KR0132258B1 - 세린 및 세린 유도생성물의 생합성 재료 및 생합성 방법 - Google Patents

세린 및 세린 유도생성물의 생합성 재료 및 생합성 방법

Info

Publication number
KR0132258B1
KR0132258B1 KR1019940701948A KR19940071948A KR0132258B1 KR 0132258 B1 KR0132258 B1 KR 0132258B1 KR 1019940701948 A KR1019940701948 A KR 1019940701948A KR 19940071948 A KR19940071948 A KR 19940071948A KR 0132258 B1 KR0132258 B1 KR 0132258B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
serine
pgd
dna
amino acids
cell
Prior art date
Application number
KR1019940701948A
Other languages
English (en)
Inventor
피. 버링게임 리차드
Original Assignee
에리히 프랑크, 칼-하인즈 림뵉
와커-해미 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에리히 프랑크, 칼-하인즈 림뵉, 와커-해미 게엠베하 filed Critical 에리히 프랑크, 칼-하인즈 림뵉
Application granted granted Critical
Publication of KR0132258B1 publication Critical patent/KR0132258B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Tires In General (AREA)
  • Epoxy Resins (AREA)
  • Ceramic Products (AREA)

Abstract

야생형 PGD와 비교하여 세린(Serine)에 의한 저해에 대한 감수성을 감소시킨 3-포스포글리세린산염 탈수소효소(PGD)를 엔코딩하는 DNA, 즉 DNA는 적어도 생합성에 유용한 효소활성을 가지며, (변성없는) 야생형 PGD보다 더 높은 레벨의 세린에서의 효소활성을 보유하는 PGD를 엔코딩한다.
이 발명은 또 a) 위 공학적 DNA의 아미노산 배열을 가진 PGD와,
b) 공학적 DNA와 숙주발현계에서 그 공학적 DNA의 발현을 하도록 배치하여 지향한 조절 DNA를 포함하는 발현벡터와,
c) 이와같은 발현벡터를 포함하는 세포와,
d) 이와같은 세포를 배양시켜 세린 또는 세린 유도생성물을 제조하는 방법에 대한 것이다.

