CN105531285B

CN105531285B - 三型金属蛋白酶(timp-3)组织抑制剂的变体、组合物和方法

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Publication number: CN105531285B
Application number: CN201480014899.0A
Authority: CN
Inventors: J.孙; J.C.奥奈尔; R.R.克彻姆; R.I.赫希特; E.J.贝罗斯基; M.L.迈克尔斯
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: US20160031969A1; MX2015012891A; AU2023254952A1; JP2022115948A; TWI733138B; JP2024095792A; EA034200B1; EA201591764A1; JP2024001144A; EP2970407A2; US20190085054A1; CN111499733A; TW201726725A; KR102258564B1; AP2015008729A0; BR112015022491A2; AU2021269437A1; JP2020074783A; AU2014236683A1; CL2015002663A1

Abstract

本发明公开TIMP‑3突变蛋白、变体和衍生物，编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法。

Description

三型金属蛋白酶(TIMP-3)组织抑制剂的变体、组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请主张2013年3月14日提交的美国临时申请号61/782,613； 2013年3月15日提交的美国临时申请号61/798,160；2013年3月18 日提交的美国临时申请号61/802,988和2014年2月17日提交的美国临时申请号61/940,673的权益，将所述申请以引用的方式整体并入本文。

对序列表的引用

本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表作为2014年3 月11日创建的标题为A-1827WOPCT_SL31314的文件提供，其大小是306KB。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本发明一般涉及金属蛋白酶抑制剂。具体来讲，本发明涉及金属蛋白酶3（“TIMP-3”)的组织抑制剂和新颖、有用的变体、突变蛋白及其衍生物。

发明背景

结缔组织和关节软骨通过胞外基质合成和降解的相对作用维持动态平衡。基质降解主要是通过金属蛋白酶的酶促作用造成的，包括基质金属蛋白酶(MMP)和具有凝血栓蛋白基序的去整合素-金属蛋白酶(ADAMTS)。虽然这些酶在许多自然过程(包括发育、形态形成、骨重塑、创伤愈合和血管生成)中是重要的，但是导致酶水平升高的这些酶的失调被认为在结缔组织降解性疾病(包括类风湿性关节炎和骨关节炎)中以及在癌症和心血管病状中发挥不利作用。

金属蛋白酶的内源性抑制剂包括血浆α2-巨球蛋白和金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)，其中有四种已知在人类基因组中编码。TIMP-3 抑制所有主要的软骨降解金属蛋白酶，有多重证明表明它保护软骨。向软骨外植体添加所述蛋白质预防细胞因子诱导的降解，并且关节内注射减少骨关节炎大鼠内侧半月板损伤模型中的软骨损伤。

MMP的失调还出现充血性心力衰竭中并且被认为在众多促炎症反应过程中发挥作用。然而，作为MMP活性的治疗抑制剂开发 TIMP-3已经受到重组蛋白质生产以及TIMP-3重组形式半衰期短的挑战所阻碍。因此，本领域需要显示良好的生产、纯化和药动学/药效学性质的形式的TIMP-3。

附图简述

图1呈现天然的全长人TIMP-3和突变形式的全长人TIMP-3的比对，其中字母“X”已经置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列有下划线；因此其他信号序列可以被置换，如本文所述。

图2呈现天然的全长人TIMP-3，和某些氨基酸置换已经完成的 TIMP-3变体的比对。呈现信号序列并且对于天然的全长TIMP-3序列加以下划线以保持编号的一致性；其他信号序列可以因此置换，如本文所述。

图3呈现二维多肽图像，其中氨基酸经排列以确定包含TIMP-3 的N-结构域(残基23-143)和C-结构域(144-211)的那些残基、以及形成二硫键的半胱氨酸位置。

图4呈现天然的人N末端TIMP3和突变形式的人N末端TIMP3 的比对，其中字母“X”已经置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列加以下划线；因此其他信号序列可以被置换，如本文所述。设想在成熟形式的N末端TIMP-3中的某些置换，并且在本文中表示为“n#m”，其中“n”表示TIMP-3的天然的N末端结构域中的氨基酸，“#”表示氨基酸残基数目，且“m”表示已被置换的氨基酸(“-”表示氨基酸已缺失)。因此，例如，“K45I”指示在氨基酸45处的赖氨酸(K)已被异亮氨酸(I)置换。M67缺失通过M67-表示。用一对甘氨酸置换残基 71-77通过Y70-GG-H78表示。本文中示例的突变形式的人TIMP-3 包括以下突变(单独或组合)：R43F、K45I、K45T、K53T、E54Y、K65T、 M67-、K68T、K68I、Y70-GG-H78、H78W。突变的特定组合包括 K45I、K53T、E54Y、K65T、M67-、K68T；K45I、K53T、E54Y、 M67-、K68I；K45I、K53T、K65T、M67-、K68T；K45I、K53T、 M67-、K68I；K45I、K53T、M67-、K68I、H78W；K45I、K65T、K68I；K45I、K65T、M67-、K68T；K45I、K65T、M67-、K68T、H78W； K45I、M67-、K68I、H78W；K45I、M67-、K68T；K45T、K65T、 M67-、K68I；K45T、K65T、M67-、K68T；K53T、E54Y；K53T、 H78W；R43F、K45I、K65T、K68I。

图5呈现天然的人N末端TlMP3和突变形式的人N末端TIMP3 的比对，其中字母“X”已被置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列加以下划线；因此其他信号序列可以被置换，如本文所述。设想在 N末端TIMP-3的成熟形式中的某些置换，并且在本文中表示为“n#m”，其中“n”表示TIMP-3的天然的N末端结构域中的氨基酸，“#”表示氨基酸残基数目，且“m”表示已被置换的氨基酸（“-”表示氨基酸已缺失)。因此，例如，“K45E”指示在氨基酸45处的赖氨酸(K)已被谷氨酰胺(E)置换。本文中示例的突变形式的人TIMP-3包括以下突变 (单独或组合)：T25G；T25H；T25K；T25P；T25R；T25S；T25W； C26A；S27V；S27A；P28A；P28D；P28L；P28S；S29I；H30A；P31A； Q32A；F35A；C36A；N37A；D39A；V41A；142A；R43A；R43E； R43T；K45E；V46A；G48A；G48S；K49S；K49E；L51E；L51T； K53D；E54S；P56N；L60I；V61Q；T63E；T74E；H78D；H78E； Q80E；G116T；C118A；N119D；C143A；和144N-。特定的突变组合包括：S27V S29I；V46AG48S K49E L51E K53D E54S P56N L60I V61Q G116T N119D；C26A C118A；C36A C143A；K45E K49E；K45E K49S；K45E Q80E；K45E T63E；K45E T63E H78E；K45E T63E H78E Q80E；L5l T T74E H78D；R43E T74E H78D Q80E；R43T T74E H78D Q80E；T63E H78D；T63E H78E；T63E H78E Q80E；T63E T74E H78D； T63E T74E H78E；T74E H78D Q80E；T74E H78E Q80E；Y70-GG-78H。

图6呈现天然TIMP-2和天然TIMP-3的比对。相应残基中的氨基酸的同一性由序列下面的星号标明。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQ ID NO：2中所示的TIMP-3的成熟区有至少95％同一性的成熟区，具有至少一个突变，所述突变选自由以下组成的组：K45E；K45N；K45S；V47T；K49N；K49E；K49S；K50N；L51T；L51N；V52T；K53T；P56N；F57N；G58T；T63E；T63N； K65T；K65N；M67T；K68S；T74E；K75N；P77T；H78D；H78E； H78N；Q80E；Q80T；K94N；E96T；E96N；V97N；N98T；K99T； D110N；K112T；Q126N；K133S；R138T；R138N；H140T；T158N； K160T；T166N；M168T；G173T；H181N；A183T；R186N；R186Q、 R186E、K188T；K188Q、K188E、P201N；K203T；1205F、I205Y、 A208G、A208V和A208Y。

在本发明的另一个实施方案中，提供一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQ ID NO：2中所示的TIMP-3的成熟区有至少95％同一性的成熟区，具有突变F57N和至少一个其他突变，其中所述突变是在TIMP-3的一个或多个K残基处的置换。在本发明的又一个方面中，所述其他突变向氨基酸序列中引入N-连接的糖基化位点。

本发明中还涉及一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与SEQ IDNO：2中所示的TIMP-3的成熟区有至少90％同一性的阐述去，其中所述突变蛋白具有至少一个向氨基酸序列中引入至少一个N-连接的糖基化位点的突变蛋白。在另一个实施方案中，所述 TIMP-3突变蛋白具有两个、三个、四个、五个或六个N-连接的糖基化位点；在又一个实施方案中，引入的N-连接的糖基化位点的数目是七个、八个、九个或十个。

在本发明的一个实施方案中，所述N-连接的糖基化位点是在选自由以下组成的组的所述TIMP-3氨基酸序列的区域引入的：包含氨基酸48-54的区域；包含氨基酸93-100的区域；包含氨基酸121-125 的区域；包含氨基酸143-152的区域；氨基酸156-164；包含氨基酸183-191的区域；及其组合。在另一个实施方案中，所述TIMP-3突变蛋白具有两个、三个、四个或五个N-连接的糖基化位点；在又一个实施方案中，引入的N-连接的糖基化位点的数目是六个、七个、八个、九个或十个。

还提供一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有在氨基酸序列方面与 SEQ ID NO：2中所示的TIMP-3的成熟区有至少95％同一性的成熟区，其中所述突变蛋白具有至少一个选自由以下组成的组的突变： (a)TIMP-3表面暴露的带正电膜片(patch)中的一个或多个突变，导致模拟TIMP-2带电表面的TIMP-3带电膜片的特征的改变；(b)一个或多个降低对蛋白水解裂解敏感度的突变；(c)一个或多个导致TIMP-3 突变蛋白与清除受体LRP-l相互作用降低的突变；(d)一个或多个导致TIMP-3突变蛋白肝素或胞外基质组分的相互作用降低的突变；(e) 向天然TIMP-3序列添加一个或多个半胱氨酰残基；(f）改善的药动学和/或药效学性质；和(g)(a)-(f)中所示的突变的组合。在一个实施方案中，所述突变是在选自由以下组成的组的TIMP-3氨基酸序列的区域引入的：包含氨基酸48-54的区域；包含氨基酸93-100的区域；包含氨基酸121-125的区域；包含氨基酸143-152的区域；氨基酸156-164；包含氨基酸183-191的区域；及其组合。

本发明的一个方面是编码根据上述TIMP-3突变蛋白的任一种的 TIMP-3突变蛋白的分离核酸。本发明的其他方面是包括这种分离核酸的表达载体；用所述表达载体转化或转染的分离宿主细胞；和产生重组TIMP-3突变蛋白的方法，所述方法包括在促进TIMP-3突变蛋白表达的条件下培养所述转化或转染的宿主细胞以及回收所述 TIMP-3突变蛋白。

还提供包含本文中描述的TIMP-3突变蛋白的组合物，以及治疗病状的方法，所述病状中被TIMP-3抑制或可被TIMP-3抑制的基质金属蛋白酶(MMP)和/或其他蛋白酶起成因或加重作用，所述方法包括对患有这种病状的个体施用足以治疗所述病状的量的这种组合物。

在一个实施方案中，所述病状选自由炎性病状、骨关节炎、心肌缺血、再灌注损伤和发展成充血性心力衰竭组成的组。在另一个实施方案中，所述病状选自由哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)和特发性肺纤维化(IPF)、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和脂泻病)、银屑病、心肌炎(包括病毒心肌炎)、动脉粥样硬化相关的炎症、和关节炎病状(包括类风湿性关节炎和银屑病关节炎)组成的组。

在又一个实施方案中，所述病状选自由以下组成的组：营养不良性大疱型表皮松解症、骨关节炎、莱特尔氏综合征、假性痛风、类风湿性关节炎(包括青年类风湿性关节炎)、强直性脊柱炎、硬皮病、牙周病、溃疡(包括角膜、表皮或胃溃疡)、手术后创伤愈合、再狭窄、肺气肿、骨佩吉特氏病、骨质疏松、硬皮病、褥疮中的骨或组织的压迫性萎缩、胆脂瘤、异常创伤愈合、类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身性发作类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠道致病关节炎、反应性关节炎、莱特尔氏综合征、SEA 综合征(血清阴性、肌腱端病、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、骨关节炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化症、原发性胆汁硬化症、硬化性胆管炎、干燥综合征、银屑病、斑块状银屑病、滴状银屑病、反转性银屑病、脓疱性银屑病、红皮病型银屑病、皮炎、特应性皮炎、动脉粥样硬化、狼疮、斯蒂尔病、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、脂泻病(非热带性口炎性腹泻)、与血清阴性关节病有关的肠病、显微或胶原结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术后造成的囊炎、胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、多发性硬化(MS)、哮喘(包括外因性和内因性哮喘以及相关的慢性炎性病状或气道的高反应性)、慢性阻塞性肺病(COPD，即慢性支气管炎、肺气肿)、急性呼吸道紊乱综合征(ARDS)、呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、肺动脉高血压、肺部血管收缩、急性肺损伤、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、结核、过敏性肺炎、职业性哮喘、哮喘样病症、类肉瘤、反应性气道疾病(或功能紊乱)综合征、棉尘肺、间质肺病、高嗜酸细胞性综合征、鼻炎、鼻窦炎和寄生肺病、与病毒诱发的病状有关的气道高反应性(例如，呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)和腺病毒)、 Guillain-Barre病、格雷夫斯病、阿狄森氏病、雷诺现象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病(GVHD)、脑缺血外伤性脑损伤、多发性硬化、神经病、肌病、脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。

