KR102258564B1 - 메탈로프로테이나제 타입 3의 조직 억제제(timp-3)의 변이체, 조성물 및 방법 - Google Patents

메탈로프로테이나제 타입 3의 조직 억제제(timp-3)의 변이체, 조성물 및 방법 Download PDF

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정훈 선
제이슨 찰스 오'네일
랜달 알. 켓쳄
랜디 이라 헥트
에드워드 제이. 벨로우스키
마크 레오 마이클스
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암젠 인크
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Abstract

TIMP-3 뮤테인, 변이체 및 유도체, 그들을 암호화하는 핵산, 및 그의 제조 방법과 사용 방법이 기재되어 있다.

Description

메탈로프로테이나제 타입 3의 조직 억제제(TIMP-3)의 변이체, 조성물 및 방법{VARIANTS OF TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE TYPE THREE (TIMP-3), COMPOSITIONS AND METHODS}
관련출원에 대한 상호참조
본 출원은 2013년 3월 14일자로 출원된 미국 가출원 61/782,613; 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가출원 61/798,160; 2013년 3월 18일자로 출원된 미국 가출원 61/802,988; 및 2014년 2월 17일자로 출원된 미국 가출원 61/940,673의 이점을 청구하며, 이들은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 전자포맷으로 서열목록과 함께 출원되어 있다. 서열목록은 크기가 306 KB인, 2014년 3월 11일자로 생성된 A-1827WOPCT_SL31314란 제목의 화일로서 제공된다. 서열목록의 전자포맷 정보는 그의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 메탈로프로테이나제 억제제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 메탈로프로테이나제 3의 조직 억제제 ("TIMP-3") 및 신규하고 유용한 이의 변이체(variants), 뮤테인(muteins) 및 유도체(derivatives)에 관한 것이다.
결합조직 및 관절 연골은 세포외 기질 합성 및 분해의 반대 효과에 의해 역학적 평형으로 유지된다. 기질 분해는 주로 기질 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디신테그린-메탈로프로테이나제 (ADAMTS)를 포함한 메탈로프로테이나제의 효소 작용에 의해 일어난다. 이들 효소가 많은 자연 과정(발생, 형태형성, 골재형성, 상처 치유 및 혈관형성을 포함함)에서 중요하지만, 그들의 증가된 수준을 유도하는 이들 효소의 부조절(disregulation)은 암 및 심혈관 상태에서뿐만 아니라, 류마티스 관절염 및 골관절염을 포함한, 결합조직의 변성 질환에서 치명적인 역할을 하는 것으로 여겨진다.
메탈로프로테이나제의 내인성 억제제는 혈장 알파2-마크로글로불린 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제(TIMP)를 포함하며, 이들 중 인간 게놈에서 암호화되는 것으로 알려진 것이 4개 있다. TIMP-3은 주요 연골-분해 메탈로프로테아제를 모두 억제하며, 다중 라인의 증거들은 그것이 연골을 보호한다고 제시하고 있다. 연골-외식편(cartilage-explant)에 단백질의 부가는 사이토킨-유도 분해를 방지하고, 관절내 주사는 골관절염의 래트 내측 반월상연골 파열 모델에서 연골 손상을 감소시킨다.
MMP의 부조절이 또한 울혈성 심부전에서 발생되며, 수많은 프로염증성(proinflammatory) 과정에서 역할을 하는 것으로 여겨진다. 그러나, MMP 활성의 치료학적 억제제로서 TIMP-3의 개발은 재조합 단백질의 생성 및 TIMP-3의 재조합 형태의 짧은 반감기에 있어서의 챌린지에 의해 방해를 받아왔다. 따라서, 유용한 생성, 정제 및 약동학적/약력학적 특성을 나타내는 TIMP-3의 형태에 대한 필요성이 당 분야에 존재한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본래(native)의 전장(full-length) 인간 TIMP-3 및 문자 "X"가 서열 내에서 특별한 아미노산에 대해 치환된 전장 인간 TIMP-3의 돌연변이 형태의 정렬을 나타낸다. 시그널 서열(signal sequence)은 밑줄이 그어져 있으며, 다른 시그널 서열은 본원에 기술된 바와 같이 이에 따라 치환될 수 있다.
도 2는 본래의 전장 인간 TIMP-3, 및 특정 아미노산 치환이 일어난 TIMP-3 변이체의 정렬을 나타낸다. 시그널 서열이 존재하며, 넘버링의 일관성을 유지하기 위하여 본래의 전장 TIMP-3 서열에 대해 밑줄이 그어져 있고; 다른 시그널 서열은 본원에 기술된 바와 같이 이에 따라 치환될 수 있다.
도 3은 2개의 이차원 폴리펩티드 맵을 나타내며, 여기서 아미노산은 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 위치뿐만 아니라, TIMP-3's N-도메인 (잔기 23 -143) 및 C-도메인 (144-211)을 포함하는 잔기들을 동정하도록 어레이(array)된다.
도 4는 본래의 인간 N-말단 TIMP-3 및 문자 "X"가 서열 내에서 특별한 아미노산에 대해 치환된 인간 N-말단 TIMP3의 돌연변이 형태의 정렬을 나타낸다. 시그널 서열은 밑줄이 그어져 있으며; 다른 시그널 서열은 본원에 기술된 바와 같이 이에 따라 치환될 수 있다. 특정 치환은 N-말단 TIMP-3의 성숙한 형태(mature form)로 고안되었고, "n # m"으로서 본원에 표시되어 있으며, 이때 "n"은 TIMP-3의 본래, N-말단 도메인에서 발견되는 아미노산을 나타내고, "#"은 아미노산 잔기 수를 나타내며, "m"은 치환된 아미노산을 나타낸다('-'은 아미노산이 결실되었음을 나타낸다). 이에 따라, 예를 들어, "K45I는 45번 아미노산 리신(K)이 이솔류신(I)으로 치환되었음을 나타내는 것이다. M67의 결실은 M67-로 나타낸다. 한 쌍 글리신에 의한 잔기 71-77의 치환은 Y70-GG-H78로 나타낸다. 본원에 예시된 인간 TIMP-3의 돌연변이 형태는 다음의 돌연변이(단독으로, 또는 조합되어)를 포함한다: R43F, K45I, K45T, K53T, E54Y, K65T, M67-, K68T, K68I, Y70-GG-H78, H78W. 돌연변이의 특정 조합은: K45I, K53T, E54Y, K65T, M67-, K68T; K45I, K53T, E54Y, M67-, K68I; K45I, K53T, K65T, M67-, K68T; K45I, K53T, M67-, K68I; K45I, K53T, M67-, K68I, H78W; K45I, K65T, K68I; K45I, K65T, M67-, K68T; K45I, K65T, M67-, K68T, H78W; K45I, M67-, K68I, H78W; K45I, M67-, K68T; K45T, K65T, M67-, K68I; K45T, K65T, M67-, K68T; K53T, E54Y; K53T, H78W; R43F, K45I, K65T, K68I를 포함한다.
도 5는 본래의 인간 N-말단 TIMP3 및 문자 "X"가 서열 내에서 특별한 아미노산에 대해 치환된 인간 N-말단 TIMP3의 돌연변이 형태의 정렬을 나타낸다. 시그널 서열은 밑줄이 그어져 있으며; 다른 시그널 서열은 본원에 기술된 바와 같이 이에 따라 치환될 수 있다. 특정 치환은 N-말단 TIMP-3의 성숙한 형태로 고안되었고, "n # m"으로서 본원에 표시되어 있으며, 이때 "n"은 TIMP-3의 본래, N-말단 도메인에서 발견되는 아미노산을 나타내고, "#"은 아미노산 잔기 수를 나타내며, "m"은 치환된 아미노산을 나타낸다('-'은 아미노산이 결실되었음을 나타낸다). 이에 따라, 예를 들어, "K45E'는 45번 아미노산 리신(K)이 글루타민(E)으로 치환되었음을 나타내는 것이다. 본원에 예시된 인간 TIMP-3의 돌연변이 형태는 다음의 돌연변이(단독으로, 또는 조합되어)를 포함한다: T25G; T25H; T25K; T25P; T25R; T25S; T25W; C26A; S27V; S27A; P28A; P28D; P28L; P28S; S29I; H30A; P31A; Q32A; F35A; C36A; N37A; D39A; V41A; I42A; R43A; R43E; R43T; K45E;V46A; G48A; G48S; K49S; K49E; L51E; L51T; K53D; E54S; P56N; L60I; V61Q; T63E; T74E; H78D; H78E; Q80E; G116T; C118A; N119D; C143A; 및 144N-. 돌연변이의 특정 조합은: S27V S29I; V46A G48S K49E L51E K53D E54S P56N L60I V61Q G116T N119D; C26A C118A; C36A C143A; K45E K49E; K45E K49S; K45E Q80E; K45E T63E; K45E T63E H78E; K45E T63E H78E Q80E; L51T T74E H78D; R43E T74E H78D Q80E; R43T T74E H78D Q80E; T63E H78D; T63E H78E; T63E H78E Q80E; T63E T74E H78D; T63E T74E H78E; T74E H78D Q80E; T74E H78E Q80E; Y70-GG-78H를 포함한다.
도 6은 본래 TIMP-2 및 본래 TIMP-3의 정렬을 나타낸다. 상응하는 잔기에서 아미노산의 동일성(Identity)은 서열아래 *로 표시했다.
발명의 요약
한 구현예로, 본 발명은 서열목록번호: 2로 제시된 TIMP-3의 성숙 영역에 대해 아미노산 서열이 적어도 95% 동일한 성숙 영역을 갖고, 적어도 1개의 돌연변이를 가지며, 돌연변이는 K45E; K45N; K45S; V47T; K49N; K49E; K49S; K50N; L51T; L51N; V52T; K53T; P56N; F57N; G58T; T63E; T63N; K65T; K65N; M67T; K68S; T74E; K75N; P77T; H78D; H78E; H78N; Q80E; Q80T; K94N; E96T; E96N; V97N; N98T; K99T; D110N; K112T; Q126N; K133S; R138T; R138N; H140T; T158N; K160T; T166N; M168T; G173T; H181N; A183T; R186N; R186Q, R186E, K188T; K188Q, K188E, P201N; K203T; I205F, I205Y, A208G, A208V, 및 A208Y로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된(isolated) TIMP-3 뮤테인을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로, 서열목록번호: 2로 제시된 TIMP-3의 성숙 영역에 대해 아미노산 서열이 적어도 95% 동일한 성숙 영역을 갖고, 돌연변이 F57N 및 적어도 1개의 추가 돌연변이를 가지며, 이때 돌연변이는 TIMP-3의 하나 이상의 K 잔기에서의 치환인, 단리된 TIMP-3 뮤테인이 제공된다. 본 발명의 추가 측면으로, 추가 돌연변이는 N-연결된(N-linked) 글리코실화 부위를 아미노산 서열로 도입시킨다.
또한, 서열목록번호: 2로 제시된 TIMP-3의 성숙 영역에 대해 아미노산 서열이 적어도 90% 동일한 성숙 영역을 갖는 단리된 TIMP-3 뮤테인이 본 발명의 범위 내에서 구현되었는데, 상기 뮤테인은 적어도 1개의 N-연결된 글리코실화 부위를 아미노산 서열로 도입시키는 적어도 1개의 돌연변이를 갖는다. 부가 구현예로, TIMP-3 뮤테인은 2, 3, 4, 5 또는 6개의 N-연결된 글리코실화 부위를 가지며; 다른 추가 구현예로, 도입된 N-연결된 글리코실화 부위의 수는 7, 8, 9 또는 10개이다.
본 발명의 한 구현예로, N-연결된 글리코실화 부위는 아미노산 48 - 54를 포함하는 영역; 아미노산 93 - 100을 포함하는 영역; 아미노산 121 -125를 포함하는 영역; 아미노산 143 - 152를 포함하는 영역; 아미노산 156 - 164를 포함하는 영역; 아미노산 183 - 191을 포함하는 영역; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 TIMP-3 아미노산 서열의 영역으로 도입된다. 부가의 구현예로, TIMP-3 뮤테인은 2, 3, 4 또는 5개의 N-연결된 글리코실화 부위를 가지며; 다른 추가 구현예로, 도입된 N-연결된 글리코실화 부위의 수는 6, 7, 8, 9 또는 10개이다.
서열목록번호: 2로 제시된 TIMP-3의 성숙 영역에 대해 아미노산 서열이 적어도 95% 동일한 성숙 영역을 갖고, 상기 뮤테인은 (a) TIMP-2 하전된 표면을 모의(mimic)하는 TIMP-3 하전된 패치(patch)의 특성에 변화가 있는 TIMP-3 표면 노출된 양으로 하전된 패치에 하나 이상의 돌연변이; (b) 단백질분해성 절단(proteolytic cleavage)에 대한 감수성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이; (c) 스캐빈저 수용체(scavenger receptor) LRP-1와 TIMP-3 뮤테인의 상호작용을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이; (d) TIMP-3 뮤테인 헤파린 또는 세포외 기질 성분들의 상호작용이 감소된 하나 이상의 돌연변이; (e) 본래 TIMP-3 서열에 하나 이상의 시스테이닐 잔기의 부가; (f) 개선된 약동학적 및/또는 약력학적 특성; 및 (g) (a) 내지 (f)에 제시된 돌연변이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 돌연변이를 갖는, 단리된 TIMP-3 뮤테인이 추가로 제공된다. 한 구현예로, 돌연변이 또는 돌연변이들은 아미노산 48 - 54를 포함하는 영역; 아미노산 93 - 100을 포함하는 영역; 아미노산 121 -125를 포함하는 영역; 아미노산 143 - 152를 포함하는 영역; 아미노산 156 - 164를 포함하는 영역; 아미노산 183 - 191을 포함하는 영역; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 TIMP-3 아미노산 서열의 영역으로 도입된다.
본 발명의 한 측면은 상기 언급한 TIMP-3 뮤테인중 어느 하나에 따르는 TIMP-3 뮤테인을 암호화하는 단리된 핵산이다. 본 발명의 다른 측면은 상기 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질감염(transfected)된 단리된 숙주 세포; 및 TIMP-3 뮤테인의 발현을 촉진하는 조건하에 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 배양하고, TIMP-3 뮤테인을 회수함을 포함하는 재조합 TIMP-3 뮤테인의 제조 방법이다.
기질 메탈로프로테아제(MMP) 및/또는 TIMP-3에 의해 억제되거나 억제될 수 있는 다른 프로테이나제가 원인 또는 악화시키는 역할을 하는 상태로 고생하는 개체에 상기 상태를 치료하기에 충분한 양의 TIMP-3 뮤테인을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 상태의 치료 방법뿐만 아니라, 본원에 기술된 TIMP-3 뮤테인을 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
한 구현예로, 상기 상태는 염증 상태, 골관절염, 심근허혈, 재관류 손상, 및 울혈성 심부전에 대한 진행으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예로, 상기 상태는 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis: IPF), 염증성 장질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병(Crohn's disease), 및 셀리악병(celiac disease)), 건선, 바이러스성 심근염을 포함한 심근염, 아테롬성 동맥경화증에 관련된 염증, 및 류마티스 관절염 및 건선 관절염을 포함한 관절염 상태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예로, 상기 상태는 이영양성 수포성 표피박리증, 골관절염, 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 가성통풍, 소아 류마티스 관절염을 포함한 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 치주 질환, 각막, 표피 또는 위궤양을 포함한 궤양, 수술후 상처 치유, 재협착증, 폐기종, 골의 파제트병(Paget's disease of bone), 골다공증, 경피증, 욕창에서와 같은 골 또는 조직의 압박 위축, 진주종, 비정상적 상처 치유, 류마티스 관절염, 소수관절(pauciarticular) 류마티스 관절염, 다관절(polyarticular) 류마티스 관절염, 전신 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 장질환성 관절염, 반응성 관절염, 라이터 증후군, SEA 증후군(Seronegativity, Enthesopathy, Arthropathy Syndrome: 혈청검사 음성형, 골근부착부 질병, 관절증 증후군), 피부근염, 건선 관절염, 경피증, 전신 홍반성 낭창, 혈관염, 척수염, 다발성 근염, 피부근염, 골관절염, 결절성 다발성동맥염, 베개너 육아중종(Wegener's granulomatosis), 동맥염, 류마티스 다발성근육통, 사르코이드종(sarcoidosis), 경화증, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 건선, 반상형 건선, 물방울양 건선, 역형 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 아테롬성 동맥경화증, 루프스, 스틸병(Still's disease), 전신 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus: SLE), 중증 근무력증, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 셀리악병(비열대성 스프루), 혈청검사음성 관절증과 관련된 장질환, 현미경적 또는 교원성 장염, 호산구성 위장염, 또는 직장결장절제술 및 회장 문합 후 생성된 주머니염증, 췌장염, 인슐린-의존성 당뇨병, 유방염, 담낭염, 담관염, 담도주위염, 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS), 천식(관련된 만성 염증성 상태, 또는 기도 과민성뿐만 아니라, 외인성 및 내인성 천식을 포함함), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD, 즉 만성 기관지염, 폐기종), 급성 호흡장애 증후군(Acute Respiratory Disorder Syndrome: ARDS), 호흡곤란 증후군, 낭포성 섬유증, 폐성 고혈압, 폐혈관수축, 급성 폐손상, 알레르기성 기관지폐 아스페르질루스증, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 기관지염, 알레르기성 기관지염 기관지확장증, 폐결핵, 과민성 간질성 폐렴, 직업성 천식, 천식-유사 장애, 유육종, 반응성 기도 질환 (또는 이상) 증후군, 면폐증, 간질성 폐질환, 과-호산성 증후군, 비염, 부비동염, 기생충성 폐질환, 바이러스-유발 상태[예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus: PIV), 리노바이러스(rhinovirus: RV) 및 아데노바이러스(adenovirus)]와 관련된 기도 과민성, 길랑-바레병(Guillain-Barre disease), 그레이브스병(Graves' disease), 에디슨병(Addison's disease), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 자가면역성 간염, 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease: GVHD), 뇌경색, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 신경병증, 근육병, 척수 손상 및 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 유도체 또는 뮤테인과 관련된 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 또한, 상기 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 유도체 또는 뮤테인 모두 또는 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, 및 그의 유도체와 단편, 예를 들어, 상기 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 유도체 또는 뮤테인 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산; 상기 핵산을 포함하는 플라스미드 및 벡터와, 상기 핵산 및/또는 벡터 및 플라스미드를 포함하는 세포 또는 세포주가 제공된다. 제공된 방법은, 예를 들어, 원하는 특성을 나타내는 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 유도체 또는 뮤테인을 제조, 동정 또는 분리시키는 방법을 포함한다.