Description

세린 및 세린 유도생성물의 생합성 재료 및 생합성 방법
이 발명은 세린 및 세린 유도생성물, 특히 트립토판의 생합성의 일반분야와 그 생합성에 사용되는 방법 및 그 물질에 관한 것이다.
세린은 콜린, 글리신, 시스테인 및 트립토판 등 경제적으로 중요한 화합물을 포함하는 광범위한 종류의 세포대사물(cellular metabolites)의 생합성의 중요한 중간체이다.
또, 세린은 단일 탄소공여체(donor)로서 작용하며, 테트라히드로폴레이트의 5,10-메틸렌 테트라히드로폴레이트의 제조에서 Cl단위의 세포(cell) 총필요량의 60-75%를 공여한다.
이들의 Cl단위는 메티오닌, 이노신, 모노포스페이트, 다른 푸린(other purines) 및 일부 피리미딘(즉, 티미딘 및 히드록시메틸시티딘)의 합성을 포함하는 광범위한 종류의 생합성 경로에 사용된다.
제1도에 나타낸 세린 생합성경로는 일반적으로 광범위한 여러 종류의 조직 및 미생물에 유효하다.
그 생합성경로의 최초공정에서는 효소 3-포스포글리세린산염 탈수소효소(PGD)에 의해 3-포스포-D-글리세린산(PGA)를 3-포스포히드록시 피루빈산(PHA)으로 변환시킨다. PGD를 엔코팅(encoding)하는 유전자를 클로닝(cloning) 및 배열(sequence)하여 PGD섭유닛(subunit)의 아미노산 배열을 추정하였다(참조문헌 : Tobey 및 Grant, J. Biol. chem, 261:12179-12813 : 1980).
야생형 PGD의 활성은 세포의 세린 레벨(cellular serine levels)에 의해 효모균(yeast) 등 미생물과 원핵생물(procaryotes)(특히 세균)에서 저해되나 고등진 핵생물(higher eukaryotes)에서 저해되지 않는다.
이와같은 저해는 운동론적으로 연구되었고, 알로스테릭적으로(allosteric matter)진행되는 것으로 보고되었다
(참고문헌:Tobey 및 Grant, J. Biol. Chem., 261:12179-12183, 1986: Dubrow 및 Pizer, J. Biol. Chem. 251: 1527-1551, 1977 : Mckitrick 및 Pizer, J. Bacteriol. 141:235-245, 1980).
참고문헌(Tosa 및 Pizer, J. Bacteriol. 106: 972-982, 1971)에서는 에.콜리(E.Coli) 및 균주에 대한 독성 세린 아날로그(normally toxic serine analog), L-세린 히드록사메이트의 영향에 대한 연구에 대하여 기재되어 있다.
그 유사체를 포함하는 성장배지의 선택으로 세린내성 변이체(serine resistant mutants)를 생산하였다. 어떤 종의 변이체는 PGD, 세릴-tRNA합성효소와 관련없는 효소에서 수식(modification)을 가짐을 나타내었다.
하나의 변이체의 거친 추출물(crude extract)은 세린 감수성이 감소된 PGD활성을 나타내었다(참고문헌 참조: J. Bacterial. 106 : 972-982, 1971; 표5; 표6 및 973면 아래 좌측란, 977면 아래 좌측란 참조).
제1의 이 발명은 일반적으로 야생형 PGD와 비교하여 세린에 의한 저해 감수성을 감소시킨 3-포스포글리세린산염 탈수소효소(PGD)를 엔코팅(encoding)하는 DNA에 그 특징이 있다. 즉, 그 DNA는 생합성에 유용한 적어도 효소활성을 가지며, (미수식)야생형 PGD보다 더 높은 세린레벨에서 그 활성을 보유하는 PGD를 엔코딩한다.
바람직한 실시예에서, 그 야생형 PGD는 미생물 또는 효모 PGD이다.
본 발명에서, 야생형(wild type) PGD(3-포스포글리세린산염 탈수소효소:3-phosphoglycerate dehydrogenase)와 비교하여 세린(serine)에 의한 저해에 대한 감수성이 감소된 PGD를 엔코딩한 공학적 DNA(engineered DNA)에 있어서, 상기 공학적 DNA는 최소한 363번째 아미산과 364번째 아미노산 사이의 삽입(insertion), 또는 394번째 아미노산과 395번째 아미노산사이의 삽입, 또는 403번째 아미노산과 404번째 아미노산사이의 삽입, 또는 364번째 아미노산에서 402번째 아미노산까지의 결실(deletion), 또는 395번째 아미노산에서 403번째 아미노산까지의 결실, 또는 C-말단 아미노산 46개의 결실 또는 C-말단 아미노산 45개의 결실, 또는 C-말단 아미노산 7개째부터 1개이상의 아미노산의 결실에서 이루어진 PGD를 엔코팅함을 특징으로 하는 공학적 DNA를 제공한다.
PGD의 야생형(WT)의 359번째∼410번째의 아미노산 배열을 다음 표 1에 나타낸다(-는 삽입부분).
이 발명은 또 다음 특징이 있다. a) PGD는 위에서 설명한 공학적 DNA의 아미노산 배열을 가짐; b) 발현 벡터(expression Vectors)는 숙주 발현계(host expression systerm)에서 공학적 DNA가 발현을 하도록 배치하여 지향시킨 조절 DNA와 그 공학적 DNA를 구성함; c) 세포(cells)는 위와같은 발현 벡터로 구성됨. d) 이와같은 세포를 배양시켜 세린 또는 세린 유도생성물을 제조하는 방법임. 위 c)에 있어서, 그 세포는 야생형 SerA 대하여 결실시키는 것이 바람직하다.
또 다른 실시예에서는 일반적으로 변화한 3 ‘말단을 가진 PGD-엔코딩 mRNA 전사체를 생산하는 공학적 처리로 한 세포에 특징이 있으며, 그 전사체는 그 세포에 의해 번역되어 야생형 PGD와 비고하여 세린에 의한 저해 감수성을 감소시키는 PGD를 얻는다.
이 발명은 중요한 생합성 제어점의 해제(decontrol)를 제공함으로써, 특히 트립토판 등 세린 및 세린유도생산물을 포함하는 그 제어점 이하의 다수 화합물 생산을 향상시킨다.
세린 (즉, 세린은 그 생합성에서 중요한 중간체임)에서 유도된 다른 세포대사물에는 콜린, 글리신, 시스테인 및 메티오닌, 이노신 모노포스페이트 및 일부 피리미딘(즉, 티미딘 및 히드록시메틸 시토신) 등의 C1-공여체-의존화합물을 포함한다.
바람직한 실시예를 아래에서 설명한다.
도면의 설명
제1도는 글루코오스로부터 L-세린을 생합성하는 공정을 나타낸다.
제2도는 토베이(Tobay) 및 그란트(grant)(위 인용한 특허문헌)에 의해 보고된 에.콜리(E.Coli)serA 유전자배열과 그 유전자에서 추정되는 아미노산 배열을 나타낸다.
제3도는 L-세린 및 테트라히드로폴레이트에서 글리신 및 N5, N10-메틸렌 테트라히드로폴레이트로의 생물변화(bioconversion)을 나타낸다.
세린-비감수성 PGD의 제공
