字）
ＨｐａＩｄｏｗｎｔｈｒＣＲ（配列番号４３）
・ＨｐａＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位と余分な塩基のための領域（大文字）
を用い、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
まず、「ｕｐｔｈｒＬ」および「ｄｏｗｎｔｈｒＣ」断片を、それぞれＨｐａＩｕｐｔｈｒＬＦ／ＢｓｔＺ１７ＩｕｐｔｈｒＬＲおよびＢａｍＨＩｄｏｗｎｔｈｒＣＦ／ＨｐａＩｄｏｗｎｔｈｒＣＲオリゴヌクレオチドを用い、ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。次に、「ｕｐｔｈｒＬ−ｄｏｗｎｔｈｒＣ」断片を、ＨｐａＩｕｐｔｈｒＬＦ／ＨｐａＩｄｏｗｎｔｈｒＣＲオリゴヌクレオチドを用い、「ｕｐｔｈｒＬ」および「ｄｏｗｎｔｈｒＣ」ＰＣＲ断片（Ｔ７Ｔｅ転写ターミネーターとＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳｆｏＩおよびＳｍａＩ制限部位からなる多重クローニング部位からなるオーバーラッピング領域を有する）から増幅した。「ｕｐｔｈｒＬ−ｄｏｗｎｔｈｒＣ」ＰＣＲ断片を制限酵素ＨｐａＩで切断し、ｐＵＣ１８ベクターのＥｃｏＲＩ／ＳｆｏＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ＤｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−ＳＭＣプラスミドを得た。
次に、クロラムフェニコール耐性カセットを、以下のオリゴヌクレオチド：
ＢｓｔＺ１７ＣｍＦ（配列番号４４）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（小文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
・ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
ＢａｍＨＩＣｍＲ（配列番号４５）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（小文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
・ＢａｍＨＩ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
を用い、ｐＫＤ３ベクターからＰＣＲ増幅した。
ＢｓｔＺ１７ＣｍＦ（配列番号４４）
・ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
ＢａｍＨＩＣｍＲ（配列番号４５）
・ＢａｍＨＩ制限部位および余分な塩基のための領域（大文字）
を用い、ｐＫＤ３ベクターからＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｔＺ１７ＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ｐＵＣ１８−ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−ＳＭＣプラスミドのＢｓｔＺ１７Ｉ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−ＳＭＣ：：Ｃｍプラスミドを得た。
最後に、Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１対立遺伝子を、制限酵素ＳｆｏＩおよびＳｍａＩを用いてｐＳＢ１プラスミドから切断し、ｐＵＣ１８−ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−ＳＭＣ：：ＣｍプラスミドのＳｆｏＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣ１８−ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１：：ＣｍプラスミドまたはｐＳＢ２を得た。
このｐＳＢ２プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で切断することにより、ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１：：Ｃｍ断片を得た後、エレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入し（ｐＫＤ４６）、ここで発現したＲｅｄリコンビナーゼ酵素により相同組換えが可能となる。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｔｈｒＡ＊１ＦおよびｔｈｒＡ＊１Ｒを用いたＰＣＲ分析により確認した。保有株をＭＧ１６５５ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１：：Ｃｍと呼ぶ。
ｔｈｒＡ＊１Ｆ（配列番号４６）：
（ｔｈｒＬ領域の配列（４６３８２７６〜４６３８２９７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同）
ｔｈｒＡ＊１Ｒ（配列番号４７）
ｔｈｒＣ領域の配列（６３４５〜６３２５）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同）
組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定により確認した。
ｔｈｒＡ＊１Ｆ（配列番号４６）：
ｔｈｒＡ＊１Ｒ（配列番号４７）
組換えプラスミドをＤＮＡ配列決定により確認した。
ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１：：Ｃｍを移入するために、ファージＰ１形質導入を用いる。ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ＤｐｙｋＦ：：Ｋｍ株への形質導入のために、ＭＧ１６５５ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１：：Ｃｍ株のファージ溶解液の調製物を用いる。
次に、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１：：Ｃｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドｔｈｒＡ＊１ＦおよびｔｈｒＡ＊１Ｒを用いたＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１：：Ｃｍと呼ぶ。
その後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去することができる。次に、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションにより組換え部位に導入する。４２℃で一連の培養を行った後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットの欠損を、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ｍｅｔＡＦ／ｍｅｔＡＲ、ｐｙｋＦ／ｐｙｋＦＲおよびｈｒＦ／ｔｈｒＡ＊１Ｒ）を用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１と呼ぶ。
３．４ プラスミドｐＭＡ−ａａｏｒｏの構築
アミノ酸オキシダーゼをコードするロドコッカス・オパカスａａｏ遺伝子の合成遺伝子はGeneart (Germany)により作製された。この遺伝子のコドン使用およびＧＣ含量は供給者のマトリックスに従って大腸菌に適合させた。この合成遺伝子の発現は構成的Ｐｔｒｃプロモーターにより駆動した。この構築物を供給者のｐＭＡベクターにクローニングし、配列決定により確認した。
Ｐｔｒｃ０１−ａａｏｒｏ：
制限部位（ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ）（配列番号４８）：
Ｐｔｒｃ０１プロモーターおよびＲＢＳ（配列番号４９）：
大腸菌（ＡＹ０５３４５０．）に対して至適化されたａａｏｒｏ遺伝子配列（配列番号５０）：
制限部位（ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰａｃＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号５１）：
アミノ酸オキシダーゼをコードするロドコッカス・オパカスａａｏ遺伝子の合成遺伝子はGeneart (Germany)により作製された。この遺伝子のコドン使用およびＧＣ含量は供給者のマトリックスに従って大腸菌に適合させた。この合成遺伝子の発現は構成的Ｐｔｒｃプロモーターにより駆動した。この構築物を供給者のｐＭＡベクターにクローニングし、配列決定により確認した。
Ｐｔｒｃ０１−ａａｏｒｏ：
制限部位（ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ）（配列番号４８）：
３．５ ＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ ＊ １（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）（ｐＭＡ−ａａｏｒｏ）株の構築
次に、ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７およびｐＭＡ−ａａｏｒｏプラスミドをＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１株に導入する。
実施例４
１，４−ブタンジオール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ ΔｇｄｈＡ（ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２）（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）の構築
４．１ ＭＧ１６５５ ΔａｃｅＢＡＫ ΔｓｕｃＣＤ株の構築
次に、ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７およびｐＭＡ−ａａｏｒｏプラスミドをＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ ΔｐｙｋＦ ΔｔｈｒＬＡＢＣ：：ＴＴ０７−Ｐｔｒｃ−ｔｈｒＡ＊１株に導入する。
実施例４
１，４−ブタンジオール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ ΔｇｄｈＡ（ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２）（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）の構築
４．１ ＭＧ１６５５ ΔａｃｅＢＡＫ ΔｓｕｃＣＤ株の構築
ａｃｅＢＡＫ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔａｃｅＢＡＫＦ（配列番号５２）：
・ａｃｅＢ領域の配列（４２１３５３１〜４２１３６１０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔａｃｅＢＡＫＲ（配列番号５３）：
・ａｃｅＫ領域の配列（４２１８２９８〜４２１８２２０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔａｃｅＢＡＫＦ（配列番号５２）：
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔａｃｅＢＡＫＲ（配列番号５３）：
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