포유동물에서 내인성 TIMP-3을 증강시키거나, 특별한 조직에서 TIMP-3의 수준을 증가시키는 것이 유용한 수많은 조건이 존재한다. 따라서, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 유도체 또는 뮤테인을 포함하는 약제학적 조성물과 같은, 조성물의 제조 방법, 및 대상, 예를 들어, 기질 메탈로프로테이나제 활성의 부조절이 조직의 지나치거나 부적절한 재형성을 유발하는 상태로 고생하는 대상에 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 유도체 또는 뮤테인을 포함하는 조성물을 투여하는 방법이 본원에서 또한 제공된다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당분야의 통상의 숙련가에 의해 통상 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 텍스트에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학 및 하이브리드화(hybridization)와 관련되어 사용되는 명명법 및 이들의 기술은 당 분야에 잘 알려지고 통상 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당 분야에 잘 알려져 있고, 달리 제시되지 않는 한 본 명세서를 통해 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 특정한 참조로 기술된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 수행한다. (참조, 예를 들어, 문헌[Sambrook 등 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)], 이들은 본원에 참조로 포함된다). 효소적 반응 및 정제 기술은 당 분야에서 통상 성취되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이, 제조업자의 사양에 따라 수행된다. 분석화학, 합성 유기화학 및 본원에 기술된 의학 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 용어, 및 이들의 실험실 방법과 기술은 당 분야에 잘 알려지고 통상 사용되는 것들이다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 전달과, 환자의 치료에 대해 사용될 수 있다.
하기 용어들은 달리 제시되지 않는 한, 하기의 의미를 갖는 것으로 이해해야 할 것이다:
분자(여기서 분자는, 예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체이다)를 특징짓기 위해 사용되는 바와 같은 용어 "단리된(isolated)"은 그의 기원 또는 파생의 근원에 의해 분자가 (1) 그의 본래 상태로 그것을 동반하는 천연적으로 결합된 성분들과 결합되지 않거나, (2) 동일 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터 세포에 의해 발현되거나, (4) 인간 개입없이 자연스럽게 발생되지 않음을 나타낸다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 또는 천연적으로 유래되는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성되는 분자는 그의 천연적으로 결합된 성분으로부터 "분리"될 것이다. 분자는 또한 당 분야에 잘 공지된 정제 기술을 사용하여, 분리(isolation)에 의해 천연적으로 결합된 성분들을 실질적으로 존재하지 않게 만들 수 있다. 분자 순도 또는 동종성(homogeneity)은 당 분야에 잘 공지된 수많은 방법에 의해 분석할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 샘플의 순도는 당 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 폴리펩티드를 가시화하기 위해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 염색(staining)을 사용하여 분석할 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 당 분야에 잘 공지된 다른 방법들을 사용함으로써 보다 높은 해상도가 제공될 수 있다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 각각 펩티드 결합에 의해 서로에 결합된 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 이들 용어는, 예를 들어, 번역-후(post-translationally), 또는 달리 공유 또는 비-공유적으로, 변형된 단백질뿐만 아니라, 본래(native) 및 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체(예: 뮤테인, 변이체 및 융합 단백질)를 포함한다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)"은 상응하는 전장 단백질과 비교하여 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결실을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은, 예를 들어, 길이가 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 또는 200개 아미노산일 수 있다. 단편은 또한, 예를 들어, 길이가 최대 1,000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10개 아미노산일 수 있다. 단편은 그의 말단중 하나 또는 모두에, 하나 이상의 부가의 아미노산, 예를 들어, 상이한 천연으로-존재하는 단백질로부터의 아미노산 서열(예: Fc 또는 류신 지퍼 도메인(leucine zipper domain)) 또는 인공 아미노산 서열(예: 인공 링커 서열 또는 태그(tag) 단백질)을 추가로 포함할 수 있다.
폴리펩티드의 "변이체" 또는 "뮤테인" (예: TIMP-3 변이체 또는 뮤테인)은 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 대해 아미노산 서열로 삽입, 이로부터 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
"보존성 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은 모 서열(parent sequence)의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 것이다 (예: 대체 아미노산은 모 서열에서 발생되는 나선형(helix)를 파괴하거나, 모 서열을 특징짓거나 그의 작용성에 필요한 2차 구조의 다른 형태를 방해하지 않도록 해야한다). 당 분야에-인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예가 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 및 Thornton et at. Nature 354:105 (1991)]에 기술되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참조로 포함된다.
본래 단백질에 대한 변이체 또는 뮤테인의 유사성 정도를 언급하는 한 방법은 2개 (또는 그 이상)의 폴리펩티드 서열 사이에 % 동일성(percent identity)으로 언급된다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 "% 동일성"은 그의 디폴트 파라미터(default parameter)를 사용하는 GAP 컴퓨터 프로그램 (GCG Wisconsin Package의 일부, version 10.3 (Accelrys, San Diego, CA))을 사용하여 서열을 비교함으로써 결정된다.
폴리펩티드의 "유도체"는 예를 들어, 다른 화학적 잔기(예: 폴리에틸렌 글리콜 또는 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민)에 대한 접합(conjugation), 포스포릴화 및/또는 글리코실화를 통해 화학적으로 변형된 폴리펩티드(예: TIMP-3 폴리펩티드, 변이체 또는 뮤테인)이다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 표준 1- 또는 3-문자 약어를 사용하여 나타내었다. 달리 제시되지 않는 한, 각각의 폴리펩티드 서열은 좌측에 아미노 말단 및 우측에 카르복시 말단이 있고; 각각의 단일-가닥 핵산 서열, 및 각각의 이중-가닥 핵산 서열의 상부 가닥은 좌측에 5' 말단 및 우측에 3' 말단을 갖는다. 특별한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 그것이 참조 서열과 얼마나 상이한 지를 설명함으로써 기술될 수 있다. 예를 들어, 아미노산의 치환은 본원에 "n # m"으로서 표시되어 있으며, 이때 "n"은 본래, 전장 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산을 나타내고, "#"은 아미노산 잔기 수를 나타내며, "m"은 치환된 아미노산을 나타낸다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은 도처에 상호교환적으로 사용되며, DNA 분자(예: cDNA 또는 게놈성 DNA), RNA 분자(예: mRNA), 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성한 DNA 또는 RNA 유사체(예: 펩티드 핵산 및 비-천연으로 존재하는 뉴클레오티드 유사체), 및 이의 하이브리드를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 한 구현예로, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 TIMP-3 폴리펩티드, 단편, 변이체, 유도체 또는 뮤테인을 암호화하는 인접 오픈리딩프레임(contiguous open reading frame)을 포함한다.
2개의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 그들의 서열이 한 폴리뉴클레오티드의 모든 뉴클레오티드가 갭의 도입없이, 그리고 각 서열의 5' 또는 3' 말단에서 쌍을 이루지못한 뉴클레오티드없이, 다른 폴리뉴클레오티드에서 그의 상보성 뉴클레오티드와 반대가 되도록 역-평행(anti-parallel) 배향으로 정렬될 수 있다면 서로 "보체(complement)"이다. 폴리뉴클레오티드는 2개의 폴리뉴클레오티드가 적절히 엄격한 조건하에 서로 다른 것에 하이브리드화될 수 있다면 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 "상보성(complementary)"이다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 그의 보체없이 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 상보성일 수 있다.
"벡터(vector)"는 그것에 연결된 다른 핵산을 세포로 도입시키기 위해 사용될 수 있는 핵산이다. 벡터의 한 형태는 "플라스미드"로, 이는 부가의 핵산 절편이 결찰될 수 있는 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터[예: 복제 결함 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스 및 아데노-결합 바이러스(adeno-associated viruses)]로, 이때 부가의 DNA 절편이 바이러스성 게놈으로 도입될 수 있다. 특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다(예: 세균성 복제기원 및 에피솜유사(episomal) 포유동물 벡터를 포함하는 세균성 벡터(bacterial vector)). 다른 벡터(예: 비-에피솜유사(non-episomal) 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 형태의 벡터이다.
뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현(예: 발현 수준, 타이밍 또는 위치)에 영향을 준다면 조절 서열에 "작동가능하게 연결된(operably linked)" 것이다. "조절 서열"은 그것이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현(예: 발현 수준, 타이밍 또는 위치)에 영향을 주는 핵산이다. 조절 서열은, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접, 또는 하나 이상의 다른 분자(예: 조절 서열 및/또는 핵산에 결합된 폴리펩티드)의 작용을 통해 그의 영향을 나타낼 수 있다. 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 다른 발현 제어 요소(예: 폴리아데닐화 시그널)를 포함한다. 조절 서열의 추가 예는, 예를 들어, 문헌(Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA and Baron 등, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06)에 기술되어 있다.
천연으로 존재하는 세포외 단백질은 통상 단백질 분비를 위해 세포 경로로 단백질을 유도하고 성숙 단백질에 존재하지 않는 "시그널 서열(signal sequence)"을 포함한다. 시그널 서열은 또한 "시그널 펩티드" 또는 "리더 펩티드(leader peptide)"로서 언급될 수 있고, 세포외 단백질로부터 효소적으로 절단된다. 그렇게 조작된 (즉, 제거된 시그널 서열을 갖는) 단백질은 종종 "성숙" 단백질로서 언급된다. 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이의 다수가 당 분야에 공지된, 천연으로 존재하는 시그널 서열 또는 이종 시그널 서열을 암호화할 수 있다.
당 분야의 숙련가중 누군가가 이해하는 바와 같이, 본 구현예에 따르는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 포유동물 세포주를 포함한, 세포주에서 발현될 수 있다. 특별한 단백질을 암호화하는 서열이 적절한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 형질전환은, 예를 들어, 바이러스에 (또는 바이러스성 벡터로) 폴리뉴클레오티드를 포장(packaging)함 및 숙주 세포를 바이러스(또는 벡터)로 형질도입(transducing)시킴을 포함한, 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 임의의 공지된 방법에 의해, 또는 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호(이들 특허는 이에 의해 본원에 참조로 포함됨)에 예시된 바와 같은, 당 분야에 공지된 형질감염 방법에 의해 이루어질 수 있다. 사용된 형질전환 방법은 형질전환되는 숙주에 따라 좌우된다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포로 도입시키는 방법이 당 분야에 잘 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합(protoplast fusion), 전기천공(electroporation), 리포솜으로 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 핵으로 DNA의 직접 미량주입법(direct microinjection)을 포함한다.
"숙주 세포"는 핵산, 예를 들어, 본 발명의 핵산을 발현시키는데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)일 수 있거나, 그것은 진핵세포, 예를 들어, 단세포 진핵생물(예: 효모 또는 다른 진균), 식물 세포(예: 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예: 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마(hybridoma)일 수 있다. 숙주 세포의 예는 원숭이 신장 세포주 COS-7 (ATCC CRL 1651) (참조: Gluzman 등, 1981, Cell 23:175), L 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 차이니스 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포 또는 그들의 유도체, 예를 들어, Veggie CHO 및 혈청-비함유 배지에서 성장한 관련 세포주(참조: Rasmussen 등, 1998, Cytotechnology 28:31) 또는 DHFR이 결핍된 CHO 균주 DX-B11(참조: Urlaub 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색원숭이 신장 세포주 CV1 (ATCC CCL 70)로부터 유래된 CV1/EBNA 세포주 (참조: McMahan 등, 1991, EMBO J. 10:2821), 인간 배아 신장 세포(human embryonic kidney cell), 예를 들어, 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상적인 2배체 세포, 1차 조직의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포 균주, 1차 외식편(primary explants), HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 포함한다.
통상적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드-암호화 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 배양 세포로, 이는 이어서 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. "일시적 형질감염(transient transfection)"에서, 핵산은 당 분야에 공지된 몇몇 방법중 하나에 의해 숙주 세포로 도입되며, 재조합 단백질은 핵산이 없어지거나 분해되기 전에, 예를 들어, 숙주 세포가 유사분열을 할 때, 한정된 시간 동안, 통상 약 4일 이하로 발현시킨다. "영구 형질감염(stable transfection)"을 원한다면, 폴리펩티드-암호화 핵산을 선택가능한 마커(selectable marker)를 암호화하는 핵산과 함께 숙주 세포로 도입시킬 수 있다. 선택가능한 마커의 사용으로 당 분야의 숙련가중 누군가는 폴리펩티드-암호화 핵산이 유사분열을 통해 유지되고 자손 세포에 의해 발현될 수 있도록 하는 방법으로 폴리펩티드-암호화 핵산이 숙주 세포 게놈으로 통합된 형질감염된 숙주 세포를 선택할 수 있게 된다.
구문 "재조합 숙주 세포"는 발현될 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 조절 서열이 핵산과 작동가능하게 연결되도록 숙주 세포로 도입되지 않는다면, 핵산을 포함하되 원하는 수준으로 그것을 발현하지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특별한 대상 세포뿐만 아니라, 상기 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 언급하는 것으로 이해한다. 특정 변형은, 예를 들어, 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은, 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "TIMP-3 DNA," "TIMP-3-암호화 DNA" 등은 이로부터 발현된 TIMP-3이 본원에 기술된 바와 같은 본래 TIMP-3 또는 TIMP-3 변이체 또는 뮤테인인 선택된 TIMP-3 암호화 핵산을 나타낸다. 마찬가지로, "TIMP-3", "TIMP-3 단백질" 및 "TIMP-3 폴리펩티드"는 본래 TIMP-3 단백질 또는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 TIMP-3 단백질(즉, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 유도체 또는 뮤테인)을 나타내기 위해 사용된다. TIMP-3의 특별한 뮤테인은 돌연변이 또는 돌연변이들로 나타낼 수 있다, 예를 들어, "K45N TIMP-3" 또는 "K45N TIMP-3 폴리펩티드"는 본래 TIMP-3의 아미노산 45번에서 리신(K)이 아스파라긴(N)으로 치환된 폴리펩티드를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "본래 TIMP-3"은 야생형 TIMP-3을 의미한다. TIMP-3은 포유동물에서 다양한 세포 또는 조직에 의해 발현되고, 세포외 기질에 존재하며; 그렇게 발현된 TIMP-3은 또한 본원에서 "내인성(endogenous)" TIMP-3으로서 언급된다. TIMP-3의 아미노산 서열 및 TIMP-3을 암호화하는 DNA의 핵산 서열이 2003년 5월 13일자로 허여된 미국 특허 제 6,562,596호에 기재되어 있으며, 이의 기재는 본원에 참조로 포함된다. 미국 특허 제 6,562,596호에 사용된 아미노산 넘버링 시스템은 음수를 갖는 시그널 (또는 리더) 펩티드로 아미노산을 나타내며, 아미노산 1 - 188과 같은 성숙 단백질(즉, 이로부터 시그널 또는 리더 펩티드가 제거된 단백질)을 참조한다. 본원에 사용된 넘버링 시스템은 #1로 표시되는 본래 리더 펩티드의 제1 아미노산을 갖는 TIMP-3을 언급하며; 이에 따라 전장 TIMP-3은 아미노산 1 - 211을 포함하고, 성숙 형태는 아미노산 24 - 211이다. 당 분야의 통상의 숙련가들은 이들 상이한 넘버링 시스템의 사용에 의해 일어날 수 있는 아미노산 넘버링의 차이를 쉽게 이해하며, 이에 따라 예를 들어, 성숙 형태의 제1 아미노산이 #1로서 언급되는 TIMP-3 폴리펩티드에 본원에 사용된 넘버링 시스템을 용이하게 적용시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 표시된 바와 같은 K45N은 미국 특허 제6,562,596호의 넘버링 시스템을 사용하는 K22N으로 표시된다.
TIMP-3은 2개의 도메인, TIMP-3의 아미노산 24 내지 143을 포함하는 N-말단 도메인 (즉, 분자의 약 2/3), 및 아미노산 144 내지 211을 포함하는 C-말단 도메인으로 형성된다. 도 3은 2차 및 3차 구조 TIMP-3의 형성을 용이하게 하는 디설파이드 결합의 복합 특성을 강조하는, TIMP-3의 2차원 폴리펩티드 어레이를 나타낸다. 종종 "N-TIMP-3"으로서 언급되는, TIMP-3의 N-말단 도메인은 TIMP-3의 생물학적 활성의 적어도 일부를 나타내는 것으로 밝혀졌고; 이에 따라, 본원에 기술된 바와 같은 TIMP-3 변이체, 유도체 및 뮤테인은 N-말단 도메인을 포함하는 TIMP-3의 단편의 변이체, 유도체 및 뮤테인으로 이해한다.
