KR20130012328A

KR20130012328A - Ｙａｐ1 변이체 유전자를 포함하는 효모 균주의 ＨＭＦ 저항성 증가용 조성물

Info

Publication number: KR20130012328A
Application number: KR1020110073453A
Authority: KR
Inventors: 한지숙; 김대희
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-07-25
Filing date: 2011-07-25
Publication date: 2013-02-04

Abstract

본 발명은 Yap1 변이체 유전자를 포함하는 효모 균주의 HMF 저항성 증가용 조성물 에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자 또는 그 발현 단백질을 함유하는 효모 균주의 HMF(Hydroxymethylfurfural) 저항성 증가용 조성물, 상기 Yap1 변이체 유전자를 이용한 효모 균주의 HMF 저항성 증진 방법, 상기 Yap1 변이체 유전자를 이용한 HMF 저항성 효모 균주의 제조방법, 및 상기 Yap1 변이체 유전자로 형질전환된 HMF 저항성 효모 균주에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명에 따르면 Yap1 변이체 유전자를 이용하여 바이오 에탄올 생산 공정 중 목질계 바이오매스의 전처리 시 생성되는 효모의 세포성장 저해물질인 HMF에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다.

Description

Ｙａｐ1 변이체 유전자를 포함하는 효모 균주의 ＨＭＦ 저항성 증가용 조성물 {Compositions for increasing tolerance to Hydroxymethylfurfural of Yeast comprising Yap1 mutant}

본 발명은 Yap1 변이체 유전자를 포함하는 효모 균주의 HMF 저항성 증가용 조성물 에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자 또는 그 발현 단백질을 함유하는 효모 균주의 HMF(Hydroxymethylfurfural) 저항성 증가용 조성물, 상기 Yap1 변이체 유전자를 이용한 효모 균주의 HMF 저항성 증진 방법, 상기 Yap1 변이체 유전자를 이용한 HMF 저항성 효모 균주의 제조방법, 및 상기 Yap1 변이체 유전자로 형질전환된 HMF 저항성 효모 균주에 관한 것이다.

화석연료의 고갈로 인해 생물자원을 이용한 에탄올 생산이 각광받고 있다. 이는 주로 미생물의 발효과정을 이용해 생산한다. 이때 미생물의 먹이로 포도당이 사용되는데, 녹말이나 사탕수수 등의 식량을 이용하는 것이 아니라, 목질계 바이오매스를 이용해서 셀룰로오스를 만들고 이를 분리하고 분해해서 만들어진 포도당을 이용하는 과정이 주로 연구되고 있다.

목질계 바이오매스는 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스 및 리그닌으로 구성이 되어 있는데, 이 결합이 매우 단단하여 전처리 과정이 필요하다. 이 과정은 고온, 고압과 강산, 강염기를 이용해서 매우 생물체에 해로우며, 그 과정에서 만들어지는 물질 또한 세포의 성장을 저해하기 때문에, 전처리 후에 셀룰로오스만 분리하는 공정이 반드시 필요하다. 이 때 만들어지는 세포성장 저해물질은 크게 5탄당 알데히드, 페놀류 물질, 그리고 카르복실산 등으로 나뉜다.

이에, 본 발명자들은 이러한 효모의 세포성장 저해물질 중 대표적 5탄당 알데히드 물질인 HMF(Hydroxymethylfurfural)에 대한 저항성 균주를 얻기 위해서 Yap1 유전자와 그 변이체 유전자를 형질전환을 통해 과발현 시켜본 결과, 야생형 균주가 자라지 못하는 높은 농도에서도 성장함을 확인하였으며, 변이체의 경우 야행형 Yap1을 과발현 시킨 경우보다도 더 빠른 성장을 나타냄을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 효모의 세포성장 저해물질 중 대표적 5탄당 알데히드 물질인 HMF에 대한 높은 저항성을 갖는, Yap1 변이체 유전자 또는 그 발현 단백질을 함유하는 효모 균주의 HMF 저항성 증가용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 Yap1 변이체 유전자를 이용한 효모 균주의 HMF 저항성 증진 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 Yap1 변이체 유전자를 이용한 HMF 저항성 효모 균주의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 Yap1 변이체 유전자로 형질전환된 HMF 저항성 효모 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자 또는 그 발현 단백질을 함유하는 효모 균주의 HMF(Hydroxymethylfurfural) 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