发明详述

本发明提供与TIMP-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白有关的组合物、试剂盒和方法。还提供核酸及其衍生物和片段，包括编码这种 TIMP-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的全部或一部分的核苷酸序列，例如，编码这种TIMP-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的全部或一部分的核酸；包含这种核酸的质粒和载体，以及包含这种核酸和 /或载体和质粒的细胞或细胞系。提供的方法包括例如，制造、鉴别或分离显示希望的性质的TIMP-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的方法。

在存在的众多病状中，增加哺乳动物中的内源性TIMP-3或升高特定组织中的TIMP-3的水平是有利的。因此，本文中还提供制造包括TIMP-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白的组合物(诸如药物组合物) 的方法，以及对受试者(例如，患有其中基质金属蛋白酶活性失调导致过度或不当组织重塑的病状的受试者)施用包括TIMP-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白组合物的方法。

除非在本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应该具有本领域技术人员通常所理解的含义。此外，除非另外通过上下文要求，否则单数的术语应该包括复数并且复数术语应该包括单数。一般来讲，结合本文中描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质及核酸化学以及杂交使用的命名法以及其技术是本领域众所周知并且常用的那些。除非另外指出，否则本发明的方法和技术通常是按照本领域熟知的传统方法并且如贯穿本说明书引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献所述进行的。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. (1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)；以及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，所述参考文献以引用的方式并入本文。酶促反应和纯化技术是根据制造商说明书，如本领域中通常所达成或如本文所述来执行。结合本文中描述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学使用的术语及其实验室操作和技术是本领域众所周知并且是常用的那些。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制剂、配制和输送以及患者治疗。

除非另外指出，否则以下术语应被理解为具有以下含义：

用于表征分子(其中所述分子是，例如，多肽、多核苷酸或抗体) 的术语“分离”表明所述分子根据其来源或衍生源(1)与伴随其天然状态的天然相关组分无关，(2)基本上没有来自相同物种的其他分子(3) 由来自不同物种的细胞表达，或(4)没有人的干预下不出现在自然界中。因此，化学合成或在不同于它所天然起源的细胞的细胞系统中合成的分子将是与其天然相关组分“分离”的。分子还可以使用本领域熟知的纯化技术分离变成基本上没有天然相关组分。分子纯度或均一性可以通过若干本领域熟知的方法测定。例如，多肽样品的纯度可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳以及使用本领域熟知的技术对凝胶染色使多肽可视化来测定。为了某些目的，通过使用HPLC或本领域熟知的其他纯化方法可以提供更高的分辨率。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”各自是指包含两个或两个以上彼此通过肽键连接的氨基酸残基的分子。这些术语涵盖，例如，天然和人造蛋白质、蛋白序列的蛋白质片段和多肽类似物(如突变蛋白、变体和融合蛋白)以及翻译后或此外共价或非共价修饰的蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是单体或聚合的。

本文使用的术语“多肽片段”是指与相应的全长蛋白质相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。片段长度可以是例如，至少5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、 150或200个氨基酸。片段长度还可以是，例如，最多1,000、750、 500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、 30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段还可以包括(在其一个末端或两个末端的)一个或多个其他氨基酸，例如，来自不同天然存在的蛋白质的氨基酸序列(例如，Fc或亮氨酸拉链结构)或人造氨基酸序列(例如，人造连接序列或标签蛋白)。

多肽的“变体”或“突变蛋白”(例如TIMP-3变体或突变蛋白)包含以下氨基酸序列：其中相对于另一多肽序列，在所述氨基酸序列中插入、缺失和/或置换有一个或多个氨基酸残基。本发明的变体包括融合蛋白。

“保守性氨基酸取代”是基本上不改变亲本序列的结构特征的取代(例如，置换氨基酸不应倾向于打断亲本序列中存在的螺旋，或破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构或是其功能所必需的)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例在Proteins，Structuresand Molecular Principles(Creighton编著，W.H.Freeman and Company, New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J. Tooze编著，GarlandPublishing，New York，N.Y.(1991))；和Thormon 等，Nature 354：105(1991)中描述，将其各自以引用方式并入本文。

参考变体或突变蛋白与天然蛋白的相似度的一种方式是参考比较的两种(或更多)多肽序列或编码核酸序列之间的一致性百分比。两种多核苷酸或两种多肽序列的“一致性百分比”是通过使用GAP计算机程序(GCG Wisconsin Package的一部分，10.3版Accelrys，San Diego， CA))用其默认参数比较所述序列确定的。

多肽的“衍生物”是已经例如借助于与另一个化学部分(例如，聚乙二醇或白蛋白，例如，人血清白蛋白)缀合、磷酸化和/或糖基化化学修饰的多肽(例如，TIMP-3多肽、变体或突变蛋白)。

多核苷酸和多肽序列使用标准的一个或三个字母缩写指示的。除非另外指出，否则每个多肽序列在左边具有氨基末端并且在右边具有羧基末端；每个单链核酸序列和每个双链核酸序列的上链在左边具有 5’末端并且在右边具有3’末端。具体的多肽或多核苷酸序列还可以通过说明其怎样与引用序列不同来描述。例如，氨基酸的置换在本文中表示为“n#m”，其中“n”表示天然的全长多肽中发现的氨基酸，“#”表示氨基酸残基数目，“m”表示已被置换的氨基酸。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”自始至终可互换使用并且包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)及其杂化物。核酸分子可以是单链或双链。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括编码本发明的 TIMP-3多肽、片段、变体、衍生物或突变蛋白的连续开放阅读框。

如果两个单链多核苷酸的序列可以以反平行取向比对使得在不引入缺口以及在任何一个序列的5’或3’端没有未配对核苷酸的情况下一个多核苷酸中的每个核苷酸与另一个多核苷酸中的其互补核苷酸相对，那么两个单链多核苷酸就是彼此的“互补序列”。如果所述两个多核苷酸可以在适当严格的条件下彼此杂交，那么多核苷酸就与另一个多核苷酸“互补”。因此，多核苷酸可以与不是其互补序列的另一个多核苷酸互补。

“载体”是可以用于向细胞中引入与其连接的另一个核酸的核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可接合其他核酸片段的线性或环状双链DNA。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)，其中可以向所述病毒基因组中引入其他DNA片段。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。“表达载体”是可以引导所选择的多核苷酸的表达的一类载体。

如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置)，那么核苷酸序列与调控序列“可操作连接”。“调控序列”是影响其所可操作连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时间或位置)的核酸。调控序列可以，例如，直接对调控的核酸直接发挥其作用，或通过一种或多种其他分子(例如，结合调控序列和/或核酸的多肽)发挥作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。调控序列的其他实例在例如，Goeddel，1990， Gene Expression Technology：Methods inEnzylnology 185，Academic Press，San Diego，CA和Baron等，1995，Nucleic AcidsRes.23：3605-06 中描述。

天然存在的胞外蛋白质通常包括“信号序列”，其引导蛋白质进入蛋白质分泌的细胞途径并且不存在于成熟蛋白质中。信号序列还可以称为“信号肽”或“前导肽”，并且从胞外蛋白质酶裂解。已经这样加工的蛋白质(即，已经除去信号序列)往往称为“成熟”蛋白质。编码本发明的蛋白质或多肽的多核苷酸可以编码天然存在的信号序列或异源信号序列，其中众多在本领域是已知的。

本领域技术人员会理解，根据本实施方案的重组蛋白质或多肽可以在包括哺乳动物细胞系在内的细胞系中表达。编码特定蛋白质的序列可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。可通过将多核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法进行转化，包括例如将多核苷酸包装在病毒中 (或包装在病毒载体中)并且用病毒(或载体)或通过本领域中已知的转染操作转导宿主细胞，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461 和4,959,455所例示(所述专利在此以引用的方式并入本文)。所用转化操作取决于有待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法在本领域是众所周知的并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、凝聚胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将聚核苷酸囊封于脂质体中以及将DNA直接显微注射于核中。

“宿主细胞”是可以用于表达核酸(例如，本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如，大肠杆菌，或者可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母菌或其他真菌)，植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)，动物细胞(例如，人细胞，猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的实例包括猴肾脏细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(参见Gluzman等，1981，Cell 23：175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生细胞，如Veggie CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(参见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28：31) 或缺乏DHFR的CHO株DX-B11(参见Urlaub等，1980，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 77：4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL 10)细胞系、衍生自非洲青猴肾脏细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL 70)(参见McMahan等，1991，EMBO J.10：2821)、人胚肾细胞如293、293EBNA或MSR 293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常二倍体细胞、衍生自初生组织离体培养的细胞株、初级外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。

通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，其随后可以在宿主细胞中表达。在“瞬时转染”中，通过一些本领域已知方法之一将核酸引入宿主细胞，并且重组蛋白质表达有限的一段时间，通常最多约四天，在核酸消失或降解之前，例如，在宿主细胞进行有丝分裂时。如果希望“稳定转染”，就可以将编码多肽的核酸连同编码选择性标记物的核酸一起引入宿主细胞。使用选择性标记物允许本领域技术人员选择转染的宿主细胞，其中编码多肽的核酸被以在通过有丝分裂保存编码多肽的核酸的方式整合到宿主细胞基因组中，并且可以通过后代细胞表达。

短语“重组宿主细胞”可以用于指示已经用要表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是包含所述核酸但是不在希望的水平表达所述核酸的细胞，除非向所述宿主细胞引入调控序列以使其与所述核酸可操作连接。应理解术语宿主细胞不仅是指具体的主题细胞，而且是指这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可以由于例如突变或环境影响而在下一代中出现，所以此类后代可能实际上与亲代细胞不相同，但仍然包括在如本文中所用的术语的范畴内。

本文使用的“TIMP-3DNA”、“TIMP-3-编码DNA”等指示选择的 TIMP-3编码核酸，其中由此表达的TIMP-3可以是天然TIMP-3或如本文所述的TIMP-3变体或突变蛋白。同样地，“TIMP-3”、“TIMP-3 蛋白质”和“TIMP-3多肽”用于表示天然TIMP-3蛋白或包含一个或多个突变的TIMP-3蛋白(即，TIMP-3多肽、变体、衍生物或突变蛋白)。 TIMP-3的特定的突变蛋白可以通过突变表示，例如，“K45N TIMP-3”或“K45N TIMP-3多肽”表示其中天然TIMP-3的氨基酸45位处的赖氨酸(K)已被天门冬酰胺(N)置换的多肽。

本文使用的术语“天然TIMP-3”是指野生型TIMP-3。TIMP-3由哺乳动物中的各种细胞或组织表达并且存在于胞外基质中；这样表达的TIMP-3在本文中还称为“内源性”TIMP-3。TIMP-3的氨基酸序列和编码TIMP-3的DNA的核酸序列在2003年5月13日颁发的美国专利6,562,596中公开，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。美国专利6,562,596中使用的氨基酸编号系统用负数表示信号(或前导) 肽中的氨基酸，并且将成熟蛋白质(即，已经除去信号肽或前导肽的蛋白质)称为氨基酸1-188。本文中使用的编号系统用表示为#1的天然前导肽的第一个氨基酸指示TIMP-3；因此全长TIMP-3包括氨基酸 1-211，并且成熟形式是氨基酸24-211。本领域技术人员容易理解使用这些不同编号系统可能出现氨基酸编号中的差异，并且因此可以容易地对例如成熟形式的第一个氨基酸被称为#1的TIMP-3多肽应用本文中使用的编号系统。因此，例如，本文中表示的K45N将为使用美国专利6,562,596的编号系统表示的K22N。