본래 TIMP-3 단백질은 치료학적 분자로서의 그의 용도를 위한 몇몇 챌린지를 나타내고 있다. 예를 들어, 표준 포유동물 발현 기술을 사용하는 TIMP-3 단백질에 대한 포유동물 발현 역가는 너무 낮아서 치료학적 단백질을 위한 적합한 규모로 충분한 양의 TIMP-3을 생성할 수 없다. 더욱이, 세포외 기질에 대한 TIMP-3의 결합은 세포 배지에 헤파린(또는 세포외 기질에 대한 TIMP-3의 결합을 감소시키는 유사한 제제)의 포함을 필요로 하며, 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(Low density lipoprotein Receptor-related Protein 1: LRP1) 스캐빈저 단백질에 대한 결합은 생산-규모 공정이 개발될 수 있도록 하는 수준으로 배지로 재조합 TIMP-3의 분비 챌린지를 악화시킨다. 전장 TIMP-3의 원핵세포의 미생물 생산은 단백질의 부정확한 폴딩(folding)으로 인하여 어려운 것으로 입증되었다.
따라서, 본 발명의 TIMP-3 변이체 또는 뮤테인은 이들 챌린지 중 하나 이상을 극복하도록 변형되었다. 본 발명의 폴리펩티드는 어떠한 방법으로, 그리고 어떠한 이유로, 예를 들어, (1) 단백질 가수분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 세포 배양시 세포외 기질에 대한 TIMP-3의 결합을 억제하는 제제에 대한 필요성을 감소시키고, (4) 다른 잔기, 예를 들어, 스캐빈저 수용체(예: LRP-1)에 대한 결합 친화성을 변화시키고, (5) 약동학 및/또는 약력학을 포함한, 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여 또는 변형시키고, (6) 재조합 단백질의 발현 및/또는 정제를 용이하게 하기 위하여 변형시킨 폴리펩티드를 포함한다. 유사체는 폴리펩티드의 뮤테인을 포함한다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(예: 보존적 아미노산 치환)은 천연으로 존재하는 서열에서 (예를 들어, 분자간 접촉부(contacts)를 형성하는 도메인(들) 밖의 폴리펩티드 부분에서) 이루어질 수 있다. 컨센서스 서열(Consensus sequences)은 치환을 위한 아미노산 잔기를 선택하기 위해 사용될 수 있으며; 당 분야의 숙련가들은 부가의 아미노산 잔기가 또한 치환될 수 있음을 인지한다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 본래 TIMP-3에 의해 관찰되는 것에 비하여 뮤테인 또는 변이체의 발현 수준에 있어서 증가를 나타낼 TIMP-3 뮤테인 및/또는 변이체가 제공되며; 본 발명의 다른 측면에 있어서, 증가된 발현은 포유동물 세포 발현 시스템에서 생긴다. 발현 수준은 세포 배양 상등액 유체, 즉 조건화된 배지(conditioned media: CM)에서 양 또는 재조합 TIMP-3(본래, 변이체 또는 뮤테인)의 정량적 또는 반-정량적 분석을 허용할 임의의 적절한 방법에 의해 측정할 수 있다. 한 구현예로, 샘플 또는 CM은 웨스턴 블롯(Western blot)으로 평가하며; 다른 구현예로, CM 샘플은 표준 인간 TIMP-3 ELISA를 사용하여 평가한다.
한 구현예로, 발현의 증가는 일시적 발현 시스템에서 관찰되고; 발현의 증가는 영구 형질감염 시스템에서 관찰된다. 한 구현예는 관찰된 발현의 증가가 본래 TIMP-3에 대해 관찰된 것보다 2배(2x) 더 큰 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체를 제공하며; 다른 구현예는 발현의 증가가 본래 TIMP-3에 대해 관찰된 것보다 5배(5x) 더 큰 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체를 제공한다. 추가의 구현예는 발현의 증가가 3배(3x), 4배(4x) 또는 6배(6x)인 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체를 포함한다. 한 구현예는 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체의 발현이 본래 TIMP-3에 의해 관찰된 것보다 10배(10x) 더 크고; 다른 구현예로, 관찰된 발현은 본래 TIMP-3에 의해 관찰된 것보다 10배 초과, 예를 들어, 20배(20x) 또는 그 이상이다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 세포 배지에 헤파린 (또는 세포외 기질에 대한 TIMP-3의 결합을 억제하는 다른 제제)의 부가 요구에 대한 감소를 나타내는 TIMP-3 뮤테인 (또는 변이체)가 제공된다. 헤파린 (또는 다른 제제)의 양에 있어서 감소는 반-정량적 방식으로 기술될 수 있는데, 즉 감소는 부분적, 보통, 실질적 또는 완전할 수 있다. 다른 구현예로, 감소는 %로서 표현되며, 예를 들어, 헤파린 (또는 유사 제제)의 양은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상 (예: 60%, 70% 80%, 90 % 또는 100%)만큼 감소될 수 있다.
한 구현예로, 삽입된 글리코실화 부위를 포함하는 TIMP-3 변이체 또는 뮤테인이 제공된다. 당 분야에 공지된 바와 같이, 글리코실화 유형은 단백질의 서열(예: 하기 논의되는, 특별한 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생성되는 숙주 세포 또는 유기체 모두에 따라 좌우될 수 있다. 특별한 발현 시스템은 하기에 논의된다. 글리코실화의 존재, 부재 또는 정도는 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 의해 또는 쿠마지 염색된(coomassie stained) SDS-PAGE 겔로부터 관찰된 바와 같이 분자량(MW)에 있어서 이동(shift)의 반정량적 척도를 포함하는, 당 분야의 숙련가중 누군가에게 공지된 어떤 방법에 의해 결정할 수 있지는 반면에, 정량적 척도는 질량분석기 기술 및 아스파라긴-연결된 글리코실화(Asparagine-linked glycosylation)의 부가에 상응하는 mw 이동의 관찰을 이용함, 또는 펩티드-N-글리코시다제 F (PNGase-F; SigmaAldrich, St. Louis, MO)와 같은 효소에 의한 아스파라긴-연결된 글리코실화의 제거와 함께 질량 이동의 관찰을 통함을 포함할 수 있다.
폴리펩티드의 글리코실화는 통상 N-연결(N-linked) 또는 O-연결(O-linked)된다. N-연결됨은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티(moiety)의 결합을 의미한다. 트리-펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 (N X S) 및 아스파라긴-X-트레오닌 (N X T)(여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 결합에 대한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 트리-펩티드 서열중 각각의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 또한 사용될 수 있음에도 불구하고, 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한, 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스중 하나의 결합을 의미한다.
항원 결합 단백질에 대한 글리코실화 부위의 부가는 편의상 그것이 상기 기술한 트리-펩티드 서열(N-연결된 글리코실화 부위에 대한)을 하나 이상 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 성취된다. 변화는 또한 출발 서열(O-연결된 글리코실화 부위에 대한)에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 이들에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 용이하게, 단백질 아미노산 서열은 바람직하게는 DNA 수준의 변화를 통해, 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 표적 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 돌연변이시켜 변화시킨다.
따라서, N-연결된 글리코실화 부위는 단일 아미노산에 대한 코돈을 변화시킴으로써 부가할 수 있다. 예를 들어, N - X - z (여기서, z는 임의의 아미노산임)를 암호화하는 코돈은 N - X - T (또는 N - X - S)를 암호하도록 변화시킬 수 있거나, 또는 y - X - T/S를 암호화하는 코돈은 N - X - T/S를 암호화하도록 변화시킬 수 있다. 대안적으로, 2개의 아미노산을 암호화하는 코돈은 동시에 N-연결된 글리코실화 분위를 도입시키기 위해 변화시킬 수 있다(예를 들어, y - X - z에 대한 코돈은 N - X - T/S를 암호화하기 위하여 변화될 수 있다). 이 방법으로, 1 내지 10개의 N-연결된 글리코실화 부위가 삽입될 수 있다.
N-연결된 글리코실화 부위를 TIMP-3으로 삽입시키는 것 이외에, 본래 TIMP-3에 존재하는 임의의 글리코실화 부위는, 예를 들어, 분자 구조를 안정화시키기 위한 노력으로 변형시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 잔기 208의 A는 상이한 잔기(예: Y, V 또는 G)에 의해 치환시킬 수 있다. 잔기 206 - 208의 'N - X - T' 부위에서 부가의 변형은 잔기 208에서 상기 언급한 치환중 하나와 함께, 잔기 205에서 I에 대한 F의 치환, 또는 잔기 205에서 I에 대한 Y의 치환을 포함한다.
다른 구현예로, 단백질분해성 절단에 대해 민감하거나 감수성이 큰 영역이 확인되었고 돌연변이된다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 스캐빈저 수용체 LRP-1과의 상호작용이 감소된 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체가 제공된다. 한 구현예로, 상기 뮤테인은 TIMP-3과 LRP-1 사이의 상호작용에서 중요한 것으로 가설화된 리신 잔기의 동정 및 돌연변이에 의해 만들어진다.
더욱이, TIMP-3 뮤테인 또는 변이체는 이들 특성중 하나 이상을 나타낼 수 있다고 인지되고 있다 (예를 들어, 삽입된 글리코실화 부위는 세포 배지에서 헤파린에 대한 필요성을 감소시킬 수 있고, LRP-1과의 상호작용을 감소시키며, 단백질분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있다). 부가의 구현예는 돌연변이의 조합으로 상기 언급한 특성 또는 효과들중 하나 이상이 유발되도록, 1개 이상의 돌연변이를 갖는 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체를 포함한다.
바람직한 TIMP-3 뮤테인은 몇몇 방법으로 확인할 수 있다. 첫 번째 방법으로, 인실리코 분석(in silico analysis)이 TIMP-3과 관련된 메탈로프로테이나제 억제제, TIMP-2 사이에 하전 재밸런싱을 용이하게 하기 위해 사용된다 (후자는 양호한 포유동물 발현 프로필을 나타내기 위하여 관찰되었다). 본 발명의 한 구현예로, TIMP-3 표면 노출된 양으로 하전된 패치는 TIMP-2 하전된 표면을 모의하기 위하여 재분포되었다. 다른 구현예로, TIMP-2와 TIMP-3 사이의 전하 차이는 글리코실화 부위의 삽입에 의해 차단된다. 글리코실화 삽입은 또한 발현 개선에 유용할 수 있다 (참조, 예를 들어, Enhancing the Secretion of Recombinant Proteins by Engineering N-Glycosylation Sites. Liu Y. et al, Amer Inst Chem Eng 2009, pg. 1468).
따라서, 다른 구현예로, 컴퓨터 분석에 의해 전개된 용매 노출 부위의 서브-세트(sub-set)는 N-글리코실화 가능성에 대해 스크리닝한다. 글리코실화 부위의 삽입을 포함하는 방법에 있어서, N-글리코실화 예상 도구는, 예를 들어, 정규(canonical) N-x-T 글리코실화 부위 (여기서, N은 아스파라긴이고, x는 임의의 아미노산이며, T는 트레오닌임)를 형성하도록 돌연변이시킬 수 있는 잔기를 확인함으로써, 잠재적인 N-연결된 글리코실화를 용이하게 하기 위해 돌연변이될 수 있는 부위를 선택하는데 유용하다. 추가 구현예로, 구조 기반 방법들이 모든 용매 노출된 아미노산(측쇄 노출 > 20Å2인 아미노산을 포함)을 확인하는데 사용된다. 부가의 구현예는 TIMP-3에 대해 맵핑된 상호작용하는 RAP 리신과 함께 LRP1/RAP (Receptor Associated Protein)의 결정 구조를 기반으로, TIMP-3에 대한 LRP1 상호작용하는 리신의 돌연변이를 포함한다.
부가의 조합이 본원에서 시도된다. 예를 들어, F57N 돌연변이는 리신 잔기에서의 돌연변이와 조합되어 이루어지며, 이때 리신 잔기는 TIMP-3에서 임의의 리신이다. 한 구현예로, 단일 리신이 돌연변이되며; 다른 구현예로, 2, 3, 4 또는 5개의 리신 잔기가 돌연변이된다. 특정 구현예로, 45번 및/또는 133번 아미노산의 리신 잔기가 돌연변이될 수 있다. 다른 예로, F57N 돌연변이는 단일 N-연결된 글리코실화 부위를 도입하며; 이 돌연변이는 부가의 글리코실화 부위를 도입시키기 위해 부가의 돌연변이와 함께, 또는 상기 언급한 TIMP-3의 특성중 하나 이상에 영향을 주도록 디자인된 다른 돌연변이와 함께 이루어질 수 있다. 1개의 도입된 N-연결된 글리코실화 부위를 포함하며, 2, 3 또는 4개의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함하고, 5개 이상의 N-연결된 글리코실화 부위를 포함하는 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체가 본원에서 시도되었다.
특별한 돌연변이는 도 1 및 2에 제시되어 있다. 도 1은 본래, 전장 인간 TIMP-3 및 문자 "X"가 서열 내에서 특별한 아미노산에 대해 치환된 전장 인간 TIMP-3의 돌연변이 형태의 정렬을 나타낸다. 시그널 서열은 밑줄이 그어져 있으며; 다른 시그널 서열은 본원에 기술된 바와 같이 이에 따라 치환될 수 있다. 특정 치환은 TIMP-3의 성숙한 형태로 고안되었고, "n # m"으로서 본원에 표시되어 있으며, 이때 "n"은 본래, 전장 TIMP-3에서 발견되는 아미노산을 나타내고, "#"은 아미노산 잔기 수를 나타내며, "m"은 치환된 아미노산을 나타낸다. 이에 따라, 예를 들어, "K45N"는 45번 아미노산 리신(K)이 아스파라긴(N)으로 치환되었음을 나타내는 것이다. 본원에 예시된 인간 TIMP-3의 돌연변이 형태는 다음의 돌연변이(단독으로, 또는 조합되어)를 포함한다: K45N; K45S; V47T; K50N; V52T; P56N; F57N; G58T; T63E; T63N; K65T; T74E; H78E; H78E; H78N; Q80T; K94N; E96T; D110N; K112T; Q126N; R138T; 및 G173T. 이들 돌연변이의 조합이 또한 시도되었고, 2 내지 10개(즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9 또는 10개)의 상기 언급한 치환을 포함할 수 있다.
돌연변이의 특정 조합은 K45E, K49S; K45E, K49E; K45E, T63E; K45E, Q80E; K45E, T63E, H78E; T63E, H78E, Q80E; K45E, T63E, H78E, Q80E; L51T, T74E, H78D; T74E, H78E, Q80E; T74E, H78D, Q80E; K45N, V47T; K49N, L51T; K75N, P77T; K45E, K49N, L51T, T63E; E96N, N98T; V97N, K99T; R138N, H140T; T158N, K160T; T166N, M168T; H181N, A183T; R186N, K188T; P201N, K203T; A208Y; A208V; T63E, T74E, H78E; T63E, T74E, H78D; K65N, M67T; K45N, V47T, T63E, T74E, H78E; K49N, L51T, T63E, T74E, H78E; K49N, L51T, T74E, H78E; K49N, L51T; K50N, V52T; L51N, K53T; T63N, K65T; H78N, Q80T; K94N, E96T; D110N, K112T; Q126N; R138T; G173T; F57N; P56N, G58T; P56N, G58T; T63N, K65T; K45S, F57N; K49S, F57N; K68S, F57N; K133S, F57N; K45S, K133S, F57N; 및 K49S, K68S, F57N을 포함한다.
부가의 조합은 K45S, F57N, D110N, K112T; K45S, F57N, H78N, Q80T, D110N, K112T; K45S, F57N, H78N, Q80T, D110N, K112T, Q126N; K45S, F57N, H78N, Q80T, K94N, E96T Q126N; K45S, F57N, H78N, Q80T, Q126N, G173T; K45S, F57N, T63N, K65T; K45S, F57N, T63N, K65T, K94N, E96T; K45S, F57N, T63N, K65T, K94N, E96T, G173T; K45S, F57N, T63N, K65T, R138T, G173T; K45N, V47T, F57N, T63N, K65T,　 R138T, G173T; K45S, F57N, T63N, K65T, K94N, E96T, R138T; K45N, V47T, F57N, T63N, K65T, K94N, E96T, R138T ; K45S, F57N, Q126N, R138T, G173T; P56N, G58T, T63N, K65T, K94N, E96T, Q126N, G173T; P56N, G58T, T63N, K65T, D110N, K112T, Q126N, G173T; 및 K45S, F57N, Q126N, R138T, G173T를 포함한다.
추가의 돌연변이는 K49S, K50N/V52T, K53E, V97N/K99T, R186N/K188T; K50N/V52T, V97N/K99T, R186N/K188T; K49E, K53E, K188Q; K50N/V52T, R186N/K188T; K50N/V52T, F57N, R186N/K188T; K45S, K50N/V52T, F57N, R186N/K188T; K50N/V52T, F57N, T63N/K65T, R186N/K188T; K45S, K50N/V52T, F57N R186N/K188T; K45S, K49S, K50N/V52T, F57N R186N/K188T; K49S, K50N/V52T, F57N, V97N/K99T, R186N/K188T; 및 K45S, K50N/V52T, F57N, V97N/K99T, R186N/K188T를 포함한다.
도 2는 본래의 전장 인간 TIMP-3, 및 TIMP-2의 것과 보다 유사한 서열을 만드는 특정 아미노산 치환이 일어난 TIMP-3 변이체의 정렬을 나타낸다. 시그널 서열이 존재하며, 넘버링의 일관성을 유지하기 위하여 본래의 전장 TIMP-3 서열에 대해 밑줄이 그어져 있고; 다른 시그널 서열은 본원에 기술된 바와 같이 이에 따라 치환될 수 있다. TIMP-3 변이체의 서열에서, "X"는 치환이 계획된 TIMP-3의 성숙 형태에서 잔기를 나타내기 위하여 특별한 아미노산에 대해 치환되었고; 이들 치환은 25번 잔기에 H, K, P, R, S 또는 W; 27번 잔기 A; 28번 잔기에 D, L 또는 S; 32번 잔기에 N; 39번 잔기에 T; 43번 잔기에 T, F, A 또는 N; 45번 잔기에 I 또는 T; 46번 잔기에 D; 48번 잔기에 S; 49번 잔기에 S; 51번 잔기에 T; 63번 잔기에 N; 67번 잔기에 N; 68번 잔기에 I; 78번 잔기에 D 또는 W; 96번 잔기에 T; 202번 잔기에 N 및 207번 잔기에 S를 포함한다. 치환은 개별적으로, 또는 조합되어 이루어질 수 있다. 따라서, 도 1에 대해 기술된 포맷팅을 이용하여, 도 2에 예시된 한 변이체는 A27T, I68K이다. 부가의 조합이 또한 시도되었고, 2 내지 10개의 상기 언급한 치환을 포함할 수 있다. 더욱이, 도 2에 기술된 치환은 도 1에 기술된 치환, 예를 들어, A27T, P56N, G58T와 조합될 수 있다.