상기 ‘Yap1 유전자’는 Yeast activation protein 1을 말하는 것으로, 전사조절인자(transcription factor)이며 promoter sequence 중 YRE(yap1 response element)에 결합하여 TRX2, GSH1 등 유전자의 전사를 유도(induction)한다 (Molecular Microbiology (2005) 58(5), 1454-1467). Yap1 유전자는 과산화수소나 활성산소 등 산화적 스트레스가 있는 상황에서 발현이 증가하여 효모가 스트레스에 저항하도록 만든다. 보통 상태의 Yap1은 C-말단에 Crm1이 결합해서 세포질로 나가게 되는데, 산화적 스트레스 상황에서는 C-말단에 이황화결합(disulfide bond)이 형성되어 Crm1의 결합이 억제되고 Yap1이 핵 내에 머무름에 따라서 관련 유전자들이 계속적으로 발현된다. 이를 통해서 효모는 산화적 스트레스에 대한 저항성을 갖추게 된다.

또한 산화적 스트레스 뿐만 아니라, 다른 다양한 성장 억제제에 대해서 Yap1 유전자가 없는 경우 성장이 멈추거나 감소하게 되는데, 이는 Yap1 유전자의 하위(downstream)에 다양한 유전자가 존재하고 이것들이 다양한 성장 억제제들에 대한 저항성을 갖추게 하는 것으로 여겨진다. 또한 Yap1 유전자가 과발현될 경우, 일부 성장 억제제에 대한 저항성이 향상되기도 한다. 뿐만 아니라, 이전 연구에서 Yap1의 C-말단의 아미노산 한 개에 변이를 도입해서 C620F의 변이체를 제작했더니 Diazaborines라는 산화와 관련된 강한 미생물 성장 억제 물질에 대한 저항성이 유도되었다 (Rererence : Eur. J. Biochem. 267, 4809-4816 (2000)).

이와 같은 Yap1 유전자의 산화 스트레스에 대한 연구 결과에도 불구하고, 산화와 관련된 것으로 알려진 Diazaborines과는 달리, 아직까지 그 저항 메커니즘이 밝혀지지 않은 HMF(Hydroxymethylfurfural)에 대해서는 저항성을 유도할 수 있는지는 연구된 바가 없다. 따라서 본 발명자들은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자를 이용하여 효모의 HMF에 대한 저항성을 증가시킬 수 있는지를 확인하였고, 그 결과 상기 Yap1 변이체가 Yap1 유전자에 비교하여 HMF에 대한 더 높은 저항성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 ‘HMF(Hydroxymethylfurfural)’는 미생물의 발효 공정을 이용하는 바이오 에탄올 생산 공정에서 목질계 바이오매스의 전처리 시 생성되는 5탄당 알데히드를 말하는 것으로, 에탄올 생산에 이용되는 효모 균주의 성장을 저해하는 물질로 알려져 있다.

본 발명에서는, 이러한 HMF에 대하여 저항성을 나타내는 효모 균주를 얻기 위해 효모 균주의 저항성을 증가시킬 수 있는 유전자를 탐색하게 되었으며, 산화 스트레스에 대한 저항성을 나타내는 것으로 알려진 Yap1 유전자의 변이체, 즉 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자를 이용하는 경우 HMF에 대하여 매우 높은 저항성을 부여할 수 있음을 확인하였다 (도 2 참조).

본 발명의 조성물에서, 상기 Yap1 변이체 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 Yap1 유전자의 C-말단 아미노산 한 개에 변이를 도입한 C620F의 변이체로서, 도 8에서 볼 수 있듯이 Yap1 유전자의 620번째 시스테인(Cysteine, C)이 페닐알라닌(Phenylalanine, F)으로 변이되었음을 확인할 수 있다 (도 8 참조).