オリゴヌクレオチドΔａｃｅＢＡＫＦおよびΔａｃｅＢＡＫＲを用いてプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入する（ｐＫＤ４６）。次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドａｃｅＢ ＡＫＦおよびａｃｅＢ ＡＫＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｍｅｔＡ：：Ｋｍと呼ぶ。
ａｃｅＢＡＫＦ（配列番号５４）：
（４２１３２５１〜４２１３２７４の配列と相同）
ａｃｅＢＡＫＲ（配列番号５５）：
（４２１８７２８〜４２１８７０２の配列と相同）
ａｃｅＢＡＫＦ（配列番号５４）：
ａｃｅＢＡＫＲ（配列番号５５）：
ｓｕｃＣＤ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｓｕｃＣＤＦ（配列番号５６）：
・ｓｕｃＣ領域の配列（７６２２６８〜７６２３４７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｓｕｃＣＤＲ（配列番号５７）：
・ｓｕｃＤ領域の配列（７６４２４１〜７６４１６８）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｓｕｃＣＤＦ（配列番号５６）：
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｓｕｃＣＤＲ（配列番号５７）：
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
オリゴヌクレオチドＤｓｕｃＣＤＦおよびＤｓｕｃＣＤＲを用いて、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入する（ｐＫＤ４６）。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｓｕｃＣＤＦおよびｓｕｃＣＤＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ：：Ｃｍと呼ぶ。
ｓｕｃＣＤＦ（配列番号５８）：
（７６１８８７〜７６１９１４の配列と相同）
ｓｕｃＣＤＲ（配列番号５９）：
（７６４５５５〜７６４５２７の配列と相同）
ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｋｍを移入するため、ファージＰ１形質導入の方法を用いる。ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ：：Ｃｍ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ＤａｃｅＢＡＫ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物を用いる。
ｓｕｃＣＤＦ（配列番号５８）：
ｓｕｃＣＤＲ（配列番号５９）：
ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｋｍを移入するため、ファージＰ１形質導入の方法を用いる。ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ：：Ｃｍ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ＤａｃｅＢＡＫ：：Ｋｍ株のファージ溶解液の調製物を用いる。
次にカナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｋｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドａｃｅＢＡＫＦおよびａｃｅＢＡＫＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ：：Ｃｍ ΔａｃｅＢＡＫ：：Ｋｍ株と呼ぶ。
その後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去することができる。次に、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションにより組換え部位に導入する。４２℃で一連の培養を行った後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットの欠損を、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチド（ａｃｅＢＡＫＦ／ａｃｅＢＡＫＲおよびｓｕｃＣＤＦ／ｓｕｃＣＤＲ）を用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫと呼ぶ。
４．２ ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ ΔｇｄｈＡ株の構築
ａｒｃＡ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔａｒｃＡＦ（配列番号６０）：
・ａｒｃＡ領域の配列（４６３８３２２〜４６３８２４５）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔａｒｃＡＲ（配列番号６１）：
・ａｒｃＡ領域の配列（４６３７６２１〜４６３７６９９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ａｒｃＡ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔａｒｃＡＦ（配列番号６０）：
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔａｒｃＡＲ（配列番号６１）：
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
オリゴヌクレオチドＤａｒｃＡＦおよびＤａｒｅ ＡＲを用いてプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入する（ｐＫＤ４６）。次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドａｒｃＡＦおよびａｒｃＡＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔａｒｃＡ：：Ｋｍと呼ぶ。
ａｒｃＡＦ（配列番号６２）：
（４６３８７４６〜４６３８７２７の配列と相同）
ａｒｃＡＲ（配列番号６３）：
（４６３７３０８〜４６３７３２８の配列と相同）
ΔａｒｃＡ：：Ｋｍを移入するため、ファージＰ１形質導入を用いる。ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ＤａｒｃＡ：：Ｋｍ株のファージ溶解液を用いる。
ａｒｃＡＦ（配列番号６２）：
ａｒｃＡＲ（配列番号６３）：
ΔａｒｃＡ：：Ｋｍを移入するため、ファージＰ１形質導入を用いる。ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ＤａｒｃＡ：：Ｋｍ株のファージ溶解液を用いる。
次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、ΔａｒｃＡ：：Ｋｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドａｒｃＡＦおよびａｒｃＡＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｇｄｈＡ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。オリゴヌクレオチドΔｇｄｈＡＦおよびΔｇｄｈＡＲを用いてプラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する。
ΔｇｄｈＡＦ（配列番号６４）：
・遺伝子ｇｄｈＡの上流配列（１８４０３４８〜１８４０３９７）（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｇｄｈＡＲ（配列番号６５）：
・ｇｄｈＡ遺伝子の末端および下流領域の配列（１８４１７６７〜１８４１７１８）（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域（小文字）
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株に導入する。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｇｄｈＡｖｅｒＦおよびｇｄｈＡ Ｒを用いるＰＣＲ分析により確認する。
Ｐｔｒｃ−ｇｄｈＡｖｅｒＦ（配列番号６６）：
・ｇｄｈＡ遺伝子の上流領域の配列（１８４０１６８〜１８４０１８８）（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域
ｇｄｈＡ Ｒ（配列番号６７）：
・ｇｄｈＡ遺伝子の下流領域の配列（１８４２２７４〜１８４２２９３）（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域
ｇｄｈＡ遺伝子を欠失させるため、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。オリゴヌクレオチドΔｇｄｈＡＦおよびΔｇｄｈＡＲを用いてプラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する。
ΔｇｄｈＡＦ（配列番号６４）：
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｇｄｈＡＲ（配列番号６５）：
・クロラムフェニコール耐性カセットの増幅のための領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株に導入する。次にクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、オリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｇｄｈＡｖｅｒＦおよびｇｄｈＡ Ｒを用いるＰＣＲ分析により確認する。
Ｐｔｒｃ−ｇｄｈＡｖｅｒＦ（配列番号６６）：
ｇｄｈＡ Ｒ（配列番号６７）：
得られた株をＭＧ１６５５ ΔｇｄｈＡ：：Ｃｍと呼んだ。
ΔｇｄｈＡ：：Ｃｍを移入するために、ファージＰ１形質導入を用いる。ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ΔｇｄｈＡ：：Ｃｍ株のファージ溶解液を用いる。
ΔｇｄｈＡ：：Ｃｍを移入するために、ファージＰ１形質導入を用いる。ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ株への形質導入のためにＭＧ１６５５ ΔｇｄｈＡ：：Ｃｍ株のファージ溶解液を用いる。
次にカナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、ΔｇｄｈＡ：：Ｃｍを、従前に定義されたオリゴヌクレオチドＰｔｒｃ−ｇｄｈＡｖｅｒＦおよびｇｄｈＡ Ｒを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ：：Ｋｍ ΔｇｄｈＡ：：Ｃｍと呼ぶ。
その後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットを除去することができる。次にカナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションにより組換え部位に導入する。４２℃で一連の培養を行った後、カナマイシン耐性カセットおよびクロラムフェニコール耐性カセットの欠損を、従前に用いたもの同じオリゴヌクレオチド（ａｃｅＢＡＫＦ／ａｃｅＢＡＫＲ、ｓｕｃＣＤＦ／ｓｕｃＣＤＲ、ａｒｃＡＦ／ａｒｃＡＲ、およびｇｄｈＡｖｅｒＦ／ｇｄｈＡ Ｒ）を用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ ΔｇｄｈＡと呼ぶ。
４．３ クロストリジウム・アセトブチリカムの二官能性アセトアルデヒド−ＣｏＡ／アルコールデヒドロゲナーゼａｄｈＥ２および大腸菌のプロピオニル−ＣｏＡシンセターゼｐｒｐＥ遺伝子の過剰発現のためのプラスミド：ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２の構築
二官能性アセトアルデヒド−ＣｏＡ／アルコールデヒドロゲナーゼをコードするクロストリジウム・アセトブチリカム由来のａｄｈＥ２遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９にクローニングした。プロピオニル−ＣｏＡシンセターゼをコードするｐｒｐＥ遺伝子をａｄｈＥ２の上流にクローニングした。オリゴヌクレオチドａｄｈＥ２Ｃａ ＦおよびａｄｈＥ２Ｃａ Ｒを用い、ａｄｈＥ２遺伝子をクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４株のメガプラスミドｐＳｏｌ１からＰＣＲ増幅した（３３７２２〜３６２９８番）。
ａｄｈＥ２Ｃａ Ｆ（配列番号６８）：
・ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ制限部位の付加のための領域（太字の小文字）
・プロモーターＰｔｒｃ０１の付加のための領域（下線の小文字）
・オペレーター配列ＯＰ０１の付加のための領域（斜体の小文字）
・ＳｎａＢＩ制限部位の付加のための領域（太字の大文字）
・ＲＢＳ０１配列の付加のための領域（小文字）
・Ｃ．アセトブチリカムａｄｈＥ２領域３３７２２〜３３７５２と相同な領域（下線の大文字）
ａｄｈＥ２Ｃａ Ｒ（配列番号６９）：
・ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ制限部位の付加のための領域（大文字）
・ターミネーターＴＴ０２の付加のための領域（下線太字の小文字）
・ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＡｖｒＩＩ制限部位の付加のための領域（斜体文字）
・Ｃ．アセトブチリカムａｄｈＥ２領域３６２６４〜３６２９８と相同な領域（下線の大文字）
二官能性アセトアルデヒド−ＣｏＡ／アルコールデヒドロゲナーゼをコードするクロストリジウム・アセトブチリカム由来のａｄｈＥ２遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９にクローニングした。プロピオニル−ＣｏＡシンセターゼをコードするｐｒｐＥ遺伝子をａｄｈＥ２の上流にクローニングした。オリゴヌクレオチドａｄｈＥ２Ｃａ ＦおよびａｄｈＥ２Ｃａ Ｒを用い、ａｄｈＥ２遺伝子をクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４株のメガプラスミドｐＳｏｌ１からＰＣＲ増幅した（３３７２２〜３６２９８番）。
ａｄｈＥ２Ｃａ Ｆ（配列番号６８）：
・プロモーターＰｔｒｃ０１の付加のための領域（下線の小文字）
・オペレーター配列ＯＰ０１の付加のための領域（斜体の小文字）
・ＳｎａＢＩ制限部位の付加のための領域（太字の大文字）
・ＲＢＳ０１配列の付加のための領域（小文字）
・Ｃ．アセトブチリカムａｄｈＥ２領域３３７２２〜３３７５２と相同な領域（下線の大文字）
ａｄｈＥ２Ｃａ Ｒ（配列番号６９）：
・ターミネーターＴＴ０２の付加のための領域（下線太字の小文字）
・ＰａｃＩ、ＸｂａＩ、ＮｈｅＩ、ＡｖｒＩＩ制限部位の付加のための領域（斜体文字）
・Ｃ．アセトブチリカムａｄｈＥ２領域３６２６４〜３６２９８と相同な領域（下線の大文字）
このＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、同じ制限酵素で消化したベクターｐＵＣ１９にクローニングした。得られたプラスミドをｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ＴＴ０２と呼んだ。
ｐｒｐＥ遺伝子を増幅するために、鋳型としての大腸菌の染色体ＤＮＡとプライマーｐｒｐＥ ＦおよびｐｒｐＥ Ｒを用いてＰＣＲを行う。
ｐｒｅｐ Ｆ（配列番号７０）：
・制限部位ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩの付加のための領域（太字下線の文字）
・３５１９１０〜３５１９３２の領域（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域（小文字）
ｐｒｅｐ Ｒ（配列番号７１）：
・制限部位ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｎａＢＩＩの付加のための領域（太字下線の文字）
・３５３８１６〜３５３７９７の領域（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域（小文字）
ｐｒｐＥ遺伝子を増幅するために、鋳型としての大腸菌の染色体ＤＮＡとプライマーｐｒｐＥ ＦおよびｐｒｐＥ Ｒを用いてＰＣＲを行う。
ｐｒｅｐ Ｆ（配列番号７０）：
・３５１９１０〜３５１９３２の領域（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域（小文字）
ｐｒｅｐ Ｒ（配列番号７１）：
・３５３８１６〜３５３７９７の領域（http://www.ecogene.org/blast.php）と相同な領域（小文字）
このＰＣＲ断片をＸｂａＩおよびＮｈｅＩで消化し、同じ制限酵素で消化したベクターｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ＴＴ０２にクローニングした。得られたプラスミドをｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２と呼んだ。
４．４ ＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ ΔｇｄｈＡ（ｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２）（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７）株の構築
次にｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２およびｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７プラスミドをＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ ΔｇｄｈＡ株に導入する。
実施例５
エルレンマイヤーフラスコにおけるエチレングリコール生産株の発酵
次にｐＵＣ１９−Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ０１−ａｄｈＥ２ｃａ−ｐｒｐＥ−ＴＴ０２およびｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７プラスミドをＭＧ１６５５ ΔｓｕｃＣＤ ΔａｃｅＢＡＫ ΔａｒｃＡ ΔｇｄｈＡ株に導入する。
実施例５
エルレンマイヤーフラスコにおけるエチレングリコール生産株の発酵
５００ｍｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ培養にて、１０ｇ／ｌのＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌのグルコースを添加し、ｐＨ６．８に調整した改変Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)を用い、株の性能を評価した。必要であればスペクチノマイシンを５０ｍｇ／ｌ濃度で加え、かつ／または必要であればクロラムフェニコールを３０ｍｇ／ｌ濃度で加えた。２４時間前培養物を用い、５０ｍｌ培養系にＯＤ６００ｎｍが約０．３となるように接種した。培養物をシェーカー上、３７℃、２００ｒｐｍで、培養培地中のグルコースが消費されるまで維持した。培養の終了時に、グルコースおよび主要な生成物を、分離にＢｉｏｒａｄ ＨＰＸ ９７Ｈカラムを、検出に屈折計を用い、ＨＰＬＣにより分析した。エチレングリコールの生産を、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５９７３シリーズマスセレクティブデテクター（ＥＩ）およびＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（２５ｍ長、内径０．２０ｍｍ、フィルム厚０．２０ミクロン）と組み合わせたＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０シリーズガスクロマトグラフを用いたガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）により確認した。生成したエチレングリコールの保持時間および質量スペクトルをエチレングリコール標品と比較した。生産株と対照株の性能の比較を下表に示す（生産株の構築については下記参照）
実施例６
エチレングリコール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴＯＴ）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ）の構築
６．１ 乳酸連鎖球菌のヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼｋｉｖＤ、大腸菌のヒドロキシアルデヒドレダクターゼｙｑｈＤおよびホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼｙｅａＢ遺伝子の過剰発現のためのプラスミド：ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７プラスミドの構築
ｙｅａＢ含有断片をＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤにクローニングし、得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＯ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７と呼んだ。
ｙｅａＢ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｙｅａＢ ＦおよびｙｅａＢ Ｒを用い、大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
ｙｅａＢ Ｆ（配列番号７２）
・ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位の付加のための領域（斜体太字の大文字）
・リボソーム結合部位の付加のための領域（下線の小文字）
・大腸菌ＭＧ１６５５ ｙｅａＢ領域１８９４１９５〜１８９４２１５（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
ｙｅａＢ Ｒ（配列番号７３）
・大腸菌ＭＧ１６５５ ｙｅａＢ領域１８９４７７２〜１８９４７４５（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（太字の大文字）
・ターミネーター配列Ｔ７Ｔｅ（Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24参照）と相同な領域（下線の大文字）
・ＰｓｉＩ、ＰｖｕＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＸｍｎＩ、ＰａｃＩ、ＳａｃＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位の付加のための領域（斜体の大文字）