Lee 등 (J. Biol. Chem. 282:6887; 2007)은 TIMP-3에서 세포외 기질 결합 모티프(motif)를 동정하는 것으로 알려진 연구를 기재하고 있다. 그들이 TIMP-3에서 공지된 헤파린 결합 서열을 동정하지 못했을 때, 그들은 11개의 리신 및 아르기닌 잔기를 동정했고, 이의 위치는 이들 염기성 아미노산의 측쇄가 상당히 고밀도로 TIMP-3의 표면에 노출되어 있었다고 제시하였다. 이들 잔기는 K26, K27, K30, K71, K76, R100, K123, K125, K137, R163, K165였다 (본원에 사용된 넘버링 시스템을 사용하여, 이들 잔기는 K49, K50, K53, K94, K99, R123, K146, K148, K160, R186, K188로 넘버링되었다). 따라서, 부가의 TIMP-3 뮤테인은 하기 제시된 것들을 포함한다. 이들 뮤테인은 부분적 또는 완전 헤파린 무관성(independence)을 나타내리라 예상된다. 표면-노출 염기성 아미노산 측쇄의 변형 이외에, 특정 돌연변이가 또한 TIMP-3 뮤테인(즉, K94N/E96T)으로 N-연결된 글리코실화 부위를 도입할 것이다.
헤파린 무관성을 감소시키도록 제조된 뮤테인 중에, K49E, K50E, K53E, K99E, R186Q, K188Q; K49E, K50E, K53E, F57N, K99E, R186Q, K188Q; K45S, K50E, K53E, F57N, K99E, R186Q, K188Q; K49S, K50N/V52T, K99E, K188Q; K50N/V52T, K99E, K188Q; K50N/V52T, K94N/E96T, K188Q; K50N/V52T, K94N/E96T, G173T; K50N/V52T, R186N/K188T; K50N/V52T, K94N/E96T, R186N,K188T; K50N/V52T, F57N, K94N/E96T, R186N/K188T; K45S, K50N/V52T, F57N, K94N/E96T, R186N/K188T; K50N/V52T, T63N/K65T, K94N/E96T, R186N/K188T; K45S, K50N/V52T, T63N/K65T, K94N/E96T, R186N/K188T가 있다. 본 발명에 따르면, 이들 뮤테인중 몇몇은 다중의 유용한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 몇몇 뮤테인은 삽입된 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하며; 다른 뮤테인은 포유동물 세포 시스템에서 발현을 개선하는 돌연변이를 포함한다.
TIMP-3 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 본래 TIMP-3의 것과 아주 유사한 아미노산 서열을 가질 것이다. 한 구현예로, TIMP-3 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 본래 TIMP-3과 적어도 85% 동일할 것이고; 다른 구현예로, TIMP-3 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 본래 TIMP-3과 적어도 90% 동일할 것이고; 다른 구현예로, TIMP-3 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 본래 TIMP-3과 적어도 95% 동일할 것이다. 추가 구현예로, TIMP-3 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 본래 TIMP-3과 적어도 96% 동일하거나, 97% 동일하거나, 98% 동일하거나, 99% 동일하다. 본원에 사용된 바와 같이, % 동일성(% identity)은 본래 TIMP-3의 성숙, 전장 형태에 대한 성숙, 전장 변이체, 뮤테인 또는 유도체, 즉 시그널 펩티드(TIMP-3의 아미노산 24 내지 211)가 결여된 TIMP-3의 비교를 의미하는 것이다. 당 분야의 숙련가들은 유사한 비교가 TIMP-3의 N-말단 도메인의 변이체, 뮤테인 또는 유도체와 본래 TIMP-3의 N-말단 도메인 사이에서 이루어질 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.
유사성(Similarity)은 또한 뮤테인 또는 변이체와 본래 TIMP-3 사이에 상이한 아미노산의 수로 나타낼 수 있다. 예를 들어, TIMP-3 변이체 또는 뮤테인은 1개 아미노산, 2개 아미노산, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 7개 아미노산, 8개 아미노산, 9개 아미노산 또는 10개 아미노산만큼 본래 TIMP-3과 다를 수 있다. 10개 아미노산에서 본래 TIMP-3과 상이한 변이체 또는 뮤테인은 본래 TIMP-3과 약 95% 동일할 것이다. 추가의 구현예로, TIMP-3 변이체 또는 뮤테인은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산에서 본래 성숙 TIMP-3과 상이하다.
부가의 변화는 발현을 용이하게 하기 위하여 TIMP-3 폴리펩티드 (본래, 뮤테인, 변이체 또는 유도체)를 암호화하는 핵산에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 본래 TIMP-3의 단일 펩티드는 상이한 단일 펩티드로 치환될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 TIMP-3 폴리펩티드의 다른 유도체는 예를 들어, TIMP-3 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종 폴리펩티드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의한 다른 단백질 또는 폴리펩티드와 함께, TIMP-3 폴리펩티드의 공유(covalent) 또는 응집(aggregative) 접합체, 또는 이의 단편을 포함한다. 예를 들어, 접합된 펩티드는 이종 단일 (또는 리더) 펩티드(예: 효모 알파-인자 리더), 또는 에피토프 태그(epitope tag)와 같은 펩티드일 수 있다. 당 분야의 통상의 숙련가들은 이종 단일 펩티드가 본래 TIMP-3 단일 펩티드와 길이가 상이할 수 있지만, 이종 단일 펩티드를 이용하여 제조된 TIMP-3 폴리펩티드의 N-말단 시스테인 잔기를 정렬함으로써 성숙 TIMP-3의 아미노산 서열에 대해 뮤테인의 위치를 정확히 동정할 수 있음을 이해한다.
TIMP-3 폴리펩티드-함유 융합 단백질은 TIMP-3 폴리펩티드(예: 폴리-His)의 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위하여 부가된 펩티드를 포함할 수 있다. 다른 태그 펩티드는 문헌(Hopp 등, Bio/Technology 6:1204, 1988), 및 미국 특허 제5,011,912호에 기술된 FLAG® 펩티드이다. FLAG® 펩티드는 상당히 항원성이고, 특정 모노클로날 항체(mAb)에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하여, 발현된 재조합 단백질의 신속한 검정 및 용이한 정제를 가능하게 한다. FLAG® 펩티드가 제시된 폴리펩티드에 융합된 융합 단백질의 제조에 유용한 제제가 시판되고 있다 (Sigma, St. Louis, MO).
공유 변형(Covalent modification)은 또한 TIMP-3 폴리펩티드의 유도체를 고려하고, 본 발명의 범위 내에 포함되며, 일반적으로, 그러나 항상은 아니지만, 번역후에 일어난다. 예를 들어, 항원 결합 단백질의 몇몇 공유 변형 형태는 항원 결합 단백질의 특정 아미노산 잔기와 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제를 반응시킴으로써 분자로 도입시킨다.
시스테이닐 잔기는 가장 통상적으로 알파-할로아세테이트 (및 상응하는 아민)(예: 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드)와 반응하여 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 수득한다. 시스테이닐 잔기는 또한 브로모트리플루오로아세톤, 알파-브로모-베타-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로메르쿠리벤조에이트, 2-클로로메르쿠리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도체화시킨다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 있어서, 시스테이닐 잔기는, 예를 들어, Cys를 암호화하는 선택된 코돈(들)을 바꿈으로써 본래 TIMP-3 서열에 부가된다. 상기 Cys 치환은 본원에 제시된 바와 같은 발현, 폴딩 또는 다른 특성을 위해 중요한 것으로 보여지는 TIMP-3의 영역에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 단백질 상에 탄수화물 모이어티의 수는 단백질에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의해 증가시킬 수 있다. 이들 방법은 그들이 N- 및 O-연결된 글리코실화를 위한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서 단백질의 생성을 필요로하지 않는 것이 유용하다. 사용된 커플링 형태에 따라, 당(들)이 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 유리 설프히드릴기(예: 시스테인의 것들), (d) 유리 히드록실기(예: 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것들), (e) 방향족 잔기(예: 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것들), 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 결합될 수 있다. 이들 방법이 1987년 9월 11일자로 공개된 WO 87/05330 및 문헌(Aplin 및 Wriston, 1981, CRC Crit . Rev. Biochem ., pp. 259-306)에 기술되어 있다.
출발 재조합 단백질 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 성취할 수 있다. 화학적 탈글리코실화(Chemical deglycosylation)는 화합물 트리플루오로메탄설폰산, 또는 등가의 화합물에 단백질의 노출을 요한다. 이 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한, 대부분 또는 모든 당의 절단을 일으키는 반면에, 폴리펩티드를 온전하게 남게한다. 화학적 탈글리코실화는 문헌(Hakimuddin 등, 1987, Arch. Biochem. Biophys . 259:52 및 Edge 등, 1981, Anal. Biochem . 118:131)에 기술되어 있다.　 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌(Thotakura 등, 1987, Meth . Enzymol . 138:350)에 기술된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 성취될 수 있다. 잠재적인 글리코실화 부위에서 글리코실화는 문헌(Duskin 등, 1982, J. Biol . Chem . 257:3105)에 기술된 바와 같이 화합물 투니카마이신의 사용에 의해 방지할 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코시드 결합의 형성을 차단한다.
항원 결합 단백질의 공유 변형의 다른 형태는 미국 특허 제4,640,835호; 제 4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로 이로써 제한되는 것은 아니지만, 다양한 폴리올, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌을 포함하는 다양한 비단백질성 중합체에 단백질을 결합시킴을 포함한다. 또한, 당 분야에 공지된 바와 같이, 아미노산 치환은 중합체(예: PEG)의 부가를 용이하게 하기 위해 단백질 내에 다양한 위치에서 이루어질 수 있다.
TIMP -3 폴리펩티드의 발현
당 분야에 공지된 임의의 발현 시스템이 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 원하는 TIMP-3 폴리펩티드(TIMP-3 뮤테인 또는 변이체)를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환시킨다. 사용될 수 있는 숙주 세포중에 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵세포가 있다. 원핵생물은 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 바실리(bacilli)를 포함한다. 고등 진핵세포는 곤충 세포 및 포유동물 기원의 정립된 세포주를 포함한다. 적절한 포유동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장 세포주 COS-7 (ATCC CRL 1651) (Gluzman 등, 1981, Cell 23:175), L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 및 문헌(McMahan 등, 1991, EMBO J. 10: 2821)에 기술된 바와 같이 아프리카 녹색원숭이 신장 세포주 CVI로부터 유래된 CVI/EBNA 세포주 (ATCC CCL 70)를 포함한다. 세균, 진균, 효모 및 포유동물 세포성 숙주와 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터가 Pouwels 등의 문헌(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)에 기술되어 있다.
포유동물 세포 발현은 TIMP-3 폴리펩티드의 제조시, 본래 TIMP-3의 것을 꼭 닮은 형태의 폴딩 및 채택을 용이하게 하는데 유용성을 제공할 수 있다. 수많은 포유동물 세포 발현 시스템이 당 분야에 공지되어 있고/있거나, 시판중이고; 후자는 Gibco®Freedom® CHO-S® (차이니스 햄스터 난소(CHO)-유래 현탁 배양시 재조합 단백질의 클로닝 및 발현의 모든 측면에서 사용하기 용이하게 디자인된 제품; ProBioGen, Life Technologies; Carlsbad, CA), GS 유전자 발현 시스템TM (고수율의 안정한 cGMP-혼화성 포유동물 세포주의 발달을 제공하도록 디자인된 형질감염 시스템; Lonza Biologics, Slough, UK), PER.C6® 기술 (단일, 불멸화(immortalized) 인간 세포로부터 유래된 세포의 세트를 연속적으로 분할시킴을 이용하여, 재조합 단백질의 대규모 제조를 용이하게 하도록 디자인된 툴(tool) 패키지; Crucell, Leiden, The Netherlands), 또는 불멸화 양막세포(예: CAP 및 CAP-T) (복합 단백질의 발현 및 제조를 위한 인간 세포-기반 발현 시스템; Cevec, Cologne, Germany)와 같은 시스템을 포함한다.
부가의 세포 발현 시스템은 Selexis SUREtechnology Platform™ (재조합 단백질의 제조를 위해 세포주의 발달을 용이하게 하기 위한 다양한 세포주에 적용될 수 있는 기술 플랫폼(technology platform); Selexis Inc., Switzerland); ProFection® 포유동물 형질감염 시스템 (재조합 단백질의 제조를 위해 세포의 고효율 형질감염을 제공하는 형질감염 시스템; Promega, Madison WI); Expi293™ 발현 시스템 [고밀도 포유동물 일시적 단백질 발현 시스템(high-density mammalian transient protein expression system), Life Technologies, Grand Island, NY]; 및 MaxCyte® VLX™ 및 STX™ 일시적 형질감염 시스템 (항체를 포함하는 재조합 단백질의 제조시 사용하기 위한 확장가능한(scalable) 형질감염 시스템; MaxCyte, Gaithersburg, MD)과 같은 시스템을 포함한다. 당 분야의 숙련가들은 Wigler 등(Cell 1979:777)이 본래 기술한 기술들 및, 예를 들어, 그들의 웹사이트에 캐나다 국립 연구의회(the National Research Council of Canada)가 기술한 부가의 기술들과 같은, 다른 발현 시스템을 추가로 알고 있다.
다양한 용기가 형질전환된 세포의 배양 및 재조합 단백질의 제조에 적합한 것으로 당 분야에 공지되어 있다. 이들은 24-deep 웰 플레이트, 250ml 및 1L 쉐이크플라스크; 및 다양한 크기, 예를 들어, 2L, 5L, 10L, 30L, 100L, 1000L, 10000L 및 더 큰 바이오리액터(Bioreactor)와 같은 다양한 바이오리액터를 포함한다. 세포 배양을 위한 다른 적절한 용기가 당 분야에 공지되어 있고, 본원에 기술된 바와 같이 또한 사용될 수 있다.
세포 배양배지(culture media) 제형이 당 분야에 잘 알려져 있고; 통상적으로 배양배지는 완충제 및 염뿐만 아니라, 필수 및 비-필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질, 및 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포가 필요한 미량 원소를 제공한다. 배양배지는 또한, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 호르몬 및/또는 기타 성장 요인, 특별한 이온(예: 나트륨, 염화물, 칼슘, 마그네슘, 및 인산염), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소(매우 낮은 최종 농도로 대개 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질 및/또는 글루코스 또는 다른 에너지원을 포함한, 최소 비율보다 높게 성장 및/또는 생존을 개선하는 보충 성분을 함유할 수 있으며; 본원에 기술된 바와 같이, 세포-주기 억제제가 배양배지에 부가될 수 있다. 특정 구현예로, 배지는 세포 생존 및 증식을 위해 최적화된 pH 및 염 농도로 유용하게 제형화된다. 특정 구현예로, 배지는 세포 배양 개시후 부가되는 피드 배지(feed medium)이다. 특정 구현예로, 세포 배양배지는 출발 영양소 용액 및 세포 배양 개시후 부가되는 임의의 피스 배지의 혼합물이다.
한정된 배양배지를 포함한, 다양한 조직 배양배지가 시판되고 있다, 예를 들어, 하기의 세포 배양배지중 어느 하나 또는 이의 조합이 사용될 수 있다: 다른 것들중, RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 최소 필수 배지 이글(Minimum Essential Medium Eagle), F-12K 배지, Ham's F12 배지, 이스코브 개질 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), McCoy's 5A 배지, Leibovitz's L-15 배지, 및 혈청-비함유 배지(serum-free media)(예: EX-CELLTM 300 Series (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). 상기 배양배지의 혈청-비함유 버젼이 또한 이용가능하다. 세포 배양배지는 배양할 세포의 요건 및/또는 원하는 세포 배양 파라미터에 따라, 부가 또는 증가된 농도의 성분들(예: 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량 원소 등)로 보충될 수 있다.
형질전환된 세포는 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건하에 배양시킬 수 있고, 폴리펩티드는 통상적인 단백질 정제 방법에 의해 회수되었다. 한 가지 상기 정제 방법은 당 분야에 공지된 다른 방법뿐만 아니라, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)의 사용을 포함한다. 포유동물 상등액으로부터 TIMP-3 모 또는 TIMP-3 뮤테인을 분리시키는 한 방법은 6x-히스티딘 친화성 Ni-세파로스 수지와 조합된 카르복시-말단 6x-히스티딘 태그에 융합된 TIMP-3을 이용하는 것이다 (예를 들어, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(Immobilized Metal Affinity Chromatography: IMAC); 일반적인 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 상기 방법을 위한 시약 및 이의 예는 QIAGEN(Germantown, MD 소재) 및 GE Healthcare(Pittsburg, PA)가 제시하고 있다). 양이온 교환 크로마토그래피(예: SP-HP 세파로스®, GE Healthcare)가 IMAC 용출 후 TIMP-3을 추가로 분리시키기 위해, 또는 IMAC의 사용없이 대안적 계획으로서, 포유동물 상등액으로부터 TIMP-3을 포획하기 위해 이용될 수 있다 (TIMP-3 및 이의 뮤테인의 용출은 중성 pH에서 염화나트륨 구배의 사용에 의해 일어난다). 크기배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography)(예: Superdex 200®, GE Healthcare, (이동상 예: 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 137mM NaCl, 2.7mM KCl))는 TIMP-3 및 이의 뮤테인을 추가로 분리시키기 위해 사용될 수 있는 일반적인 계획이다(IMAC 공정 또는 이온교환 크로마토그래피와 함께). 이들 및 다른 방법이 당 분야에 공지되어 있고; 예를 들어, 문헌(Protein Purification Principles: High Resolution Methods, and Applications, Third Edition (2012, John Wiley and Sons; Hoboken, NJ)을 참조하다.