TIMP-3由两个结构域形成，包含TIMP-3的氨基酸24至143的 N末端结构域(即，约三分之二的所述分子)和包含氨基酸144至211 的C末端结构域。图3呈现TIMP-3的2维多肽阵列，突出显示促进二级和三级结构TIMP-3形成的二硫键的络合性质。已经发现TIMP-3 的N末端结构域(常称为″N-TIMP-3″)显示至少一些TIMP-3的生物活性；因此，如本文所述的TIMP-3变体、衍生物和突变蛋白包括含有 N末端结构域的TIMP-3片段的变体、衍生物和突变蛋白。

天然TIMP-3蛋白作为治疗分子使用有一些挑战。例如，使用标准哺乳动物表达技术的TIMP-3蛋白的哺乳动物表达效价太低以致不允许足够量的TIMP-3在适合于治疗蛋白质的规模上产生。此外， TIMP-3与胞外基质的结合使在细胞培养基中包含肝素成为必需(或减少TIMP-3与胞外基质结合的相似剂)，并且与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)清除蛋白质结合加剧重组TIMP-3以允许待开发的生产规模工艺的水平向介质中分泌的挑战。已经证明全长TIMP-3在原核细胞中的微生物生产是困难的，这是由于蛋白质的不正确折叠。

因此，为了克服一个或多个这些挑战，本发明的TIMP-3变体或突变蛋白已经被修饰。本发明的多肽包括已经以任何方式以及任何原因进行修饰的多肽，例如，从而：(1)降低对蛋白质水解的敏感度，(2) 降低对氧化的敏感度，(3)降低对抑制TIMP-3与细胞培养中的胞外基质结合的剂的需要，(4)改变其他部分的结合亲和力，例如清除受体如 LRP-1，(5)带来或改变其他物理化学或功能性质，包括药动学和/或药效学，(6)促进重组蛋白质的表达和/或纯化。类似物包括多肽的突变蛋白。例如，单个或多个氨基酸置换(例如保守氨基酸置换)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的结构域外部的多肽部分中进行)。共有序列可以用于选择用于置换的氨基酸残基；本领域技术人员意识到其他氨基酸残基也可以被置换。

在本发明的一个方面中，提供显示突变蛋白或变体的表达水平比用天然TIMP-3观察的突变蛋白或变体的表达水平升高的TIMP-3突变蛋白或变体；在本发明的另一个方面中，升高的表达出现在哺乳动物细胞表达系统中。表达水平可以通过允许定量或半定量分析细胞培养上清液(即，条件培养基(CM))中的重组TIMP-3(天然、变体或突变蛋白)的量的任何合适的方法测定。在一个实施方案中，通过蛋白质印迹评价样品或CM；在另一个实施方案中，使用标准人TIMP-3 ELISA评价CM样品。

在一个实施方案中，在瞬时表达系统中观察到表达升高；在另一个实施方案中，在稳定转染系统中观察到表达升高。一个实施方案提供观察到的表达升高比天然TIMP-3观察到的大两倍(2x)的TIMP-3 突变蛋白或变体；另一个实施方案提供观察到的表达升高比天然 TIMP-3观察到的大五倍(5x)的TIMP-3突变蛋白或变体。其他实施方案包括表达升高三倍(3x)、四倍(4x)或六倍(6x)的TIMP-3突变蛋白或变体。在一个实施方案中，TIMP-3突变蛋白或变体的表达比天然 TIMP-3观察到的大十倍(10x)；在另一个实施方案中，观察到的表达比天然TIMP-3观察到的大十倍以上，例如，大20倍(20x)或更高

在本发明的另一个方面中，提供了显示对向细胞培养基中添加肝素(或抑制TIMP-3与胞外基质结合的另一种剂)的要求降低的TIMP-3 突变蛋白(或变体)。肝素(或其他剂)的量的降低可以用半定量的方式描述，即，降低可以是部分、中等、相当大或彻底的。在另一个实施方案中，降低表达为百分比，例如肝素(或相似的剂)的量可以降低 10％、20％、30％、40％、50％或更多(例如60％、70％、80％、90％或100％)。

在一个实施方案中，提供包含插入的糖基化位点的TIMP-3变体突变蛋白。正如本领域所知，糖基化类型可以取决于蛋白质的序列(例如，存在或不存在特定的糖基化氨基酸残基，在下面讨论)或产生蛋白质的宿主细胞或有机体两者。下面讨论特定的表达系统。糖基化的存在、不存在或程度可以通过本领域技术人员已知的任何方法测定，包括通过蛋白质印迹或考马斯染色SDS-PAGE凝胶观察到的分子量 (MW)中的位移的半定性测量，而定量测量可以包括使用质谱分光光度计技术以及观察对应于天门冬酰胺连接的糖基化增加的mw变化，或观察天门冬酰胺连接的糖基化被诸如肽-N-糖苷酶F(PNGase-F； SigmaAldrich，St.Louis，MO)等酶除去的质量变化。

多肽的糖基化通常是N-连接或邻-连接的。N-连接是指碳水化合物部分与天门冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天门冬酰胺-X-丝氨酸(N X S)和天门冬酰胺-X-苏氨酸(NX T)，其中X是脯氨酸除外的任何氨基酸，是碳水化合物部分与天门冬酰胺侧链酶连接的识别序列。因此，在多肽中存在这些三肽序列的任何一个产生一个潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，不过也可以使用5- 羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

向抗原结合蛋白添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三肽序列来方便地实现(对于N-连接的糖基化位点)。变化也可以通过向起始序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(对于O-连接的糖基化位点)。为了简便，蛋白质氨基酸序列优选通过DNA水平的变化来改变，特别是通过使编码靶多肽的DNA在预选的碱基处突变从而产生将翻译成希望的氨基酸的密码子。

因此，可以通过改变单个氨基酸的密码子添加N-连接的糖基化位点。例如，编码N-X-z的密码子(其中z是任何氨基酸)可以被改变成编码N-X-T(或N-X-S)，或编码y-X-T/S的密码子可以被改变成编码N-X-T/S。或者，编码两个氨基酸的密码子可以被同时改变成引入N-连接的糖基化位点(例如，y-X-z的密码子可以被改变成编码 N-X-T/S)。以这种方式，可以插入一到十个N-连接的糖基化位点。

除了向TIMP-3中插入N-连接的糖基化位点之外，可以改变存在于天然TIMP-3中的任何糖基化位点，例如在努力稳定分子结构的过程中。因此，例如，在残基208处的A可以被不同残基置换，如Y、 V或G。在残基206-208的‘N-X-T’位点处的其他改变包括用F置换在残基205处的I，或用Y置换在残基205处的I，以及在残基208 处的上述置换之一。

在另一个实施方案中，鉴别对蛋白水解裂解敏感的区域并且使其突变。在本发明的另一个方面中，提供显示与清除受体LRP-1相互作用降低的TIMP-3突变蛋白或变体。在一个实施方案中，这种突变蛋白是通过鉴别假设在TIMP-3与LRP-1之间的相互作用中重要的赖氨酸残基并且使其突变而得到。

此外，认为TIMP-3突变蛋白或变体可以显示一种以上这些性质 (例如，插入的糖基化位点可以降低细胞培养基中对肝素的需要，降低与LRP-1的相互作用以及提高对蛋白质水解的抗性)。其他实施方案包括具有一个以上突变的TIMP-3突变蛋白或变体，从而使突变的组合产生一种以上上述性质或作用。

可以用一些方式来鉴别希望的TIMP-3突变蛋白。在第一个方法中，使用模拟实验来促进TIMP-3和相关的金属蛋白酶抑制剂TIMP-2 之间的电荷再平衡(已经观察到后者显示优良的哺乳动物表达谱)。在本发明的一个实施方案中，TIMP-3表面暴露的带正电膜片重新分布以模拟TIMP-2带电表面。在另一个实施方案中，TIMP-2和TIMP-3 之间的电荷差被糖基化位点的插入掩盖。糖基化插入也可以用于表达改善(参见，例如，Enhancing theSecretion of Recombinant Proteins by Engineering N-Glycosylation Sites.LiuY.等，Amer Inst Chem Eng 2009， 1468页)。

因此，在另一个实施方案中，筛选了通过计算分析开发的溶剂暴露位点的亚集合的N-糖基化可能性。对于涉及糖基化位点插入的方法，N-糖基化预测工具在选择可以发生突变以促进潜在的N-连接的糖基化中是有用的，例如通过鉴别可以发生突变以形成典型的N-x-T 糖基化位点的残基(其中N是天门冬酰胺，x是任何氨基酸并且T是苏氨酸)。在又一个实施方案中，使用基于结构的方法鉴别所有溶剂暴露的氨基酸(包括具有侧链暴露＞

的那些氨基酸)。又一个实施方案包括在TIMP-3上的LRPl相互作用赖氨酸的突变，基于LRP1/RAP(受体相关蛋白质)的晶体结构(其中相互作用的RAP赖氨酸相对TIMP-3定位)。

本文中涵盖其他组合。例如，F57N突变可以连同在赖氨酸残基处的突变一起完成，其中所述赖氨酸残基是TIMP-3中的任何赖氨酸。在一个实施方案中，单个赖氨酸发生突变；在另一个实施方案中，两个、三个、四个或五个赖氨酸残基发生突变。在某些实施方案中，在氨基酸45和/或133的赖氨酸残基可以发生突变。在另一个实例中， F57N突变引入单个N-连接的糖基化位点；这种突变可以与其他突变一起完成从而引入其他糖基化位点，或和设计成能影响一种或多种 TIMP-3的上述性质的其他突变。本文中涵盖包括一个引入的N-连接的糖基化位点、包括两个、三个或四个N-连接的糖基化位点以及包括五个或更多N-连接的糖基化位点的TIMP-3突变蛋白或变体。

特定的突变在图1和2中展示。图1呈现天然的全长人TIMP-3 和突变形式的全长人TIMP-3的比对，其中字母“X”已被置换为所述序列内的具体氨基酸。信号序列加以下划线；因此其他信号序列可以被置换，如本文所述。设想在TIMP-3的成熟形式中的某些置换，并且在本文中表示为“n#m”，其中“n”表示天然的全长TIMP-3中发现的氨基酸，“#”表示氨基酸残基数目，且“m”表示已被置换的氨基酸。因此，例如，“K45N”指示在氨基酸45处的赖氨酸(K)已被天门冬酰胺(N) 置换。本文中示例的突变形式的人TIMP-3包括以下突变(单独或组合)：K45N；K45S；V47T；K50N；V52T；P56N；F57N；G58T；T63E； T63N；K65T；T74E；H78E；H78E；H78N；Q80T；K94N；E96T； D110N；K112T；Q126N；R138T和G173T。还涵盖这些突变的组合，并且可以包括两到十个(即，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)上述置换。

突变的特定组合包括K45E、K49S；K45E、K49E；K45E、T63E； K45E、Q80E；K45E、T63E、H78E；T63E、H78E、Q80E；K45E、 T63E、H78E、Q80E；L51T、T74E、H78D；T74E、H78E、Q80E； T74E、H78D、Q80E；K45N、V47T；K49N、L51T；K75N、P77T； K45E、K49N、L51T、T63E；E96N、N98T；V97N、K99T；R138N、 H140T；T158N、K160T；T166N、M168T；H181N、A183T；R186N、 K188T；P201N、K203T；A208Y；A208V；T63E、T74E、H78E； T63E、T74E、H78D；K65N、M67T；K45N、V47T、T63E、T74E、 H78E；K49N、L51T、T63E、T74E、H78E；K49N、L51T、T74E、 H78E；K49N、L51T；K50N、V52T；L51N、K53T；T63N、K65T； H78N、Q80T；K94N、E96T；D110N、K112T；Q126N；R138T；G173T； F57N；P56N、G58T；P56N、G58T；T63N、K65T；K45S、F57N； K49S、F57N；K68S、F57N；K133S、F57N；K45S、K133S、F57N；和K49S、K68S、F57N。

其他组合包括K45S、F57N、D110N、K112T；K45S、F57N、 H78N、Q80T、D110N、K112T；K45S、F57N、H78N、Q80T、D110N、 K112T、Q126N；K45S、F57N、H78N、Q80T、K94N、E96T Q126N；K45S、F57N、H78N、Q80T、Q126N、G173T；K45S、F57N、T63N、 K65T；K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T；K45S、F57N、 T63N、K65T、K94N、E96T、G173T；K45S、F57N、T63N、K65T、 R138T、G173T；K45N、V47T、F57N、T63N、K65T、R138T、G173T； K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、R138T；K45N、V47T、 F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、R138T；K45S、F57N、Q126N、 R138T、G173T；P56N、G58T、T63N、K65T、K94N、E96T、Q126N、 G173T；P56N、G58T、T63N、K65T、D110N、K112T、Q126N、G173T；和K45S、F57N、Q126N、R138T、G173T。

