CN116046947B - 一种德谷胰岛素中残留赖氨酰内切酶的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域,具体讲,涉及一种德谷胰岛素中残留赖氨酰内切酶的检测方法。本发明的方法可以根据需要调整对照样品中Lys‑C酶浓度限度,进而简便、稳定且准确的判断样品中Lys‑C酶是否超过指定限度。本发明检测方法的灵敏度高、稳定性高,且简单、易于实施。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体讲,涉及一种德谷胰岛素中残留赖氨酰内切酶的检测方法。
背景技术
赖氨酰特异性内切酶(Lysyl endopeptidase,EC3.4.21.50)又称赖氨酰肽链内切酶、无色杆菌蛋白酶I、赖氨酸内肽酶、赖氨酰内切酶、赖氨酸C端内切酶、Lys-C内切酶,是一种丝氨酸蛋白酶,最初由Masaki等人从土壤细菌中发现并分离得到的。赖氨酰肽链内切酶具有高度特异性,可特异性切割肽链中赖氨酸残基和S-氨乙基半胱氨酸残基羧基端的肽键。
根据德谷胰岛素第29位为Lys的特点,充分利用Lys-C酶特异性高、成本低的优势,针对德谷胰岛素设计了包含Lys-C酶酶切位点的重组构建体。上述构建体在纯化后,经过Lys-C酶酶切等一系列反应,最终得到德谷胰岛素。因此,上述方法制备德谷胰岛素中会有一定量的Lys-C酶残留,故需要对其残留浓度进行检测,确保Lys-C酶残留量控制在合理范围内。而经过纯化后的德谷胰岛素中,其Lys-C酶含量非常低。如何能够准确检测样品中Lys-C酶残留在指定的限度内,是亟需解决的问题。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明通过大量的研究,提供了一种德谷胰岛素中残留赖氨酰内切酶的检测方法,本发明的检测方法稳定可靠,灵敏度高,且方法简单、易于实施。
由于经过纯化的胰岛素或其类似物样品,其赖氨酰内切酶含量相对较低。而常规的赖氨酰内切酶底物Lys-PNA,是通过检测酶切底物吸光度确定酶活,而酶切后该酶切底物吸光度只有在一定酶浓度范围内,才能与酶活成比例,且灵敏度有限,其无法适用于低浓度条件的Lys-C酶残留量的检测。因此,本发明申请人经过广泛的筛选和深入的研究后发现,HGEGTFTSDLSKX尤为适合作为底物肽段,其经Lys-C酶切后得到的酶切肽段HGEGTFTSDLSK(简称“肽段H”),经高效液相在色谱波长214nm分析检测,该肽段相较其他肽段紫外显著更强。而比较发现,该肽段即为艾塞那肽的起始肽段,因此,本发明申请人选择使用艾塞那肽作为底物使用。并基于该底物发现的进一步应用研究,本发明申请人研发得到了本发明的胰岛素或其类似物中残留Lys-C酶含量的检测方法。实验也表明,选用艾塞那肽作为底物的本发明的检测方法,当酶切比例为1:50,000时,酶切肽段在214 nm仍有较强的吸收,且峰型良好、稳定,能稳定、准确的呈现检测结果。
艾塞那肽是一种新型糖尿病治疗药物,由美国礼来公司研发的降血糖素类似物,是肠促胰素类似物家族的第一个成员,经人工合成的多肽类化合物,其结构明确、稳定,且来源广泛。
经过深入研究验证,本发明申请人发现上述方法适用于几乎所有重组胰岛素或其类似物中Lys-C酶残留量的检测。但在进一步的研究中,申请人发现将该方法应用于德谷胰岛素时,其结果却出现一定的偏差,分析原因,或许因为德谷胰岛素不同于其他胰岛素类似物,其具备一条脂肪酸侧链,该侧链结构存在导致其对Lys-C酶活性产生一定影响。为了解决该技术问题,本申请发明人经过大量研究发现,在反应体系中,加入氯化钙可以解决这一问题。
因此,本发明的第一方面提出了一种德谷胰岛素中残留赖氨酰内切酶的检测方法,采用赖氨酰内切酶的底物分别与待测样品和阳性对照品进行酶切反应,通过比较两个酶切产物在高效液相色谱分析中的酶切肽段峰面积,判定待测品中残留赖氨酰内切酶的含量。
具体的,本发明的检测方法至少包括以下步骤:
S1、分别配制底物溶液、Lys-C酶阳性对照品溶液、稀释液、氯化钙溶液和待测样品溶液;
S2、取Lys-C酶阳性对照品溶液、底物溶液、稀释液和氯化钙溶液,按比例混合后,进行酶切反应,反应结束后终止反应,得到阳性对照品反应液;
