CN101684461B - 改进的从溶组织梭菌液体培养物纯化胶原酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过依次进行硫酸铵沉淀、疏水性相互作用层析、阳离子交换层析和阴离子层析,从复杂混合物中纯化溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)I型和II型胶原酶蛋白的方法。并且提供即使在沉淀步骤后也使部分纯化的制剂稳定的条件。本发明的方法能够快速和有效的去除其他蛋白水解活性。本发明的制剂提供特别纯的和完整的具有酶活性的I型和II型胶原酶蛋白。本发明还提供所述两种分离的蛋白的混合物。本发明还提供所述纯化的胶原酶蛋白或其混合物用于体外处理组织样品的用途。

Description

改进的从溶组织梭菌液体培养物纯化胶原酶
本发明属于蛋白生物化学领域,涉及提供纯化的溶组织梭菌(C.histolyticum)胶原酶I和II酶的方法。本发明特别的技术优势在于从共存的蛋白水解活性(尤其是梭菌蛋白酶)中快速分离所需酶的改进。在根据本发明纯化时,胶原酶尤其适合作为用于组织解离的蛋白酶混合物的成分。
本发明提供通过依次进行硫酸铵沉淀、阳离子交换层析和阴离子层析,从复杂混合物中纯化溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)I型和II型胶原酶蛋白的方法。并且提供即使在沉淀步骤后也使部分纯化的制剂稳定的条件。本发明的方法能够快速和有效的去除其他蛋白水解活性。本发明的制剂提供特别纯的和完整的具有酶活性的I型和II型胶原酶蛋白。本发明还提供所述两种分离的蛋白的混合物。本发明还提供所述纯化的胶原酶蛋白或其混合物用于体外处理组织样品的用途。
发明背景
微生物胶原酶(EC 3.4.24.3)是金属蛋白酶,其将天然胶原蛋白的螺旋区降解为小片段。优选的切割是序列-Pro-Xaa-Gly-Pro-中的-Gly。从溶组织梭菌已经分离出6种主要形式(被分为两类),它们是免疫交叉反应的,但具有不同的序列和不同的特异性。已经从蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus),Empedobacter collagenolyticum,海粘假单胞菌(Pseudomonasmarinoglutinosa),以及弧菌属(Vibrio)和链霉菌属(Streptomyces)的物种中分离出其他变体。
胶原酶在细菌(诸如溶组织梭菌)的发病机理中起破坏胞外结构的作用。因此,它们是外毒素,起毒力因子的作用,例如通过促进气性坏疽的传播。胶原酶通常靶向于肌细胞和其他身体器官中的结缔组织。由于对结缔组织有效的水解活性,胶原酶以及其他蛋白酶诸如嗜热菌蛋白酶被用于体外的组织解离。
由溶组织梭菌产生的胶原酶是第一种被发现和表征的胶原酶。溶组织梭菌的培养物滤液包含胶原酶与其他蛋白酶的混合物。分子量范围从68到130kDa的6种主要胶原酶已经被纯化到均质,并被命名为I型和II型胶原酶(两种类型的蛋白在本文中也被统称为“胶原酶蛋白”)。所述梭菌胶原酶的每条蛋白链包含大约1个锌,因此看起来锌原子是酶活性必需的。
在工业规模上,从溶组织梭菌的培养物滤液分离梭菌胶原酶。粗品包含胶原酶以及褐色素,梭菌蛋白酶(梭菌肽酶B),氨肽酶和数种中性蛋白酶。粗品可作为纯化单独的I型和II型胶原酶的来源,但纯化路线是相当长的。
所述混合物中半胱氨酸蛋白酶梭菌蛋白酶的存在提出了一个重要的技术问题,因为该肽酶逐渐地水解胶原酶。在这点上I型胶原酶看起来比II型胶原酶更易受梭菌蛋白酶的蛋白水解攻击。因此当从溶组织梭菌培养物滤液或液体培养物上清纯化胶原酶时,希望在早期步骤中分离梭菌蛋白酶以将损失最小化。