其他突变包括K49S、K50N/V52T、K53E、V97N/K99T、 R186N/K188T；K50N/V52T、V97N/K99T、R186N/K188T；K49E、 K53E、K188Q；K50N/V52T、R186N/K188T；K50N/V52T、F57N、R186N/K188T；K45S、K50N/V52T、F57N、R186N/K188T；K50N/V52T、F57N、T63N/K65T、RI 86N/K188T；K45S、K50N/V52T、F57N R186N/K188T；K45S、K49S、K50N/V52T、F57N R186N/K188T；K49S、K50N/V52T、F57N、V97N/K99T、R186N/K188T；和K45S、 K50N/V52T、F57N、V97N/K99T、R186N/K188T。

图2呈现天然的全长人TIMP-3和其中已经完成使所述序列变得更相似于TIMP-2的序列的某些氨基酸置换的TIMP-3变体。呈现信号序列并且对于天然的全长TIMP-3序列加以下划线以保持编号的一致性，其他信号序列可因此被置换，如本文所述。在TIMP-3变体的序列中，“X”已被置换为特定的氨基酸以指明设想有置换的成熟形式的TIMP-3中的残基。这些置换包括在残基25处的H、K、P、R、S 或W；在残基27处的A、在残基28处的D、L或S；在残基32处的N；在残基39处的T；在残基43处的T、F、A或N；在残基45 处的I或T；在残基46处的D；在残基48处的S；在残基49处的S；在残基51处的T；在残基63处的N；在残基67处的N；在残基68 处的I；在残基78处的D或W；在残基96处的T；在残基202处的 N和在残基207处的S。置换可以是单独或组合进行的。因此，使用对于图1描述的编排格式，图2中示例的一个变体是A27T、I68K。还涵盖其他组合，并且可以包括两到十个上述置换。此外，图2中描述的置换可以与图1中描述的置换组合，例如，A27T、P56N、G58T。

Lee等(J.Biol.Chem.282：6887；2007)公开了声称鉴别TIMP-3中的胞外基质结合基序的研究。当他们未能鉴别TIMP-3中的已知肝素结合序列时，他们鉴别了十一个赖氨酸和精氨酸残基，其位置表明这些碱性氨基酸的侧链会以相当高的密度暴露在TIMP-3的表面。这些残基是K26、K27、K30、K71、K76、R100、K123、K125、K137、 R163、K165(使用本文中使用的编号系统，这些残基编号将是K49、 K50、K53、K94、K99、R123、K146、K148、K160、R186、K188)。因此，其他TIMP-3突变蛋白包括下面显示的那些。这些突变蛋白预期显示部分或全部肝素独立性。除了改变表面暴露的碱性氨基酸侧链之外。某些突变还会向TIMP-3突变蛋白(即，K94N/E96T)中引入N- 连接的糖基化位点。

在被降低肝素独立性的突变蛋白当中是K49E、K50E、K53E、 K99E、R186Q、K188Q；K49E、K50E、K53E、F57N、K99E、R186Q、 K188Q；K45S、K50E、K53E、F57N、K99E、R186Q、K188Q；K49S、K50N/V52T、K99E、K188Q；K50N/V52T、K99E、K188Q；K50N/V52T、 K94N/E96T、K188Q；K50N/V52T、K94N/E96T、G173T；K50N/V52T、 R186N/K188T；K50N/V52T、K94N/E96T、R186N、K188T； K50N/V52T、F57N、K94N/E96T、R186N/K188T；K45S、K50N/V52T、 F57N、K94N/E96T、R186N/K188T；K50N/V52T、T63N/K65T、 K94N/E96T、R186N/K188T；K45S、K50N/V52T、T63N/K65T、 K94N/E96T、R186N/K188T。根据本发明，这些突变蛋白的一些可以显示多种良好的性质。例如，一些突变蛋白含有插入的N-连接的糖基化位点；其他突变蛋白包含增强哺乳动物细胞系统中的表达的突变。

TIMP-3变体、突变蛋白或衍生物将具有与天然TIMP-3很相似的氨基酸序列。在一个实施方案中，TIMP-3变体、突变蛋白或衍生物将与天然TIMP-3有至少85％同一性；在另一个实施方案中TIMP-3 变体、突变蛋白或衍生物将与天然TIMP-3有至少90％同一性；在另一个实施方案中，TIMP-3变体、突变蛋白或衍生物将与天然TIMP-3 有至少95％同一性。在其他实施方案中，TIMP-3变体、突变蛋白或衍生物与天然TIMP-3有至少96％、97％、98％或99％同一性。如本文使用，一致性百分比是指成熟的全长变体、突变蛋白或衍生物与成熟的全长形式的天然TIMP-3比较，即，缺少信号肽的TIMP-3(TIMP-3 的氨基酸24至211)。本领域技术人员将容易地理解，可以在TIMP-3 的N末端结构域的变体、突变蛋白或衍生物和天然TIMP-3的N末端结构域之间进行类似的比较。

相似性还可以通过突变蛋白或变体和天然TIMP-3之间不同的氨基酸数目表示。例如，TIMP-3变体或突变蛋白与天然TIMP-3的不同之处可以在于：一个氨基酸、两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸、五个氨基酸、六个氨基酸、七个氨基酸、八个氨基酸、九个氨基酸或十个氨基酸。变体或突变蛋白与天然TIMP-3有十个氨基酸的不同将与天然TIMP-3有约95％同一性。在其他实施方案中，TIMP-3 变体或突变蛋白与天然成熟TIMP-3有11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20个氨基酸不同。

在编码TIMP-3多肽(或者天然、突变蛋白、变体或衍生物)的核酸中可以进行其他改变以便于表达。例如，天然TIMP-3的信号肽可以用不同信号肽置换。

在本发明范畴内的TIMP-3多肽的其他衍生物包括TIMP-3多肽或其片段与其他蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物，如通过包含融合到TIMP-3多肽的N末端或C末端的异源多肽的重组融合蛋白的表达。例如，所述缀合的肽可以是异源信号(或前导)肽例如酵母菌α-因子前导区、或肽如表位标签。本领域技术人员理解，异源信号肽可以在长度方面与天然TIMP-3信号肽不同，但是可以通过使用异源信号肽比对产生的TIMP-3多肽的N末端半胱氨酸残基来正确地鉴别突变蛋白相对于成熟TIMP-3的氨基酸序列的位置。

含有TIMP-3多肽的融合蛋白可以包括添加以便于纯化或识别 TIMP-3多肽的肽(例如，多-His、)。另一种标签肽是Hopp等， Bio/Technology 6：1204，1988和美国专利5,011,912中描述的

肽。

肽是高度抗原性的并且提供由特定的单克隆抗体(mAb) 可逆结合的表位，实现所表达的重组蛋白质的快速测定和简易纯化。对制备其中

肽与给定多肽融合的融合蛋白有用的试剂是市售可得的(Sigma，St.Louis，MO)。

共价修饰也是所考虑的TIMP-3多肽的衍生物并且包括在本发明范畴内，并且通常，但不总是，在翻译后进行。例如，一些类型的抗原结合蛋白的共价修饰是通过抗原结合蛋白的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或N或C末端残基反应的有机衍生化剂反应引入所述分子的。

半胱氨酰残基最常见是与α-卤代醋酸酯(和相应的胺)反应，如氯乙酸或氯乙酰胺，得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N- 烷基马来酰亚胺、3-硝基2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应衍生化。因此，在本发明的一个方面中，将半胱氨酰残基加入天然 TIMP-3序列，例如通过改变所选择的密码子编码Cys。这种Cys置换可以在证明对于表达、折叠或如本文中所示的其他性质重要的 TIMP-3的区域中进行。

本发明的蛋白质上的碳水化合物部分的数目可以通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联来增加。这些操作之所以是有利的，是因为它们不需要在对N-和O-连接的糖基化具有糖基化能力的宿主细胞中产生所述蛋白质。取决于使用的偶联方式，糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的那些游离巯基，(d) 游离羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些游离羟基，(e)芳香残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳香残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin 和Wriston，1981，CRC Crit.Rev.Biochem.，259-306页中描述。

除去起始重组蛋白质上存在的碳水化合物部分可以通过化学或酶法实现。化学去糖基化需要蛋白质与化合物三氟甲烷磺酸或等价化合物接触。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺) 外的大部分或所有糖裂解，而剩下多肽是完整的。化学去糖基化由 Hakimuddin等，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge等，1981，Anal.Biochem.118：131描述。多肽上的碳水化合物部分的酶裂解可以通过使用如Thotakura等，1987，Meth.Enzymol.138：350所述的各种内切-和外切-糖苷酶实现。在潜在的糖基化位点的糖基化可以通过使用如Duskin等，1982，J.Biol.Chem.257：3105所述的化合物衣霉素避免。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。

另一种类型的抗原结合蛋白的共价修饰包括以美国专利号 4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337 中所示的方式将蛋白质与各种非蛋白质聚合物连接，包括但不限于，各种多元醇如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。此外，正如本领域所知，为了便于添加诸如PEG等的聚合物，可以在蛋白质内的多个位置中进行氨基酸置换。

TIMP_-3多肽的表达

本领域已知的任何表达系统都可以用于制造本发明的重组多肽。一般来讲，用包含编码希望的TIMP-3多肽的DNA的重组表达载体 (包括TIMP-3突变蛋白或变体)转化宿主细胞。在宿主细胞当中可采用的是原核生物、酵母菌或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和建立的哺乳动物来源细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾脏细胞的COS-7系(ATCCCRL 1651)(Gluzman等，1981， Cell 23：175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和如McMahan等，1991，EMBO J.10：2821所述的衍生自非洲青猴肾脏细胞系CVI(ATCC CCL 70)的CVI/EBNA细胞系。用于与细菌、真菌、酵母菌和哺乳动物细胞宿主使用的合适的克隆和表达载体由Pouwels等(Clonmg Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，New York， 1985)描述。

哺乳动物细胞表达可以在便于折叠以及采用密切类似天然 TIMP-3的构象中为TIMP-3多肽的产生提供优势。众多哺乳动物细胞表达系统在本领域是已知的，和/或是市售可得的；后者包括诸如以下系统：

(一种设计成便于与中国仓鼠卵巢(CHO)-源性混悬液培养中的重组蛋白质的克隆和表达的所有方面使用的产品；ProBioGen，Life Technologies；Carlsbad，CA)、GS Gene Expression System^TM(设计成能提供高产率、稳定、cGMP相容的哺乳动物细胞系的开发的转染系统；Lonza Biologics，Slough，UK)、

技术(设计成便于使用源自单个永生化人细胞的细胞的连续分裂集大规模生产重组蛋白质的工具包；Crucell，Leiden，The Netherlands)，或诸如CAP和CAP-T等永生化羊水细胞(用于复合蛋白质的表达和生产的基于人细胞的表达系统；Cevec，Cologne， Germany)。

其他细胞表达系统包括诸如以下系统：Selexis SUREtechnology Platform^TM(一个可以应用于各种细胞系从而促进开发重组蛋白质生产的细胞系的技术平台；SelexisInc.，Switzerland)；

哺乳动物转染系统(一个为重组蛋白质生产提供高效率的细胞转染的转染系统；Promega，Madison WI)；Expi293^TM表达系统(高密度哺乳动物瞬时蛋白质表达系统，Life Technologies，Grand Island，NY)以及

VLX^TM和STX^TM瞬时转染系统(一个用于在包括抗体在内的重组蛋白质生产中使用的可扩展转染系统；MaxCyte，Gaithersburg， MD。本领域技术人员还知道其他表达系统，如最初由Wigler等(Cell 1979：777)描述的技术和例如由加拿大国家研究委员会在其网站上描述的其他技术。

适于转化细胞培养和重组蛋白质生产的各种容器在本领域是已知的。这些包括24深孔板、250ml和1L振摇瓶；以及具有各种大小的各种生物反应器，例如，2L、5L、10L、30L、100L、1000L、10000L 和更大的生物反应器。用于细胞培养的其他合适的容器在本领域是已知的并且也可以如本文所述使用。

细胞培养基配方在本领域是众所周知的；通常，培养基提供必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和细胞最小生长和/或存活需要的痕量元素以及缓冲液和盐。培养基还可以包含提高生长和/或存活高于最小率的补充组分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯离子、钙、镁和磷酸根)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以非常低的最终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能源；如本文所述，可以向培养基中加入细胞循环抑制剂。在某些实施方案中，将培养基配制成对于细胞存活和增殖而言最佳的pH和含盐浓度是有利的。在某些实施方案中，培养基是细胞培养开始之后添加的补给培养基。在某些实施方案中，细胞培养基是起始营养液和开始细胞培养之后添加的任何补给培养基的混合物。