1. 유전자의 공학적 규성
이 발명의 바람직한 실시예는 세린과 세린유도생성물의 생합성에 특징이 있다.
즉, 위에서 설명한 생성물은 세린에서 생합성에 의해 유도된다.
이 발명에 의한 이들 화합물의 생합성의 최초공정은 아래에서 설명한 바와 같이 세린 비감수성 PGD를 제공하는데 있다.
본 발명자들은, PGD에 특이적 세린 피드백 매개영역 (specific serine feedback mediating domain)이 존재하여 그 영역은 유용한 레벨의 PGD활성을 유지하면서 세린감수성을 감소하도록 변화시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
제2도는 다음 설명에서 사용될 수 있는 하나의 특정의 PGD유전자 및 아미노산 배열을 나타낸다. 제2도의 배열에는 410개의 아미노산(성숙단백질에서 개열된 최초의 Met포함)을 포함한다.
PGD활성을 파괴시킴이 없이 세린 감수성을 감소시킬 수 있는 PGD의 영역은 그 분자의 C-말단 25%이내, 바람직하게는 50개의 C-말단잔류기 이내에 있다.
이 발명에 속하는 PGD수식(modification)의 예로는 유용한 PGD작용을 유지하면서 세린감수성을 감소하는 C-말단 아미노산 42개중 일부분 또는 전부의 결실 (deletion)또는 그 영역내에서 삽입 또는 치환이 있다. 예로서 Val 363과 Asn 364사이에 아미노산 잔류기를 삽입하면 그 PGD의 활성을 유지한 상태로 야생형에 대한 PGD의 ki가 증가한다.
그 C-말단 아미노산잔류기의 일부 또는 전부를 결실시킴으로써, Ki를 보다 크게 증가시킬 수 있다.
예로서, C-말단잔류기 GTIRARLLY를 결실시켜 ASLD로 치환시키면 유용한 레벨의 PGD의 활성을 유지한 상태에서 Ki의 값이 증가한다. 이발명의 범위내에 있는 다른 삽입에는 Ala392와 Gln394사이의 삽입이 있다.
다른 유용한 수식(modifiction)에는 위에서 설명한 삽입 및 수식외에 그 C-말단에서의 결실이 있다.
위에서 설명한 세린-비감수성 PGD를 엔코딩하는 유전자는 C-말단 아미노산을 코딩(coding)하는 코딩영역의 3'말단을 변성시킨 다음, 운반자(매개물)로 숙주균주를 형질전환시켜 변화한 PGD효소를 발현하는 것을 포함하는 유전자 공학적 기술에 의해 구성할 수 있다.
후보변성효소(candiate altered enzyme)를 세린 친화성(serine affinity)(Ki)과 PGD활성에 대하여 아래에서 설명되는 방법에 의해 스크리닝한다(screen)
2. 유전자의 공학적구조의 스크리닝(screening).
위 방법에 의해 작성한 유전자 구조물을 스크리닝 할 때, PGD활성과 세린 감수성에 대한 다음 평가분석을 사용한다.
이 발명에 중요하지 않으나, PGD활성의 평가분석은 일반적으로 그 변성효소의 세린감수성의 정도를 구하기 위하여 필요하다. 이 기술분야에서 공지된 바와같이, 효소활성은 총효소분자수와 각 분자의 촉매활성에 관계가 있다.
이와같이 PGD 피드백 변이체의 촉매활성을 비교할 때 상대촉매활성(relative catalytic activity)을 비교하는 샘플에 대한 PGD분자의 상대수를 충분히 제어하는 공정을 설정하여야 한다.
이것을 달성할 수 있는 여러 가지 방법이 있다. 그러나, 절단 serA유전자로 형질 전환시킨 세포내의 유전자발현의 레벨을 충분하게 설정하기가 어렵기 때문에 (생존도의 감소로 인하여), 여러 가지의 구조물에서 생산되는 PGD활성과 야생형을 대비하는 가장 적합한 방법은 표준조절요소(standard regulatory elements)를 포함하는 변성 serA유전자를 단일복제(single copy)로 염색체와 일체화(integrate)시킨 다음 그 형질전환체(trans formants)를 채취하여 야생형 세포에서의 PGD와 비교하여 상대촉매활성을 구한다. PGD활성 측정에 적합한 어떤 방법으로도 사용할 수 있다.
PGD 활성은 참고문헌(McKitrick, John C. 및 Lewis I. Pizer; 1980, J. Bacterial. 141, 235-245)의 방법에 의해 정반을 또는 역반응의 검출에 의해 측정할 수 있다.
위에서 설명한 효소의 평가분석은 화학적으로 수식한 C-말단을 가진 PGD효소를포함하여 어떤 PGD효소에 대해서도 세린 감수성의 측정에 적합하다. 그 평가분석은 여러 가지 레벨의 세린 존재하에서 실시한다.
세린 존재하에서 촉매활성을 세린이 없는 촉매활성과 대비하여 Ki를 산출한다. 대부분의 경우, PGD촉매활성을 크게 변화시킴이 없이 세린의 감수성을 감소시키는 것이 바람직하다.
또 다른 실시예에서는 그 피드백 감수성과 촉매활성을 감소시키는 것이 바람직하다.
표 1에 열거한 3-포스포글리세린산염 탈수소효소의 C-말단 아미노산배열을 가진 구조물을 사용할 수 있다.
수식3' 말단(end)을 가진 다른 구조물로, 이 발명에 의한 테스트하는 구조물을 조제하여 세포를 형질전환시키고 PGD 활성의 세린저해에 대하여 간단하게 테스트할 수 있어, 이 발명의 범위내에 속한다.
세인에 의한 저해에 대한 감수성이 결여된 PGD 단백질을 발현하게 하는 그 어떤 벡터(Vector)라도 이 발명에 속한다. 그러나, 일반적으로 세린의 싱크(a sink of serine)가 없을 경우 피드백프리 PGD(feedback of PGD)의 높은 레벨의 발현은, 얻어진 높은 레벨의 단백질의 세린 또는 세린유도대사물이 세포에 대하여 유해하므로 피해야 한다. 이와같이, 일반적으로 통상의 촉매활성과, 천연유전자(native gene)의 것과 유사한 발현레벨을 가진 피드백 저해 PGD를 엔코딩하는 구조물에 있어서도 형질전환에 의해 높은 레벨의 PGD가 발현하여 세포 생존성이 감소하는 경향이 있다.
생산된 높은 레벨의 세린의 독성으로 인하여 실제로 PGD발현을 감소시킨 변이체를 선택한다.
이와같이, 다복제 플라스미드(multi-copy plasmids)를 사용하는 형질전환은 일부 실시예에서 사용한 구조물의 초기 스크리닝에 유용하므로, 단일 복제에서의 serA구조물을 게놈(genome)으로 염색체와 일체화(chromosomally intergrate) 하는 것이 바람직하다.
추가로, 아래에 설명되는 염색체의 일체화로 피드백 결실 PGD의 활성측정이 용이하다.
따라서, 강력한 촉매활성이 예측되거나 바람직한 대부분의 실시예에서는 단일복제 염색체와의 일체화에 적합한 벡터를 이용하는 것이 바람직하다.
다수의 이와같은 벡터와 이들의 사용방법은 기술분야에서 공지되어 있다(참고문헌:Beckman, 미국출원번호 07/091,837, 87.9.1. 출원).