폴리펩티드(본래 TIMP-3 또는 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체)의 양은 세포 배양 상등액 유체, 즉 조건화 배지(CM)에서 재조합 TIMP-3 (본래, 변이체 또는 뮤테인)의 양을 분석할 수 있도록 할 임의의 적절한, 정량적 또는 반-정량적 방법에 의해 측정할 수 있다. 적절한 정량적 또는 반-정량적 방법은 웨스턴 블롯 및 쿠마지 염색된 SDS PAGE 겔을 포함한다. 정량적 측정법은 TIMP-3의 항체 매개 포획과 함께, 인간 TIMP-3 ELISA (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), 또는 ForteBio Octet® (Pall ForteBio Corp, Menlo Park, CA)와 같은 효소 면역검정법, 또는 정제된 TIMP-3에 대한 직접 UV(자외선) 흡광도(280nm) 측정의 이용을 포함한다.
따라서, TIMP-3에서 특별한 돌연변이의 효과는 유사한 배양 조건하에 제조된 본래 단백질의 양에 대해 제조된 재조합 뮤테인의 양을 비교함으로써 평가할 수 있다. TIMP-3 뮤테인 또는 변이체는 본래 TIMP-3에 대해 관찰된 바와 같은 수준의 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 그 이상의 수준으로 발현될 수 있다. 경우에 따라, 특별한 형질전환 또는 형질감염 세포주의 특정 생산성은 다양한 형태의 TIMP-3에 대한 특정 생산성을 비교할 수 있도록 하기 위해 측정할 수 있다. 특정 생산성, 또는 qP는 재조합 단백질 피코그램/세포/일(pg/c/d)로 나타내고, 배양액중 세포를 정량화하기 위해 당 분야에 공지된 방법 및 재조합 단백질을 정량화하는 상기 언급된 방법들을 적용시켜 용이하게 결정할 수 있다.
TIMP -3 폴리펩티드에 대한 용도
TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는, 예를 들어, 검정시 사용될 수 있거나, 또는 그들은 이로써 제한되는 것은 아니지만, 염증 상태, 골관절염, 및 지나치거나 부적합한 MMP 활성이 발생되는 다른 상태(예: 심근허혈, 재관류 손상, 및 울혈성 심부전에 대한 진행 동안)를 포함한, 더 큰 수준의 TIMP-3 활성을 원하는 어떤 상태(기질 메틸로프로테아제(MMP) 및/또는 TIMP-3으로 억제되거나 억제될 수 있는 다른 프로테이나제가 원인 또는 악화시키는 역할을 하는 상태)를 치료하는데 사용될 수 있다. 염증 상태는 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 및 특발성 폐섬유화증(IPF), 염증성 장질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병, 및 셀리악병), 건선, 바이러스성 심근염을 포함한 심근염, 아테롬성 동맥경화증에 관련된 염증, 및 류마티스 관절염 및 건선 관절염을 포함한 관절염 상태 등을 포함한다.
본원에 기술된 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체 조성물은 발병과정을 변형시키고, 기질 분해 및/또는 염증을 특징으로 하는 질환 또는 상태, 즉 메탈로프로테이나제가 유해한 역할을 하는 상태에 대해 유용한 치료법을 제공한다. 조성물은 단독으로 또는 상기 상태의 치료시 사용되는 한 종 이상의 제제와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체 조성물은 지나친 기질 손실이 메탈로프로테이나제 활성에 의해 유발되는 어떤 장애의 치료시 유용할 수 있다. 본 TIMP-3 변이체, 뮤테인 또는 유도체 조성물은 이영양성 수포성 표피박리증, 골관절염, 라이터 증후군, 가성통풍, 소아 류마티스 관절염을 포함한 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 치주 질환, 각막, 표피 또는 위궤양을 포함한 궤양, 수술후 상처 치유 및 재협착증을 포함한, 콜라게나제, 아그레카나제, 또는 다른 기질-분해 또는 염증-촉진 효소(들)의 과잉생성에 관련된 다양한 장애의 치료시, 단독으로, 또는 다른 약제와 병용하여 유용하다. 지나친 콜라겐 및/또는 프로테오글리칸 분해가 역할을 할 수 있고, 이에 따라 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체 조성물을 적용할 수 있는 다른 병리학적 상태는 폐기종, 골의 파제트병, 골다공증, 경피증, 욕창에서와 같은 골 또는 조직의 압박 위축, 진주종 및 비정상적 상처 치유를 포함한다. 직접 또는 간접적으로, TIMP-3의 감소된 양 및 메탈로프로테아제의 증가된 양의 결과인 부가 상태(예: 심근허혈, 재관류 손상, 및 울혈성 심부전에 대한 진행 동안)는 또한 단독으로, 또는 상기 상태로 고생하는 개체를 치료하기 위해 통상 사용되는 다른 약제와 함께 현재 기술된 조성물로 치료할 수 있다. TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체 조성물은 다른 상처 치유 촉진제에 대한 보조제로서, 예를 들어, 치유 과정 동안 콜라겐의 전환을 조절하기 위하여 부가적으로 적용될 수 있다.
많은 메탈로프로테이나제는 또한 프로-염증성 활성을 나타내며; 따라서, 부가의 구현예는 염증 및/또는 자가면역 장애의 치료 방법을 포함하며, 이때 장애는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 연골 염증 및/또는 골 분해, 관절염, 류마티스 관절염, 소수관절 류마티스 관절염, 다관절 류마티스 관절염, 전신 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 장질환성 관절염, 반응성 관절염, 라이터 증후군, SEA 증후군(혈청검사 음성형, 골근부착부 질병, 관절증 증후군), 피부근염, 건선 관절염, 경피증, 전신 홍반성 낭창, 혈관염, 미올리티스, 폴리미올리티스, 더마토미올리티스, 골관절염, 결절성 다발성동맥염, 베개너 육아중종, 동맥염, 류마티스 다발성근육통, 사르코이드종, 경화증, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 반상형 건선, 물방울양 건선, 역형 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 아테롬성 동맥경화증, 루프스, 스틸병, 전신 홍반성 낭창(SLE), 중증 근무력증, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 셀리악병(비열대성 스프루), 혈청검사음성 관절증과 관련된 장질환, 현미경적 또는 교원성 장염, 호산구성 위장염, 또는 직장결장절제술 및 회장 문합 후 생성된 주머니염증, 췌장염, 인슐린-의존성 당뇨병, 유방염, 담낭염, 담관염, 담도주위염, 다발성 경화증(MS), 천식(관련된 만성 염증성 상태, 또는 기도 과민성뿐만 아니라, 외인성 및 내인성 천식을 포함함), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD, 즉 만성 기관지염, 폐기종), 급성 호흡장애 증후군(ARDS), 호흡곤란 증후군, 낭포성 섬유증, 폐성 고혈압, 폐혈관수축, 급성 폐손상, 알레르기성 기관지폐 아스페르질루스증, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 기관지염, 알레르기성 기관지염 기관지확장증, 폐결핵, 과민성 간질성 폐렴, 직업성 천식, 천식-유사 장애, 유육종, 반응성 기도 질환 (또는 이상) 증후군, 면폐증, 간질성 폐질환, 과-호산성 증후군, 비염, 부비동염 및 기생충성 폐질환, 바이러스-유발 상태[예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 파라인플루엔자 바이러스(PIV), 리노바이러스(RV) 및 아데노바이러스]와 관련된 기도 과민성, 길랑-바레병, 그레이브스병, 에디슨병, 레이노 현상, 자가면역성 간염 및 GVHD 등을 포함한다. TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 또한 TIMP-3의 감소된 상대적 수준(즉, 메탈로프로테아제에 대한 내인성 TIMP-3의 비에 있어서의 감소, 이는 TIMP-3의 감소된 양 및 메탈로프로테아제의 증가된 양의 결과일 수 있다)이 병리학적 효과와 관련이 있는 경우, 예를 들어, 심근허혈, 재관류 손상 및 울혈성 심부전으로 진행하는 동안 적용된다.
결합 조직 분해를 억제하는 TIMP-3의 능력을 기반으로 하여, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 신생혈관형성의 억제가 유용한 경우, 예를 들어, 종양 발병의 예방 또는 지연시, 및 기생충 침입의 예방시 적용된다. 예를 들어, 종양 침습 및 전이 분야에서, 일부 특별한 종양의 전이적 잠재성은 콜라게나제를 합성하고 분비하는 능력의 증가 및 상당량의 메탈로프로테이나제 억제제를 합 성 및 분비하지 못하는 무능(inability)과 상관관계가 있다. 현재 기술된 TIMP-3 단백질은 또한 1차 종양의 제거 도중, 화학요법 및 방사선 치료 도중, 오염된 골수의 하베스팅(harvestin) 도중, 및 암성 복수의 션팅(shunting) 도중 종양세포 전파(dissemination)를 억제하는데 치료학적 적용성을 갖는다. 진단학적으로, 종양 시료에서 TIMP-3 생성의 부재 및 그의 전이 잠재성 간에 상관관계는 가능한 예방 요법에 대한 척도뿐만 아니라, 예후로서 유용하다.
MMP는 또한 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier: BBB)을 개방하는 경로의 일부로서 뇌에서 기저판 및 치밀한 접착 단백질에 작용하여, 뇌로 세포 및 가용성 염증 매개물질의 도입을 용이하게 한다. 따라서, 본 조성물 및 방법은 BBB의 지나치거나 부적합한 침투성(permeabilization)을 특징으로 하는 신경계 장애의 치료시 유용할 수 있다. 부가적으로, 신경 주위에 기질 단백질의 분해는 접촉부의 손실 및 세포사(cell death)를 일으킬 수 있고; 이에 따라, 기술된 TIMP-3 조성물은 신경 세포 주위에 기저막을 보호함으로써 손상으로부터 신경 세포를 보호할 수 있다. 본 발명의 TIMP-3 조성물은 손상에 대한 신경염증성 반응, 예를 들어, 뇌허혈, 또는 외상성 뇌손상을 치료 또는 완화시키는데 유용하다. 본원에 기술된 조성물은 또한 다양한 형태의 신경병증 및/또는 근육병, 척수 손상 및 근위축성 측삭경화증(ALS)의 치료시뿐만 아니라, 염증이 질환의 기초원인인, 신경변성 질환, 예를 들어, 다발성 경화증의 치료시 유용할 것이다. 따라서, 본 조성물의 사용은 BDNF, NT-3, NGF, CNTF, NDF, SCF, 또는 다른 신경세포 성장 또는 증식 조절 인자와의 공-투여를 포함할 수 있다. 또한, 본 조성물 및 방법은 결합조직 파괴의 국부 억제가 조직의 외관을 바꿀 수 있는, 화장용으로 적용시킬 수 있다.
TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 내인성 TIMP-3 활성을 증가시키고/시키거나, TIMP-3-유도된 생물학적 활성을 개선하기 위하여 시험관내(in vitro) 방식으로 사용되거나, 생체내(in vivo ) 투여될 수 있다. 본 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 내인성 TIMP-3이 하향조절되거나 낮은 수준으로 존재하는 상황하에 생체내에서 사용될 수 있다. 이의 예가 본원에 제공된, TIMP-3-억제 가능한 프로테이나제에 의해 유발되거나 악화되는 (직접 또는 간접적으로) 장애가 이에 따라 치료될 수 있다. 한 구현예로, 본 발명은 TIMP-3-유도된 생물학적 활성을 증가시키는데 유효한 양으로 이를 필요로 하는 포유동물에 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체의 생체내 투여를 포함하는 치료학적 방법을 제공한다. 다른 구현예로, 본 발명은 TIMP-3의 내인성 수준을 증가시키는데 유효한 양으로 이를 필요로 하는 포유동물에 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체의 생체내 투여를 포함하는 치료학적 방법을 제공한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 개선된 생체내 반감기를 갖는 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체를 제공한다. 한 구현예로, TIMP-3 뮤테인의 반감기는 본래 TIMP-3의 것의 적어도 2배이며; 다른 구현예로, 반감기는 본래 TIMP-3의 것보다 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배 또는 10배 더 크다. 한 구현예로, 반감기는 비-인간 포유동물에서 측정하였고; 다른 구현예로, 반감기는 인간 대상에서 측정하였다. 추가 구현예는 (예를 들어, 인간 대상에 투여한 경우) 생체내에서 적어도 1일의 반감기를 갖는 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체를 제공한다. 한 구현예로, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 적어도 3일의 반감기를 갖는다. 다른 구현예로, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 4일 또는 더 긴 반감기를 갖는다. 다른 구현예로, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체는 8일 또는 더 긴 반감기를 갖는다.
다른 구현예로, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체 또는 뮤테인은 그것이 비유도체화되거나 비변형된 TIMP-3 결합 단백질에 비하여 더 긴 반감기를 갖도록 유도체화되거나 변형된다. 유도체화된 폴리펩티드는 특별한 용도에서 증가된 반감기와 같은 폴리펩티드에 대해 원하는 특성을 부여하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도체화된 폴리펩티드는, 예를 들어, 검출가능한 (또는 표지된) 모이어 티[예: 방사성, 비색적(colorimetric), 항원성(antigenic) 또는 효소적 분자], 검출가능한 비이드[예: 자기 또는 전자고밀도(electrodense) (예: 금) 비이드], 또는 다른 분자에 결합되는 분자(예: 비오틴 또는 스트렙타비딘), 치료학적 또는 진단학적 모이어티(예: 방사성, 세포독성, 또는 약제학적 활성 모이어티), 또는 특별한 용도를 위해 폴리펩티드에 적합성(suitability)을 증가시키는 분자(예: 사람 대상과 같은 대상에 투여, 또는 다른 생체내 또는 시험관내 용도)를 포함한다.
상기의 한 예로, 폴리펩티드는, 예를 들어, WO2008063291 및/또는 문헌(Rothenfluh 등, Nature Materials 7:248 (2008))에 기술된 바와 같이, 관절 연골 조직에 특이적으로 결합된 리간드로 유도체화시킨다. 폴리펩티드를 유도체화시키는데 사용될 수 있는 분자의 예는 알부민(예: 인간 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 폴리펩티드의 알부민-연결 및 페길화(PEGylated) 유도체는 당 분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 한 구현예로, 폴리펩티드는 트란스티레틴(transthyretin: TTR) 또는 TTR 변이체에 콘쥬게이트되거나 달리 연결된다. TTR 또는 TTR 변이체는, 예를 들어, 덱스트란, 폴리(n-비닐 피우롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 화학물질로 변형시킬 수 있다(미국 특허출원 제20030195154호).
조성물
TIMP-3 치료법(즉, TIMP-3의 내인성 수준의 증가 또는 내인성 TIMP-3의 활성 증가가 유용한 상태)에 유용한 약제학적으로 허용되는 희석제, 보존제, 안정화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 본 발명의 폴리펩티드 생성물(즉, TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체)을 유효량 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 발명에 의해 이해된다. 상기 조성물은 다양한 완충제 내용물(예: Tris-HCl, 아세테이트, 인산염), pH 및 이온강도(ionic strength)의 희석제; 세제 및 가용화제(예: Tween 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예: 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트), 보존제(예: 티메르졸, 벤질 알콜) 및 벌킹 물질(bulking substances)(예: 락토스, 만니톨)과 같은 첨가제; 단백질에 대한 중합체(예: 폴리에틸렌 글리콜)의 공유결합 (상기 논의된 바와 같음, 참조예: 참조로 포함된 미국 특허 제4,179,337호); 중합체성 화합물(예: 폴리락트산, 폴리글리콜산 등)의 미립 제제로, 또는 리포좀으로 물질의 혼입을 포함한다. 상기 조성물은 TIMP-3 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거율(rate of in vivo clearance)에 영향을 줄 것이다 (참조예: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712, 이는 본원에 참조로 포함됨).
일반적으로, 본 폴리펩티드의 유효량은 수용자의 연령, 중량 및 질환의 상태나 중증정도에 의해 결정될 것이다 (참조: 상기 Remingtons Pharmaceutical Sciences, pages 697-773, 본원에 참조로 포함됨). 통상적으로, 약 0.001g/㎏ 체중 내지 약 1g/㎏ 체중의 용량이 사용될 수 있지만, 전문가가 인식하게 됨에 따라, 더 많거나 적게 사용될 수 있다. 국소(topical) 또는 관절내 적용과 같은, 국부(local) (즉, 비-전신성) 적용의 경우, 용량은 약 0.001 내지 약 1g/㎠일 수 있다. 용량은 하루 1회 이상, 또는 덜 빈번할 수 있고, 본원에 기술된 바와 같은 다른 조성물과 함께 존재할 수 있다. 본 발명은 본원에 인용된 용량으로 제한되지 않음을 주지해야 한다.
관련 분야에서 이해되는 바와 같이, 본 발명의 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 처방에 적절한 방식으로 대상에 투여한다. 약제학적 조성물은 이로써 제한되는 것은 아니지만, 비경구, 국소, 국부 또는 흡입에 의함을 포함하는, 임의의 적절한 기술에 의해 투여될 수 있다. 주사였다면, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 병변내(intralesional), 복강내 또는 피하 경로를 통해, 볼루스(bolus) 주사에 의해, 또는 연속 주입으로 투여할 수 있다.