各种组织培养基，包括确定的培养基，是市售可得的，例如，可以使用以下细胞培养基的任一种或组合：RPMI-1640培养基、 RPMI-1641培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、最小量伊格尔基础培养基、F-12K培养基、Ham′s F12培养基、Iscove′s改良达尔伯克培养基、McCoy′s 5A培养基、Leibovitz′s L-15培养基，和无血清培养基如EX-CELL^TM300系列(JRH Biosciences，Lenexa，Kansas)，等。这些培养基的无血清形式也是可利用的。细胞培养基可以补充有其他或增加浓度的组分，如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、痕量元素等，取决于培养的细胞的要求和/或希望的细胞培养参数。

转化的细胞可以在促进多肽表达的条件下培养，并且通过常规蛋白质纯化操作回收多肽。一个这种纯化操作包括使用亲和色谱法以及本领域已知的其他方法。从哺乳动物上清液分离TIMP-3亲本或 TIMP-3突变蛋白的一种方法是利用与羧基末端6x-组氨酸标签以及 6x-组氨酸亲和力Ni-琼脂糖凝胶树脂融合的TIMP-3(例如，固定金属亲和色谱法(IMAC)；一般操作在本领域已知，这些操作的试剂和实例由QIAGEN，Germantown，MD and GEHealthcare，Pittsburg，PA列出)。阳离子交换色谱法(例如SP-HP

，GEHealthcare)可以用于进一步分离IMAC洗脱后的TIMP-3，或作为不使用IMAC从哺乳动物上清液捕获TIMP-3的替代方案策略(TIMP-3及其突变蛋白的洗脱伴随在中性pH下使用氯化钠梯度发生)。尺寸排阻色谱法(例如， Superdex

GE Healthcare，(流动相实例：10mMNa₂HPO₄，1.8mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl))是可以用于进一步分离TIMP-3 或其突变蛋白的一般策略(与IMAC过程或离子交换色谱法结合。这些和其他方法在本领域是已知的；参见例如，Protein Purification： Principles：High Resolution Methods，andApplications，第三版(2012， John Wiley and Sons；Hoboken，NJ)。

多肽(天然TIMP-3或TIMP-3突变蛋白或变体)的量可以通过允许分析细胞培养上清液(即，条件培养基(CM))中的重组TIMP-3(天然、变体或突变蛋白)的量的任何合适的、定量或半定量法测定。合适的定性或半定量法包括蛋白质印迹和考马斯染色SDS PAGE凝胶。定量测量可以包括使用酶免疫测定如人TIMP-3ELISA(R&D Systems Inc.， Minneapolis，MN)，或者具有抗体介导的TIMP-3捕获或对纯化 TIMP-3的直接UV(紫外线)吸光度(280nm)测量的ForteBio

(Pall ForteBio Corp，Menlo Park，CA)。

因此，TIMP-3中的特定突变的作用可以通过比较制得的重组突变蛋白的量与在类似培养条件下制得的天然蛋白的量来评价。 TIMP-3突变蛋白或变体可以以对于天然TIMP-3观察到的水平的1 倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更高倍数的水平表达。如有需要，可以测定特定的转化或转染的细胞系的比生产率，从而允许比较各种形式的TIMP-3的比生产率。比生产率或qP以每天每个细胞的重组蛋白质的皮克数(pg/c/d)表示，并且可以通过应用本领域已知的定量培养物中的细胞的方法以及上述的定量重组蛋白质的方法容易地测定。

TIMP-3多肽的用途

TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物可以例如在测定中使用，或者它们可以在治疗其中希望更高TIMP-3活性水平的任何病状中使用(即，其中被TIMP-3抑制或可被TIMP-3抑制的基质金属蛋白酶 (MMP)和/或其他蛋白酶发挥成因或加剧作用的病状)，包括但不限于炎性病状、骨关节炎和其中出现过度或不当MMP活性的其他病状(例如，心肌缺血、再灌注损伤以及在发展成充血性心力衰竭期间)。炎性病状包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)，特发性肺纤维化(IPF)、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和脂泻病)、银屑病、心肌炎(包括病毒心肌炎)、动脉粥样硬化相关的炎症，以及关节炎病状 (包括类风湿性关节炎，银屑病关节炎)等。

本文中描述的TIMP-3多肽、变体突变蛋白或衍生物组合物改善发病机理并且为特征为基质降解和/或炎症的疾病或病状(即，其中金属蛋白酶发挥有害作用的那些)提供有益的疗法。所述组合物可以单独使用或与治疗这些病状中使用的一种或多种剂一起使用。因此，本发明的TIMP-3多肽、变体突变蛋白或衍生物组合物可以用于治疗其中过度的基质损失是由金属蛋白酶活性造成的任何病症。本发明的 TIMP-3变体突变蛋白或衍生物组合物单独或与其他药物组合地用于治疗与胶原酶、聚蛋白多糖酶或其他基质降解或炎症促进酶的超量产生相关的各种病症，包括营养不良性大疱型表皮松解症、骨关节炎、莱特尔氏综合征、假性痛风、类风湿性关节炎(包括青年类风湿性关节炎)、强直性脊柱炎、硬皮病、牙周病、溃疡(包括角膜、表皮或胃溃疡)、手术后创伤愈合和再狭窄。其中过量胶原和/或蛋白多糖降解可能发挥作用并且因此可以应用TIMP-3多肽、变体突变蛋白或衍生物组合物的其他病理学病状包括肺气肿、骨佩吉特氏病、骨质疏松、硬皮病、如在褥疮、胆脂瘤和异常创伤愈合中的骨或组织的压迫性萎缩。为TIMP-3的量降低或金属蛋白酶的量增加的(直接或间接)结果的其他病状(例如，在心肌缺血、再灌注损伤中，以及在发展成充血性心力衰竭期间)也可以用单独或与常用于治疗患有这些病状的个体的其他药物组合使用的本发明描述的组合物治疗。TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物组合物此外可以作为其他创伤愈合促进剂的辅助剂应用，例如，用于调节愈合过程期间的胶原反转。

许多金属蛋白酶还显示促炎性活性；因此，其他实施方案包括治疗炎症和/或自身免疫性疾病的方法，其中所述病症包括但不限于软骨炎症和/或骨降解、关节炎、类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身性发作类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠道致病关节炎、反应性关节炎、莱特尔氏综合征、SEA综合征(血清阴性、肌腱端病、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮、脉管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、骨关节炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化症、原发性胆汁硬化症、硬化性胆管炎、干燥综合征、银屑病、斑块状银屑病、滴状银屑病、反转性银屑病、脓疱性银屑病、红皮病型银屑病、皮炎、特应性皮炎、动脉粥样硬化、狼疮、斯蒂尔病、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、脂泻病(非热带性口炎性腹泻)、与血清阴性关节病有关的肠病、显微或胶原结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术后造成的囊炎、胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、多发性硬化(MS)、哮喘(包括外因性和内因性哮喘以及气道的相关的慢性炎性病状或高反应性)、慢性阻塞性肺病(COPD，即，慢性支气管炎、肺气肿)、急性呼吸道紊乱综合征(ARDS)、呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、肺动脉高血压、肺部血管收缩、急性肺损伤、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、结核、过敏性肺炎、职业性哮喘、哮喘样病症、类肉瘤、反应性气道疾病(或功能紊乱)综合征、棉尘肺、间质肺病、高嗜酸细胞性综合征、鼻炎、鼻窦炎和寄生肺病、与病毒诱发的病状有关的气道高反应性(例如，呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)和腺病毒)、 Guillain-Barre病、格雷夫斯病、阿狄森氏病、雷诺现象、自身免疫性肝炎、GVHD等。TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物也在TIMP-3 相对水平降低(即，内源性TIMP-3与金属蛋白酶的比例降低，这可能是TIMP-3的量降低或金属蛋白酶的量升高的结果)与例如在心肌缺血、再灌注损伤中和在发展成充血性心力衰竭期间中的病理作用相关联的案例中有应用。

基于TIMP-3抑制结缔组织降解的能力，TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物在抑制血管生成有用的案例(例如，预防或阻滞肿瘤发展以及预防寄生虫侵入)中有应用。例如，在肿瘤发病和转移的领域中，一些特定肿瘤的转移潜力与合成和分泌胶原酶的能力提高以及不能合成和分泌显著量的金属蛋白酶抑制剂相关。本发明公开的 TIMP-3蛋白也在除去原发肿瘤期间、化学治疗和放射治疗期间、采集损害的骨髓期间以及癌腹水分流期间抑制肿瘤细胞散布中有治疗应用。在诊断上，肿瘤样本中不产生TIMP-3及其转移潜力之间的相关性可用作预后指标以及可能的预防疗法的指标。

MMP也作用于脑中的基膜和紧密连接蛋白质，作为打开血脑屏障(BBB)途径的一部分，有助于炎症细胞和可溶介体进入脑部。因此，本发明组合物和方法可以用于治疗特征为BBB透化过量或不恰当的神经系统病症的治疗。此外，神经元周围的基质蛋白质的降解可能导致联络中断和细胞死亡；因此，公开的TIMP-3组合物可以通过保护神经细胞周围的基膜而防止神经细胞受破坏。本发明的TIMP-3组合物可用于治疗或缓解对损伤(例如，脑缺血或外伤性脑损伤)的神经炎性反应。本文中公开的组合物也可用于治疗神经退行性疾病(其中炎症是所述疾病的潜在的原因，例如，多发性硬化)，以及治疗各种形式的神经病和/或肌病、脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。因此，本发明组合物的用途可以涉及与BDNF、NT-3、NGF、CNTF、NDF、 SCF或其他神经细胞生长或增殖调节因子共同施用。此外，本发明组合物和方法可能适用于整形目的，这是因为局部抑制结缔组织分解可以改变组织的外观。

TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物可以在体外操作中使用或体内施用以增加内源性TIMP-3活性和/或提高TIMP-3诱导的生物活性。本发明的TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物在内源性 TIMP-3下调或存在水平低的情况下体内使用。因此可以治疗由TIMP-3可抑制蛋白酶(直接或间接)导致或加剧的病症(其实例在本文中提供)。在一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括对有需要的哺乳动物体内施用可有效提高TIMP-3诱导的生物活性的量的TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物。在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗方法，其包括对有需要的哺乳动物体内施用可有效提高内源性TIMP-3水平的量的TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物。

在另一个方面中，本发明提供具有改善的体内半衰期的TIMP-3 多肽、变体、突变蛋白或衍生物。在一个实施方案中，TIMP-3突变蛋白的半衰期是天然TIMP-3半衰期的至少两倍；在另一个实施方案中，半衰期比天然TIMP-3半衰期大至少三倍、四倍、五倍、六倍、八倍或十倍。在一个实施方案中，半衰期是在非人哺乳动物中测定的；在另一个实施方案中，半衰期是在人受试者中测定的。其他实施方案提供具有体内至少一天的半衰期(例如，对人受试者施用时)的TIMP-3 突变蛋白或变体。在一个实施方案中，TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物具有至少三天的半衰期。在另一个实施方案中，TIMP-3 多肽、变体、突变蛋白或衍生物具有四天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物具有八天或更长的半衰期。

在另一个实施方案中，衍生或修饰的TIMP-3多肽、变体或突变蛋白以使它相较于未衍生或未修饰的TIMP-3结合蛋白具有较长的半衰期。衍生多肽可包含将所需性质(诸如在特定用途中增加的半衰期) 赋予多肽的任何分子或物质。衍生多肽可包含例如可检测(或标记)部分(例如，放射性、比色、抗原或酶分子、可检测珠粒(诸如磁性或电子致密珠粒(例如，金珠粒))，或结合另一分子的分子(例如，生物素或链霉亲和素)，治疗或诊断部分(例如，放射性、细胞毒性或药学活性部分)，或增加多肽对于特定用途(例如，施用于受试者(诸如人受试者)，或其他体内或体外用途)的适应性的分子)。

在一个这种实例中，用特异性结合关节软骨组织的配体将多肽衍生化，例如WO2008063291和/或Rothenfluh等，Nature Materials 7：248 (2008)中公开的。可用于衍生多肽的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。多肽的白蛋白连接的和PEG化的衍生物可以使用本领域熟知的技术制备。在一个实施方案中，将多肽缀合或以其它方式连接于转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体。TTR或 TTR变体可以例如用选自由以下组成的组的化学物质进行化学修饰：右旋糖酐、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇(美国专利申请号20030195154)。