Bond,M.,D.,Van Wart,H.,E.,(Biochemistry 23(1984)3077-3085)公开了一种基于层析的纯化方案,其从粗制的酶制剂开始。在第一步中,粗制酶在羟磷灰石上层析。羟磷灰石层析的机理亦被称为“混合模式”离子交换。它涉及固定相羟磷灰石树脂上带正电荷的钙离子和带负电荷的磷酸盐离子与蛋白带负电荷的羧基和带正电荷的氨基的非特异性相互作用。为了洗脱,通常使用渐增的磷酸盐浓度的缓冲液。根据Bond,M.,D.,Van Wart,H.,E.(上文),用磷酸钾梯度洗脱出3个部分。第一部分包含大部分色素,第三部分包含95%的胶原酶活性。第三部分进一步在SephacrylTM S200柱上进行凝胶过滤层析,然后在L-精氨酸-Affi-GelTM 202上进行亲和层析。这些按照公开的顺序组合的步骤用于去除褐色素和大部分污染的蛋白酶活性,所述活性抗酪蛋白、苯甲酰基-L-精氨酸乙酯和弹性蛋白。ReactiveRedTM 120染料配体层析细分I型和II型胶原酶。
WO 2003/004628公开了一种纯化方案,其中溶组织梭菌培养物上清依次在(1)羟磷灰石,(2)阴离子交换树脂,和(3)阳离子交换树脂上进行层析。从羟磷灰石柱洗脱的第三部分代表胶原酶I/II部分,但还包含梭菌蛋白酶。洗脱阴离子交换剂以分离为胶原酶I和胶原酶II两个部分。但是,这两个部分仍包含梭菌蛋白酶。利用阳离子交换剂将胶原酶从梭菌蛋白酶分离。
如上所述的方法展示了不同的层析方法,其目的在于从胶原酶中去除不希望有的梭菌蛋白酶。
WO 2007/089851公开了一种对利用硫酸铵沉淀作为主要回收步骤的评价,所述步骤用于从培养物滤液(其包含大量其他蛋白酶诸如梭菌蛋白酶)回收胶原酶蛋白。因此,向滤液中添加硫酸铵,初始浓度为100到400g/l,然后浓度为400到520g/l。发现通过沉淀来回收胶原酶在400g/l是显著的,并且利用该浓度产生的沉淀是最容易重悬的。此外,高于400g/l的浓度明显地对于胶原酶蛋白产生非常类似的回收。
为了在更大规模上产生胶原酶,WO 2007/089851公开了以下组合:(1)专门挑选的溶组织梭菌株,(2)具有优化胶原酶产生并且旨在减少梭菌蛋白酶产生的生长条件的发酵方法,和(3)胶原酶I/II的纯化方案。
两个要素(即溶组织梭菌株和液体发酵培养基的选择)有助于减少原料(用于纯化步骤)中的梭菌蛋白酶。因此,应当注意WO 2007/089851中公开的条件是使得纯化方案基于特异性梭菌蛋白酶活性为0.7到5.5U每毫克总胶原酶的粗品。根据所述公开的内容,这些值还反映了培养物上清中梭菌蛋白酶对胶原酶的比例,因为没有发现作为硫酸铵沉淀的效果的梭菌蛋白酶的显著分离。同等低量的梭菌蛋白酶(0.7到5.5U每毫克总胶原酶)看起来是发酵肉汤中蛋白胨的选择的作用。具体来说,来自猪的蛋白胨用于提供这种作用。
通过硫酸铵沉淀的方法从发酵肉汤中获得包含发酵产物的胶原酶粗品。
WO 2007/089851的纯化方案从液体发酵批量产物的过滤开始。在向滤液中添加硫酸铵并去除不溶物后,在液相中存在硫酸铵的条件下进行疏水性相互作用层析。向包含胶原酶的洗脱部分中添加亮抑酶肽(梭菌蛋白酶及其他丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的公知的(可逆)抑制剂),表明没有实现梭菌蛋白酶和/或其他蛋白酶的完全分离。在纯化过程的更晚步骤中去除亮抑酶肽。
还应注意到,最终纯化的胶原酶I和胶原酶II制剂还包含N末端切割的降解产物,并且对于胶原酶I来说还包含C末端切割的降解产物。
亮抑酶肽在WO 2007/089851纯化方法中的广泛使用表明即使在疏水性相互作用层析后,在包含胶原酶的洗脱部分仍然存在显著残留量的不希望有的蛋白水解活性。这类残留的蛋白酶是尤其不利的,因为它们快速降解所需胶原酶,而I型胶原酶是特别敏感的靶标。