예를 들어, 질환 또는 손상 부위에 국부 투여는 이식물로부터 경피 전달 및 서방출(sustained release)과 같이 시도된다. 다른 대안은 점안제; 환제, 시럽, 로젠즈(lozenge) 또는 츄잉검을 포함한 경구용 제제; 및 로션, 겔, 스프레이 및 연고와 같은 국소용 제제를 포함한다. 예를 들어, 관절 또는 근골격계에 대한 국부 투여는 관절 주위, 관절내, 낭내(intrabursal), 연골내, 활액내 및 건내(intratendinous) 투여를 포함한다. 호흡계에 대한 투여는 폐내, 인트라플루랄(intraplural), 폐내, 기관내, 인트라사이널(intrasinul) 및 기관지내 전달을 포함하며, 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저(nebulizer)에 의해 용이할 수 있다. 조성물을 뇌 및/또는 신경계로 도입시키는데 유용한 척추관 전달 및 다른 방법, 예를 들어, 척수 주위, 꼬리내(intracaudal), 대뇌내, 낭내(intracisternal) 및 척수내 투여뿐만 아니라, 경막외, 경막내 또는 경막 주위 투여가 또한 시도되었다.
국부 투여의 추가 예는 수술 또는 다른 의학적 처치와 함께 조직으로 전달을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 심장 증상을 치료하거나 완화시키기 위해 수행하는 수술 도중, 또는 심장 카테터법(cardiac catheterization)과 같은 처치(예: 경피적 관상동맥 중재술(percutaneous coronary intervention)) 도중 심장 조직으로 투여할 수 있다. 전달은, 예를 들어, 관상동맥내, 심장내, 심근내 및/또는 트랜스엔도카디알(transendocardial) 경로를 통할 수 있고, 주사할 심장 부위의 심장 내막 또는 전기화학적 맵에 의해, 또는 자기 공명 영상(MRI)과 같은 다른 기술의 이용에 의해 유도될 수 있다. 조성물은 또한 심장 패치(cardiac patch)에, 또는 심장 상태에 유용한 스텐트 또는 다른 장치의 코팅에 내포를 통해 전달할 수 있다.
점안제 이외에, 눈에 본 조성물을 투여하기 위해 연고, 크림 또는 겔의 사용이 또한 시도되었다. 눈 안쪽으로 직접 투여는 눈주위, 결막, 각막내, 결막하, 건주하(subtenon), 안구뒤, 안구내, 및/또는 유리체강내 주사 또는 투여에 의해 성취될 수 있다. 이들 및 다른 기술이, 예를 들어, 문헌(Gibaldi's Drug Delivery Systems in Pharmaceutical Care (2007, American Society of Health-System Pharmacists, Bethesda, MD))에서 논의된다.
다수의 제제가 세포외 기질 및 조직의 동적 평형을 유지하기 위하여 일제히 작용한다. 평형이 편향된 상태의 치료시, 한 종 이상의 다른 제제가 본 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있다. 이들 다른 제제는 순차적으로(in seriatim) 또는 이의 조합으로 공-투여되거나 투여될 수 있다. 일반적으로, 이들 다른 제제는 메탈로프로테이나제, 세린 프로테아제, 기질 분해 효소의 억제제, 세포내 효소, 세포유착 조절제(cell adhesion modulator), 및 세포외 기질 분해 프로테이나제 및 그들의 억제제의 발현을 조절하는 인자로 이루어진 리스트로부터 선택될 수 있다. 특정 예가 하기에 제시되어 있지만, 당 분야의 숙련가는 부가 제제, 또는 다른 형태의 제시된 제제(예: 합성적으로, 재조합 DNA 기술을 통해 제조된 것들, 및 유사체와 유도체)를 포함한, 등가 기능을 수행하는 다른 제제를 인지할 것이다.
세포외 기질 분해의 증가되거나 보다 특정한 예방을 원한다면 다른 분해 억제제가 또한 사용될 수 있다. 억제제는 알파2 마크로글로불린, 임신역 단백질(pregnancy zone protein), 오보스타틴, 알파1-프로테이나제 억제제, 알파2-항플라스민, 아프로티닌, 프로테아제 넥신-1, 플라스미노겐 활성화제 억제제 (PAI)-1, PAI-2, TIMP-1, 및 TIMP-2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당 분야의 숙련가가 인지하게되는 바와 같은 다른 것이 사용될 수 있다.
세포내 효소가 또한 본 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있다. 세포내 효소는 또한 세포외 기질 분해에 영향을 줄 수 있고, 리조솜 효소, 글리코시다제 및 카텝신을 포함한다.
세포유착 조절제가 또한 본 폴리펩티드와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 폴리펩티드를 사용하는 세포외 기질 분해의 억제 전, 도중 또는 후에 세포외 기질에 대한 세포 유착을 조절하고자 할 수 있다. 세포외 기질에 대한 세포 유착을 나타낸 세포는 파골세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 킬러 T 세포 및 비만세포를 포함한다. 세포유착 조절제는 "RGD" 모티프 또는 유사 또는 모방성(mimetic) 길항제 또는 효능제를 함유하는 펩티드를 포함한다.
세포외 기질 분해 프로테이나제 및 그들의 억제제의 발현을 조절하는 인자는 사이토킨, 예를 들어, IL-1 및 TNF-알파, TGF-베타, 글루코코르티코이드 및 레티노이드를 포함한다. 원하는 효과가 상기 세포 효과와 함께, 본 폴리펩티드를 사용하여 세포외 기질 분해를 억제하고자 한다면, 세포 증식 및/또는 미분화에 영향을 주는 기타 성장 인자가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 염증 동안, 세포외 기질의 유지(효소적 활성의 억제를 통해)는 원할 수 있고 게다가 호중구의 생성을 원할 수 있다; 이에 따라, G-CSF를 투여할 수 있다. 다른 인자는 에리트로포이에틴, 인터류킨 그룹 구성원, SCF, M-CSF, IGF-I, IGF-II, EGF, FGF 그룹 구성원, 예를 들어, KGF, PDGF, 및 기타를 포함한다. 부가적으로 인터페론(예: 인터페론 알파', 베타', 감마', 또는 컨센서스 인터페론)의 활성을 원할 수 있다. 세포내 제제는 G-단백질, 단백질 키나제 C 및 이노시톨 포스파타제를 포함한다. 본 폴리펩티드의 사용은 염증 치료법에 관연되는 한 종 이상의 제제와 함께 치료학적 이점을 제공할 수 있다.
세포 트래픽킹 제제(Cell trafficking agent)가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 염증은 세포외 기질의 분해, 및 손상 부위로 세포의 이동, 또는 트래픽킹을 포함한다. 세포외 기질 분해의 예방은 상기 세포 트래픽킹을 방지할 수 있다. 따라서, 세포 트래픽킹-조절제의 효능제 또는 길항제와 함께 본 폴리펩티드의 사용이 염증 치료시 바람직할 수 있다. 세포 트래픽킹-조절제는 내피세포 표면 수용체(예: E-셀렉틴 및 인테그린); 백혈구세포 표면 수용체(L-셀렉틴); 케모킨 및 화학주성인자(chemoattractant)로 이루어진 리스트로부터 선택될 수 있다. 염증에 관여되는 조성물의 검토를 위해, 문헌(Carlos 등, Immunol. Rev. 114: 5-28 (1990))을 참조하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.
더욱이, 조성물은 neu 미분화 인자(neu differentiation factor), "NDF"를 포함할 수 있으며, 치료 방법은 TIMP-3의 투여 전, 동시에, 함께 또는 후에 NDF의 투여를 포함할 수 있다. NDF는 TIMP-2의 생성을 자극하는 것으로 밝혀졌고, NDF, TIMP -1, -2 및/또는 -3의 조합물이 종양 치료시 이점을 제공할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 생성물은 고체 조직 및 유체 샘플(예: 혈액 또는 뇨)에서 TIMP-3의 검출 및 정량화에 유용한 시약을 제공하기 위하여 검출 가능한 마커 물질과의 결합에 의해 "표지화(labeled)"될 수 있다 (예: 125I로 방사성표지되거나, 또는 형광단(예: AlexaFluor® [LifeTechnologies, Grand Island NY])으로 표지됨). 본 발명의 핵산 생성물은 검출 가능한 마커(예: 방사성표지 및 비-동위원소 표지(예: 비오틴))로 표지화할 수 있고, 예를 들어, 관련 유전자를 동정하기 위하여 하이브리드화 과정에 사용될 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 본 TIMP-3 폴리펩티드, 변이체, 뮤테인 또는 유도체 조성물은 다양한 장애에 광범위하게 적용된다. 따라서, 본원에서 시도된 다른 구현예는 세포외 기질 분해에 관여하는 장애의 치료를 위한, 본 조성물 및 임의로 한 종 이상의 상기 기술한 부가 조성물을 포함하는 키트이다. 부가의 구현예는 상기 포장재 내에 포장재 및 약제학적 제제를 포함하는 제조 제품으로, 이때 상기 약제학적 제제는 본 폴리펩티드(들), 변이체(들), 뮤테인(들) 또는 유도체(들)을 함유하고, 상기 포장재는 TIMP-3에 대한 치료학적 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 한 구현예로, 약제학적 제제는 암, 염증, 관절염(골관절염 등을 포함함), 이영양성 수포성 표피박리증, 치주질환, 궤양, 폐기종, 골장애, 경피증, 상처치유, 적혈구 결핍증, 화장용 조직 재구성, 비료 또는 배아 이식 조절, 및 신경세포 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 징후에 대해 사용될 수 있다. 이 제조 제품은 임의로 다른 조성물 또는 다른 조성물의 라벨 설명서를 포함할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예 또는 특징을 예시할 목적으로 제공되며, 이의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1:
본 실시예는 만일 있다면, 포유동물 발현 시스템에서 발현시 생성된 TIMP-3의 돌연변이 또는 돌연변이들의 효과를 측정하기 위해 사용된 방법을 기술하고 있다. 본 실시예는 일반적인 벡터 및 숙주 세포 시스템을 기술하고 있으며, 수많은 벡터 및 숙주 세포 시스템은 당 분야에 공지되어 있고, 본원에 기술되어 있으며, 만일 있다면, 재조합 단백질의 발현시 TIMP-3 서열에 있어서의 특별한 돌연변이의 효과를 측정하는데 적합하다.
일반적으로, TIMP-3-암호화 DNA는 통상적인 조건하에 발현 벡터로 결찰되며 (즉, TIMP-3-암호화 DNA는 발현될 수 있도록 벡터의 다른 서열에 작동가능하게 연결된다), 적절한 포유동물 세포는 벡터에 의해 형질전환되거나 형질감염된다. 형질전환되거나 형질감염된 세포는 적절한 조건하에 배양시키며, 재조합 단백질이 발현되고, 그 양은, 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 SDS-PAGE에 의해 정량적/반-정량적으로, ELSA (R&D Systems, Minneapolis MN) 또는 ForteBio Octet® (Pall ForteBio Corp, Menlo Park, CA)와 같은 검정을 사용하여 보다 정량적으로 평가했다. 이 방법으로, TIMP-3 단백질, 뮤테인 또는 변이체를 발현하는 포유동물 세포의 능력에 대한 다양한 돌연변이의 효과를 측정할 수 있다.
돌연변이 또는 돌연변이들이 N-연결된 글리코실화 부위를 TIMP-3 폴리펩티드로 도입시키기 위해, 또는 본래 글리코실화 부위를 개선하기 위하여 만들어진다면, 글리코실화 존재 및/또는 정도를 평가하는 것이 바람직할 수 있다. 세포는 앞서 기술한 바와 같이 형질전환 또는 형질감염시키고, N-연결된 글리코실화가 성공적으로 혼입, 부분 혼입 또는 완전 혼입되었는 지를 측정하기 위하여 반-정량적 측정(예: 웨스턴 블롯)이 사용될 수 있다.
실시예 2:
본 실시예는 TIMP-3에서 돌연변이들 또는 돌연변이가 증가된 헤파린 무관성을 야기하는 지를 측정하기 위하여 사용된 방법을 기술하고 있다. 세포는 앞서 기술한 바와 같이 형질전환 또는 형질감염시키고, 헤파린의 존재 또는 부재하에 배양시켰다. 헤파린은 헤파린 의존성 정도의 반-정량적 관념을 전개시키도록 다양한 양으로 부가할 수 있다. 이어서, 다양한 조건하에 발현된 TIMP-3 단백질, 뮤테인 또는 변이체의 양을 측정하고, 특별한 돌연변이가, 세포외 기질로부터 TIMP-3 단백질, 뮤테인 또는 변이체의 방출을 위해 헤파린이 필요한지 여부에 대해, 또는 필요한 헤파린의 양이 감소되는지에 대해 어떤 영향을 갖는지를 결정하기 위하여 비교한다.
실시예 3:
본 실시예는 MMP 활성이 형광법(fluorimetric method)을 사용하여 측정되는 MMP 억제 검정법을 기술하고 있으며; 다른 방법들이 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 형광 시그널은 활성화된 MMP 서브타입 또는 서브타입 특이적 촉매 도메인에 의해 퀀칭된(quenched) MMP 서브타입 5-FAM/QXL 520 형광공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 펩티드 기질을 절단시 증가된다. FRET 펩티드는, 예를 들어, Anaspec(Fremont, CA 소재)으로부터의 수많은 상이한 MMP가 이용가능하다. 본원에 사용된 TIMP-3 단백질은 본래 TIMP-3 또는 TIMP-3 뮤테인, 변이체 또는 유도체일 수 있고; 시험되는 단백질은 시험 분자로서 언급된다.
MMP2 활성 검정의 경우, 인간 pro-MMP2(Anaspec, Fremont, CA)는 37oC에서 블랙 384-웰 Optiplate (PerkinElmer, Waltham, MA)중 다양한 농도의 시험 분자에 대해 제조업자가 제공한 검정용 완충제에서 MMP2 민감성 5-FAM/QXL 520 FRET 펩티드를 배양시키기 전에 37oC에서 1시간 동안 1mM 4-아미노페닐머큐릭 아세테이트(APMA, Anaspec, Fremont, CA)로 활성화시킨다. 2시간의 배양 후, 반응 플레이트로부터의 형광 시그널은 엔비젼 멀티라벨 마이크로플레이트 리더(EnVision multilabel microplate reader)(PerkinElmer, Waltham, MA)로 여기 (490nm) 및 방출 (520nm)에서 측정한다. 상대적 형광 단위(relative fluorescence unit: RFU)로 데이터는 절반 최대억제상수(half maximal inhibition constant)(IC50)를 측정하기 위하여 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA)에서 시험된 시험 분자 농도에 대해 플롯팅한다.
MMP9 활성 측정을 위해, 인간 MMP9 (Anaspec, Fremont, CA)의 촉매 도메인은 37oC에서 블랙 384-웰 Optiplate (PerkinElmer, Waltham, MA)중 다양한 농도의 시험 분자 및 MMP9 민감성 5-FAM/QXL 520 FRET 펩티드와 배양시킨다. 2시간의 배양 후, 형광 시그널은 엔비젼 멀티라벨 마이크로플레이트 리더(PerkinElmer, Waltham, MA)로 여기 (490nm) 및 방출 (520nm)에서 측정한다. 상대적 형광 단위(RFU)로 데이터는 절반 최대억제상수(IC50)를 측정하기 위하여 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA)에서 시험된 시험 분자 농도에 대해 플롯팅한다.
MMP13 활성을 위해, 시험 분자는 검정용 완충제 (20mM Tris, 10mM CaCl2, 10uM ZnCl2, 0.01% Brij 35 (Calbiochem / EMD, San Diego, CA), pH 7.5)에서 적정하고, 블랙 폴리스티렌 96 또는 384 웰 검정 플레이트 (Griener Bio-One, Germany)로 가한다. 활성　MMP13 (Calbiochem / EMD)은 검정용 완충제에서 희석시켜 시험 분자 적정으로 가하고, 50 microL의 최종 용적으로 실온에서 10분 동안 배양시켰다. 대안적으로, pro-MMP-13 (R & D Systems, Minneapolis, MN)은 37oC에서 2시간 동안 APMA로 활성화시켜 검정에 사용한다. 형광원(fluorogenic) 기질[예: Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 형광원 MMP 기질 또는 Mca-KPLGL-Dpa-AR-NH2 형광원 펩티드 기질 (R & D Systems)]을 제조하여, MMP-13 효소/huTIMP-3/시험 분자 용액에 가한다. MMP-13 활성은, 예를 들어, 분자 장치 형광판 리더(Molecular Devices fluorescent plate reader) (또는 등가물)을 사용하여 20분 동안 동력학적으로 측정한다.
시험한 분자의 효과는　MMP 효소적 활성의 예상되는 최대 TIMP-3 억제%로서 나타낼 수 있다. 대안적으로, MMP 억제 활성의 정량적 평가는 필요치 않을 수 있고; 오히려, 개별 시험 분자는 그들이 MMP를 억제하는지 아닌지의 여부에 대해 평가할 수 있다. 당 분야의 통상의 숙련가들은 본원에 제시된 파라미터가 통상적인 실험의 적용에 의해 변할 수 있음을 인지한다. 예를 들어, MMP 또는 pro-MMP의 적절한 농도가 측정하기 위하여 미리 시험된 TIMP-3 및 다른 물질을 사용하여 예비실험을 수행한다. 유사하게, 기질의 형태 및 적절한 농도가 또한 측정될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어, MMP를 적정하고, 검정 파라미터를 최적화하기 위하여 미리 시험된 MMP 배치와 비교할 수 있다. 부가적으로, 당 분야의 통상의 숙련가들은 다른 MMP를 억제하는 TIMP-3 뮤테인 또는 변이체의 능력에 대해 존재한다면, 효과 또는 다양한 TIMP-3 돌연변이를 평가하기 위하여 유사한 검정을 이용할 수 있다.