组合物

本发明还包括包含有效量的本发明的多肽产品(即，TIMP-3多肽、变体、突变蛋白或衍生物)连同可药用的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或TIMP-3疗法中有用的载体(即，其中提高内源性 TIMP-3水平或增加内源性TIMP-3活性有用的条件)的药物组合物。此类组合物包括各种缓冲液内容物(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、 pH值和离子强度的稀释剂；添加剂，诸如除垢剂和助溶剂(例如， Tween 80，聚山梨酸酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，硫柳汞、苄醇)和增量物质(例如，乳糖、甘露醇)；将诸如聚乙二醇等聚合物共价连接到蛋白质(如上述讨论，参见，例如美国专利4,179,337，在此以引用方式引入)；将所述材料并入聚合物 (诸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的颗粒制剂中或脂质体中。此类组合物会影响TIMP-3结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版 (1990，MackPublishing Co.，Easton，Pa.18042)第1435-1712页，将其在此以引用方式并入本文。

一般来讲，本发明多肽的有效量可通过受者的年龄、体重和疾病的状态或严重程度确定。参见，Remingtons Pharmaceutical Sciences，上述，第697-773页，以引用的方式并入本文。通常，可以使用约 0.001g/kg体重至约1g/kg体重之间的剂量，但是有经验的从业者会认识到，可以使用或多或少的剂量。对于局部(即，非全身性)应用，如局部或关节内应用，剂量可以在约0.001g/cm²至约1g/cm²之间。投药可以是每天一次或多次，或更少，并且可以与如本文所述的其他组合物一起。应该注意本发明不限于本文中叙述的剂量。

正如相关领域中所理解，以适合于适应症的方式对受试者施用包含本发明分子的药物组合物。药物组合物可以通过任何合适的技术施用，包括但不限于肠胃外、局部(topically)、局部(1ocally)或经吸入。如果注射的话，则所述药物组合物可以例如经由静脉内、肌内、病灶内、腹腔内或皮下途径，通过快速浓注或连续输注来施用。

涵盖例如在疾病或损伤的位点处的局部施用，以及来自植入物的透皮递送和缓释。其他替代方案包括眼药水；口腔制剂，包括丸剂、糖浆、锭剂或口香糖；以及局部制剂，如洗剂、凝胶、喷雾剂和软膏。例如，对关节或肌肉骨胳系统的局部施用包括关节周围、关节内、粘液囊内、软骨内、滑膜内和腱内施用。对呼吸系统施用包括肺内、胸膜内(intraplural)、肺内、气管内、窦内(intrasinal)和支气管内输送，并且可以例如通过吸入器或喷雾器来促进。本文中还涵盖鞘内输送和对向脑部和/或神经系统中引入组合物有用的其他方法，例如，硬膜外、硬膜内或硬膜周围施用，以及神经周围、尾部内、脑内、脑池内和脊柱内施用。

局部施用的其他实例包括结合手术或另一种医学操作对组织输送。例如，在治疗或改善心脏症状的手术期间或在诸如心导管插入术 (例如，经皮冠状动脉介入)期间可以对心脏组织施用药物组合物。递送可以是经由例如冠状动脉内、心内、心肌内和/或经心内膜途径，并且可以通过要注射的心脏区域的心内或电动机械图像或通过使用其他技术(如磁共振成象(MRI））指导。组合物还可以经由包含于心脏补片中或于支架或对心脏病状有用的其他装置的涂层中来递送。

除了滴眼剂之外，还涵盖使用软膏、乳膏或凝胶对眼睛施用本发明组合物。直接对眼睛内部施用可以通过眼周、结膜、角膜内、结膜下、球筋膜下(subtenons)、眼球后、眼内和/或玻璃体内注射或施用实现。这些和其他技术例如在Gibaldi’s Drug DeliverySystems in Pharmaceutical Care(2007，American Society of Health-SystemPharmacists，Bethesda，MD)中有讨论。

为了保持胞外基质和组织的动态平衡，许多剂协调发挥作用。在平衡偏离的病状的治疗中，一种或多种其他剂可以与本发明多肽一起使用。这些其他剂可以共同施用或依次施用，或以其组合来施用。一般来讲，这些其他剂可以选自由金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、基质降解酶抑制剂、胞内酶、细胞粘附调节剂和调节胞外基质降解蛋白酶及其抑制剂的表达的因子组成的列表。虽然下面列出特定的实例，本领域技术人员会认识到完成等价功能的其他剂，包括其他剂，或列出的剂的其他形式(如通过合成、经由重组DNA技术产生的那些、以及类似物和衍生物)。

如果希望胞外基质降解更高或更特异性的预防，还可以使用其他降解抑制剂。抑制剂可以选自由α₂巨球蛋白、妊娠区带蛋白、卵固蛋白、α₁蛋白酶抑制因子、α₂抗血纤维蛋白酶、抑蛋白酶肽、蛋白酶连接素-1、纤溶酶原激活因子抑制剂(PAI)-1、PAI-2、TIMP-1和TIMP-2 组成的组。本领域技术人员会认识到可以使用其他的抑制剂。

胞内酶也可以与本发明多肽一起使用。胞内酶还可以影响胞外基质降解，并且包括溶酶体酶、糖苷酶和组织蛋白酶。

细胞粘附调节剂也可以与本发明多肽组合使用。例如，人们可能在使用本发明多肽抑制胞外基质降解之前、期间或之后调节对胞外基质的细胞粘附。对胞外基质显示细胞粘附的细胞包括破骨细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、杀伤性T细胞和肥大细胞。细胞粘附调节剂包括含有“RGD”基序或类似物或模拟物拮抗剂或激动剂的肽。

调节胞外基质降解蛋白酶表达的因子及其抑制剂包括细胞因子，如IL-1和TNF-α、TGF-β、糖皮质激素和类视黄醇。如果希望的作用是使用本发明多肽抑制胞外基质降解，连同这些细胞作用，也可以使用影响细胞增殖和/或分化的其他生长因子。例如，在炎症期间，人们可能希望维持胞外基质(借助于抑制酶活性)又希望产生嗜中性粒细胞；因此可以施用G-CSF。其他因子包括促红细胞生成素、白细胞介素家族成员、SCF、M-CSF、IGF-I、IGF-II、EGF、FGF家族成员如 KGF、PDGF及其他。人们此外可能希望干扰素的活性，如干扰素α、β、γ或复合干扰素的活性。细胞内剂包括G-蛋白质、蛋白激酶C和肌醇碱性磷酸酶。使用本发明多肽可以与一种或多种涉及炎症疗法的剂提供治疗益处。

还可以使用细胞运输剂。例如，炎症涉及胞外基质的降解，以及细胞向损伤位置的运动或运输。胞外基质降解的预防可以防止这些细胞运输。因此本发明多肽连同细胞运输调节剂的激动剂或拮抗剂一起使用在治疗炎症中可能是希望的。细胞运输调节剂可以选自由内皮细胞表面受体(如E-选择素和整联蛋白)；白细胞表面受体(L-选择素)；趋化因子和化学引诱剂组成。对于涉及炎症的组合物的综述，参见 Carlos等，Immunol.Rev.114：5-28(1990)，将其以引用方式并入本文。

此外，组合物可以包括neu分化因子(“NDF”)，治疗方法可以包括在施用TIMP-3之前、同时或之后施用NDF。已经发现NDF刺激 TIMP-2的产生，并且NDF、TIMP-1、TIMP-2和/或TIMP-3可以在治疗肿瘤中提供益处。

本发明的多肽产品可以通过与可检测的标记物质(例如，用¹²⁵I 放射性标记，或用荧光团如

[LifeTechnologies，Grand Island NY]标记)缔合“标记”，从而提供在固体组织和流体样品(如血液或尿液)中TIMP-3的检测和定量中有用的试剂。例如，本发明的核酸产品还可以用可检测标记物(如放射性标记和非同位素标记，如生物素)标记并且在杂交过程中使用以鉴别相关基因。

如上所述，本发明的TIMP-3多肽、变体突变蛋白或衍生物组合物在各种病症中有广泛的应用。因此，本文中涵盖的另一个实施方案是包括本发明组合物和任选一种或多种上述用于治疗涉及胞外基质降解的病症的其他组合物的试剂盒。又一个实施方案是在所述包装材料内包括包装材料和药剂的制品，其中所述药剂包含本发明多肽、变体、突变蛋白或衍生物并且其中所述包装材料包括标明TIMP-3治疗用途的标签。在一个实施方案中，所述药剂可以用于选自由以下组成的组的适应症：癌症、炎症、关节炎(包括骨关节炎等)、营养不良性大疱型表皮松解症、牙周病、溃疡、肺气肿、骨病症、硬皮病、创伤愈合、红细胞缺陷、整形组织再建、受精或胚胎植入调节和神经细胞病症。这种制品可以任选包括其他组合物或其他组合物的标签描述。

提供以下实施例以用于说明本发明的具体实施方案或特征并且不欲限制其范围。

实施例1：

本实施例描述了用于测定产生的TIMP-3中的突变对在哺乳动物表达系统中表达的作用(如果有的话)的方法。本实施例描述了一般的载体和宿主细胞系统，众多载体和宿主细胞系统是本领域已知，本文中描述的，并且适于测定TIMP-3序列中的特定突变对重组蛋白表达的作用(如果有的话)。

一般来讲，TIMP-3编码DNA在常规条件下连接到表达载体中 (即，TIMP-3编码DNA可操作连接到载体中的其他序列以便可表达)，并且用所述载体转化或转染合适的哺乳动物细胞。在适当的条件下培养转化或转染细胞，并且表达重组蛋白以及例如通过蛋白质印迹或 SDS＝PAGE定性/半定量地评价量，或使用诸如ELSA(R&D Systems， Minneapolis MN)或ForteBio

(Pall ForteBio Corp，Menlo Park， CA)等的测定更定量地评价。以这种方式，可以测定各种突变对哺乳动物细胞表达TIMP-3蛋白、突变蛋白或变体的能力的作用。

如果所发生的突变是向TIMP-3多肽中引入N-连接的糖基化位点，或增强天然糖基化位点，那么可能希望评价糖基化的存在和/或程度。如先前所述转化或转染细胞并且半定量测量(例如蛋白质印迹) 可以用于测定N-连接的糖基化是否成功引入、部分引入或完全引入。

实施例2：

本实施例描述了用于测定TIMP-3中的突变是否导致肝素独立性提高的方法。如先前所述转化或转染细胞，并且在存在或不存在肝素下培养。为了形成肝素依赖性程度的观念，可以添加不同量的肝素。随后测定在各种条件下表达的TIMP-3蛋白、突变蛋白或变体的量，并且作比较以确定特定突变是否对TIMP-3蛋白、突变蛋白或变体从胞外基质释放是否需要肝素有任何作用，或者需要的量或肝素是否降低。

实施例3：

本实施例描述了其中MMP活性通过使用荧光法测量的MMP抑制测定；其他方法在本领域是已知的。例如，在通过活化MMP亚型或亚型特定催化结构域裂解淬灭的MMP亚型5-FAM/QXL 520荧光共振能量转移(FRET)肽底物时荧光信号升高。对于若干不同的MMP 来说，FRET肽可从例如Anaspec，Fremont，CA获得。本文中使用的 TIMP-3蛋白可以是天然TIMP-3或TIMP-3突变蛋白、变体或衍生物；要检测的蛋白称为测试分子。

对于MMP2活性测定，在37℃下用1mM 4-氨基苯基乙酸汞 (APMA，Anaspec，Fremont，CA)活化人pro-MMP2(Anaspec，Fremont， CA)1小时，随后在37℃下用供应商提供的在测定缓冲液中的MMP2 敏感性5-FAM/QXL 520 FRET肽相对在黑色384孔Optiplate(PerkinElmer，Waltham，MA)中的各种浓度的测试分子孵育。孵育2小时之后，在EnVision多标记微盘读数器(PerkinElmer，Waltham，MA) 上在激发(490nm)和发射(520nm)下测定来自反应板的荧光信号。在 GraphPad Prism 5.0(GraphPad，San Diego，CA)中相对所测试的测试分子浓度绘制相对荧光单位(RFU)的数据，从而估算半数最大抑制常数 (IC50)。

对于MMP9活性测量结果，在37℃下在黑色384孔 Optiplate(PerkinElmer，Waltham，MA)中用MMP9敏感性5-FAM/QXL 520FRET肽和各种浓度的测试分子孵育人MMP9催化结构域(Anaspec，Fremont，CA)。孵育2小时之后，在EnVision多标记微盘读数器(PerkinElmer，Waltham，MA)上在激发(490nm)和发射(520nm)下测定荧光信号。在GraphPadPrism 5.0(GraphPad，San Diego，CA)中相对所测试的测试分子浓度绘制相对荧光单位(RFU)的数据，从而估算半数最大抑制常数(IC50)。