S3、取超纯水、底物溶液、待测样品溶液、稀释液和氯化钙溶液,混合后在与S2相同条件下进行酶切反应,反应结束后终止反应,得到待测样品反应液;
其中,超纯水的体积等于步骤S2中Lys-C酶阳性对照品溶液的体积,S3中待测样品溶液体积与稀释液体积之和等于步骤S2中稀释液的体积;步骤S2和S3中底物溶液用量相同;
S4、对阳性对照品反应液和待测样品反应液分别进行高效液相色谱检测,比较酶切肽段的峰面积,判断待测样品中赖氨酰内切酶残留是否超过阳性对照品溶液的浓度。
作为本发明一种优选的技术方案,S2、S3中,酶切反应的条件为35 ~ 40℃条件下反应5 ~ 15小时。进一步为在36 ~ 38℃条件下反应5 ~ 10小时,更优选在37℃水浴反应6小时。
作为本发明一种优选的技术方案,S2中,阳性对照品溶液中的赖氨酰内切酶标准品和底物的质量比40000 ~ 55000,优选为1:50000。
作为本发明一种优选的技术方案,S2中,底物溶液的浓度为0.5 ~ 2 mg/mL,优选为0.75 ~ 1.5 mg/mL,更优选为1 mg/mL。
作为本发明一种优选的技术方案,S2中,Lys-C酶阳性对照品溶液中 Lys-C酶的浓度为0.2 ~ 1 μg/mL,优选为0.25 ~ 0.75 μg/mL,更优选为0.5 μg/mL。
作为本发明一种优选的技术方案,S2、S3中,氯化钙溶液的浓度为20 ~ 80 mmol/L,优选为30 ~ 60 mmol/L,更优选为44 mmol/L。
作为本发明一种优选的技术方案,S3中,待测样品溶液中德谷胰岛素的浓度为10~ 30 mg/mL,优选为15 ~ 25 mg/mL,更优选为20 mg/mL。
作为本发明一种优选的技术方案,S2、S3中,氯化钙溶液和底物溶液的体积比为1:10。
作为本发明一种优选的技术方案,阳性对照品溶液、底物溶液、稀释液的体积比为10:250:265。
作为本发明一种优选的技术方案,超纯水、底物溶液、待测样品溶液和稀释液的体积比为10:250:250:15。
作为本发明一种优选的技术方案,S2中,阳性对照品溶液、底物溶液、稀释液的体积分别为10 μL、250μL、265 μL。
作为本发明一种优选的技术方案,S3中,超纯水、底物溶液、待测样品溶液和稀释液的体积分别为10 μL、250μL、250μL、15 μL。
作为本发明一种优选的技术方案,S2和S3中均通过加入10μL的1.5 mol/L醋酸溶液终止反应。
作为本发明一种优选的技术方案,底物溶液和待测样品溶液均采用稀释液配制;所述稀释液为0.05 mol/L 的Tirs-HCl缓冲液,pH为7.9 ~ 8.1,优选为8.0。
作为本发明一种优选的技术方案,Lys-C酶阳性对照品溶液中 Lys-C酶的浓度为A,其在S2和S3中用量分别为Va,待测样品中胰岛素或其类似物的浓度为B,其在S2和S3中用量分别为Vb,则在S4中,根据酶切肽段峰面积的比较,判断待测样品中Lys-C酶的含量是否超过检测限(A×Va)/(B×Vb)。
作为本发明一种优选的技术方案,高效液相检测的条件为:
色谱柱选自C18反相色谱柱;
流动相:流动相A为0.1%TFA的水溶液,流动相B为含有0.1%TFA的乙腈;
流速:1.0 mL/min;
柱温:50℃;
检测波长:214 nm。
本发明的技术方案至少具有以下技术效果:
本发明检测方法的灵敏度高,赖氨酰内切酶与底物的质量比达1:50,000时也可检出。
本发明的检测方法稳定性高、且方法简单、易于实施。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施;显然,说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
以下实施例中采用的试剂均为市售。
实施例1:德谷胰岛素中Lys-C酶残留检测方法
S1、溶液配制:
(1)稀释液(0.05 mol/L Tirs-HCl缓冲液,pH8.0):称取Tris 0.606 g,溶于80 mL超纯水中,用盐酸调节pH至8.0±0.1,用超纯水定容至100mL,混匀,即得。
(2)1.5 mol/L醋酸溶液:量取醋酸1.0mL,加10.7 mL超纯水混匀,即得。