본 발명의 조성물에서, 상기 Yap1 변이체 유전자는 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 Yap1 변이체 유전자는 발현벡터에 삽입되어 효모 세포에서 발현된다. 여기서, "발현벡터"란 상기 Yap1 변이체 유전자가 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따라 준비된 Yap1 변이체 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 "발현 조절 서열"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전시 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 Yap1 변이체 유전자를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Yap1 변이체 유전자의 발현 유도가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예서는, 발현벡터로서 pRS-415 vector (ATCC 87374™)를 이용하여 ADH 프로모터와 함께 Yap1 변이체 유전자를 상기 발현벡터에 삽입하여 도 1과 같은 방식으로 재조합벡터를 제작하였다. 제작된 pRS-415/Yap1 mutant 재조합벡터는 도 9에 나타내었다.

본 발명의 Yap1 변이체 유전자를 포함하는 재조합벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주세포에 도입시킬 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합벡터를 숙주세포에 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl₂) 및 열쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 pRS-415/Yap1 mutant 재조합벡터를 염화리튬과 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 효모 세포 내로 형질도입 시켰다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자를 효모 세포에 형질전환 시키는 것을 포함하는 효모 균주의 HMF 저항성 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자를 준비하는 단계; 상기 Yap1 변이체 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제조하는 단계; 및 상기 재조합벡터를 효모 세포에 형질전환 시키는 단계를 포함하는 HMF 저항성 효모 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자로 형질전환된 HMF 저항성 균주를 제공한다.

본 발명에 따른 Yap1 변이체 유전자를 효모 세포내로 형질전환 시킴으로써 HMF에 대한 저항성을 증진시킬 수 있고 또한 HMF 저항성 균주를 제조할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, Yap1 변이체가 형질전환된 효모 균주는 Yap1 이외의 다른 유전자 또는 Yap1 유전자로 형질전환된 균주에 비해 월등히 높은 HMF 저항성을 나타내었다 (도 2 참조).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 Yap1 변이체 유전자를 이용하여 바이오 에탄올 생산 공정 중 목질계 바이오매스의 전처리 시 생성되는 효모의 세포성장 저해물질인 HMF에 대한 저항성을 증진시킬 수 있다. 특히 효모 균주에서 Yap1 변이체 유전자를 과발현 시킬 경우 야생형 Yap1 유전자를 과발현 시킨 경우와 비교하여 높은 농도의 HMF에서도 성장할 수 있으므로, Yap1 변이체 유전자를 이용하여 바이오 에탄올 생산 공정에 더욱 적합한 효모 균주를 제작할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 Yap1 변이체 유전자를 발현시키기 위한 pRS-415 발현벡터 맵을 나타낸다.
도 2는 HMF가 들어 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양 40시간 후 각 농도에서 효모의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 3은 HMF가 들어 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양 85시간 후 각 농도에서 효모의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 4는 HMF가 없는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양시간에 따른 효모의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 5는 HMF가 30 mM 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양시간에 따른 효모의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 6은 HMF가 35 mM 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양시간에 따른 효모의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 7은 HMF가 40 mM 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양시간에 따른 효모의 성장을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 Yap1 변이체의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 Yap1 변이체 유전자가 삽입된 재조합벡터 맵을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

균주와 벡터

효모 균주는 실험균주로서 널리 사용되고 있는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae) BY4741 (ATCC 201388™)을 사용하였고 (YEAST VOL. 14: 115132 (1998)), 여기에 pRS-415 벡터(ATCC 87374™)를 이용해 다양한 유전자를 삽입하였다. 사용된 벡터 맵은 도 1에 나타내었다.

실시예 1. Yap1 변이체 유전자를 위한 PCR 과정

BY4741 균주의 Genomic DNA를 Template로 사용하고 모든 유전자의 제한효소 서열은 XbaI과 Xho1을 이용하였다. 사용한 유전자들은 Yap1 과 Yap1의 변이체, 그리고 효모 genome 내에서 발현될 때 promoter에 YRE를 갖는 Yap1의 타겟 유전자들로써 모두 산화적 스트레스에 대한 저항성과 연관되며, 각자 효모 내에 구체적인 역할을 하는 효소로 발현되므로 과발현 시 활성이 있다면 그것이 HMF에 대한 저항성 메커니즘에 연관되어 있다는 것을 알 수 있으며 Yap1이 과발현된 균주가 활성을 가질 때 이 유전자가 거기에 큰 역할을 하고 있음을 볼 수 있다. 각각의 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