エチレングリコール経路フラックスが増強された株：ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴＯＴ）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ）の構築
６．１ 乳酸連鎖球菌のヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼｋｉｖＤ、大腸菌のヒドロキシアルデヒドレダクターゼｙｑｈＤおよびホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼｙｅａＢ遺伝子の過剰発現のためのプラスミド：ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７プラスミドの構築
ｙｅａＢ含有断片をＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤにクローニングし、得られたプラスミドをｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＯ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７と呼んだ。
ｙｅａＢ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｙｅａＢ ＦおよびｙｅａＢ Ｒを用い、大腸菌ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
ｙｅａＢ Ｆ（配列番号７２）
・リボソーム結合部位の付加のための領域（下線の小文字）
・大腸菌ＭＧ１６５５ ｙｅａＢ領域１８９４１９５〜１８９４２１５（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
ｙｅａＢ Ｒ（配列番号７３）
・ターミネーター配列Ｔ７Ｔｅ（Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24参照）と相同な領域（下線の大文字）
・ＰｓｉＩ、ＰｖｕＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＸｍｎＩ、ＰａｃＩ、ＳａｃＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位の付加のための領域（斜体の大文字）
ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＸｂａＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ＴＴ０７のＸｂａＩ−ＢｇｌＩＩ部位にクローニングし、ベクターｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７を得た。
６．２ 大腸菌のホスホグリセル酸デヒドロゲナーゼｓｅｒＡの過剰発現のためのプラスミド：ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡプラスミドの構築
ｓｅｒＡ遺伝子の発現を増強するために、この遺伝子を、その適切なプロモーターを用い、コピーコントロールベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から発現させた。
このため、ｓｅｒＡ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｓｅｒＡ ＦおよびｓｅｒＡ Ｒを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＵＣ１８(Stratagene)にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＡと呼んだ。
ｓｅｒＡ Ｆ（配列番号７４）：
・遺伝子ｓｅｒＡの配列（３０５５１９９〜３０５５２２０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・ＸｂａＩ部位を担持する領域（太字の文字）
ｓｅｒＡ Ｒ（配列番号７５）：
・遺伝子ｓｅｒＡ領域の配列（３０５６８８０〜３０５６８６１）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字の文字）
遺伝子ｓｅｒＡをコピーコントロールベクターｐＣＣ１ＢＡＣに移入するため、ベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＡを酵素ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ＨｉｎｄＩＩＩクローニングレディーｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)にクローニングした。
得られた構築物を確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡと呼んだ。
ｓｅｒＡ遺伝子の発現を増強するために、この遺伝子を、その適切なプロモーターを用い、コピーコントロールベクターｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)から発現させた。
このため、ｓｅｒＡ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｓｅｒＡ ＦおよびｓｅｒＡ Ｒを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＵＣ１８(Stratagene)にクローニングした。得られたベクターをｐＵＣ１８−ｓｅｒＡと呼んだ。
ｓｅｒＡ Ｆ（配列番号７４）：
・ＸｂａＩ部位を担持する領域（太字の文字）
ｓｅｒＡ Ｒ（配列番号７５）：
・ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を担持する領域（太字の文字）
遺伝子ｓｅｒＡをコピーコントロールベクターｐＣＣ１ＢＡＣに移入するため、ベクターｐＵＣ１８−ｓｅｒＡを酵素ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ＨｉｎｄＩＩＩクローニングレディーｐＣＣ１ＢＡＣ(Epicentre)にクローニングした。
得られた構築物を確認し、ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡと呼んだ。
６．３ ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７）（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ）株の構築
ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ株の構築は従前に詳説されている（パート２．２）。次にｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡプラスミドおよびｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７プラスミドをＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ株に導入した。
ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ株の構築は従前に詳説されている（パート２．２）。次にｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡプラスミドおよびｐＭＥ１０１−ｋｉｖＤｌｌ−ｙｑｈＤ−ｙｅａＢ−ＴＴ０７プラスミドをＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ株に導入した。
実施例７
乳酸連鎖球菌の遺伝子ｋｉｖＤによりコードされているヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性の証明
７．１ ＫｉｖＤの特性決定のための株：ＢＬ２１（ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ）の構築
ＫｉｖＤタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターｐＰＡＬ７(Bio-rad)から発現させた。
このために、ｋｉｖＤ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｒを用い、乳酸連鎖球菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌと呼んだ。
ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｆ（配列番号７６）：
・乳酸連鎖球菌ｋｉｖＤ遺伝子の合成遺伝子の配列と相同な領域（斜体の文字）
・精製に好都合とするために短いＮ末端アミノ酸延長部を含むタグ無しタンパク質を生じるのに必要なヌクレオチドを担持する領域（太字の文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｒ（配列番号７７）：
・乳酸連鎖球菌ｋｉｖＤ遺伝子の合成遺伝子の配列と相同な領域（斜体の文字）
・ＥｃｏＲＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
次にｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞株(Invitrogen)に導入した。
乳酸連鎖球菌の遺伝子ｋｉｖＤによりコードされているヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性の証明
７．１ ＫｉｖＤの特性決定のための株：ＢＬ２１（ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ）の構築
ＫｉｖＤタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターｐＰＡＬ７(Bio-rad)から発現させた。
このために、ｋｉｖＤ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｒを用い、乳酸連鎖球菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌと呼んだ。
ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｆ（配列番号７６）：
・精製に好都合とするために短いＮ末端アミノ酸延長部を含むタグ無しタンパク質を生じるのに必要なヌクレオチドを担持する領域（太字の文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｒ（配列番号７７）：
・ＥｃｏＲＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
次にｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞株(Invitrogen)に導入した。
７．２ タンパク質ＫｉｖＤの過剰生産
タンパク質ＫｉｖＤの過剰生産を、２ｌエルレンマイヤーフラスコにて、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培養液(Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300)を用いて行った。一晩前培養物を用い、５００ｍｌ培養系にＯＤ６００ｎｍが約０．１５となるように接種した。この前培養は、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培養液５０ｍｌを入れた５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコで行った。培養をまずシェーカー上、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００ｎｍが約０．５となるまで維持し、その後、培養物を２５℃、２００ｒｐｍの第二のシェーカーにＯＤ６００ｎｍが０．６〜０．８となるまで（約１時間）移した後、５００μＭのＩＰＴＧで誘導を行った。培養を２５℃、２００ｒｐｍで、ＯＤ６００ｎｍが４前後となるまで維持した後に止めた。細胞を４℃にて７０００ｒｐｍで５分遠心分離した後、−２０℃で保存した。