与本领域的现有技术相反,本发明基于培养物滤液或上清,其中溶组织梭菌培养物的发酵肉汤不含任何哺乳动物来源的组分(诸如蛋白胨),并且其中所述滤液或上清中的特异性梭菌蛋白酶活性为约10到约200U每毫克总胶原酶,优选的为约50到约200U每毫克总胶原酶,更优选的为约75到约200U每毫克总胶原酶,甚至更优选的为约100到约200U每毫克总胶原酶。
本发明人意外地发现,在疏水性相互作用层析前利用硫酸铵((NH4)2SO4))的沉淀步骤能够获得包含所需I型和II型胶原酶的稳定中间产物。在回收沉淀并将其再溶解后,可以通过疏水性相互作用层析将所获包含胶原酶的合并的洗脱液中梭菌蛋白酶活性降低至约1/100到约1/150,胰蛋白酶活性降低至1/100-1/400,而与再溶解沉淀中存在的量相比,所述合并的洗脱液中存在80-95%的混合胶原酶I和II。因此,在疏水性相互作用层析后,在无任何蛋白酶抑制剂(例如亮抑酶肽)存在的条件下胶原酶I和II的混合物是基本上稳定的。也就是说,在本发明的条件下,检测不到或者只能检测到极低的胶原酶I或II的蛋白水解降解。重要地是,对制剂中共存的非胶原酶蛋白酶的去除是非常有效的,使得胶原酶I和II的进一步纯化能够产生具有特别高的纯度并且甚至没有N末端降解的产物。
发明概述
本发明的第一个方面是从复杂混合物部分地纯化溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白的方法,包括以下步骤:(a)提供溶于水性液相的复杂混合物;(b)通过在步骤(a)的液相中溶解硫酸铵形成I型和II型胶原酶蛋白的沉淀;(c)从所述液相中分离步骤(b)的沉淀;(d)在包含Ca2+离子并且pH为6.0到8.0的水性缓冲液中溶解步骤(c)的沉淀,并调节含有溶解沉淀的缓冲液的电导率值为50到300mS/cm,从而形成包含I型和II型胶原酶蛋白的复杂缓冲溶液;(e)通过将步骤(d)的复杂缓冲溶液与疏水性固定相接触并且使I型和II型胶原酶蛋白吸附到所述固定相上,以此来提取所述复杂缓冲溶液;(f)将步骤(e)的含有吸附的I型和II型胶原酶蛋白的疏水性固定相从提取的溶液分离;(g)从步骤(f)的固定相洗脱I型和II型胶原酶蛋白;从而纯化I型和II型胶原酶蛋白。本发明的第二个方面是一种可通过本发明的方法获得的制剂,其包含具有酶活性的溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白。本发明的第三个方面是一种可通过本发明的方法获得的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂。本发明的第四个方面是一种可通过本发明的方法获得的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂。本发明的第五个方面是一种包含溶组织梭菌I型胶原酶和溶组织梭菌II型胶原酶的混合物,其特征在于本发明第一已测定量的纯化制剂与本发明第二已测定量的纯化制剂混合。本发明的第六个方面是本发明具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂、本发明具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂或本发明的混合物用于处理组织样品的用途,由此所述样品中的胶原蛋白被消化。
发明详述
在本发明的说明书中,某些术语具有特殊的含义,或第一次被定义。用于本发明时,当使用的术语具有本领域公知的定义时,它们采用这样的定义,除非那些定义与下面阐述的定义冲突或部分冲突。如果定义有冲突时,术语的含义首先由下面阐述的任意一项定义来确定。
本发明涉及I型和II型溶组织梭菌胶原酶(EC 3.4.24.3),如Bond,M.,D.,van Wart,H.,E Biochemistry 23(1984),3077-3085和Bond,M.,D.vanWart,H..E.,Biochemistry 23(1984),3085-3091先前给出的。