PCR에 사용된 프라이머들은 cosmogenetech 사에서 구입하였다. 가장 큰 유전자는 Pdr3로 2931 bp이다. PCR에 사용된 각 물질의 농도 및 첨가량은 하기 표 2에 나타내었으며 PCR reagent는 모두 Solgent 사에서 구입하였다. 또한, PCR 반응은 처음에 95℃로 5분간 denaturation을 수행하였으며, 95℃에서 45초, 55℃에서 45초, 및 72℃에서 6분에 맞추어 denaturation/annealing/extension으로 30 cycle을 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 수행하였다.

실시예 2. 형질전환 균주의 제조

벡터와 인서트(insert)는 총 20 μl로 Eppendorf 사의 1.7 ml 튜브에 넣고 제한효소를 처리하였으며, 제한효소는 엔지노믹스 사의 XhoI과 Xba1을 이용하였다. 10X buffer를 2 μl, 100~300 μg/μl의 DNA (PCR 산물 + pRS-415 벡터)를 4 μl, XhoI과 XbaI 제한효소를 0.5 μl씩 넣고 나머지 13 μl은 증류수로 채웠다. Overnight 처리 후 Quagen 사의 추출키트(gel extraction kit)를 이용하여 상기 제한효소 처리된 DNA 조각을 얻어내고, 이것을 Roche사의 라이게이즈(ligase; T4 DNA Ligase recombinant form of the enzyme from T4 phage, 10481220001)를 이용해서 1시간 라이게이션(ligation)시킨 후 E. coli DH5α에 형질전환(transformation) 시켰다. LBA(Luria Bertani + Ampicillin) plate에 14시간 배양시킨 후 자란 콜로니를 따서, 2 ml 액체 LBA 배지에 10시간 정도 키운 후, Alkaline lysis (Molecular cloning, 3rd edition, CSHL press)를 이용해 플라스미드를 얻었다. 플라스미드를 염화리튬(lithium chloride)과 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 이용하여 효모세포에 형질전환 시켰다 (Gietz et al, 1995, yeast v11:355).

실시예 3. 형질전환 균주의 HMF 에 대한 저항성 확인

실시예 2에서 형질전환된 효모세포를 SC-Leu(Synthetic Complete-Leu) plate에 스프레딩(spreading)하고 30℃에서 3일간 배양한 후, 콜로니를 다른 SC-Leu plate에 스트리킹(streaking)하고 2일간 배양하였다. 스트리킹한 것을 액체 SC-Leu 배지에 1차 접종한 후 정지기까지 배양하고 2차 접종을 수행하였다. 2차 접종은 광학 밀도를 파장 600 nm에서 0.01로 맞추고, 각 배지에 각 농도에 해당하는 HMF (Hydroxymethylfurfural, Sigma-Aldrich, H40807)를 함께 넣고 성장률을 조사하였다. HMF는 1M stock을 만든 후 각 배지에 첨가했다. 2차 접종의 배지량은 총 300 μl로 96웰 플레이트에서 진행하였다. 균주마다 0, 30, 35, 40 mM로 HMF를 처리했고 0, 10, 20, 40, 60 및 85시간에 맞추어 성장률을 확인하였다.

도 2는 HMF가 들어 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양 40시간 후 각 농도에서 효모의 성장을 나타내는 그래프이다. 유전자는 pRS415 벡터를 이용했으며, ADH 프로모터를 이용해서 과발현시켰다 (도 1 참조). 성장은 600 nm 파장에서의 흡광도를 이용하였으며, 그 흡광도를 ELISA 기기(Thermo Scientific, Multiskan GO)를 사용해서 측정하였다. 유전자가 들어있지 않은 pRS415 벡터가 들어있는 효모의 성장을 음성대조군으로 HMF를 1 몰농도의 stock으로 3차 증류수에 녹여 해당하는 농도로 희석해서 사용하였다 (Control: p415-ADH vector, 나머지는 각 유전자를 p415-ADH vector에 클로닝하여 과발현시킨 균주).