タンパク質ＫｉｖＤの過剰生産を、２ｌエルレンマイヤーフラスコにて、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培養液(Bertani, 1951, J. Bacteriol. 62:293-300)を用いて行った。一晩前培養物を用い、５００ｍｌ培養系にＯＤ６００ｎｍが約０．１５となるように接種した。この前培養は、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培養液５０ｍｌを入れた５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコで行った。培養をまずシェーカー上、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００ｎｍが約０．５となるまで維持し、その後、培養物を２５℃、２００ｒｐｍの第二のシェーカーにＯＤ６００ｎｍが０．６〜０．８となるまで（約１時間）移した後、５００μＭのＩＰＴＧで誘導を行った。培養を２５℃、２００ｒｐｍで、ＯＤ６００ｎｍが４前後となるまで維持した後に止めた。細胞を４℃にて７０００ｒｐｍで５分遠心分離した後、−２０℃で保存した。
７．３ タンパク質ＫｉｖＤの精製
７．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
約１８８ｍｇの大腸菌バイオマスを３０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。この細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカル試験管）を５０ｍｌコニカル試験管中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した（Bandelin sonoplus、７０Ｗ）。音波処理後、細胞を室温で３０分、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
７．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
約１８８ｍｇの大腸菌バイオマスを３０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。この細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカル試験管）を５０ｍｌコニカル試験管中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した（Bandelin sonoplus、７０Ｗ）。音波処理後、細胞を室温で３０分、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
７．３．２ 工程２：アフィニティー精製
生産者が推奨するプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジにのせた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、４℃にて、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに一晩インキュベートした。２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、１００ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロールｐＨ８に対して透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
生産者が推奨するプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジにのせた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、４℃にて、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに一晩インキュベートした。２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、１００ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロールｐＨ８に対して透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
７．４ ヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼアッセイ
７．４．１ ５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸の化学合成
５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸の化学合成は刊行物：Friedhelm Korte, Karl Heinz Buchel, α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung, X. α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung in waβriger Salzsaure Chemische Berichte, Volume 92 Issue 4, Pages 877-883 (1959)に記載されている。
７．４．１ ５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸の化学合成
５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸の化学合成は刊行物：Friedhelm Korte, Karl Heinz Buchel, α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung, X. α-Hydroxyalkyliden-lacton-Umlagerung in waβriger Salzsaure Chemische Berichte, Volume 92 Issue 4, Pages 877-883 (1959)に記載されている。
７．４．２ ４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸の化学合成
４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸の化学合成は刊行物：R S Lane; EE Dekker; (1969).2-keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8(7), 2958-2966に記載されている。
４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸の化学合成は刊行物：R S Lane; EE Dekker; (1969).2-keto-4-hydroxybutyrate. Synthesis, chemical properties, and as a substrate for lactate dehydrogenase of rabbit muscle Biochemistry., 8(7), 2958-2966に記載されている。
７．４．３ ヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼアッセイ
ヒドロキシケト酸の脱炭酸は、結合酵素アッセイを用いて３０℃で測定した。ヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性アッセイは、総容量１ｍｌ中、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭチアミン二リン酸、７２単位／ｍｌのサッカロミセス・セレビシエ由来アルコールデヒドロゲナーゼ、１０ｍＭの中和ヒドロキシケト酸（ヒドロキシピルビン酸または４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸または５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸）および約４０μｇの精製タンパク質を用いて行った。分光光度計にて３４０ｎｍでＮＡＤＨの消費をモニタリングした。基質を欠いた対照アッセイにおいて検出された活性を、基質を含むアッセイにおいて検出された活性から差し引いた。１単位のヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性は、３０℃で１分間に１μｍｏｌのヒドロキシケト酸の脱炭酸を触媒するのに必要な酵素量である（ε３４０ｎｍ＝６２９０Ｍ−１ｃｍ−１）。
ヒドロキシケト酸の脱炭酸は、結合酵素アッセイを用いて３０℃で測定した。ヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性アッセイは、総容量１ｍｌ中、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭチアミン二リン酸、７２単位／ｍｌのサッカロミセス・セレビシエ由来アルコールデヒドロゲナーゼ、１０ｍＭの中和ヒドロキシケト酸（ヒドロキシピルビン酸または４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸または５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸）および約４０μｇの精製タンパク質を用いて行った。分光光度計にて３４０ｎｍでＮＡＤＨの消費をモニタリングした。基質を欠いた対照アッセイにおいて検出された活性を、基質を含むアッセイにおいて検出された活性から差し引いた。１単位のヒドロキシケト酸デカルボキシラーゼ活性は、３０℃で１分間に１μｍｏｌのヒドロキシケト酸の脱炭酸を触媒するのに必要な酵素量である（ε３４０ｎｍ＝６２９０Ｍ−１ｃｍ−１）。
７．５ 精製酵素の活性
実施例８
大腸菌の遺伝子ｙｑｈＤによりコードされているヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性の証明
８．１ ＹｑｈＤの特性決定のための株：ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍ（ｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤ）の構築
８．１．１ ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ株の構築
ｙｑｈＤ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｙｑｈＤＦ（配列番号７８）
・ｙｑｈＤ領域の配列（３１５３３７７〜３１５３４５６）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（小文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｙｑｈＤＲ（配列番号７９）
・ｙｑｈＤ領域の配列（３１５４５４０〜３１５４４６０）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