유용한 벡터 구조물은, 바람직한 생성물을 생산하는데 적합한 숙주에서 효소의 성공적인 발현과 형질전환을 하도록 할 수 있다.
이와같은 목적을 달성하기 위한 수단은 이 분야의 기술자에게 공지되어 있으며 이 발명에서는 중요하지 않다.
변성 PGD-엔코딩 DNA이외에, 발현벡터에는 아래에서 설명되는 여러 가지의 다른 요소를 포함한다.
첫째로, 벡터에 존재하는 코딩배열은 프로모터(Promoters), 리보솜 결합부위(ribosome bindins sites) 및 종결배열(termination sequences)을 포함하는 코딩배열의 적합한 레벨의 발현에 필요로하는 적당한 조절요소를 동반한다.
대부분의 경우, 이 분야에서 공지되고 아직도 발견되는 다수의 다른 조절배열을 이용할 수 있으나, 천연 serA 조절배열이 그 분자의 촉매활성부분의 바람직한 소오스(source)이다.
둘째로, 적당한 조절인자와 함께 선택마커(markers) 및/또는 리포터(reporter) 유전자를 엔코딩하는 배열로 존재하는 것이 바람직하다.
이와같은 선택마커의 발현은 형질전환테를 동정하는 데 유용하다. 적당한 선택마커 유전자에는 암피실린, 테트라시클린 및 클로람 페니콜을 코딩하는 마커 유전자가 포함되어있다.
셋째로, 그 플라스미드 벡터에서의 복제기점(origin of replicatiion)의 바람직한 특성(desirability)은 주로 염색체 또는 액색체이외 유전자를 유지하는 바람직한 특성에 의존한다.
이 기술분야에서 잘 알려진 방법은 복제기점의 결여(lack)를 이용하여 염색체에 일체화를 촉진시킬 수 있는 여러 가지의 방법을 평가한다(참고문헌:Backman 등, 미국특허 제4,743,546호).
일단 발현벡터가 구성되면, 적당한 숙주세포를 세린 비감수성 PGD 단백질을 코딩하는 전사단위(transcription unit)를 포함하는 벡터로 형질전환시킬 수 있다.
대부분의 경우, 내인성 PGD단백질(endorenous PGD protein)이 세린에 의해 저해되는 것은 공지되어 있으며, 그 인성 serA 유전자가 결실되어 이 발명의 변성 유전자에 의해 치환되는 세포를 이용하는 것이 유용하다. 이와같은 세포계는 세린 유도대사물의 과잉생산에 유용하다.
세린감수성단백질의 포함이 공지되어있는 세포는 원핵생물(Prokaryotes)과 효모이다.
다음에 실시예를 설명하나 여기에 한정되어 있는 것은 아니다.
피드백 내성 3-포스포글리세린산염 탈수소 효소를 엔코딩하는 serA 유전자 대립유전자의 구조에.콜리(E.coli)K12 serA유전자를, pTR264의 Bc1I부위에 클로링(cloning)한 Sau 3A 부분 소화물에서 유래하는 6.4kb DNA 단편에서 분리하였다.(참고문헌:Backmann 등, 미국특허출원 07/285, 128 1988.12.16 : Robert등, Gene 12 : 123, 1980).
이 플라스미드를 pKB1302라 명명하였다. serA 유전자를 포함하는 pkB1302 DNA의 3kb Sa1I∼SphI 단편을 pUC19에 클로닝시켜 pKB1321을 생성하였다.
피드백 내성 3-포스포글리세린산염 탈수소효소를 엔코딩하는 serA의 대립유전자(Alleles)를 그 serA 유전자의 3'영역에서 제한 부위에 XbaI 링커(linkers)를 삽입하여 생성하였다.
HincII에 의한 폴라스미드pKB1321의 부분 소화물에 의해 부위 1793에서 평활말단(blunt ends)이 생성하였다. 여기서 링커의 삽입에 의해, a)절단3-포스포글리세린산염 탈수소효소를 엔코팅하는 pKB 1459: b)절단 3-포스포글리세린산염 탈수소효소를 엔코딩하는 pKB 1507: 및 c) 4개의 아미노산 잔류기를 삽입하여 3-포스포글리세린산염 탈수효소를 엔코딩하는 pKB1508이 생성되었다.
pKB1321의 PstI 소화(digestion)는 위치 1888 3'현수(overhang)를 얻었다.
그 평활단은 DNA 중합효소I의 클레노(Klenow)단편의 작용에 의해 생성하였다. 링커(linkers)를 그 평활단 단편으로 결찰시켰으며(ligate), 그 유도플라스미드는 두 개의 아미노산을 삽입하여 3-포스포글리세린산염 탈수소효소를 엔코딩하는 pKB1509와, 절단 3-포스포글리세린산염 탈수소효소를 엔코딩하는 pKB1510이었다.
pKB1370의 KpnI 소화물을 DNA 중합효소 I의 클레노 단편을 사용하여 평활단으로하여, 삽입링커에 의해 절단 3-포스포글리세린산염 탈수소효소, pKB1455 및 pKB1512 및 pKB1512 또는 2개의 아미노산 잔류기를 삽입하여 가진 3-포스포글리세린산염 탈수소효소, pKB1511을 생성하였다.
결실플라스미드 pKB1530 및 pKB1531을 각각 pKB1508 유래의 0.8Kb BamHi∼xbal 단편 또는 pKB1509 유래의 0.9Kb BamHI 단편 내지 Xbal단편을 pKB1511의 5.8Kb BamHI∼Xbal단편에 삽입시킴으로써 생성하였다.
다음 표 2는 작성한 여러 가지 구조물을 요약한 것이다.
모든 구조물에 있어서, 개시벡터, 사용한 제한부위 및 삽입링커의 배열을 나타낸다. 세린의 Ki값을 표 1에 나타내며, 또한 이들 구조물 다음의 염색체 일체화(chromosomal integration)(아래에서 설명)후 이들의 구조물 3종에 대한 상대 촉매활성을 나타낸다.
N/A에서 그 구조물은 염색체 일체화가 되어있지 않음을 나타낸다. 따라서, 그 활성레벨을 표준화하지 않았다. 레벨을 표준화하지 않았다.
3. 화학적 수식 (Chemical modifications)
야생형 PGD의 C-말단의 결실 또는 수식의 예로서 카르복시텝티다아제 Y를 포함하는 여러 가지의 카르복시 텝티다아제 또는 락퍼옥시다아제 개제 요오드화에 의해 효소 또는 화학적으로 달성할 수 있는 것은 이 분야 기술자에 의해 이해할 수 있다.
4. 앤티센스(antisense)mRNA의 사용
또, 천연 PGD 또는 형질전환한 PGD를 엔코딩한 배열의 3' 코팅영역부분을 보상하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 생산 앤티센스 mRNAS에 의해 3' 말단에서 절단한 PGD를 엔코딩하는 전사체의 생성을 통해 생체내에서 세린감수성을 감소시킬 수도 있다.
C. 바람직한 화합물의 생산
제 3도에서 나타낸 바와 같이, 세린은 글리신 제조에 있어서 중간체이다. 또, 세린은 메티오닌, 푸린류(이노신 포함) 및 피리미딘의 합성에 필수적인 일반형 C공여체(donor)로서 N , N -메틸렌테트라히드로 폴레이트의 제조중간체이다. 따라서, 포스포글리세린산염으로부터 세린의 과잉생산은 콜린, 글리신, 시스테인, 메티오닌, 트립토판 및 이노신모노포스페이트를 포함하는 모든 푸린류의 생산계(Production system)를 포함하는 광범위한 세균생산계에서 유용하다.