(3)氯化钙溶液(44 mmol/L):取氯化钙0.488g,溶于80ml超纯水中,用超纯水定容至100 mL,混匀,即得。
(4)底物(艾塞那肽)溶液:取艾塞那肽适量,用稀释液溶解并稀释至1 mg/mL,混匀,即得。
(5)Lys-C酶阳性对照品溶液(0.5 μg/mL):取Lys-C酶,用超纯水溶解,浓度0.5 μg/mL。
(6)德谷胰岛素待测样品溶液(20 mg/mL):取德谷胰岛素待测样品适量,精密称定,用稀释液溶解并稀释至20 mg/mL,混匀,即得。
(7)德谷胰岛素纯品溶液(20 mg/mL):取德谷胰岛素纯品适量,精密称定,用稀释液溶解并稀释至20 mg/mL,混匀,即得。
S2、阳性对照品溶液酶切反应:
取10 μL的Lys-C酶阳性对照品溶液、250 μL的底物(艾塞那肽)溶液和265μL的稀释液、25 μL的氯化钙溶液混合均匀,置于37℃水浴反应6小时;反应结束后,加入10 μL的醋酸溶液(1.5 mol/L),终止反应。
S3、系统适应的纯品溶液酶切反应:
取10 μL的超纯水、250 μL的底物(艾塞那肽)溶液、250 μL的德谷胰岛素纯品溶液、25μL的氯化钙溶液和15 μL的稀释液,混合均匀,置于37℃水浴反应6 小时;反应结束后,加入10 μL的醋酸溶液(1.5 mol/L),终止反应。
S4、将S2、S3中终止反应后的反应液分别进行高效液相检测,检测酶切肽段H在214nm的色谱峰面积,色谱条件具体为:
以WelchUltimate ® XB-C18(4.6 × 250 mm,5 μm,300Å)反相色谱柱;以0.1%TFA的水溶液作为流动相A,0.1%TFA的乙腈溶液作为流动相B,流速为1.0 mL/min,柱温50℃,检测波长为214 nm。
以S2、S3终止反应后的反应液按照上述方法进行检测(重复三次),验证方法可行性,结果如表1所示:
表1
如表1的重复结果显示,阳性对照溶液与系统适应用纯品溶液中,酶解肽段H峰的面积基本相同,且检测结果稳定可靠;两者的差异非常小;且多次重复,结果稳定。而且,酶解肽段H与底物、德谷胰岛素等分离度良好,不存在混峰情况。
S5、待测样品反应液的酶切反应:取10 μL的超纯水、250 μL的底物(艾塞那肽)溶液、250 μL的德谷胰岛素待测样品溶液、25 μL的氯化钙溶液和15 μL的稀释液,混合均匀,置于37℃水浴反应6 h;反应结束后,加入10μL的醋酸溶液(1.5 mol/L),终止反应。
同样按照S4中的高效液相方法,检测经过纯化的德谷胰岛素待测样品溶液。根据检测结果的色谱图可知,申请人纯化制备的德谷胰岛素样品中未检出肽段H峰,说明其Lys-C酶含量远低于限定量。
实验表明,本发明的检测方法可以准确反应样品中Lys-C酶的残留量。按照本实施例检测方法,低于对照峰面积,说明样品中,Lys-C酶在每g样品中含量低于1 μg。
对比例1:
S1、按照实施例1的方法进行溶液配制:
S2、阳性对照品溶液酶切反应:
取10 μL的Lys-C酶阳性对照品溶液、250 μL的底物(艾塞那肽)溶液和250μL的稀释液混合均匀,置于37℃水浴反应6 小时;反应结束后,加入10 μL的醋酸溶液(1.5 mol/L),终止反应。
S3、系统适应的纯品溶液酶切反应:
取10 μL的Lys-C酶对照品溶液、250 μL的底物(艾塞那肽)溶液和250μL的德谷胰岛素纯品溶液,置于37℃水浴反应6 小时;反应结束后,加入10 μL的醋酸溶液(1.5 mol/L),终止反应。
S4、将S2、S3终止反应后的反应液分别进行高效液相检测,检测肽段H在214 nm的色谱峰面积,色谱条件具体为:
以WelchUltimate ® XB-C18(4.6×250 mm,5 μm,300Å)反相色谱柱;以0.1%TFA-水溶液作为流动相A,0.1%TFA-乙腈溶液作为流动相B,流速为每分钟1.0 mL,柱温50℃,检测波长为214 nm。
以S2、S3终止反应后的反应液按照上述方法进行检测(重复三次),验证方法可行性,结果如表2所示:
表2
由表2实验结果可知,原方法用于德谷胰岛素的检测时,系统适应性溶液中数值较阳性对照差异较大,且批次间结果差异较大。