大腸菌の遺伝子ｙｑｈＤによりコードされているヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性の証明
８．１ ＹｑｈＤの特性決定のための株：ＭＧ１６５５ ΔｐｙｋＦ：：Ｋｍ（ｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤ）の構築
８．１．１ ＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ株の構築
ｙｑｈＤ遺伝子を欠失させるために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え法を用いた。この方法により、関与する遺伝子の大部分を欠失させるとともにクロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能である。このために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ΔｙｑｈＤＦ（配列番号７８）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
ΔｙｑｈＤＲ（配列番号７９）
・カナマイシン耐性カセットの増幅のための領域（大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
オリゴヌクレオチドΔｙｑｈＤＦおよびΔｙｑｈＤＲを用い、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションによりＭＧ１６５５株に導入する（ｐＫＤ４６）。次にカナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、以下に定義されるオリゴヌクレオチドｙｑｈＤＦおよびｙｑｈＤＲを用いるＰＣＲ分析により確認する。保有株をＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｙｑｈＤＦ（配列番号８０）：
（３１５３０６８〜３１５３１００の配列と相同）
ｙｑｈＤＲ（配列番号８１）：
（３１５４８２５〜３１５４７９７の配列と相同）
ｙｑｈＤＦ（配列番号８０）：
ｙｑｈＤＲ（配列番号８１）：
８．１．２ プラスミドｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤの構築
ＹｑｈＤタンパク質の特性決定を行うために、対応する遺伝子をベクターｐＴＲＣ９９Ａ(Amersham)から発現させた。このために、ｙｑｈＤ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｙｑｈＤ Ｆ ｐＴＲＣ９９Ａ ＦおよびｙｑｈＤ Ｒ ｐＴＲＣ９９Ａ Ｒを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｐＨＩを用いて制限酵素処理し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処理したベクターｐＴＲＣ９９Ａにクローニングした。得られたベクターをｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤと呼んだ。
ｙｑｈＤ Ｆ ｐＴＲＣ９９Ａ Ｆ（配列番号８２）：
・遺伝子ｙｑｈＤの配列（３１５３３７７〜３１５３４０８）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（下線の文字）
・ＢｓｐＨＩ制限部位（太字の文字）
ｙｑｈＤ Ｒ ｐＴＲＣ９９Ａ Ｒ（配列番号８３）：
・遺伝子ｙｑｈＤの配列（３１５４５４０〜３１５４４８３）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（下線の文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（太字の文字）
次にｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤプラスミドをＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ株に導入した。
ＹｑｈＤタンパク質の特性決定を行うために、対応する遺伝子をベクターｐＴＲＣ９９Ａ(Amersham)から発現させた。このために、ｙｑｈＤ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｙｑｈＤ Ｆ ｐＴＲＣ９９Ａ ＦおよびｙｑｈＤ Ｒ ｐＴＲＣ９９Ａ Ｒを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｐＨＩを用いて制限酵素処理し、ＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で処理したベクターｐＴＲＣ９９Ａにクローニングした。得られたベクターをｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤと呼んだ。
ｙｑｈＤ Ｆ ｐＴＲＣ９９Ａ Ｆ（配列番号８２）：
・ＢｓｐＨＩ制限部位（太字の文字）
ｙｑｈＤ Ｒ ｐＴＲＣ９９Ａ Ｒ（配列番号８３）：
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（太字の文字）
次にｐＴＲＣ９９Ａ−ｙｑｈＤプラスミドをＭＧ１６５５ ΔｙｑｈＤ：：Ｋｍ株に導入した。
８．２ タンパク質ＹｑｈＤの過剰生産
タンパク質ＹｑｈＤを３７℃、好気性条件下、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５００ｍｌ ＬＢ培地の入った２ｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコで過剰産生した。これらのフラスコをオービタルシェーカーにて２００ｒｐｍで振盪した。５５０ｎｍで測定した光学密度が０．５単位に達した際に、フラスコを２５でインキュベートした。光学密度が１．２単位に達した際に、ＩＰＴＧを終濃度５００μＭとなるように加えることによりＹｑｈＤタンパク質の生産を誘導した。培養物が３．５単位を超える光学密度に達した際に遠心分離によりバイオマスを採取した。上清を廃棄し、ペレットを−２０℃で保存した。
タンパク質ＹｑｈＤを３７℃、好気性条件下、２．５ｇ／ｌのグルコースおよび５０ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む５００ｍｌ ＬＢ培地の入った２ｌバッフル付きエルレンマイヤーフラスコで過剰産生した。これらのフラスコをオービタルシェーカーにて２００ｒｐｍで振盪した。５５０ｎｍで測定した光学密度が０．５単位に達した際に、フラスコを２５でインキュベートした。光学密度が１．２単位に達した際に、ＩＰＴＧを終濃度５００μＭとなるように加えることによりＹｑｈＤタンパク質の生産を誘導した。培養物が３．５単位を超える光学密度に達した際に遠心分離によりバイオマスを採取した。上清を廃棄し、ペレットを−２０℃で保存した。
８．３ タンパク質ＹｑｈＤの精製
８．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
４００ｍｇの大腸菌バイオマスを７０ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞をＲｏｓｅｔｔセルＲＺ３中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した。音波処理後、細胞を室温で１時間、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。上清を粗抽出物として維持した。
８．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
４００ｍｇの大腸菌バイオマスを７０ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞をＲｏｓｅｔｔセルＲＺ３中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した。音波処理後、細胞を室温で１時間、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。上清を粗抽出物として維持した。
８．３．２ 工程２：硫酸アンモニウム沈殿
粗抽出物を５０％濃度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、固体の硫酸アンモニウム（３００ｇ／ｌ）を氷上で粗抽出物に加えた。４℃で１５分のインキュベーションの後、混合物を４℃、１２０００ｇにて１５分遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿を５０ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１ Ｍ硫酸アンモニウムに溶解させた。
８．３．３ 工程３：疎水性クロマトグラフィー
粗抽出物を５０％濃度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、固体の硫酸アンモニウム（３００ｇ／ｌ）を氷上で粗抽出物に加えた。４℃で１５分のインキュベーションの後、混合物を４℃、１２０００ｇにて１５分遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿を５０ｍｌの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１ Ｍ硫酸アンモニウムに溶解させた。
８．３．３ 工程３：疎水性クロマトグラフィー
Ａｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ(GE Healthcare)を用い、前工程からのタンパク質抽出物を、同じバッファーで平衡化した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ ＰｈｅｎｙｌＨＰカラム(GE Healthcare)にのせた。カラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄した。タンパク質を、１Ｍから０．５Ｍへの１０カラム容量の硫酸アンモニウム勾配と０．５Ｍから０Ｍへの２０カラム容量の硫酸アンモニウム勾配の２段階の勾配で溶出させた。溶出後、カラムを１０カラム容量の５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．５で洗浄した。カラムの流速は２．５ｍｌ／分とし、２．５ｍｌ画分を回収した。タンパク質を含有する画分をプールし、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５で透析し、１．１４μｇ／μｌの濃度まで濃縮した。
８．４ ヒドロキシアルデヒドレダクターゼアッセイ
８．４．１ ４−ヒドロキシブチルアルデヒドの化学合成
４−ヒドロキシブチルアルデヒドの化学合成は刊行物：N°158 Transposition des dihydro-2.5 furannes en dihydro-2.3 furannes. - Application a la preparation de l'hydroxy-4 butanal; par R. PAUL, M. FLUCHAIRE et G. GOLLARDEAU.
Bulletin de la Societe Chimique de France, 668-671, 1950に記載されている。
８．４．１ ４−ヒドロキシブチルアルデヒドの化学合成
４−ヒドロキシブチルアルデヒドの化学合成は刊行物：N°158 Transposition des dihydro-2.5 furannes en dihydro-2.3 furannes. - Application a la preparation de l'hydroxy-4 butanal; par R. PAUL, M. FLUCHAIRE et G. GOLLARDEAU.