다음에 구체적인 실시예를 들어 설명한다.
실시예 2
숙주 균주의 조제
플라스미드 유래 serA 유전자에 대하여 내부의 배열을, 카나마이신 내성유전자로 대치하였다. 그 다음, 이 플라스미스를 사용하여 다음과 같이 대립유전자 교환(allele exchange)에 의해 숙주 균주 serA 유전자를 불활성화(실활)하였다:
YMC9(ATCC 33920)의 serA영역을, PC1523(argI61, argF58, SerA 27, PurA54, thr-25, tonA49, relA1, spoTI)(Coli genetic stock center에서 취득, 예일대학, 미국)의 상보(Complementation)에 의해 Sau 3AI로 부분 소화한 염색체 DNA로부터 클로닝하였다.
serA 유전자를 가진 3Kb단편을 pUC19에 섭클로닝(subcloning)하여 pKB1321로 칭하는 플라스미드를 얻었다.
이 플라스미드에서, 3Kb salI∼Hind III단편을 PBR322에 재클로닝하여 플라스미드 pKB1370을 얻었다.
serA 유전자의 3'말단에서의 KpnI부위를, 링커(linker)를 사용하여 BamHI로 변환시켰으며, 그 결과 얻어진 serA에 대하여 내부의 BamHI단편을, Tn903 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 pUC-4-KSAC(Pharmacia)유래의 BamHI단편으로 치환하였다. 이 새로운 플라스미드를 pKB1429로 명명하였다.
복재의 기점을 플랭킹하여(flanking) MboI 및 TTh III1을 KPnI부위로 변환시킨 pKB701(ATCC 39772)로 칭하는 pBR322 유도체(USSN 06/757,019 참조; 이 미국 특허출원 명세서에서 기재되어 있는 내용은 인용참고문헌으로 본 명세서의 내용으로 함)를 생성하였다.
pKB1429 유래의 serA::KanR을 포함하는 SalI-EcoRI단편을 pKB701로 클로닝하여 pKB1438을 얻었다.
pKB1438을 KpnI로 소화시켜 ori영역을 제거하였다.
그 암피실린 내성코딩영역과 serA::KanR을 포함하는 대형 단편을 환화하여(circularized), YMC9의 CaCl형질전환에 사용하였다.
형질전환 후에 그 숙주 YMC9 세포는 암피실린을 사용하여 선택하도록 하였다.
이와같은 조건에서, 암피실린내성클론은 상동재조함(homologous recombination)을 통하여 serA유전자 플랭킹(flanking)영역에서 환상 DNA를 결합에 의해 생성된다(develop).
암피실린선택을 하지 않은 경우 그 암피실린 내성분리균주(isolate)의 성장결과, serA유전자 플랭킹영역의 반복배열의 상동재조합에 의해 암피실린 내성 유전자가 상실되었다.
이와같은 균주(strains)는 제조업자의 지시에 따라 Ampscreen(BRL)을 사용하는 β-락타마아제 생산손실에 의해 동정하였다. 세린이 있을 때와 없을 때 배지상에서 단일 클로니의 중복 스트리킹(duplicate streaking)에 의해 최소배지에서의 성장에 세린을 필요로 하는 암피실린 감수성으로 카나마이신에 대하여 내성이 있는 클론으로 판명되었다. 이와같은 하나의 분리균주를 KB875로 명명하였다.
실시예 3
대립유전자(allele) 교환에 의한 변성 serA배열의 염색체 일체화(Chromosomal intergration)
serA1455 대립유전자를 실시예 2에서와 같이 serA::KanR의 도입에 사용되는 방법과 동일한 방법에 의해 그 염색체에 도입시켰다.
즉, serA1455 대립유전자를 가진 단편(SalI∼Hina III)을 pKB701로 클로닝하였다. 플라스미드 기점을 KpnI 소화에 의해 제거하였다. 그 환상화 DNA를 사용하여 암피실린의 내성으로 형질전환하여 명명균주를 얻었다.
암프스크린(ampscreen) 및 카나마이신용 리필리카 평판(replica plating)을 사용한 비선택 성장을 한 후, KB904(serA1455)를 분리할 때 암피실린 및 카나마이신 KB904에 대하여 감수성이 있음을 확인하였다. 그 결과 얻어진 serA1544 대립유전자는 P1형질도입에 의해 생산균주로 전이시킬 수 있다(참고문헌:Miller(1972), Experiments In Mo1, Genetics Cold Spring Harbor Press, pp. 201∼205).
실시예4 recD 의존 유전자 치환에 의해 변화한 serA 배열의 염색체 일체화 또 다른 접근방법을 이용하여 serA1508 대립유전자를 그 염색체에 이동시켰다.
V220(recD, argA:Tn10. Amundsen등, 1986, Proc. Acad. Sci., U.S.A. 825558-5562)(DSM 6823)의 PI형질도입에 의해 균주 KB875를 recD로 하였다.
엑소뉴클라아제 V의 필수 제3섭유니트(third subunit)용유전자를 사용하여 JGP101를 얻었다. 플라스미드 pKB1508을 선상화하여 참조문헌(Shevel1등, 1988, J. Bacteriol. 170 3294-3296)에 의해 기재된 바와 같이 주로 세린프로토트로피(Serine Prototrophy)에 대하여 JGP101을 형질전환시키는 데 사용하여 JGP103을 얻었다.
그 다음, serA1508 대립유전자는 P1형질도입에 의해(참고문헌:Miller등, Experiments in Mo1. Genetics Cold Spring Lab., pp. 201∼205, 1972) 생산균주로 이동시킬 수 있다.
과잉생산 대사물의 채취
세린-유도대사물의 과잉생산을 위하여, 세린 감수성을 감소시킨 PGD를 생산하는 세포를 조제하여, 대부분의 경우 적당한 조건에서 정상기까지 효소조(fermentor) 내에서 성장시켰다. 그 다음, 그 세포를 채취하여 용균하고, 표준생화학 처리조작에 따라 필요로 하는 대사물을 조제하였다.
그 미생물의 성장에 대한 조건, 원리 및 참고문헌과 특정대사물의 채취는 다음의 참고문헌에 기재되어 있다(Crueger and crueger, 1982, Bio technology: A Textbook of Industrial Microbiology: Herrmann 및 Somerville, 1983: Amino acids: Biosynthesis 및 Genetic Regulation). 이 참고문헌에 기재되어 있는 내용은 인용에 의해 본 발명 명세서의 내용으로 한다.