本发明说明书和权利要求中使用的术语“包含”表示“包括,但不是必须限于”。
冠词“一”在本文中使用时是指一或者超过一(即至少一)的该冠词的语法对象。举例来说,“一种化合物”是指一种化合物或超过一种化合物。
当指定数值范围诸如浓度范围时,范围用单词“在...之间”表示,后面是第一值n1和第二值n2。指定范围的下边界被理解为等于或高于第一值的值。指定范围的上边界被理解为等于或低于第二值的值。因此,值x的指定范围用n1≤x≤n2表示。
如果不另外声明,应当理解术语“约”与数值n联用时表示位于所述值的数值±5%之间的值x,即n-0.05*n≤x≤n+0.05*n。在术语“约”与数值n联用描述本发明的优选实施方案的情况下,如果不另外标明,则n值是最优选的。
氨基酸标志使用氨基酸的三字母缩写以及单字母表,即,Asp D天冬氨酸,Ile I异亮氨酸,Thr T苏氨酸,Leu L亮氨酸,Ser S丝氨酸,Tyr Y酪氨酸,Glu E谷氨酸,Phe F苯丙氨酸,Pro P脯氨酸,His H组氨酸,Gly G甘氨酸,Lys K赖氨酸,Ala A丙氨酸,Arg R精氨酸,Cys C半胱氨酸,TrpW色氨酸,Val V缬氨酸,Gln Q谷氨酰胺,Met M甲硫氨酸,Asn N天冬酰胺。
本文的“复杂混合物”(从其纯化胶原酶蛋白)包含感兴趣的蛋白及一种或者更多种杂质。组合物可以被“部分纯化”(即已经进行一个或多个纯化步骤或可以直接从产生蛋白的溶组织梭菌培养物获得(例如所述复杂混合物可以包括收集的培养液)。
“杂质”是不同于任意一种所需蛋白的物质。杂质包括但不限于溶组织梭菌蛋白,除了任意一种靶蛋白之外的多肽,核酸,内毒素,外毒素,噬菌体组分,等等。如本文使用的,“蛋白”通常是指具有超过约10个氨基酸的多肽。包括每种相应同工型的每一胶原酶I(“I型胶原酶”)和胶原酶II(“II型胶原酶”)蛋白还被称为“所需蛋白”、“靶蛋白”或“感兴趣的蛋白”,前提是所述蛋白具有胶原酶酶活性的特征。因此一个实例是根据Bond,M.,D.,van Wart,H.,E.,Biochemistry 23(1984),3085-3091的胶原酶蛋白的任意一种。如果不明确另外声明的话,术语“所需蛋白”、“靶蛋白”、“感兴趣的蛋白”,“胶原酶”或“胶原酶蛋白”中任意一种的复数形式是指总的I型和II型胶原酶蛋白。从包含蛋白和一种或者更多种杂质的组合物“纯化”所述蛋白表示通过从所述组合物去除(完全地或部分地)至少一种杂质来增加组合物中所述蛋白的纯度。根据本发明,胶原酶蛋白的纯化通过以下方法进行,包括硫酸铵沉淀,疏水性相互作用层析,和阳离子交换层析,由此纯化步骤按这种特定顺序进行。“纯化步骤”是产生溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白的“均质”组合物的总纯化过程的部分。因此,当存在于均质组合物中时,蛋白被“纯化到均质”。通过附加的和后续的阴离子交换层析步骤,I型和II型胶原酶蛋白被纯化到均质。
术语“层析”是指一种过程,通过该过程混合物中感兴趣的溶质与混合物中的其他溶质分离,这是混合物中各种溶质在流动相影响下迁移通过固定介质的速率差异或在结合和洗脱过程中的差异造成的。“盐”是由酸和碱基的相互作用形成的化合物。可用于本发明的盐包括,但不限于氯化物(例如氯化钠,氯化钙)和硫酸盐(例如硫酸铵)。如本文使用的,“溶剂”是指能够溶解或分散一种或者更多种其他物质以提供溶液的液体物质。
术语“离子交换”和“离子交换层析”是指层析过程,其中混合物中感兴趣的溶质(诸如蛋白)与固相离子交换物质上连接(诸如通过共价附着)的带电化合物相互作用,这样的话感兴趣的溶质相对于混合物中的溶质杂质或污染物更强或更弱地与带电化合物非特异性相互作用。混合物中的一种或者更多种污染溶质(杂质)比感兴趣的溶质更快或更慢地从离子交换物质的柱中洗脱,或相对于感兴趣的溶质来说与树脂结合或被树脂排斥。“离子交换层析”具体包括阳离子交换,阴离子交换和混合模式层析。“离子交换物质”是指带负电荷的(即阳离子交换树脂)或带正电荷的(即阴离子交换树脂)的固相。可以通过将一种或者更多种带电配体附着到固相(例如通过共价连接)提供电荷。可选择地,或此外,电荷可以是固相的固有性质(例如和二氧化硅的情况一样,其总的来说是带负电荷的)。