Bulletin de la Societe Chimique de France, 668-671, 1950に記載されている。
８．４．２ グリコールアルデヒドおよび４−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼアッセイ
グリコールアルデヒドおよび４−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ活性は、分光光度計にて波長３４０ｎｍおよび３０℃の一定温度でＮＡＤＰＨ酸化の初速を測定することによりアッセイした。グリコールアルデヒドまたは４−ヒドロキシブチルアルデヒドを基質として用いた反応混合物は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２μｇの精製酵素を最終容量１ｍｌで実施した。反応混合物を３０℃で５分インキュベートした後、基質（グリコールアルデヒドまたは４−ヒドロキシブチルアルデヒド）を終濃度１０ｍＭで加えることにより反応を開始させた。基質を欠いた対照アッセイ（ブランク）を並行して測定し、ＮＡＤＰＨの非特異的酸化（ε３４０ｎｍ＝６２９０Ｍ−１ｃｍ−１）を考慮に入れるため、対照に対して測定された値をアッセイに対して測定された値から差し引いた。１単位の酵素活性は、このアッセイ条件下で１分間に１μｍｏｌの基質を消費した酵素の量と定義した。特異的酵素活性はタンパク質１ｍｇ当たりの単位として表した。
グリコールアルデヒドおよび４−ヒドロキシブチルアルデヒドレダクターゼ活性は、分光光度計にて波長３４０ｎｍおよび３０℃の一定温度でＮＡＤＰＨ酸化の初速を測定することによりアッセイした。グリコールアルデヒドまたは４−ヒドロキシブチルアルデヒドを基質として用いた反応混合物は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．５、０．１ｍＭ硫酸亜鉛、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２μｇの精製酵素を最終容量１ｍｌで実施した。反応混合物を３０℃で５分インキュベートした後、基質（グリコールアルデヒドまたは４−ヒドロキシブチルアルデヒド）を終濃度１０ｍＭで加えることにより反応を開始させた。基質を欠いた対照アッセイ（ブランク）を並行して測定し、ＮＡＤＰＨの非特異的酸化（ε３４０ｎｍ＝６２９０Ｍ−１ｃｍ−１）を考慮に入れるため、対照に対して測定された値をアッセイに対して測定された値から差し引いた。１単位の酵素活性は、このアッセイ条件下で１分間に１μｍｏｌの基質を消費した酵素の量と定義した。特異的酵素活性はタンパク質１ｍｇ当たりの単位として表した。
８．４．３ ３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼ活性アッセイ
基質３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）に対するＹｑｈＤの活性は刊行物：Hongmei Li; Jia Chen; Hao Li; Yinghua Li; Ying Li; (2008). Enhanced activity of yqhD oxidoreductase in synthesis of 1,3-propanediol by error-prone PCR Prog Nat Sci., 18 (12), 1519-1524に記載されている。これらの筆者は３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼアッセイに５ｍＭ塩化亜鉛、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ β−メルカプトエタノールを使用した。
基質３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）に対するＹｑｈＤの活性は刊行物：Hongmei Li; Jia Chen; Hao Li; Yinghua Li; Ying Li; (2008). Enhanced activity of yqhD oxidoreductase in synthesis of 1,3-propanediol by error-prone PCR Prog Nat Sci., 18 (12), 1519-1524に記載されている。これらの筆者は３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドレダクターゼアッセイに５ｍＭ塩化亜鉛、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ β−メルカプトエタノールを使用した。
８．５ 精製酵素の活性
実施例９
大腸菌の遺伝子ｓｅｒＣによりコードされているＬ−セリントランスアミナーゼ活性の証明
９．１ ＳｅｒＣの特性決定のための株：ＢＬ２１（ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ）株の構築
ＳｅｒＣタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターｐＰＡＬ７(Bio-rad)から発現させた。
このために、ｓｅｒＣ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ Ｒを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣと呼んだ。
ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ Ｆ（配列番号８４）：
・遺伝子ｓｅｒＣの配列（９５６８７６〜９５６９０４）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（太字の文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ Ｒ（配列番号８５）：
・遺伝子ｓｅｒＣ領域の配列（９５７９６４〜９５７９３７）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/に参照配列）と相同な領域（太字の文字）
・ＥｃｏＲＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
次にｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣプラスミドをコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞(Invitrogen)に導入した。
大腸菌の遺伝子ｓｅｒＣによりコードされているＬ−セリントランスアミナーゼ活性の証明
９．１ ＳｅｒＣの特性決定のための株：ＢＬ２１（ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ）株の構築
ＳｅｒＣタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターｐＰＡＬ７(Bio-rad)から発現させた。
このために、ｓｅｒＣ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ Ｒを用い、大腸菌ゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素で処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣと呼んだ。
ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ Ｆ（配列番号８４）：
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
ｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣ Ｒ（配列番号８５）：
・ＥｃｏＲＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
次にｐＰＡＬ７−ｓｅｒＣプラスミドをコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞(Invitrogen)に導入した。
９．２ タンパク質ＳｅｒＣの過剰生産
実施例７．２と同じプロトコールを適用し、タンパク質ＳｅｒＣの過剰生産を行った。
実施例７．２と同じプロトコールを適用し、タンパク質ＳｅｒＣの過剰生産を行った。
９．３ タンパク質ＳｅｒＣの精製
９．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
約２８０ｍｇの大腸菌バイオマスを４５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカル試験管）を５０ｍｌコニカル試験管中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した（Bandelin sonoplus、７０Ｗ）。音波処理後、細胞を室温で３０分、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
９．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
約２８０ｍｇの大腸菌バイオマスを４５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁させた。細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカル試験管）を５０ｍｌコニカル試験管中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した（Bandelin sonoplus、７０Ｗ）。音波処理後、細胞を室温で３０分、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
９．３．２ 工程２：アフィニティー精製
製造者が推奨するプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジにのせた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温にて、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに３０分インキュベートした。２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロールｐＨ８に対して透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
製造者が推奨するプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジにのせた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温にて、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに３０分インキュベートした。２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロールｐＨ８に対して透析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
９．４ Ｌ−セリントランスアミナーゼ活性アッセイ
Ｌ−セリントランスアミナーゼ活性アッセイのため、約３０μｇの精製酵素を、総容量３００μｌ中、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ８．２、３ｍＭ Ｌ−セリン、１ｍＭ α−ケトグルタル酸を含有するバッファーに加えた。この反応物を３０℃で６０分インキュベートした。反応生成物（ヒドロキシピルビン酸）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより直接測定した。
Ｌ−セリントランスアミナーゼ活性アッセイのため、約３０μｇの精製酵素を、総容量３００μｌ中、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ８．２、３ｍＭ Ｌ−セリン、１ｍＭ α−ケトグルタル酸を含有するバッファーに加えた。この反応物を３０℃で６０分インキュベートした。反応生成物（ヒドロキシピルビン酸）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより直接測定した。
９．５ 精製酵素の活性
実施例１０
サッカロミセス・セレビシエの遺伝子ＧＰＰ２によりコードされている３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性の証明
１０．１ ＧＰＰ２ｓｃの特性決定のための株：ＢＬ２１（ｐＦＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ）の構築
ＧＰＰタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターｐＰＡＬ７(Bio-rad)から発現させた。
このために、ｇｐｐ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ Ｒを用い、サッカロミセス・セレビシエゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素により処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃと呼んだ。
ｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ Ｆ（配列番号８６）：
・遺伝子ｇｐｐ２領域の配列（２８０６８０〜２８０６５５）（ウェブサイトhttp://www.yeastgenome.org/に参照配列）と相同な領域（太字の文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｒ（配列番号８７）：
・遺伝子ｇｐｐ２領域の配列（２７９９２８〜２７９９５４）（ウェブサイトhttp://www.yeastgenome.org/に参照配列）と相同な領域（太字の文字）
・ＢａｍＨＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
次にｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃプラスミドをコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞(Invitrogen)に導入する。