Claims (10)

  1. 야생형(wild type) PGD (3-포스포글리세린산염 탈수소효소: 3-phosphoglycerate dehydrogenase)와 비교하여 세린(serine)에 의한 저해(inhibition)에 대한 감수성이 감소된 PGD를 엔코딩한 공학적 DNA(engineered DNA)에 있어서, 최소한 363번째 아미노산과 364번째 아미노산 사이의 삽입(insertion), 또는 394번째 아미노산과 395번째 아미노산 사이의 삽입, 또는 403번째 아미노산과 404번째 아미노산 사이의 삽입, 또는 364번째 아미노산에서 402번째 아미노산까지의 결실(deletion), 또는 395번째 아미노산에서 403번째 아미노산까지의 결실, 또는 C-말단 아미노산 46개의 결실, 또는 C-말단 아미노산 45개의 결실, 또는 C-말단 아미노산 7개째부터 1개이상의 아미노산의 결실에서 이루어진 PGD를 엔코딩(encoding)함을 특징으로 하는 공학적 DNA.
  2. 제 1항에 있어서, 야생형 PGD는 미생물 또는 효모 PGD임을 특징으로 하는 공학적 DNA.
  3. 제 1항에 있어서,
    (a) serA1455 (b) serA1459 (c) serA1507 (d) serA1508
    (e) serA1509 (f) serA1510 (f) serA1511 (h) serA1512
    (i) serA1530 (j) serA1531 로 구성되는 그룹에서 선택함을 특징으로 하는 공학적 DNA.
  4. 제 1항의 공학적 DNA에 의해 엔코딩한 아미노산 배열을 가진 3-포스포글리세린산염 탈수소효소.
  5. 제 1항의 공학적 DNA와, 숙주발현계(host expression system)에서 공학적 DNA를 발현하도록 배치하여(positioned) 지향한(oriented) 조절 DNA(regulatory DNA)를 포함한 발현벡터(expression vector).
  6. 제 1항의 공학적 DNA와 세포에서 공학적 DNA를 발현하도록(express) 배치하여 지향한 조절 DNA를 포함한 세포(cell).
  7. 제 6항에 있어서, 세포는 야생형 serA에 대하여 결실함을 특징으로 하는 세포.
  8. 세린 또는 세린 유도생성물의 제조방법에 있어서, 제6항의 새포를 배양시켜, 그 얻어진 생성물을 회수함을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 생성물은 세린임을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 변화한 3'말단을 가진 PGD-엔코딩 전사체(PGD-encoding transcript)를 제조하도록 처리한 세포에 있어서, 전사체를 야생형 PGD와 비교하여 세린에 의한 저해에 대한 감수성이 감소된 PGD로 변역할 수 있도록 한(translating) 세포.
KR1019940701948A 1991-12-12 1992-08-17 세린 및 세린 유도생성물의 생합성 재료 및 생합성 방법 KR0132258B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91121385 1991-12-12
EP91121385.8 1991-12-12
PCT/EP1992/001873 WO1993012235A1 (en) 1991-12-12 1992-08-17 Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR0132258B1 true KR0132258B1 (ko) 1998-04-11