“固相”或“固定相”表示一种或者更多种带电配体可以附着的非水基质。固相或固定相可以是纯化柱,分散颗粒的非连续相,膜,或滤器等等。用于形成固相的物质的实例包括多糖(诸如琼脂糖和纤维素);和其他机械稳定的基质诸如二氧化硅(例如可控孔度玻璃),聚(苯乙烯二乙烯基)苯,聚丙烯酰胺,陶瓷颗粒及上述任一种的衍生物。
“阳离子交换树脂”是指带负电荷的固相,因此其具有游离的阳离子来和通过固相上或穿过固相的水溶液中的阳离子交换。附着到固相形成阳离子交换树脂的带负电荷的配体可以是诸如羧酸酯或磺酸酯。商品化供应的阳离子交换树脂包括羧甲基纤维素,固定在琼脂糖上的sulphopropyl(SP)(例如SP-SEPHAROSETM FAST FLOW或SP-SEPHAROSETM HIGHPERFORMANCE)和固定在琼脂糖上的磺酰(例如S-SEPHAROSETMFAST FLOW)。“混合模式的离子交换树脂”是指用阳离子、阴离子和疏水性部分共价修饰的固相。
本文使用的术语“阴离子交换树脂”是指带正电荷的固相,例如具有一种或者更多种带正电荷的配体,诸如附着到其上的季氨基。商品化供应的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素,QAE SEPHADEXTM和FAST FLOW QSEPHAROSETM
“缓冲液”是通过其酸碱配对组分的作用防止pH变化的溶液。取决于例如该缓冲液的所需pH可以使用的各种缓冲液描述于Buffers.A Guidefor the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems,Gueffroy,D.,ed.Calbiochem Corporation(1975)。在一个实施方案中,缓冲液的pH范围为约2到约9,可选择地从约3到约8,可选择地从约4到约7,可选择地从约5到约7。将pH控制在该范围的缓冲液的非限制性实例包括MES,MOPS,MOPSO,Tris,HEPES,磷酸盐,醋酸盐,柠檬酸盐,琥珀酸盐和铵缓冲液,及其组合。
“上样缓冲液”是指用于将组合物(包含感兴趣的多肽分子和一种或者更多种杂质)上样到离子交换树脂的缓冲液。上样缓冲液具有的电导率和/或pH使得感兴趣的多肽分子(和通常一种或者更多种杂质)结合离子交换树脂或使得感兴趣的蛋白流过柱而杂质结合到树脂。本文使用的术语“洗涤缓冲液”是指在洗脱感兴趣的多肽分子前,用于洗涤或再平衡离子交换树脂的缓冲液。方便地,洗涤缓冲液和上样缓冲液可以是相同的,但这不是必需的。“洗脱缓冲液”用于从固相洗脱感兴趣的多肽。洗脱缓冲液的电导率和/或pH能够使得感兴趣的多肽从离子交换树脂上洗脱。“再生缓冲液”可以用于再生离子交换树脂使得它可以被再次使用。再生缓冲液具有从离子交换树脂上基本上去除所有杂质和感兴趣的多肽所需的电导率和/或pH。
术语“电导率”是指水溶液在两个电极间导电的能力。在溶液中,电流通过离子迁移流动。因此,随着水溶液中存在的离子量的增加,溶液将具有更高的电导率。电导率的计量单位是毫西门子(mS)每厘米(mS/cm),可以用电导率计来测量。通过改变溶液中的离子浓度可以改变溶液的电导率。例如,可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如(NH4)2SO4,NaCl或CaCl2)的浓度以便得到所需电导率。优选地,按照下文实施例部分所述,改变各种缓冲液的盐浓度以得到所需电导率。