각 농도에 따른 효모의 성장을 관찰한 결과, HMF의 농도 30 mM 이상에서는 Yap1와 Yap1 변이체 유전자 이외의 다른 유전자를 과발현시킨 효모 균주들은 성장이 억제된 반면, Yap1 유전자 및 Yap1 변이체를 과발현시킨 효모 균주는 높은 성장을 나타내었다. 특히 Yap1 변이체의 경우 Yap1 유전자에 비해 월등히 높은 성장률을 나타내었다.

도 3은 HMF가 들어 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양 85시간 후 각 농도에서 효모의 성장을 나타내는 그래프이다. 배양시간을 제외하고 상기 방법과 동일하게 수행하였다.

각 농도에 따른 효모의 성장을 관찰한 결과, HMF의 농도 30 mM 이상에서는 Yap1 이외의 다른 유전자를 과발현시킨 효모 균주들은 성장이 억제된 반면, Yap1 유전자 및 Yap1 변이체를 과발현시킨 효모 균주는 높은 성장을 나타내었다. 특히 Yap1 변이체의 경우 Yap1 유전자에 비해 월등히 높은 성장률을 나타내었다.

도 4는 HMF가 없는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양시간에 따른 효모의 성장을 나타내는 그래프이다. 도 4에서, HMF가 없는 모든 경우에서 균주의 성장에는 저해가 일어나지 않음을 확인하였다.

도 5 내지 도 7은 각각 HMF가 30 mM, 35 mM 및 40 mM 있는 배지에서 각각의 유전자를 과발현시켰을 때, 배양시간에 따른 효모의 성장을 나타내는 그래프이다. 도 5 내지 도 7에서와 같이, Yap1와 Yap1 변이체 유전자 이외의 다른 유전자를 과발현시킨 효모 균주들은 성장이 억제된 반면, Yap1 유전자 및 Yap1 변이체를 과발현시킨 효모 균주는 높은 성장을 나타내었다. 특히 Yap1 변이체의 경우 Yap1 유전자에 비해 월등히 높은 성장률을 나타내었으며, 40 mM의 고농도에서는 HMF에 의한 저항성에서 Yap1 유전자와 Yap1 변이체 유전자의 HMF에 대한 저항성의 차이는 약 3배 정도까지 크게 나타났다.

결론

일반적으로 저해제(inhibitor)에 대한 저항성은 대조군에 비해 높은 성장률을 보이는 것으로 알 수 있다. 도 2에서, 동일한 배양시간 동안 HMF의 농도가 높아짐에 따라 다른 유전자들을 과발현시키거나 공벡터를 과발현시킨 대조군은 거의 자라지 못하는데 비해, Yap1 유전자나 Yap1 변이체를 과발현시킨 균주는 성장 저해 정도가 적고, 특히 Yap1 변이체의 경우는 성장률이 매우 높은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 Yap1 유전자가 HMF 존재하에서 성장에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있으며, 본 발명에 따른 Yap1 변이체를 이용하는 경우 Yap1 유전자에 비해 월등히 높은 성장률을 나타낼 수 있다.