对于MMPl3活性，在测定缓冲液(20mM Tris，10mM CaCl₂，10uM ZnCl₂，0.01％Brij35(Calbiochem/EMD，San Diego，CA)pH 7.5)中滴定测试分子并且添加到黑色聚苯乙烯96或384孔测定板(Griener Bio-One，Germany)中。在测定缓冲液中稀释活性MMPl3(Calbiochem/EMD)并添加到测试分子滴定中且在室温下在50μL最终体积中孵育10分钟。可选地，在37℃下用APMA将pro-MMP-13(R&D Systems，Minneapolis，MN)活化2小时，并且在测定中使用。制备荧光底物，如Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2荧光MMP底物或 Mca-KPLGL-Dpa-AR-NH2荧光肽底物(R&D Systems)，并且添加到 MMP-13酶/huTIMP-3/测试分子溶液中。在动力学上测定MMP-13活性，例如使用Molecular Devices荧光板读数器(或同等物)进行20分钟。

所测试的分子的作用可以表示为MMP酶活性的预期最大 TIMP-3抑制的百分比。可选地，MMP抑制活性的定量评价可能是不需要的；更确切地，单个测试分子可以评价它们是否抑制MMP。本领域技术人员认识到，本文中列出的参数可以由常规实验的应用改变。例如，使用先前测试的TIMP-3和其他材料进行初步实验，从而确定MMP或pro-MPP的合适浓度。类似地，也可以确定底物的类型和合适的浓度。因此，例如，可以滴定MMP并且与先前测试批次的 MMP比较以优化测定参数。此外，本领域技术人员可以利用类似的测定评价各种TIMP-3突变对TIMP-3突变蛋白或变体抑制其他MMP 的能力的作用(如果有的话)。

实施例4

使用分子生物学标准技术，制备编码众多TIMP-3突变蛋白的核酸并且在哺乳动物细胞中表达，基本上如先前所述。评价突变对编码的TIMP-3突变蛋白的表达的作用。发生的突变的列表包括：

G115T、N118D；K45E、K49S；K45E、K49E；K45E、T63E； K45E、Q80E；T63E、H78E；K45E、T63E、H78E；T63E、H78E、 Q80E；K45E、T63E、H78E、Q80E；T63E、H78D；T63E、T74E、 H78E；T63E、T74E、H78D；L51T、T74E、H78D；T74E、H78E、 Q80E；T74E、H78D、Q80E；R43T、T74E、H78D、Q80E；R43E、 T74E、H78D、Q80E；R43N、K45T；K45N、V47T；K49N、L51T； K65N、M67T；K75N、P77T；R43N、K45T、K49N、L51T；K45N、 V47T、K49N、L51T；R43N、K45T、T63E、T74E、H78E；K45N、 V47T、T63E、T74E、H78E；K49N、L51T、T63E、T74E、H78E； K45E、K49N、L5lT、T63E；R43T、K49N、L51T、T74E、H78D； R43N、K45T、T74E、H78E；K49N、L51T、T74E、H78E；R43N、 K45T、K49N、L51T、T74E、H78E；Q32N、A34T；S38D、D39T； R43N、K45T；V47N、K49T；K49N、L51T；K50N、V52T；L51N、 K53T；F57N；P56N、G58T；T63N、K65T；P56N、G58T、T63N、 K65T；M67N、M69T；H78N、Q80T；T84N、A86T；K94N、E96T； E96N、N98T；V97N、K99T；K99N、Q101T；T105N、R107T；D110N、 K112T；E122N、W124T；R123N、D125T；Q126N；T128N；Q131N、 K133T；R132N G134T；R138N、H140T；R138T；H140N、G142T； K142T；K146N、K148T；T158N、K160T；T166N、M168T；M168N； G173T；HSl79N、H181T；H181N、A183T；R186N、K188T；R196N、 W198T；P200N、D202T；P20lN、K203T；D202N；A208Y；A208V； K45S、F57N；K49S、F57N；K68S、F57N；K133S、F57N；K45S、 K133S、F57N；和K49S、K68S、F57N。

对所表达的突变蛋白进行其他评价，并且如下所述。涵盖其他突变蛋白，包括K49E、K50E、K53E、K99E、R186Q、K188Q；K49S、K50N/V52T、K53E、V97N/K99T、R186N/K188T；K50N/V52T、 V97N/K99T、R186N/K188T；K49E、K53E、K188Q；K50N/V52T、 R186N/K188T；K50N/V52T、F57N、R186N/K188T；K45S、K50N/V52T、 F57N、R186N/K188T；K50N/V52T、F57N、T63N/K65T、R186N/K188T；K45S、K50N/V52T、F57N R186N/K188T；K45S、K49S、K50N/V52T、 F57N Rl86N/Kl 88T；K49S、K50N/V52T、F57N、V97N/K99T、 R186N/K188T；K45S、K50N/V52T、F57N、V97N/K99T、R186N/K188T。这些突变蛋白可以如本文所述制造和测试。

实施例5：

此表总结了用在哺乳动物细胞中表达的众多TIMP-3突变蛋白获得的表达和MMP抑制结果。对于“哺乳动物表达对比WT”，数据记录为‘+’，表示表达基本上与野生型(或天然)TIMP-3相同；‘++’表示表达比用野生型TIMP-3观察到的提高2-4倍，且‘+++’表示表达比野生型TIMP-3提高4倍以上。在提及酶抑制的列中的标识‘---’表示这些测试没有进行。说明与观察到的野生型TIMP-3表达相比的表达倍数升高的表达水平升高是定性地通过使用蛋白质印迹或SDS-PAGE考马斯染色凝胶，或通过使用捕获TIMP-3的抗TIMP-3抗体利用ForteBio

读数器测量的表达效价测量结果来确定(这些抗体是公开可利用的，例如购自EMD Millipore，Billerica，MA：

， Cambridge，MA；或R&D Systems，Minneapolis，MN)。

表1

这些突变中的某些与在哺乳动物细胞中的野生型TIMP-3相比显示表达提高：T63E、T74E、H78E；T63E、T74E、H78D；K65N、M67T；K45N、V47T、T63E、T74E、H78E；K49N、L51T、T63E、 T74E、H78E；K49N、L51T、T74E、H78E；K49N、L51T；K50N、 V52T；L51N、K53T；T63N、K65T；K75N、P77T；H78N、Q80T； K94N、E96T；D110N、K112T；Q126N；R138T；G173T；F57N； P56N、G58T；P56N、G58T；T63N、K65T；K45S、F57N；K49S、F57N；K68S、F57N；K133S、F57N；K45S、K133S、F57N；和K49S、 K68S、F57N。在这些当中，子集(F57N；P56N、G58T；P56N、G58T； T63N、K65T；K45S、F57N；K49S、F57N；K68S、F57N；K133S、 F57N；K45S、K133S、F57N；和K49S、K68S、F57N)表达水平是用野生型TIMP-3观察到的表达水平的四倍或四倍以上。

对于一些突变蛋白和野生型TIMP-3(WT)在MMP活性结果上进行了详细比较；这些结果在下面显示。

表2

实施例6

这个实施例描述了通过激发荧光细胞分选器(FACS)分析评价 TIMP-3蛋白结合HTB-94TM细胞(购自American Type Culture Collection，Manassas，VA的软骨细胞细胞系)的能力。在37C，5％CO₂下的HTB-94培养基(含有10％胎牛血清[FBS]和2IBM L谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM)中培养HTB-94细胞。在染色之前将细胞以2.5x10⁴个细胞/ml的细胞密度接种在标准组织培养瓶中达6-12周，并且在经由胰酶消化从瓶中除去之后每3-4天传代一次。在FACS染色之前大约16小时，将HTB-94细胞以100,000个细胞每孔接种在标准组织培养12孔板中的2ml体积HTB94培养基中并且在37C，5％CO₂下孵育。在染色之前细胞是80-90％融合的。

大约16小时之后，通过抽吸从12孔板除去HTB94培养基并且每个孔施加1ml 4C染色缓冲液(磷酸盐缓冲盐水[PBS]2％FBS 0.15％NaN₃)。将细胞板在冰上孵育1h。抽吸染色缓冲液并且添加在染色缓冲液中稀释的80μg/ml的TIMP-3HIS-Myc标记蛋白质(天然TIMP-3或TIMP-3变体)，0.9ml/孔；向阴性对照孔中仅添加相同体积的缓冲液。将细胞板在冰上孵育30min，抽吸并且用1ml/孔染色缓冲液洗涤两次。第二次洗涤之后抽吸缓冲液，添加在染色缓冲液中稀释到 20ug/ml的小鼠抗pentaHIS AlexaFluor488缀合抗体(Qiagen，Valencia， CA)，0.9ml/孔。平行地，向用已知结合剂TIMP3HIS-Myc（例如， K45S、F57N，SEQID NO：23)染色的复制孔平行地添加在染色缓冲液中稀释到20μg/ml的不相关的mIgG₁AlexaFluor488缀合抗体 (eBioscience，San Diego，CA)阴性对照染色试剂。

将细胞板在冰上孵育30min同时避光保存，抽吸并且用1ml/孔染色缓冲液冲洗两次。第二次冲洗之后抽吸缓冲液，每个孔添加1mL 细胞解离缓冲液(无酶，PBS，目录号13151-014；Life Technologies， Grand Island NY)。在37C下孵育细胞板5min，并且将细胞转移至4ml FACS管中。用1ml/孔25C PBS冲洗板孔并且将冲洗液添加到含有在细胞解离缓冲液中的细胞的相应FACS管中。在1000RPM下将管离心5min以形成细胞沉淀并且抽吸。将细胞再悬浮在300μL在PBS中的4％多聚甲醛(PFA)中并且可以在4C避光储存直到在FACS上试验。

在TIMP3染色的两天之内，例如在使用FL1检测AlexaFluor488 荧光的BectonDickinson FACS Calibur上获取8000个固定的HTB94 细胞事件。正向散射(FSC)检测器的电压设定在E00，侧向散射(SSC) 检测器的电压设定在316。组合使用，这些检测器测量细胞的反射的光为‘正向散射’和‘侧向散射’，这允许限定HTB-94细胞门，也称为‘门控’，并且根据细胞大小和粒度与管中的非细胞材料分开。FL1检测器的电压设定在370。测定是例如使用FlowJo vX.0.6完成的。

以这种方式分析一些TIMP-3变体与HTB-94结合；两个不同实验的结果在下面的表3中展示(n.a.＝不适用；n.d.＝未完成)。九个 TIMP3HIS-Myc标记的糖变体没有显示与HTB-94细胞结合，因为对于描述方法来说没有检测到超过背景的FL1信号。结果在下面表3中展示。

实施例7：

此表总结了用在哺乳动物细胞中表达的众多TIMP-3突变蛋白获得的表达和MMP抑制结果。

表3：TIMP-3突变蛋白的表达和活性

1：产率相对于野生型(WT)TIMP-3的产率；“-“表示观察到的表达水平小于野生型TIMP-3的表达水平；“+”表示观察到的水平与野生型TIMP-3的表达水平相似；“++”和“+++”表示表达水平大于和显著大于野生型TIMP-3的表达水平

2：活性在WTTIMP-3活性10倍之内

3：改变是对比相应的MMP活性的倍数降低(提高)