将分子“结合”到固定相(诸如疏水性相互作用物质或离子交换物质)是指在合适条件下(pH/电导率)将分子暴露于固定相使得分子“吸附”到或者可逆地固定到固定相中或固定相上。这会由于所述分子与固定相的官能团之间疏水性或离子相互作用而受到影响。“洗涤”固定相是指将适当缓冲液穿过固定相或在固定相上流过。在本发明优选的实施方案中,在洗涤过程中靶蛋白保持与固定相的吸附或吸附到固定相之上。从固定相上“洗脱”分子(例如,所需多肽或杂质)表示通过改变参数(选自由固定相周围的缓冲液的组分、电导率、离子强度和pH组成的组)从固定相去除分子,这样的话所述分子从固定相的官能团释放。
本发明提供从溶组织梭菌培养物上清、滤液等等(即包含I型和II型胶原酶蛋白作为溶解物的复杂溶液)纯化具有酶活性的胶原酶蛋白的方法。为了限制靶蛋白的蛋白水解消化,将复杂溶液冷却到2℃到10℃的温度。如果不另外指出的话,在该范围内的温度下进行后续纯化步骤。
一旦获得包含感兴趣的蛋白的溶液,通常通过利用不同层析技术的组合实现它们与溶液中不希望有的组分之间的分离。不希望有的组分包括培养基的残留成分(诸如蛋白,蛋白胨,碳水化合物和其他化合物)或由细胞产生的其他蛋白(即非胶原酶蛋白)。
在本发明第一个实施方案中,在层析纯化前进行硫酸铵沉淀步骤。通过沉淀,大部分不希望有的组分从胶原酶蛋白分离。在液体培养物上清、滤液等等(也被统称为“澄清的培养物上清”)中,在浓度为2.6M到2.8M((NH4)2SO4的目标浓度)的硫酸铵存在条件下,形成包含胶原酶蛋白的沉淀。
硫酸铵沉淀是一种通过改变蛋白的溶解度来纯化蛋白的方法。它是被称为盐析的更常规技术的具体实例。通常使用硫酸铵是因为其溶解度非常高,能够获得具有高离子强度的盐溶液。蛋白的溶解度根据溶液的离子强度从而根据盐浓度来改变。观察到两种不同的作用:在低盐浓度,蛋白的溶解度随盐浓度的增加(即增加离子强度)而增加,这是称为盐溶的作用。当盐浓度(离子强度)进一步增加时,蛋白的溶解度开始降低。在足够高的离子强度下,蛋白将几乎完全从溶液中沉淀(盐析)。因为蛋白在高离子强度下的溶解度显著不同,盐析是辅助纯化指定蛋白的非常有效的方法。通常使用的盐是硫酸铵,因为它的水溶性非常高,并且对酶活性没有不利作用。在连续搅拌液相时可以添加干物质形式的硫酸铵。可选择地,可以添加浓缩溶液(例如饱和水溶液)形式的硫酸铵。优选地,在约30分钟内向液体培养物上清、滤液等等中连续添加(NH4)2SO4,并在其中溶解,以便达到(NH4)2SO4的目标浓度。
在调节硫酸铵浓度为2.6M到2.8M后,能够在约10分钟到约30分钟的时段内形成沉淀。然后通过离心去除沉淀的蛋白,随后将硫酸铵浓度增加到能沉淀大部分感兴趣的蛋白同时将最大量的蛋白污染物仍保留在溶液中的值。通过离心回收沉淀的感兴趣的蛋白,将其溶于新鲜的缓冲液用于下一阶段的纯化。
该技术作为本发明纯化方案的第一步,可用于快速去除大量污染蛋白。它还可用于纯化的更晚阶段以便从诸如凝胶过滤和其他层析分离技术的步骤之后的稀释溶液中浓缩蛋白。
层析技术基于蛋白的电荷、疏水程度或大小来分离蛋白混合物。对于这些技术中的每一种有数种不同的层析树脂,能够为涉及到的具体蛋白提供精确定制的纯化方案。这些分离方法中每一种的本质是使蛋白以不同的速率沿长柱移动从而实现物理分离(当它们进一步穿过柱时这种分离增加),或与分离介质选择性附着,然后通过不同的溶剂差异洗脱。在一些情况下,当杂质特异性吸附到柱而感兴趣的蛋白不吸附到柱(即感兴趣的蛋白存在于″流过液″时),所需蛋白与杂质分离。