Yap1은 원래 산화 스트레스(oxidative stress) 시에 핵 내에 머물게 되면서 관련 유전자를 발현시켜 스트레스에 저항하게 하지만, 아직 그 저항 메커니즘이 알려지지 않은 HMF에 대해서 저항성을 유발하는 효과를 나타낼 수 있음을 본 발명에서 처음으로 확인하였다. 이러한 결과가 나타내는 의미는, 기존에는 Diazaborine과 같은 다른 저해제에 대해서 Yap1 변이체가 대조군에 비해 더 높은 성장을 나타내는 것에 대한 보고가 있었지만, Yap1 변이체가 HMF에 대해서도 저항성이 있는지를 확인한 것은 본 발명이 처음이므로, 본 발명은 바이오 에탄올 산업 분야에서 목질계 바이오매스 처리 시 발생하는 HMF에 대하여 높은 저항성을 나타내는 균주를 생산할 수 있는 기술로서 산업적 이용가치가 높은 것이다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Compositions for increasing tolerance to Hydroxymethylfurfural of Yeast comprising Yap1 mutant <130> PN110378 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Yap1 mutant gene <400> 1 atgagtgtgt ctaccgccaa gaggtcgctg gatgtcgttt ctccgggttc attagcggag 60 tttgagggtt caaaatctcg tcacgatgaa atagaaaatg aacatagacg tactggtaca 120 cgtgatggcg aggatagcga gcaaccgaag aagaagggta gcaaaactag caaaaagcaa 180 gatttggatc ctgaaactaa gcagaagagg actgcccaaa atcgggccgc tcaaagagct 240 tttagggaac gtaaggagag gaagatgaag gaattggaga agaaggtaca aagtttagag 300 agtattcagc agcaaaatga agtggaagct acttttttga gggaccagtt aatcactctg 360 gtgaatgagt taaaaaaata tagaccagag acaagaaatg actcaaaagt gctggaatat 420 ttagcaaggc gagatcctaa tttgcatttt tcaaaaaata acgttaacca cagcaatagc 480 gagccaattg acacacccaa tgatgacata caagaaaatg ttaaacaaaa gatgaatttc 540 acgtttcaat atccgcttga taacgacaac gacaacgaca acagtaaaaa tgtggggaaa 600 caattacctt caccaaatga tccaagtcat 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ttgactacga catgtttttt 1500 agagattcat cgaaggaagg taacaattta tttggagagt ttttagagga tgacgatgat 1560 gacaaaaaag ccgctaatat gtcagacgat gagtcaagtt taatcaagaa ccagttaatt 1620 aacgaagaac cagagcttcc gaaacaatat ctacaatcgg taccaggaaa tgaaagcgaa 1680 atctcacaaa aaaatggcag tagtttacag aatgctgaca aaatcaataa tggcaatgat 1740 aacgataatg ataatgatgt cgttccatct aaggaaggct ctttactaag gtgttcggaa 1800 atttgggata gaataacaac acatccgaaa tactcagata ttgatgtcga tggtttattt 1860 tccgagctaa tggcaaaggc aaaatgttca gaaagagggg ttgtcatcaa tgcagaagac 1920 gttcaattag ctttgaataa gcatatgaac taa 1953 <210> 2 <211> 650 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yap1 mutant gene <400> 2 Met Ser Val Ser Thr Ala Lys Arg Ser Leu Asp Val Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ala Glu Phe Glu Gly Ser Lys Ser Arg His Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Asn Glu His Arg Arg Thr Gly Thr Arg Asp Gly Glu Asp Ser Glu Gln 35 40 45 Pro Lys Lys Lys Gly Ser Lys Thr Ser Lys Lys Gln Asp Leu Asp Pro 50 55 60 Glu Thr Lys Gln Lys Arg Thr Ala Gln Asn Arg Ala Ala Gln Arg Ala 65 70 75 80 Phe Arg Glu Arg Lys Glu Arg Lys Met Lys Glu Leu Glu Lys Lys Val 85 90 95 Gln Ser Leu Glu Ser Ile Gln Gln Gln Asn Glu Val Glu Ala Thr Phe 100 105 110 Leu Arg Asp Gln Leu Ile Thr Leu Val Asn Glu Leu Lys Lys Tyr Arg 115 120 125 Pro Glu Thr Arg Asn Asp Ser Lys Val Leu Glu Tyr Leu Ala Arg Arg 130 135 140 Asp Pro Asn Leu His Phe Ser Lys Asn Asn Val Asn His Ser Asn Ser 145 150 155 160 Glu Pro Ile Asp Thr Pro Asn Asp Asp Ile Gln Glu Asn Val Lys Gln 165 170 175 Lys Met Asn Phe Thr Phe Gln Tyr Pro Leu Asp Asn Asp Asn Asp Asn 180 185 190 Asp Asn Ser Lys Asn Val Gly Lys Gln Leu Pro Ser Pro Asn Asp Pro 195 200 205 Ser His Ser Ala