此表总结了哺乳动物细胞中表达的众多TIMP-3突变蛋白的糖基化位点和其他特征。

表4：TIMP-3突变蛋白的糖基化和特征

4：数字表示引入突变蛋白中的N-糖基化位点的数目，除了任何天然N-糖基化位点之外

5：肝素独立性是是/否(yes/no)特征，其显示在不存在肝素的情况下TIMP-3突变蛋白是否分泌到培养基中，如实施例2中所述。

*发生在残基208和/或205处的突变以便于在TIMP-3中的天然 N-糖基化位点的糖基化

涵盖其他突变蛋白，包括K45S、F57N、D110N、K112T；K45S、 F57N、H78N、Q80T、D110N、K112T；K45S、F57N、H78N、Q80T、 D110N、K112T、Q126N；K45S、F57N、H78N、Q80T、K94N、E96T Q126N；K45S、F57N、H78N、Q80T、Q126N、G173T；K45S、F57N、 T63N、K65T；K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T；K45S、 F57N、T63N、K65T、R138T、G173T；K45N、V47T、F57N、T63N、K65T、R138T、G173T；K45S、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、 R138T；K45N、V47T、F57N、T63N、K65T、K94N、E96T、R138T； K45S、F57N、Q126N、R138T、G173T；P56N、G58T、T63N、K65T、 K94N、E96T、Q126N、G173T；P56N、G58T、T63N、K65T、D110N、 K112T、Q126N、G173T；K49S、K50N、V52T、K53E、V97N、K99T、 R186N、K188T；K50N、V52T、V97N、K99T、R186N、K188T； K49E、K53E、K188Q；K50N、V52T、R186N、K188T；K50N、V52T、 F57N、R186N、K188T；K45S、K50N、V52T、F57N、R186N、K188T；K50N、V52T、F57N、T63N、K65T、R186N、K188T；K45S、K50N、 V52T、F57N R186N、K188T；K45S、K49S、K50N、V52T、F57N R186N、 K188T；K49S、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T、R186N、K188T； K45S、K50N、V52T、F57N、V97N、K99T、R186N、K188T；K45E、 K50N、V52T、D110N、K112T、R138T、G173T、K188E；K45E、 F57N、D110N、K112T、R138T、G173T、K188E；K45E、K50N、 V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、K188E；K45E、F57N、 K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、K188E；K45E、K50N、V52T、 D110N、K112T、R138T、G173T、R186N、K188T；K45E、F57N、 D110N、K112T、R138T、G173T、R186N、K188T；K45E、K50N、 V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186N、K188T； K45E、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186N、K188T； K45E、K50N、V52T、D110N、K112T、R138T、G173T、R186Q、 K188Q；K45E、F57N、D110N、K112T、R138T、G173T、R186Q、 K188Q；K45E、K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、 R186Q、K188Q；K45E、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、 R186Q、K188Q；K45E、K50N、V52T、D110N、K112T、R138T、 K188E；K45E、F57N、D110N、K112T、R138T、K188E；K45E、 K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、K188E；K45E、F57N、 K94N、E96T、D110N、K112T、K188E；K45E、K50N、V52T、D110N、 K112T、R138T、R186N、K188T；K45E、F57N、D110N、K112T、 R138T、R186N、K188T；K45E、K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、 K112T、R186N、K188T；K45E、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R186N、K188T；K45E、K50N、V52T、D110N、K112T、R138T、 R186Q、K188Q；K45E、F57N、D110N、K112T、R138T、R186Q、 K188Q；K45E、K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、 K188Q；K45E、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、K188Q； K50N、V52T、D110N、K112T、R138T、G173T、K188E；K45S、 F57N、D110N、K112T、R138T、G173T、K188E；K50N、V52T、 K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、K188E；K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、K188E；K50N、V52T、D110N、 K112T、R138T、G173T、R186N、K188T；K45S、F57N、D110N、 K112T、R138T、G173T、R186N、K188T；K50N、V52T、K94N、 E96T、D110N、K112T、G173T、R186N、K188T；K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186N、K188T；K50N、 V52T、D110N、K112T、R138T、G173T、R186Q、K188Q；K45S、 F57N、D110N、K112T、R138T、G173T、R186Q、K188Q；K50N、 V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186Q、K188Q； K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186Q、K188Q； K50N、V52T、D110N、K112T、R138T、K188E；K45S、F57N、D110N、 K112T、R138T、K188E；K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、 K188E；K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、K188E；K50N、 V52T、D110N、K112T、R138T、R186N、K188T；K45S、F57N、 D110N、K112T、R138T、R186N、K188T；K50N、V52T、K94N、 E96T、D110N、K112T、R186N、K188T；K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R186N、K188T；K50N、V52T、D110N、K112T、 R138T、R186Q、K188Q；K45S、F57N、D110N、K112T、R138T、 R186Q、K188Q；K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、 K188Q；K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、K188Q； K50N、V52T、K94N、E96T、D110N、K112T、R138T、G173T；K50N、 V52T、K94N、E96T、R138T、G173T；K45E、F57N、K94N、E96T、 D110N、K112T、R138T、G173T；K45E、F57N、K94N、E96T、R138T、 G173T；K45S、F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R138T、G173T； K45S、F57N、K94N、E96T、R138T、G173T；K45N、V47T、、H78N、 Q80T、Q126N、R186Q、K188Q；K45N、V47T、F57N、H78N、Q80T、 Q126N、R186Q、K188Q；K45N、V47T、F57N、H78N、Q80T、K94N、 E96T、Q126N；K45N、V47T、F57N、H78N、Q80T、Q126N、R138T； K45N、V47T、F57N、H78N、Q80T、R138T、R186Q、K188Q；K45N、 V47T、F57N、H78N、Q80T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、 K188Q；K50N、V52T、K94N、E96T、H78N、Q80T、R138T；K50N、V52T、K94N、E96T、H78N、Q80T、R138T、R186Q、K188Q；K45E、 F57N、Q126N、R138T、R186Q、K188Q；K45N、V47T、F57N、Q126N、 R138T、R186Q、K188Q；K45N、V47T、F57N、H78N、Q80T、R186Q、 K188Q；K45S、F57N、H78N、Q80T、Q126N、R138T、R186Q、K188Q； K45S、F57N、H78N、Q80T、K94N、E96T、R138T、R186Q、K188Q； K50N、V52T、K94N、E96T、H78N、Q80T、R138T；K45N、V47T、 F57N、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、K188Q；K45S、F57N、 H78N、Q80T、K94N、E96T、R138T；K45N、V47T、F57N、K94N、 E96T、D110N、K112T、R186Q；和K45N、V47T、F57N、K94N、 E96T、D110N、K112T、K188Q。其他突变蛋白包括K50N、V52T、 P56N、G58T、R186N、K188T；K45S、K50N、V52T、P56N、G58T、R186N、K188T；K50N、V52T、P56N、G58T、T63N、K65T、R186N、 K188T；K45S、K50N、V52T、P56N、G58T R186N、K188T；K45S、 K49S、K50N、V52T、P56N、G58T R186N、K188T；K49S、K50N、 V52T、P56N、G58T、V97N、K99T、R186N、K188T；K45S、K50N、 V52T、P56N、G58T、V97N、K99T、R186N、K188T；K45E、P56N、 G58T、D110N、K112T、R138T、G173T、K188E；K45E、P56N、 G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、K188E；K45E、K50N、 V52T、D110N、K112T、R138T、G173T、R186N、K188T；K45E、 P56N、G58T、D110N、K112T、R138T、G173T、R186N、K188T； K45E、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、R186N、 K188T；K45E、P56N、G58T、D110N、K112T、R138T、G173T、 R186Q、K188Q；K45E、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、 G173T、R186Q、K188Q；K45E、P56N、G58T、D110N、K112T、 R138T、K188E；K45E、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、K188E；K45E、P56N、G58T、D110N、K112T、R138T、R186N、 K188T；K45E、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186N、 K188T；K45E、P56N、G58T、D110N、K112T、R138T、R186Q、 K188Q；K45E、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、 K188Q；K45S、P56N、G58T、D110N、K112T、R138T、G173T、K188E；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、G173T、 K188E；K45S、P56N、G58T、D110N、K112T、R138T、G173T、 R186N、K188T；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、 G173T、R186N、K188T；K45S、P56N、G58T、D110N、K112T、 R138T、G173T、R186Q、K188Q；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、 D110N、K112T、G173T、R186Q、K188Q；K45S、P56N、G58T、D110N、K112T、R138T、K188E；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、 D110N、K112T、K188E；K45S、P56N、G58T、D110N、K112T、 R138T、R186N、K188T；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186N、K188T；K45S、P56N、G58T、D110N、K112T、 R138T、R186Q、K188Q；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、 K112T、R186Q、K188Q；K45E、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、R138T、G173T；K45E、P56N、G58T、K94N、E96T、R138T、 G173T；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、R138T、 G173T；K45S、P56N、G58T、K94N、E96T、R138T、G173T；K45N、V47T、P56N、G58T、H78N、Q80T、Q126N、R186Q、K188Q；K45N、 V47T、P56N、G58T、H78N、Q80T、K94N、E96T、Q126N；K45N、 V47T、P56N、G58T、H78N、Q80T、Q126N、R138T；K45N、V47T、 P56N、G58T、H78N、Q80T、R138T、R186Q、K188Q；K45N、V47T、 P56N、G58T、H78N、Q80T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、 K188Q；K45E、P56N、G58T、Q126N、R138T、R186Q、K188Q； K45N、V47T、P56N、G58T、Q126N、R138T、R186Q、K188Q；K45N、 V47T、P56N、G58T、H78N、Q80T、R186Q、K188Q；K45S、P56N、 G58T、H78N、Q80T、Q126N、R138T、R186Q、K188Q；K45S、P56N、 G58T、H78N、Q80T、K94N、E96T、R138T、R186Q、K188Q；K45N、 V47T、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q、K188Q； K45S、P56N、G58T、H78N、Q80T、K94N、E96T、R138T；K45N、 V47T、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、R186Q；和 K45N、V47T、P56N、G58T、K94N、E96T、D110N、K112T、K188Q。这些突变蛋白可以如本文所述制造和检测。

Claims

1.一种分离的组织抑制剂金属蛋白酶3（TIMP-3）突变蛋白，所述突变蛋白具有MMP抑制活性，其中所述突变蛋白与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比仅具有突变F57N。

2.一种分离TIMP-3突变蛋白，其具有MMP抑制活性，其中所述突变蛋白与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比仅具有突变F57N和K45S。

3.一种编码根据权利要求1-2中任一项所述的TIMP-3突变蛋白的分离核酸。

4.一种包含如权利要求3所述的分离核酸的表达载体。

5.一种用如权利要求4所述的表达载体转化或转染的分离宿主细胞。

6.一种产生重组TIMP-3突变蛋白的方法，其包括在促进所述TIMP-3突变蛋白表达的条件下培养如权利要求5所述的转化或转染的宿主细胞，以及回收所述TIMP-3突变蛋白。

7.一种包含如权利要求1-2中任一项所述的TIMP-3突变蛋白和生理学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体的组合物。

8.足够量的如权利要求7所述的组合物在制备适用于治疗病状的药物中的用途，所述病状中基质金属蛋白酶(MMP)起成因或加重的作用，其中所述病状选自由以下组成的组：营养不良性大疱型表皮松解症、假性痛风、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、牙周病、溃疡、手术后创伤愈合、再狭窄、肺气肿、骨佩吉特氏病、骨质疏松、硬皮病、褥疮中的骨或组织的压迫性萎缩、胆脂瘤、异常创伤愈合、肠道致病关节炎、反应性关节炎、莱特尔氏综合征、SEA综合征、银屑病关节炎、脉管炎、肌炎、韦格纳肉芽肿、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化症、干燥综合征、银屑病、皮炎、狼疮、斯蒂尔病、重症肌无力、炎性肠病、与血清阴性关节病有关的肠病、显微或胶原结肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、或直肠结肠切除术和回肠肛管吻合术后造成的囊炎、胰腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、乳腺炎、胆囊炎、胆管炎、胆管周炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、急性呼吸道紊乱综合征、呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、肺动脉高血压、肺部血管收缩、急性肺损伤、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性肺炎、嗜酸细胞性肺炎、支气管炎、过敏性支气管炎支气管扩张、结核、哮喘样病症、类肉瘤、反应性气道疾病综合征、棉尘肺、间质肺病、高嗜酸细胞性综合征、鼻炎、鼻窦炎和寄生肺病、与病毒诱发的病状有关的气道高反应性、Guillain-Barre病、格雷夫斯病、阿狄森氏病、雷诺现象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病、脑缺血、外伤性脑损伤、神经病和脊髓损伤。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述类风湿性关节炎是青年类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、多关节类风湿性关节炎或全身性发作类风湿性关节炎。

10.如权利要求8所述的用途，其中所述溃疡是角膜、表皮或胃溃疡。

11.如权利要求8所述的用途，其中所述狼疮是系统性红斑狼疮。

12.如权利要求8所述的用途，其中所述肌炎是皮肌炎。

13.如权利要求8所述的用途，其中所述动脉炎是结节性多动脉炎。

14.如权利要求8所述的用途，其中所述胆管炎是硬化性胆管炎。

15.如权利要求8所述的用途，其中所述哮喘选自外因性哮喘、内因性哮喘或相关的慢性炎性病状或气道的高反应性或职业性哮喘。

16.如权利要求8所述的用途，其中所述硬化症是原发性胆汁硬化症、动脉粥样硬化、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化。

17.如权利要求8所述的用途，其中所述银屑病是斑块状银屑病、滴状银屑病、反转性银屑病、脓疱性银屑病或红皮病型银屑病。

18.如权利要求8所述的用途，其中所述皮炎是特应性皮炎。

19.如权利要求8所述的用途，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎、克罗恩氏病或脂泻病。

20.足够量的如权利要求7所述的组合物在制备适用于治疗病状的药物中的用途，所述病状中基质金属蛋白酶(MMP)起成因或加重的作用，其中所述病状选自由以下组成的组：骨关节炎、多肌炎和肌病。