サッカロミセス・セレビシエの遺伝子ＧＰＰ２によりコードされている３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性の証明
１０．１ ＧＰＰ２ｓｃの特性決定のための株：ＢＬ２１（ｐＦＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ）の構築
ＧＰＰタンパク質の特性決定を行うため、対応する遺伝子を発現ベクターｐＰＡＬ７(Bio-rad)から発現させた。
このために、ｇｐｐ遺伝子を、オリゴヌクレオチドｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ ＦおよびｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ Ｒを用い、サッカロミセス・セレビシエゲノムから増幅した。ＰＣＲ産物を、酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限酵素処理し、同じ制限酵素により処理したベクターｐＰＡＬ７にクローニングした。得られたベクターをｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃと呼んだ。
ｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃ Ｆ（配列番号８６）：
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
ｐＰＡＬ７−ｋｉｖＤｌｌ Ｒ（配列番号８７）：
・ＢａｍＨＩ制限部位を担持する領域（下線の文字）
次にｐＰＡＬ７−ｇｐｐ２ｓｃプラスミドをコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞(Invitrogen)に導入する。
１０．２ タンパク質ＧＰＰ２ｓｃの過剰生産
実施例７．２と同じプロトコールを適用し、タンパク質ＧＰＰ２ｓｃの過剰生産を行った。
実施例７．２と同じプロトコールを適用し、タンパク質ＧＰＰ２ｓｃの過剰生産を行った。
１０．３ タンパク質ＧＰＰ２ｓｃの精製
１０．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
約２９４ｍｇの大腸菌バイオマスを４５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁した。細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカル試験管）を５０ｍｌコニカル試験管中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した（Bandelin sonoplus、７０Ｗ）。音波処理後、細胞を室温で３０分、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
１０．３．１ 工程１：細胞不含抽出物の調製
約２９４ｍｇの大腸菌バイオマスを４５ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６およびプロテアーゼ阻害剤カクテルに懸濁した。細胞懸濁液（１５ｍｌ／コニカル試験管）を５０ｍｌコニカル試験管中、氷上で、３０秒間隔で３０秒８回音波処理した（Bandelin sonoplus、７０Ｗ）。音波処理後、細胞を室温で３０分、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により細胞残渣を除去した。
１０．３．２ 工程２：アフィニティー精製
製造者が推奨するプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジにのせた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温にて、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに一晩インキュベートした。２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、１００ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロールｐＨ８に対して透析し、０．２２μｇ／μｌの濃度まで濃縮した。
タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
製造者が推奨するプロトコールに従い、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙカラム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジ５ｍｌ）での親和性により、粗細胞抽出物からタンパク質を精製した。粗抽出物を１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で平衡化した５ｍｌ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅｘａｃｔカートリッジにのせた。このカラムを１０カラム容量の同じバッファーで洗浄し、室温にて、１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、１００ｍＭフッ化物とともに一晩インキュベートした。２カラム容量の１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６で、カラムからタンパク質を溶出させた。タグは樹脂に強く結合したままで、精製タンパク質が遊離した。タンパク質を含有する画分をプールし、１００ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１０％グリセロールｐＨ８に対して透析し、０．２２μｇ／μｌの濃度まで濃縮した。
タンパク質濃度を、ブラッドフォールドタンパク質アッセイを用いて測定した。
１０．４ ３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性アッセイ
１０．４．１ ３−ホスホヒドロキシピルビン酸の化学合成
３−ホスホヒドロキシピルビン酸の化学合成は刊行物：CE Ballou; H Hesse; R Hesse; (1956)．The Synthesis and Properties of Hydroxypyruvic Acid Phosphate J Am Chem Soc, 78 (15), 3718-3720に記載されている。
１０．４．２ ３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性アッセイ
１０．４．１ ３−ホスホヒドロキシピルビン酸の化学合成
３−ホスホヒドロキシピルビン酸の化学合成は刊行物：CE Ballou; H Hesse; R Hesse; (1956)．The Synthesis and Properties of Hydroxypyruvic Acid Phosphate J Am Chem Soc, 78 (15), 3718-3720に記載されている。
１０．４．２ ３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性アッセイ
総容量３００μｌ中、３−ホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼ活性アッセイは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ８．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．６ｍＭ ３−ホスホヒドロキシピルビン酸および約６μｇの精製酵素（Ｇｐｐ）を用いて行った。反応物を３０℃で１２０分インキュベートした。反応生成物（ヒドロキシピルビン酸）をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより直接測定した。
１０．５ 精製酵素の活性
実施例１１
エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオール生産の最大収量のシミュレーション
１１．１ シミュレーションに用いるパラメーター
シミュレーションは、本発明者らのＭＥＴＥＸ専売ソフトウエアＭＥＴＯＰＴ（商標）を用いて行った。中枢代謝ネットワーク、あらゆるバイオマス前駆体の代謝経路および上記のような特定の生産経路を含む、大腸菌の簡略化された代謝ネットワークを用いた。大腸菌で慣例のバイオマス組成を用いた。各特異的ジオールにつき２つのシミュレーションを行った。第一のシミュレーションは理論的最大収量を計算するものであり（増殖も維持エネルギーも考えずにモデルの化学量論だけを考慮する）、第二のシミュレーションは、増殖速度０．１ｈ−１および維持エネルギー５ｍｍｏｌＡＴＰ・ｇＤＷ −１ｈ−１を考慮して実際の最大収量を計算するものである。シミュレーションは総て、グルコースの特異的取り込み率３ｍｍｏｌ・ｇＤＷ−１ｈ−１で行った。エチレングリコールおよび１，３−プロパンジオールに関しては、好気性条件でシミュレーションを行った。特に１，４−ブタンジオールでは、好気性条件と嫌気性条件の双方でシミュレーションを行った。嫌気性条件では、増殖速度は０．１ｈ−１とすることができなかった。増殖速度は利用可能なＡＴＰに応じて達成可能な最大増殖速度である。
１１．２ シミュレーション結果
エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオール生産の最大収量のシミュレーション
１１．１ シミュレーションに用いるパラメーター
シミュレーションは、本発明者らのＭＥＴＥＸ専売ソフトウエアＭＥＴＯＰＴ（商標）を用いて行った。中枢代謝ネットワーク、あらゆるバイオマス前駆体の代謝経路および上記のような特定の生産経路を含む、大腸菌の簡略化された代謝ネットワークを用いた。大腸菌で慣例のバイオマス組成を用いた。各特異的ジオールにつき２つのシミュレーションを行った。第一のシミュレーションは理論的最大収量を計算するものであり（増殖も維持エネルギーも考えずにモデルの化学量論だけを考慮する）、第二のシミュレーションは、増殖速度０．１ｈ−１および維持エネルギー５ｍｍｏｌＡＴＰ・ｇＤＷ −１ｈ−１を考慮して実際の最大収量を計算するものである。シミュレーションは総て、グルコースの特異的取り込み率３ｍｍｏｌ・ｇＤＷ−１ｈ−１で行った。エチレングリコールおよび１，３−プロパンジオールに関しては、好気性条件でシミュレーションを行った。特に１，４−ブタンジオールでは、好気性条件と嫌気性条件の双方でシミュレーションを行った。嫌気性条件では、増殖速度は０．１ｈ−１とすることができなかった。増殖速度は利用可能なＡＴＰに応じて達成可能な最大増殖速度である。
１１．２ シミュレーション結果
Claims (13)
- 脂肪族ジオールの生物生産のために遺伝的に改変された微生物であって、
２−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を用いてヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物を脱炭酸するための代謝経路を含んでなり、該脱炭酸工程から得られた産物が、さらに、ヒドロキシアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素を用いて対応する脂肪族ジオールへ還元されるものであり、かつ
該ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物の生産が改良されるように遺伝的に改変されている、微生物。 - 細菌、酵母および真菌からなる群から選択される、請求項１に記載の微生物。
- 腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、バシラス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)から選択される、請求項１または請求項２のいずれか一項に記載の微生物。
- ２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする内因性遺伝子を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
- ２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする内因性遺伝子の発現を増強するようにさらに改変されている、請求項４に記載の微生物。
- ２−ケト酸デカルボキシラーゼをコードする異種遺伝子を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
- 脂肪族ジオールがエチレン−グリコールであり、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物がヒドロキシピルビン酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
- 脂肪族ジオールが１，３−プロパンジオールであり、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物が４−ヒドロキシ−２−ケト酪酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
- 脂肪族ジオールが１，４−ブタンジオールであり、ヒドロキシ−２−ケト−脂肪酸代謝産物は５−ヒドロキシ−２−ケトペンタン酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
- 脂肪族ジオールの発酵生産のための方法であって、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物を、炭素源を含んでなる適当な培養培地上で培養する工程と、
その培養培地から脂肪族ジオールを回収する工程と
を含んでなる、方法。 - ジオールがさらに精製される、請求項１０に記載の方法。
- 炭素源が、六炭糖、五炭糖、単糖、二糖、オリゴ糖、糖蜜、デンプンおよびその組合せから選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
- 炭素源が、グルコースおよびスクロースから選択される、請求項１２に記載の方法。
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