Family

ID=8207424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019940701948A KR0132258B1 (ko) 1991-12-12 1992-08-17 세린 및 세린 유도생성물의 생합성 재료 및 생합성 방법

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5618716A (ko)
EP (1) EP0620853B1 (ko)
JP (1) JP2584409B2 (ko)
KR (1) KR0132258B1 (ko)
CN (1) CN1065914C (ko)
AU (1) AU668359B2 (ko)
BR (1) BR9206902A (ko)
CA (1) CA2124214C (ko)
CZ (1) CZ285915B6 (ko)
DE (1) DE69208894T2 (ko)
ES (1) ES2084373T3 (ko)
FI (1) FI113665B (ko)
HU (1) HU217795B (ko)
RU (1) RU2154671C1 (ko)
SK (1) SK279805B6 (ko)
TW (1) TW313589B (ko)
UA (1) UA39861C2 (ko)
WO (1) WO1993012235A1 (ko)
ZA (1) ZA926405B (ko)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4232468A1 (de) * 1992-09-28 1994-03-31 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung
JP4066543B2 (ja) * 1998-01-12 2008-03-26 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
JP3997631B2 (ja) 1998-01-12 2007-10-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
US6431870B1 (en) 1999-11-30 2002-08-13 Ora Metrix, Inc. Method and apparatus for generating a desired three-dimensional digital model of an orthodontic structure
US6350120B1 (en) 1999-11-30 2002-02-26 Orametrix, Inc. Method and apparatus for designing an orthodontic apparatus to provide tooth movement
US6250918B1 (en) 1999-11-30 2001-06-26 Orametrix, Inc. Method and apparatus for simulating tooth movement for an orthodontic patient
US6471512B1 (en) 1999-11-30 2002-10-29 Ora Metrix, Inc. Method and apparatus for determining and monitoring orthodontic treatment
US6540512B1 (en) 1999-11-30 2003-04-01 Orametrix, Inc. Method and apparatus for treating an orthodontic patient
AU2001259263A1 (en) * 2000-05-02 2001-11-12 Agrinomics, Llc Identification and characterization of a pagoda phenotype (pgd) in plants
DE10331291A1 (de) * 2003-07-10 2005-02-17 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
AU2006220803A1 (en) 2005-03-07 2006-09-14 Align Technology, Inc. Variations of dental aligners
US20060275731A1 (en) 2005-04-29 2006-12-07 Orthoclear Holdings, Inc. Treatment of teeth by aligners
DE102005049527B4 (de) * 2005-10-17 2013-05-08 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Serin, Gensequenz, Vektoren sowie Mikroorganismus
RU2006129690A (ru) 2006-08-16 2008-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010017082A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BRPI0816429A2 (pt) 2007-09-04 2019-09-24 Ajinomoto Kk microorganismo, e, método para a produção de um l-aminoácido.
JP5332237B2 (ja) * 2008-03-06 2013-11-06 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
EP2138585B1 (en) * 2008-03-06 2011-02-09 Ajinomoto Co., Inc. An L-cysteine producing bacterium and a method for producing L-cysteine
ES2549003T3 (es) 2008-12-31 2015-10-22 Metabolic Explorer Método para la preparación de dioles
BR112012012915B1 (pt) * 2009-11-30 2020-12-01 Ajinomoto Co., Inc. método para produção de l-cisteína, l-cistina, um derivado das mesmas, ou uma mistura das mesmas
US8911978B2 (en) 2010-07-02 2014-12-16 Metabolic Explorer Method for the preparation of hydroxy acids
DE102011075656A1 (de) 2011-05-11 2012-03-29 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystin
DE102011078481A1 (de) 2011-06-30 2013-01-03 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von natürlichem L-Cystein
DE102012208359A1 (de) 2012-05-18 2013-11-21 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure
DE102012216527A1 (de) 2012-09-17 2014-03-20 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Produktion von L-Cystein und Derivaten dieser Aminosäure
WO2014049382A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Metabolic Explorer Ethylenediamine fermentative production by a recombinant microorganism
DE102013209274A1 (de) 2013-05-17 2014-11-20 Wacker Chemie Ag Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Überproduktion von Gamma-Glutamylcystein und Derivaten dieses Dipeptids
CN113710807A (zh) 2019-02-20 2021-11-26 布拉斯科公司 用于由己糖生产含氧化合物的微生物和方法
EP3927816A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Braskem S.A. Degradation pathway for pentose and hexose sugars
US20230265473A1 (en) 2020-06-26 2023-08-24 Wacker Chemie Ag Improved cysteine-producing strains
WO2023165684A1 (de) 2022-03-01 2023-09-07 Wacker Chemie Ag Verbesserte cystein produzierende stämme