실시예 4:
분자생물학의 표준 기술을 사용하여, 실질적으로 앞서 기술한 바와 같이, TIMP-3의 수많은 뮤테인을 암호화는 핵산을 제조하여, 포유동물 세포에서 발현시켰다. 암호화된 TIMP-3 뮤테인의 발현에 대한 돌연변이의 효과를 평가하였다. 만들어진 돌연변이 목록은 다음을 포함한다:
G115T, N118D; K45E, K49S; K45E, K49E; K45E, T63E; K45E, Q80E; T63E, H78E; K45E, T63E, H78E; T63E, H78E, Q80E; K45E, T63E, H78E, Q80E; T63E, H78D; T63E, T74E, H78E; T63E, T74E, H78D; L51T, T74E, H78D; T74E, H78E, Q80E; T74E, H78D, Q80E; R43T, T74E, H78D, Q80E; R43E, T74E, H78D, Q80E; R43N, K45T; K45N, V47T; K49N, L51T; K65N, M67T; K75N, P77T; R43N, K45T, K49N, L51T; K45N, V47T, K49N, L51T; R43N, K45T, T63E, T74E, H78E; K45N, V47T, T63E, T74E, H78E; K49N, L51T, T63E, T74E, H78E; K45E, K49N, L51T, T63E; R43T, K49N, L51T, T74E, H78D; R43N, K45T, T74E, H78E; K49N, L51T, T74E, H78E; R43N, K45T, K49N, L51T, T74E, H78E; Q32N, A34T; S38D, D39T; R43N, K45T; V47N, K49T; K49N, L51T; K50N, V52T; L51N, K53T; F57N; P56N, G58T; T63N, K65T; P56N, G58T, T63N, K65T; M67N, M69T; H78N, Q80T; T84N, A86T; K94N, E96T; E96N, N98T; V97N,K99T; K99N, Q101T; T105N, R107T; D110N, K112T; E122N, W124T; R123N, D125T; Q126N; T128N; Q131N, K133T; R132N G134T; R138N, H140T; R138T; H140N, G142T; K142T; K146N, K148T; T158N,K160T; T166N, M168T; M168N; G173T; HS179N, H181T; H181N, A183T; R186N, K188T; R196N, W198T; P200N, D202T; P201N, K203T; D202N; A208Y; A208V; K45S, F57N; K49S, F57N; K68S, F57N; K133S, F57N; K45S, K133S, F57N; 및 K49S, K68S, F57N.
발현된 뮤테인의 추가 평가를 수행했고, 하기에 기술되어 있다. K49E, K50E, K53E, K99E, R186Q, K188Q; K49S, K50N/V52T, K53E, V97N/K99T, R186N/K188T; K50N/V52T, V97N/K99T, R186N/K188T; K49E, K53E, K188Q; K50N/V52T, R186N/K188T; K50N/V52T, F57N, R186N/K188T; K45S, K50N/V52T, F57N, R186N/K188T; K50N/V52T, F57N, T63N/K65T, R186N/K188T; K45S, K50N/V52T, F57N R186N/K188T; K45S, K49S, K50N/V52T, F57N R186N/K188T; K49S, K50N/V52T, F57N, V97N/K99T, R186N/K188T; K45S, K50N/V52T, F57N, V97N/K99T, R186N/K188T를 포함하는 부가의 뮤테인을 시도한다. 이들 뮤테인을 제조하여 본원에 기술된 바와 같이 시험할 수 있다.
실시예 5:
이 표는 포유동물 세포에서 발현한 수많은 TIMP-3 뮤테인에 의해 수득되는 발현 및 MMP 억제 결과를 요약한 것이다. "포유동물 발현 대 WT"의 경우, 데이터는 발현이 야생형 (또는 본래) TIMP-3의 것과 실질적으로 동일함을 나타내는 '+'; 발현이 야생형 TIMP-3에 의해 관찰되는 것에 대하여 2 내지 4배 증가되었음을 나타내는'++', 및 야생형 TIMP-3에 비하여 발현이 4-배 보다 더 크게 증가됨을 나타내는 '+++'로서 기록한다. 효소 억제를 나타내는 칼럼에서 표시 '---'는 상기 시험이 수행되지 않았음을 나타낸다. 야생형 TIMP-3에 대해 관찰된 것에 비하여 발현의 증가 배수를 나타내는 발현 수준의 증가는 웨스턴 블롯 또는 SDS-PAGE 쿠마지 염색 겔을 통해 정성적으로, 또는 TIMP-3을 포획하기 위해 항 TIMP-3 항체를 이용하는 ForteBio Octet® 리드아웃을 사용하여 측정된 바와 같은 발현 역가 측정을 통해 측정한다 [상기 항체는, 예를 들어, EMD Millipore(Billerica, MA 소재: AbCam®(Cambridge, MA 소재): 또는 R&D Systems(Minneapolis, MN 소재)로부터 공적으로 이용가능하다].
표 1
Figure 112015095020017-pct00001
Figure 112015095020017-pct00002
Figure 112015095020017-pct00003
이들 돌연변이중 어떤 것들은 포유동물 세포에서 야생형 TIMP-3에 비하여 증가된 발현을 나타냈다: T63E, T74E, H78E; T63E, T74E, H78D; K65N, M67T; K45N, V47T, T63E, T74E, H78E; K49N, L51T, T63E, T74E, H78E; K49N, L51T, T74E, H78E; K49N,L51T; K50N, V52T; L51N, K53T; T63N, K65T; K75N, P77T; H78N, Q80T; K94N, E96T; D110N, K112T; Q126N; R138T; G173T; F57N; P56N,G58T; P56N,G58T; T63N, K65T ; K45S, F57N; K49S, F57N; K68S, F57N; K133S, F57N; K45S, K133S, F57N; 및 K49S, K68S, F57N. 이들중, 서브세트 (F57N; P56N,G58T; P56N,G58T; T63N, K65T; K45S, F57N; K49S, F57N; K68S, F57N; K133S, F57N; K45S, K133S, F57N; 및 K49S, K68S, F57N)는 야생형 TIMP-3에 의해 관찰된 것보다 4배 또는 그 이상의 수준으로 발현되었다.
상세한 비교는 몇몇 뮤테인 및 야생형 TIMP-3(WT)에 대한 MMP 활성 결과에 대해 수행하였고; 이들 결과는 하기에 제시되어 있다.
표 2
Figure 112015095020017-pct00004
실시예 6:
본 실시예는 형광 활성화 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter: FACS) 분석에 의해 HTB-94™ 세포 [ATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA 소재)로부터 이용가능한 연골 세포주]에 결합하는 TIMP-3 단백질의 능력을 평가하는 검정을 기술하고 있다. HTB-94 세포는 5% CO2중 37C에서 HTB-94 배양배지 (10% 태소 혈청[FBS] 및 2mML 글루타민을 함유하는 고-글루코스 DMEM)에서 배양시킨다. 세포는 염색 전 6-12주 동안 표준 조직 배양 플라스크에서 2.5 x104 cells/ml의 세포밀도로 씨딩하고, 트립신화를 통해 플라스크로부터 제거한 후 3-4일 마다 계대(passaged)시킨다. FACS 염색하기 대략 16시간 전에, HTB-94 세포는 2ml 용적 HTB94 배지의 표준 조직배양 12-웰 플레이트 위로 웰당 100,000 세포로 씨딩하고, 5% CO2중 37C에서 배양시킨다. 세포는 염색 전에 80 내지 90% 융합된다.
대략 16시간 후, HTB94 배양배지는 흡인(aspiration)에 의해 12-웰 플레이트로부터 제거하고, 1ml 4C 염색용 완충제 (인산염 완충된 염수 [PBS] 2% FBS 0.15% NaN3)를 웰 당 도포한다. 세포 플레이트는 얼음 위에서 1시간 동안 배양시킨다. 염색용 완충제를 흡인하고, 80microg/ml로 염색용 완충제에서 희석된 TIMP-3 HIS-Myc 태그 단백질 (본래 TIMP-3 또는 TIMP-3 변이체)을 0.9ml/웰로 가하고; 동일한 용적의 완충제 만을 음성 대조군 웰에 가한다. 세포 플레이트는 얼음 위에서 30 분 동안 배양시키고, 흡인한 다음, 1ml/웰 염색용 완충제로 2회 세척한다. 두 번째 세척용 완충제로 흡인시킨 후, 20ug/ml로 염색용 완충제로 희석시킨 마우스 항-pentaHIS AlexaFluor488 접합 항체 (Qiagen, Valencia, CA)를 0.9mL/웰로 가한다. 이와 동시에, 20microg/ml로 염색용 완충제로 희석시킨 무관한 IgG1 AlexaFluor488 접합 항체 (eBioscience, San Diego, CA) 음성 대조군 염색 시약을 공지된 결합제 TIMP3 HIS-Myc (예: K45S, F57N, 서열목록번호:23)로 잘 염색한 복제물에 동시에 가한다.
세포 플레이트는 빛으로부터 보호하고, 흡인하며, 1ml/웰 염색용 완충제로 2회 세척하면서, 얼음 위에서 30분간 배양시킨다. 두 번째 세척용 완충제로 흡인시킨 후, 1mL/웰의 세포-해리 완충제(효소-비함유, PBS, catalog # 13151-014; Life Technologies, Grand Island NY, )를 가한다. 세포 플레이트를 37C에서 5분간 배양시키고, 세포를 4ml FACS 튜브로 옮긴다. 플레이트 웰은 1ml/웰 25C PBS로 세정하고, 세정액을 세포 해리 완충제에 세포를 함유하는 상응하는 FACS 튜브로 가한다. 튜브는 1000RPM 으로 5분 원심분리하여 세포 펠릿을 형성하고, 흡인시킨다. 세포를 PBS(PFA)중 300microL 4% 파라포름알데히드에 재현탁시키고, FACS에서 수행할 때 까지 빛으로부터 보호된 4C로 저장할 수 있다.
TIMP3 염색 2일 이내에, 8000 고정 HTB94 세포 사례는, 예를 들어, AlexaFluor488 형광을 검출하기 위하여 FL1을 사용하는 Becton Dickinson FACS Calibur 상에서 수득된다. 전방산란(forward scatter: FSC) 검출기 전압은 E00으로 조정하고, 측방산란(side scatter: SSC) 검출기 전압은 316으로 조정한다. 조합으로 사용하여, 이들 검출기는 '전방산란' 및 '측방산란'으로서 세포의 반사된 빛을 측정하며, 이는 HTB-94 세포 게이트(cell gate)가 한정되어, '게이팅된(gated)'으로 또한 언급되고, 세포크기 및 입도(granularity)를 기반으로 하여 튜브에 비-세포 물질로부터 분리될 수 있도록 한다. FL1 검출기 전압은 370으로 조정한다. 분석은, 예를 들어, FlowJo vX.0.6을 사용하여 수행한다.
몇몇 TIMP-3 변이체는 이 방법으로 HTB-94 세포에 대한 결합에 대해 분석했고; 2개의 상이한 실험에 대한 결과가 하기 표 3에 제시되어 있다 (n.a.= 적용되지 않음; n.d.= 수행하지 않음). 9개의 TIMP3 HIS-Myc 태그된 글리코변이체는 HTB-94 세포에 대한 결합을 나타내지 않았고, 여기서 FL1 시그널이 기술된 방법에 대한 백그라운드에 대해 검출되지 않았다. 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다.
실시예 7:
이 표는 포유동물 세포에서 발현한 수많은 TIMP-3 뮤테인에 의해 수득된 발현 및 MMP 억제 결과를 요약한 것이다.
표 3: TIMP-3 뮤테인의 발현 및 활성
Figure 112015095020017-pct00005
Figure 112015095020017-pct00006
Figure 112015095020017-pct00007
1: 수율은 야생형(WT) TIMP-3의 수율에 관한 것이다; "-"은 관찰된 발현 수준이 야생형 TIMP-3의 발현 수준 미만이었음을 나타내며; "+"는 관찰된 수준이 야생형 TIMP-3의 발현 수준과 유사함을 나타내고; "++" 및 "+++"는 야생형 TIMP-3의 것보다 더 크고 유의하게 더 큰 발현 수준을 나타낸다.
2: 활성은 WTTIMP-3의 활성의 10배 이내이다.
3: 이동(Shift)은 각각의 MMP에 대한 활성의 감소(증가) 배수이다.
이 표는 포유동물 세포에서 발현된 수많은 TIMP-3 뮤테인의 글리코실화 부위 및 기타 특성을 요약한 것이다.
표 4: TIMP-3 뮤테인의 글리코실화 및 특징
Figure 112015095020017-pct00008
Figure 112015095020017-pct00009
Figure 112015095020017-pct00010
4: 수는 임의의 본래 N-글리코실화 부위 이외에, 뮤테인으로 조작된 N-글리코실화 부위의 수를 나타낸다.
5: 헤파린 무관성(Heparin independence)은 TIMP-3 뮤테인이 실시예 2에 기술된 바와 같이, 헤파린의 부재하에 배양배지로 분비되는지를 나타내는 예/아니오(yes/no) 특징이다.
*208번 및/또는 205번 잔기에서 돌연변이는 TIMP-3의 본래 N-글리코실화 부위에서 글리코실화가 용이하도록 만들었다.