离子交换层析(对于可交换平衡离子的称呼)是适合纯化可离子化分子的方法。离子化分子的分离是基于它们的带电基团与固相支持基质上附着的带相反电荷的分子间的非特异性静电相互作用,从而阻滞那些与固相相互作用更强的离子化分子。每种离子化分子的净电荷及其对基质的亲和力根据带电基团的数目、每个基团的电荷以及竞争与带电固相基质的相互作用的分子性质而变化。这些差异导致通过离子交换层析分离各种分子类型。在利用离子交换层析的典型蛋白纯化中,将源自宿主细胞的诸多蛋白的混合物(诸如在哺乳动物细胞培养物中)加到离子交换柱。在洗掉未结合的分子后,调整条件,诸如按照逐步或梯度方式改变pH、平衡离子浓度等等,从固相释放非特异性保留或阻滞的感兴趣的离子化蛋白,将其与具有不同电荷特性的蛋白分离。阴离子交换层析涉及在特定分离步骤的pH和条件下,感兴趣的阴离子分子与负电性平衡离子竞争与固相基质上附着的带正电荷的分子的相互作用。与此相反,阳离子交换层析涉及在特定分离步骤的pH和条件下,感兴趣的阳离子分子与正电性平衡离子竞争与固相基质上附着的带负电荷的分子的相互作用。混合模式的离子交换层析涉及在相同步骤中阳离子和阴离子交换层析介质的组合使用。尤其是,“混合模式”是指共价附着了阳离子交换、阴离子交换和疏水性相互作用部分的混合物的固相支持基质。
疏水性相互作用层析(也被称为“HIC”)是利用疏水性使蛋白彼此分离的分离技术。在这类层析中,疏水基团诸如苯基、辛基或丁基被附着到固定相。穿过柱的蛋白(其表面具有疏水性的氨基酸侧链)能够与柱上的疏水基团相互作用和结合。通常,在HIC分离中,具有高离子强度的缓冲液(通常是硫酸铵)首先被加到柱上。缓冲液中的盐减少样品溶质的溶剂化作用,因此随着溶剂化作用降低,变得暴露的疏水性区域被介质吸附。被吸附的靶分子的疏水性越高,促进结合需要的盐越少。为了从固定相洗脱吸附的蛋白,降低盐浓度以增加疏水性。逐步降低可以使用梯度形式。此外,还可以通过利用某些有机调节剂或利用去污剂来实现洗脱。
对于HIC来说,固定相能够与其他分子形成疏水性相互作用。这些相互作用在水中是非常弱的。但是,向缓冲液中添加盐产生疏水性相互作用。增加疏水性相互作用的盐包括(按照它们增强相互作用的能力的顺序):Na2SO4,K2SO4,(NH4)2SO4,NaCl,NH4Cl,NaBr和NaSCN。
尽管反相层析和疏水性相互作用层析是非常类似的,反相层析中的配体通常比疏水性相互作用层析中配体的疏水性更高。这使疏水性相互作用层析可用于更温和的洗脱条件,所述条件基本上不破坏样品。优选的进行HIC的固定相包括TOYOPEARLTM Phenyl-650,Phenyl SEPHAROSETMCL-4B,Phenyl SEPHAROSETM 6 FAST FLOW(HIGH SUB)和PhenylSEPHAROSETM 6 FAST FLOW(LOW SUB)。
本发明提供的重要优点在于优化的部分纯化,其特别将梭菌蛋白酶活性与胶原酶蛋白分离。因此,后续纯化步骤期间胶原酶蛋白的降解被降到最低。在进一步的详述中,本发明包括下列方面和优选的实施方案:
1.一种从复杂混合物纯化溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)提供溶于水性液相的复杂混合物;
(b)通过在步骤(a)的液相中溶解硫酸铵形成I型和II型胶原酶蛋白的沉淀;
(c)从液相分离步骤(b)的沉淀;
(d)在包含Ca2+离子并且pH为6.0到8.0的水性缓冲液中溶解步骤(c)的沉淀,并且调节含有溶解的沉淀的缓冲液的电导率值为50到300mS/cm,从而形成包含I型和II型胶原酶蛋白的复杂缓冲溶液;
(e)通过将步骤(d)的复杂缓冲溶液与疏水性固定相接触并且使I型和II型胶原酶蛋白吸附到所述固定相上,以此来提取所述步骤(d)的复杂缓冲溶液;
(f)将步骤(e)的含有吸附的I型和II型胶原酶蛋白的疏水性固定相与提取的溶液分离;
(g)从步骤(f)的固定相洗脱I型和II型胶原酶蛋白;
从而纯化I型和II型胶原酶蛋白。
2.第1项的方法,其特征在于步骤(b)的实施是通过在液相中溶解浓度为约2.6M到约3.2M的硫酸铵,更优选的为约2.6M到约2.8M的硫酸铵,从而形成包含I型和II型胶原酶蛋白的沉淀。
3.第2项的方法,其特征在于约417g到约458g的硫酸铵溶于1升液相。