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61247392A (ja) * 1985-02-04 1986-11-04 エンジニツクス　インコ−ポレ−テツド ２種またはより多くのアミノ酸を同時に産生できる組換え微生物
US4743546A (en) * 1985-02-13 1988-05-10 Biotechnica International, Inc. Controlled gene excision
US4753883A (en) * 1986-05-07 1988-06-28 Biotechnica International, Inc. Enzyme deregulation
US4753833A (en) * 1986-09-26 1988-06-28 Fishgal Semyon I Hollow article with zigzag projections
GB8828806D0 (en) * 1988-12-09 1989-01-18 Beecham Group Plc Novel compounds
JP2967996B2 (ja) * 1989-06-06 1999-10-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―トリプトファンの製造法
US5120837A (en) * 1989-09-20 1992-06-09 The Nutrasweet Company Dna encoding phe a feedback inhibition resistant enzyme analogues

Also Published As

Publication number Publication date
AU2426892A (en) 1993-07-19
ES2084373T3 (es) 1996-05-01
CZ140694A3 (en) 1995-01-18
CN1073209A (zh) 1993-06-16
CA2124214C (en) 2002-04-02
CA2124214A1 (en) 1993-06-24
US5618716A (en) 1997-04-08
SK279805B6 (sk) 1999-04-13
AU668359B2 (en) 1996-05-02
RU2154671C1 (ru) 2000-08-20
UA39861C2 (uk) 2001-07-16
FI942711A0 (fi) 1994-06-09
HU217795B (hu) 2000-04-28
BR9206902A (pt) 1995-11-21
JP2584409B2 (ja) 1997-02-26
TW313589B (ko) 1997-08-21
FI113665B (fi) 2004-05-31
WO1993012235A1 (en) 1993-06-24
CZ285915B6 (cs) 1999-11-17
HUT69802A (en) 1995-09-28
ZA926405B (en) 1993-04-28
EP0620853B1 (en) 1996-03-06
FI942711A (fi) 1994-06-09
CN1065914C (zh) 2001-05-16
DE69208894T2 (de) 1996-07-18
HU9400796D0 (en) 1994-06-28
SK70094A3 (en) 1995-03-08
DE69208894D1 (de) 1996-04-11
JPH06510911A (ja) 1994-12-08
EP0620853A1 (en) 1994-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0132258B1 (ko) 세린 및 세린 유도생성물의 생합성 재료 및 생합성 방법
KR100275287B1 (ko) O-아세틸세린,l-시스테인및l-시스테인 유도생성물의 제조방법
JP3331472B2 (ja) 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法
JP4471402B2 (ja) 非調節スレオニンデヒドラターゼを用いて組換え微生物によるｌ−イソロイシンの生成方法
CZ66795A3 (en) Process for preparing micro-organisms for producing tryptophan and their use
US5856148A (en) Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products
Babitzke et al. The mtrAB operon of Bacillus subtilis encodes GTP cyclohydrolase I (MtrA), an enzyme involved in folic acid biosynthesis, and MtrB, a regulator of tryptophan biosynthesis
EP0908520A2 (en) Maleate isomerase gene
EP1950287B1 (de) Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
US6107093A (en) Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous genes
Kline et al. Regulation of isoleucine-valine biosynthesis in an ilvDAC deletion strain of Escherichia coli K-12
EP0286303A1 (en) DNA and its use
Miyagawa et al. Cloning of the Bacillus subtilis IMP dehydrogenase gene and its application to increased production of guanosine
US7192772B1 (en) Recombinant cells that highly express chromosomally-integrated heterologous gene
HU216653B (hu) Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására
Orser et al. The Escherichia coli proB gene corrects the proline auxotrophy of Saccharomyces cerevisiae pro1 mutants
Ricca et al. Enhanced acetohydroxy acid synthase III activity in an ilvH mutant of Escherichia coli K-12
EP0338790A2 (en) Production of homoserine and its derivatives such as threonine derivatives and methionine precursors
CN116745412A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
CN116783290A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
CN116829705A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
CN116724113A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
CN116802283A (zh) 组氨酸导致的反馈抑制得到减少的atp-prt变体及表达该变体的组氨酸生产菌株
Thorsness Regulation of isocitrate dehydrogenase and the glyoxylate bypass by protein phosphorylation
MXPA97007921A (en) Procedure for the production of l-aminoacidomediantefermentac