K45S, F57N, D110N, K112T; K45S, F57N, H78N, Q80T, D110N, K112T; K45S, F57N, H78N, Q80T, D110N, K112T, Q126N; K45S, F57N, H78N, Q80T, K94N, E96T Q126N; K45S, F57N, H78N, Q80T, Q126N, G173T; K45S, F57N, T63N, K65T; K45S, F57N, T63N, K65T, K94N, E96T; K45S, F57N, T63N, K65T, R138T, G173T; K45N, V47T, F57N, T63N, K65T, R138T, G173T; K45S, F57N, T63N, K65T, K94N, E96T, R138T; K45N, V47T, F57N, T63N, K65T, K94N, E96T, R138T; K45S, F57N, Q126N, R138T, G173T; P56N, G58T, T63N, K65T, K94N, E96T, Q126N, G173T; P56N, G58T, T63N, K65T, D110N, K112T, Q126N, G173T; K49S, K50N, V52T, K53E, V97N, K99T, R186N, K188T; K50N, V52T, V97N, K99T, R186N, K188T; K49E, K53E, K188Q; K50N, V52T, R186N, K188T; K50N, V52T, F57N, R186N, K188T; K45S, K50N, V52T, F57N, R186N, K188T; K50N, V52T, F57N, T63N, K65T, R186N, K188T; K45S, K50N, V52T, F57N, R186N, K188T; K45S, K49S, K50N, V52T, F57N R186N, K188T; K49S, K50N, V52T, F57N, V97N, K99T, R186N, K188T; K45S, K50N, V52T, F57N, V97N, K99T, R186N, K188T; K45E, K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, G173T, K188E; K45E, F57N, D110N, K112T, R138T, G173T, K188E; K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, K188E; K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, K188E; K45E, K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186N, K188T; K45E, F57N, D110N, K112T, R138T, G173T, R186N, K188T; K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186N, K188T; K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186N, K188T; K45E, K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186Q, K188Q; K45E, F57N, D110N, K112T, R138T, G173T, R186Q, K188Q; K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186Q, K188Q; K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186Q, K188Q; K45E, K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, K188E; K45E, F57N, D110N, K112T, R138T, K188E; K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, K188E; K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, K188E; K45E, K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, R186N, K188T; K45E, F57N, D110N, K112T, R138T, R186N, K188T; K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186N, K188T; K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R186N, K188T; K45E, K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, R186Q, K188Q; K45E, F57N, D110N, K112T, R138T, R186Q, K188Q; K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, G173T, K188E; K45S, F57N, D110N, K112T, R138T, G173T, K188E; K50N, V52T,K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, K188E; K45S, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, K188E; K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186N, K188T; K45S, F57N, D110N, K112T, R138T, G173T, R186N, K188T; K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186N, K188T; K45S, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186N, K188T; K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186Q, K188Q; K45S, F57N, D110N, K112T, R138T, G173T, R186Q, K188Q; K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186Q, K188Q; K45S, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186Q, K188Q; K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, K188E; K45S, F57N, D110N, K112T, R138T, K188E; K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, K188E; K45S, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, K188E; K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, R186N, K188T; K45S, F57N, D110N, K112T, R138T, R186N, K188T; K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186N, K188T; K45S, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R186N, K188T; K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, R186Q, K188Q; K45S, F57N, D110N, K112T, R138T, R186Q, K188Q; K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K45S, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T, G173T; K50N, V52T, K94N, E96T, R138T, G173T; K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T, G173T; K45E, F57N, K94N, E96T, R138T, G173T; K45S, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T, G173T; K45S, F57N, K94N, E96T, R138T, G173T; K45N, V47T, H78N, Q80T, Q126N, R186Q, K188Q; K45N, V47T, F57N, H78N, Q80T, Q126N, R186Q, K188Q; K45N, V47T, F57N, H78N, Q80T, K94N, E96T, Q126N,; K45N, V47T, F57N, H78N, Q80T, Q126N, R138T; K45N, V47T, F57N, H78N, Q80T, R138T, R186Q, K188Q; K45N, V47T, F57N, H78N, Q80T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K50N, V52T, K94N, E96T, H78N, Q80T, R138T; K50N, V52T, K94N, E96T, H78N, Q80T, R138T, R186Q, K188Q; K45E, F57N, Q126N, R138T, R186Q, K188Q; K45N, V47T, F57N, Q126N, R138T, R186Q, K188Q; K45N, V47T, F57N, H78N, Q80T, R186Q, K188Q; K45S, F57N, H78N, Q80T, Q126N, R138T, R186Q, K188Q; K45S, F57N, H78N,Q80T, K94N, E96T, R138T, R186Q, K188Q; K50N, V52T, K94N, E96T, H78N, Q80T, R138T; K45N, V47T, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K45S, F57N, H78N, Q80T, K94N, E96T, R138T; K45N, V47T, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q; 및 K45N, V47T, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, K188Q를 포함하는 부가의 뮤테인이 시도되었다. 추가의 뮤테인은 K50N, V52T,　 P56N, G58T, R186N, K188T; K45S, K50N, V52T,　 P56N, G58T, R186N, K188T; K50N, V52T,　 P56N, G58T, T63N, K65T, R186N, K188T; K45S, K50N, V52T,　 P56N, G58T R186N, K188T; K45S, K49S, K50N, V52T,　 P56N, G58T, R186N, K188T; K49S, K50N, V52T, P56N, G58T, V97N, K99T, R186N, K188T; K45S, K50N, V52T, P56N, G58T, V97N, K99T, R186N, K188T; K45E, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, G173T, K188E; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, K188E; K45E, K50N, V52T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186N, K188T; K45E, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186N, K188T; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186N, K188T; K45E, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186Q, K188Q; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186Q, K188Q; K45E, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, K188E; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, K188E; K45E, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, R186N, K188T; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186N, K188T; K45E, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, R186Q, K188Q; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K45S, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, G173T, K188E; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, K188E; K45S, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186N, K188T; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186N, K188T; K45S, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, G173T, R186Q, K188Q; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, G173T, R186Q, K188Q; K45S, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, K188E; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, K188E; K45S, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, R186N, K188T; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186N, K188T; K45S, P56N, G58T, D110N, K112T, R138T, R186Q, K188Q; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T, G173T; K45E, P56N, G58T, K94N, E96T, R138T, G173T; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T, G173T; K45S, P56N, G58T, K94N, E96T, R138T, G173T; K45N, V47T, P56N, G58T, H78N, Q80T, Q126N, R186Q, K188Q; K45N, V47T, P56N, G58T, H78N, Q80T, K94N, E96T, Q126N,; K45N, V47T, P56N, G58T, H78N, Q80T, Q126N, R138T; K45N, V47T, P56N, G58T, H78N, Q80T, R138T, R186Q, K188Q; K45N, V47T, P56N, G58T, H78N, Q80T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K45E, P56N, G58T, Q126N, R138T, R186Q, K188Q; K45N, V47T, P56N, G58T, Q126N, R138T, R186Q, K188Q; K45N, V47T, P56N, G58T, H78N, Q80T, R186Q, K188Q; K45S, P56N, G58T, H78N, Q80T, Q126N, R138T, R186Q, K188Q; K45S, P56N, G58T, H78N, Q80T, K94N, E96T, R138T, R186Q, K188Q; K45N, V47T, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q, K188Q; K45S, P56N, G58T, H78N, Q80T, K94N, E96T, R138T; K45N, V47T, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, R186Q; 및 K45N, V47T, P56N, G58T, K94N, E96T, D110N, K112T, K188Q를 포함한다. 이들 뮤테인은 본원에 기술된 바와 같이 제조되고 시험할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN INC. <120> VARIANTS OF TISSUE INHIBITOR OF METALLOPROTEINASE TYPE THREE (TIMP-3), COMPOSITIONS AND METHODS <130> A-1827-WO-PCT <140> <141> <150> 61/940,673 <151> 2014-02-17 <150> 61/802,988 <151> 2013-03-18 <150> 61/798,160 <151> 2013-03-15 <150> 61/782,613 <151> 2013-03-14 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 633 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgacccctt ggctcgggct catcgtgctc ctgggcagct ggagcctggg ggactggggc 60 gccgaggcgt gcacatgctc gcccagccac ccccaggacg ccttctgcaa ctccgacatc 120 gtgatccggg ccaaggtggt ggggaagaag ctggtaaagg aggggccctt cggcacgctg 180 gtctacacca tcaagcagat gaagatgtac cgaggcttca ccaagatgcc ccatgtgcag 240 tacatccaca cggaagcttc cgagagtctc tgtggcctta agctggaggt caacaagtac 300 cagtacctgc tgacaggtcg cgtctatgat ggcaagatgt acacggggct gtgcaacttc 360 gtggagaggt gggaccagct caccctctcc cagcgcaagg ggctgaacta tcggtatcac 420 ctgggttgta actgcaagat caagtcctgc tactacctgc cttgctttgt gacttccaag 480 aacgagtgtc tctggaccga catgctctcc aatttcggtt accctggcta ccagtccaaa 540 cactacgcct gcatccggca gaagggcggc tactgcagct ggtaccgagg atgggccccc 600 ccggataaaa gcatcatcaa tgccacagac ccc 633 <210> 2 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Pro Trp Leu Gly Leu Ile Val Leu Leu Gly Ser Trp Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Trp Gly Ala Glu Ala Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala 195 200 205 Thr Asp Pro 210 <210> 3 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> Lys, Glu, Asn or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (47)..(47) <223> Val or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> Lys, Glu, Asn or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Lys or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (51)..(51) <223> Leu, Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Val or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Lys or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> Pro or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(57) <223> Phe or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (58)..(58) <223> Gly or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Thr, Glu or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (65)..(65) <223> Lys, Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (67)..(67) <223> Met or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Lys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (74)..(74) <223> Thr or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> Lys or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> Pro or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> His, Asp, Glu or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Gln, Glu or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (94)..(94) <223> Lys or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (96)..(96) <223> Glu, Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (97)..(97) <223> Val or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(98) <223> Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (99)..(99) <223> Lys or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (110)..(110) <223> Asp or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (112)..(112) <223> Lys or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (126)..(126) <223> Gln or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (133)..(133) <223> Lys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (138)..(138) <223> Arg, Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (140)..(140) <223> His or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (158)..(158) <223> Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (160)..(160) <223> Lys or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (166)..(166) <223> Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (168)..(168) <223> Met or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (173)..(173) <223> Gly or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (181)..(181) <223> His or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (183)..(183) <223> Ala or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (186)..(186) <223> Arg or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (188)..(188) <223> Lys or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (201)..(201) <223> Pro or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (203)..(203) <223> Lys or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (208)..(208) <223> Ala, Val or Tyr <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Xaa Val Xaa Gly 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Xaa Thr Leu Val Tyr Xaa Ile 50 55 60 Xaa Gln Xaa Xaa Met Tyr Arg Gly Phe Xaa Xaa Met Xaa Xaa Val Xaa 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Xaa Leu Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Xaa Gly Xaa 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Xaa Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Xaa Gly Leu Asn Tyr Xaa Tyr Xaa Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Xaa Ser Xaa 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Xaa Asp Xaa Leu Ser Asn Phe Xaa Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys Xaa Tyr Xaa Cys Ile Xaa Gln Xaa Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Xaa Asp Xaa Ser Ile Ile Asn Xaa 195 200 205 Thr Asp Pro 210 <210> 4 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Thr, His, Lys, Pro, Arg, Ser or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Pro, Asp, Leu or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Gln or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Asp or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (43)..(43) <223> Arg, Thr, Phe, Ala or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> Lys, Ile or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Val or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Gly or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> Lys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (51)..(51) <223> Leu or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Lys or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (54)..(54) <223> Glu or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (67)..(67) <223> Met or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Lys or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> His, Asp or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (202)..(202) <223> Asp or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (207)..(207) <223> Asn or Ser <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Cys Xaa Xaa Ser His Pro Xaa 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Xaa Ile Val Ile Xaa Ala Xaa Xaa Val Xaa 35 40 45 Xaa Lys Xaa Val Xaa Xaa Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Xaa Xaa Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro Xaa Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Xaa Lys Ser Ile Ile Xaa Ala 195 200 205 Thr Asp Pro 210 <210> 5 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any 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Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala 195 200 205 Thr Asp Pro 210 <210> 6 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 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<222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) 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<223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Glu Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Glu Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala 195 200 205 Thr Asp Pro 210 <210> 8 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 8 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Glu Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Glu 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala 195 200 205 Thr Asp Pro 210 <210> 9 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 9 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val 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Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Thr Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Glu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 20 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Glu Val Val Gly 35 40 45 Asn Lys Thr Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Glu Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 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Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 21 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Asn Lys Thr Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Glu Lys Met Pro Glu Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 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(4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 22 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser 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<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES 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<222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 23 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Ser Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Asn Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro 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<221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 24 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Ser Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Asn Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp 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peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 25 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val 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<223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> 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<222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 37 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Asn Gln Thr Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly 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any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 48 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Asn Asp Thr Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile 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peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 53 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Thr Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Glu Lys Met Pro Asp Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His 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from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 54 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Asn Val Thr Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 95 Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys 100 105 110 Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr 115 120 125 Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu Asn Tyr Arg Tyr His Leu Gly Cys Asn 130 135 140 Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys 145 150 155 160 Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly 165 170 175 Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys 180 185 190 Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala 195 200 205 Thr Asp Pro 210 <210> 55 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Met or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Thr or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Pro or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino 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Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ile or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Val or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Ser or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Leu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Asp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Trp or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Glu or any amino acid from a heterologous signal peptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Ala or any amino acid from a heterologous signal peptide <400> 56 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln 20 25 30 Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly 35 40 45 Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile 50 55 60 Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln 65 70 75 80 Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Gly Leu Lys Leu Glu 85 90 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45 Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Cys Gly Leu Asn Leu Thr Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn 85 90 95 Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Asn Tyr Thr Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr 115 120 125 Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 130 135 140 Met Leu Ser Asn Phe Thr Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala 145 150 155 160 Cys Ile Asn Gln Thr Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala 165 170 175 Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp Pro 180 185 <210> 95 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuTIMP3(K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T, G173T) <400> 95 Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp 1 5 10 15 Ile Val Ile Arg Ala Glu Val Val Gly Lys Asn Leu Thr Lys Glu Gly 20 25 30 Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg 35 40 45 Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Cys Gly Leu Asn Leu Thr Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asn Gly Thr Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn 85 90 95 Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Asn Tyr Thr Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr 115 120 125 Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 130 135 140 Met Leu Ser Asn Phe Thr Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala 145 150 155 160 Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala 165 170 175 Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp Pro 180 185 <210> 96 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuTIMP3(K45E, K50N, V52T, K94N, E96T, R138T, G173T, K188E) <400> 96 Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp 1 5 10 15 Ile Val Ile Arg Ala Glu Val Val Gly Lys Asn Leu Thr Lys Glu Gly 20 25 30 Pro Phe Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg 35 40 45 Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Cys Gly Leu Asn Leu Thr Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn 85 90 95 Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Asn Tyr Thr Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr 115 120 125 Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 130 135 140 Met Leu Ser Asn Phe Thr Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala 145 150 155 160 Cys Ile Arg Gln Glu Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala 165 170 175 Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp Pro 180 185 <210> 97 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuTIMP3(K50N, V52T, F57N, K94N, E96T, R138T, G173T) <400> 97 Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp 1 5 10 15 Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly Lys Asn Leu Thr Lys Glu Gly 20 25 30 Pro Asn Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg 35 40 45 Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Cys Gly Leu Asn Leu Thr Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asp Gly Lys Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn 85 90 95 Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Asn Tyr Thr Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr 115 120 125 Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 130 135 140 Met Leu Ser Asn Phe Thr Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala 145 150 155 160 Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala 165 170 175 Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp Pro 180 185 <210> 98 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuTIMP3(K50N, V52T, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T) <400> 98 Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp 1 5 10 15 Ile Val Ile Arg Ala Lys Val Val Gly Lys Asn Leu Thr Lys Glu Gly 20 25 30 Pro Asn Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg 35 40 45 Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Cys Gly Leu Asn Leu Thr Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asn Gly Thr Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn 85 90 95 Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Asn Tyr Thr Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr 115 120 125 Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 130 135 140 Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala 145 150 155 160 Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala 165 170 175 Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp Pro 180 185 <210> 99 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> HuTIMP3(K45E, F57N, K94N, E96T, D110N, K112T, R138T) <400> 99 Cys Thr Cys Ser Pro Ser His Pro Gln Asp Ala Phe Cys Asn Ser Asp 1 5 10 15 Ile Val Ile Arg Ala Glu Val Val Gly Lys Lys Leu Val Lys Glu Gly 20 25 30 Pro Asn Gly Thr Leu Val Tyr Thr Ile Lys Gln Met Lys Met Tyr Arg 35 40 45 Gly Phe Thr Lys Met Pro His Val Gln Tyr Ile His Thr Glu Ala Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Cys Gly Leu Asn Leu Thr Val Asn Lys Tyr Gln Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Thr Gly Arg Val Tyr Asn Gly Thr Met Tyr Thr Gly Leu Cys Asn 85 90 95 Phe Val Glu Arg Trp Asp Gln Leu Thr Leu Ser Gln Arg Lys Gly Leu 100 105 110 Asn Tyr Thr Tyr His Leu Gly Cys Asn Cys Lys Ile Lys Ser Cys Tyr 115 120 125 Tyr Leu Pro Cys Phe Val Thr Ser Lys Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp 130 135 140 Met Leu Ser Asn Phe Gly Tyr Pro Gly Tyr Gln Ser Lys His Tyr Ala 145 150 155 160 Cys Ile Arg Gln Lys Gly Gly Tyr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly Trp Ala 165 170 175 Pro Pro Asp Lys Ser Ile Ile Asn Ala Thr Asp Pro 180 185

Claims (19)

  1. 서열목록번호: 2로 제시된 TIMP-3의 성숙 영역(mature region)의 아미노산 서열을 포함하는 성숙 영역을 갖고,
    (a) 돌연변이 K45S, 및
    (b) 돌연변이 F57N
    을 갖는 단리된 TIMP-3 뮤테인.
  2. 제1항의 TIMP-3 뮤테인 및 생리학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물이며,
    염증 상태, 골관절염, 심근허혈, 재관류 손상, 및 울혈성 심부전으로의 진행으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태를 치료하는 데 사용되는 조성물.
  3. 제1항의 TIMP-3 뮤테인 및 생리학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물이며,
    천식, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 및 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis: IPF), 염증성 장질환(예를 들어, 궤양성 대장염, 크론병(Crohn's disease), 및 셀리악병(celiac disease)), 건선, 바이러스성 심근염을 포함한 심근염, 아테롬성 동맥경화증에 관련된 염증, 및 류마티스 관절염 및 건선 관절염을 포함한 관절염 상태로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태를 치료하는 데 사용되는 조성물.
  4. 제1항의 TIMP-3 뮤테인 및 생리학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물이며,
    이영양성 수포성 표피박리증, 골관절염, 가성통풍, 소아 류마티스 관절염을 포함한 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 치주 질환, 각막, 표피 또는 위궤양을 포함한 궤양, 수술후 상처 치유, 재협착증, 폐기종, 골의 파제트병(Paget's disease of bone), 골다공증, 경피증, 욕창에서와 같은 골 또는 조직의 압박 위축, 진주종, 비정상적 상처 치유, 소수관절(pauciarticular) 류마티스 관절염, 다관절(polyarticular) 류마티스 관절염, 전신(systemic onset) 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 장질환성 관절염, 반응성 관절염, 라이터 증후군(Reiter's Syndrome), SEA 증후군(혈청검사 음성형, 골근부착부 질병, 관절증 증후군(Seronegativity, Enthesopathy, Arthropathy Syndrome)), 피부근염, 건선 관절염, 경피증, 전신 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus), 혈관염, 근염, 다발성 근염, 피부근염, 골관절염, 결절성 다발성동맥염, 베개너 육아중종(Wegener's granulomatosis), 동맥염, 류마티스 다발성근육통, 사르코이드종(sarcoidosis), 경화증, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 건선, 반상형 건선, 물방울양 건선, 역형 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 아테롬성 동맥경화증, 루프스, 스틸병(Still's disease), 전신 홍반성 낭창(SLE), 중증 근무력증, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병, 셀리악병(비열대성 스프루), 혈청검사음성 관절증과 관련된 장질환, 미세(microscopic) 또는 교원성 장염, 호산구성 위장염, 또는 직장결장절제술 및 회장 문합 후 생성된 주머니염증(pouchitis), 췌장염, 인슐린-의존성 당뇨병, 유방염, 담낭염, 담관염, 담도주위염, 다발성 경화증(multiple sclerosis: MS), 천식(기도 과민성 또는 관련된 만성 염증성 상태 뿐만 아니라, 외인성 및 내인성 천식을 포함함), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD, 즉 만성 기관지염, 폐기종), 급성 호흡장애 증후군(Acute Respiratory Disorder Syndrome: ARDS), 호흡곤란 증후군, 낭포성 섬유증, 폐성 고혈압, 폐혈관수축, 급성 폐손상, 알레르기성 기관지폐 아스페르질루스증, 과민성 폐렴, 호산성 폐렴, 기관지염, 알레르기성 기관지염, 기관지확장증, 폐결핵, 과민성 간질성 폐렴, 직업성 천식, 천식-유사 장애, 유육종, 반응성 기도 질환 (또는 이상) 증후군, 면폐증, 간질성 폐질환, 과-호산성 증후군, 비염, 부비동염, 및 기생충성 폐질환, 바이러스-유발 상태[예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus: PIV), 리노바이러스(rhinovirus: RV) 및 아데노바이러스(adenovirus)]와 관련된 기도 과민성, 길랑-바레병(Guillain-Barre disease), 그레이브스병(Graves' disease), 에디슨병(Addison's disease), 레이노 현상(Raynaud's phenomenon), 자가면역성 간염, 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease: GVHD), 뇌경색, 외상성 뇌손상, 다발성 경화증, 신경병증, 근육병, 척수 손상 및 근위축성 측삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태를 치료하는 데 사용되는 조성물.
  5. 제1항에 따른 TIMP-3 뮤테인을 암호화하는 단리된 핵산.
  6. 제5항의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질감염(transfected)된 단리된 숙주 세포.
  8. TIMP-3 뮤테인의 발현을 촉진하는 조건 하에 제7항의 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 것, 및
    TIMP-3 뮤테인을 회수하는 것
    을 포함하는, 재조합 TIMP-3 뮤테인을 제조하는 방법.
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