Pro Met Pro Ile Asn Gln Thr Gln Lys Lys Leu Ser 210 215 220 Asp Ala Thr Asp Ser Ser Ser Ala Thr Leu Asp Ser Leu Ser Asn Ser 225 230 235 240 Asn Asp Val Leu Asn Asn Thr Pro Asn Ser Ser Thr Ser Met Asp Trp 245 250 255 Leu Asp Asn Val Ile Tyr Thr Asn Arg Phe Val Ser Gly Asp Asp Gly 260 265 270 Ser Asn Ser Lys Thr Lys Asn Leu Asp Ser Asn Met Phe Ser Asn Asp 275 280 285 Phe Asn Phe Glu Asn Gln Phe Asp Glu Gln Val Ser Glu Phe Cys Ser 290 295 300 Lys Met Asn Gln Val Cys Gly Thr Arg Gln Cys Pro Ile Pro Lys Lys 305 310 315 320 Pro Ile Ser Ala Leu Asp Lys Glu Val Phe Ala Ser Ser Ser Ile Leu 325 330 335 Ser Ser Asn Ser Pro Ala Leu Thr Asn Thr Trp Glu Ser His Ser Asn 340 345 350 Ile Thr Asp Asn Thr Pro Ala Asn Val Ile Ala Thr Asp Ala Thr Lys 355 360 365 Tyr Glu Asn Ser Phe Ser Gly Phe Gly Arg Leu Gly Phe Asp Met Ser 370 375 380 Ala Asn His Tyr Val Val Asn Asp Asn Ser Thr Gly Ser Thr Asp Ser 385 390 395 400 Thr Gly Ser Thr Gly Asn Lys Asn Lys Lys Asn Asn Asn Asn Ser Asp 405 410 415 Asp Val Leu Pro Phe Ile Ser Glu Ser Pro Phe Asp Met Asn Gln Val 420 425 430 Thr Asn Phe Phe Ser Pro Gly Ser Thr Gly Ile Gly Asn Asn Ala Ala 435 440 445 Ser Asn Thr Asn Pro Ser Leu Leu Gln Ser Ser Lys Glu Asp Ile Pro 450 455 460 Phe Ile Asn Ala Asn Leu Ala Phe Pro Asp Asp Asn Ser Thr Asn Ile 465 470 475 480 Gln Leu Gln Pro Phe Ser Glu Ser Gln Ser Gln Asn Lys Phe Asp Tyr 485 490 495 Asp Met Phe Phe Arg Asp Ser Ser Lys Glu Gly Asn Asn Leu Phe Gly 500 505 510 Glu Phe Leu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Lys Lys Ala Ala Asn Met Ser 515 520 525 Asp Asp Glu Ser Ser Leu Ile Lys Asn Gln Leu Ile Asn Glu Glu Pro 530 535 540 Glu Leu Pro Lys Gln Tyr Leu Gln Ser Val Pro Gly Asn Glu Ser Glu 545 550 555 560 Ile Ser Gln Lys Asn Gly Ser Ser Leu Gln Asn Ala Asp Lys Ile Asn 565 570 575 Asn Gly Asn Asp Asn Asp Asn Asp Asn Asp Val Val Pro Ser Lys Glu 580 585 590 Gly Ser Leu Leu Arg Cys Ser Glu Ile Trp Asp Arg Ile Thr Thr His 595 600 605 Pro Lys Tyr Ser Asp Ile Asp Val Asp Gly Leu Phe Ser Glu Leu Met 610 615 620 Ala Lys Ala Lys Cys Ser Glu Arg Gly Val Val Ile Asn Ala Glu Asp 625 630 635 640 Val Gln Leu Ala Leu Asn Lys His Met Asn 645 650 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Yap1 mutant <400> 3 gatgtcgatg gtttattttc cgagctaatg gc 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer for Yap1 mutant <400> 4 gccattagct cggaaaataa accatcgaca tc 32

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자 또는 그 발현 단백질을 함유하는 효모 균주의 HMF(Hydroxymethylfurfural) 저항성 증가용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 Yap1 변이체 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 효모 균주의 HMF 저항성 증가용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 Yap1 변이체 유전자는 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 효모 균주의 HMF 저항성 증가용 조성물.
서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자를 효모 세포에 형질전환 시키는 것을 포함하는 효모 균주의 HMF 저항성 증진 방법.
서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자를 준비하는 단계;
상기 Yap1 변이체 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합벡터를 효모 세포에 형질전환 시키는 단계를 포함하는 HMF 저항성 효모 균주의 제조방법.
서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 Yap1 변이체 유전자로 형질전환된 HMF 저항성 균주.