以上所述仅是本发明的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种德谷胰岛素中残留赖氨酰内切酶的检测方法,其特征在于,所述检测方法至少包括以下步骤:
S1、分别配制底物溶液、Lys-C酶阳性对照品溶液、稀释液、氯化钙溶液和待测样品溶液;所述底物为艾塞那肽;
S2、取所述Lys-C酶阳性对照品溶液、底物溶液、稀释液和氯化钙溶液,按比例混合后,进行酶切反应,反应结束后终止反应,得到阳性对照品反应液;所述Lys-C酶阳性对照品溶液中的赖氨酰内切酶标准品和所述底物的质量比1:40000 ~ 55000;
所述底物溶液的浓度为0.5 ~ 2mg/mL,所述Lys-C酶阳性对照品溶液中Lys-C酶的浓度为0.2 ~ 1 μg/mL,氯化钙溶液的浓度为20 ~ 80 mmol/L,所述氯化钙溶液和所述底物溶液的体积比为1:10;
S3、取超纯水、所述底物溶液、待测样品溶液、稀释液和氯化钙溶液,混合后在与S2相同条件下进行酶切反应,反应结束后终止反应,得到待测样品反应液;
氯化钙溶液的浓度为20 ~ 80 mmol/L;所述待测样品溶液中德谷胰岛素的浓度为10 ~30 mg/mL;所述氯化钙溶液和所述底物溶液的体积比为1:10;
其中,所述超纯水的体积等于S2中所述Lys-C酶阳性对照品溶液的体积,所述待测样品溶液体积与稀释液体积之和等于S2中所述稀释液的体积;
S2和S3中底物溶液用量相同;
所述底物溶液和所述待测样品溶液均采用稀释液配制;所述稀释液为Tirs-HCl缓冲液;
S4、对所述阳性对照品反应液和所述待测样品反应液分别进行高效液相色谱检测,比较酶切肽段HGEGTFTSDLSK的峰面积,判断所述待测样品中赖氨酰内切酶残留是否超过所述Lys-C酶阳性对照品溶液的浓度;所述高效液相色谱检测的条件为:
色谱柱选自C18反相色谱柱,规格:4.6 × 250 mm,5 μm,300Å;
流动相:流动相A为0.1%TFA的水溶液,流动相B为含有0.1%TFA的乙腈;流速:1.0 mL/min;柱温:50℃;检测波长:214 nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,S2、S3中,所述酶切反应的条件为35 ~40℃条件下反应5 ~ 15小时。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,S2中,所述Lys-C酶阳性对照品溶液中的赖氨酰内切酶标准品和所述底物的质量比1:50000。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,S2中,所述底物溶液的浓度为1 mg/mL,所述Lys-C酶阳性对照品溶液中Lys-C酶的浓度为0.5 μg/mL,氯化钙溶液的浓度为44mmol/L,
S3中,所述待测样品溶液中德谷胰岛素的浓度为20 mg/mL。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,
S2中,所述Lys-C酶阳性对照品溶液、所述底物溶液、所述稀释液的体积比为10:250:265;
S3中,所述超纯水、所述底物溶液、所述待测样品溶液和稀释液的体积比为10:250:250:15。
6.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,S2中,所述Lys-C酶阳性对照品溶液、所述底物溶液、所述稀释液的体积分别为10 μL、250 μL、265 μL;
S3中,所述超纯水、所述底物溶液、所述待测样品溶液和稀释液的体积分别为10 μL、250 μL、250 μL、15 μL。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,S2和S3中均通过加入10 μL的1.5mol/L醋酸溶液终止反应。
8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述稀释液为0.05 mol/L 的Tirs-HCl缓冲液,pH为7.5 ~ 8.5。
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