4.第2和3项中任意一项的方法,其特征在于相对于步骤(a)的溶解的复杂混合物中相应的蛋白水解活性,步骤(c)后沉淀的可溶物中梭菌蛋白酶的蛋白水解活性降低至1/90到1/150,胰蛋白酶活性降低至1/100到约1/400。
5.第4项的方法,其特征在于梭菌蛋白酶的蛋白水解活性降低至1/100到1/150,胰蛋白酶活性降低至约1/200到约1/400。
6.第5项的方法,其特征在于梭菌蛋白酶的蛋白水解活性降低直至1/150,胰蛋白酶活性降低直至约1/400。
7.第1到6项中任意一项的方法,其特征在于步骤(c)之后是另一步骤(c′),其包括在10℃或更低的温度下保存沉淀。
8.第7项的方法,其特征在于保存温度为10℃到-20℃。
9.第8项的方法,其特征在于保存温度为-20℃。
10.第1到9项中任意一项的方法,其特征在于步骤(d)中,水性缓冲液包含浓度为5mM的Ca2+离子。
11.第1到10项中任意一项的方法,其特征在于步骤(d)中,水性缓冲液包含能够在pH 6到8.5的范围内缓冲的缓冲化合物。
12.第11项的方法,其特征在于缓冲化合物存在的浓度为20mM。
13.第1到12项中任意一项的方法,其特征在于步骤(d)中,水性缓冲液包含缓冲化合物,所述缓冲化合物选自BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸),Tris(2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇),BisTris(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷),BisTris propane(1,3-双(三(羟甲基)甲氨基)丙烷),HEPES(N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2-乙磺酸),MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸),MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸),MOPSO(3-吗啉代-2-羟基丙磺酸),PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)),TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸),TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸),TEA(三乙醇胺)和Tricine(N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)。
14.第13项的方法,其特征在于步骤(d)中,水性缓冲液包含TES或HEPES。
15.第1到14项中任意一项的方法,其特征在于步骤(d)中,水性缓冲液的pH是中性的。
16.第1到15项中任意一项的方法,其特征在于步骤(d)中,复杂缓冲溶液的pH是中性的。
17.第1到16项中任意一项的方法,其特征在于步骤(d)中,复杂缓冲溶液的电导率为50mS/cm到290mS/cm。
18.第17项的方法,其特征在于步骤(d)中,复杂缓冲溶液的电导率为50mS/cm到200mS/cm。
19.第18项的方法,其特征在于步骤(d)中,复杂缓冲溶液的电导率为50mS/cm到150mS/cm。
20.第19项的方法,其特征在于步骤(d)中,复杂缓冲溶液的电导率为90mS/cm到100mS/cm。
21.第20项的方法,其特征在于步骤(d)中,复杂缓冲溶液的电导率为大约95mS/cm。
22.第17到21项中任意一项的方法,其特征在于复杂缓冲溶液中硫酸铵的浓度为0.3M到1M。
23.第22项的方法,其特征在于复杂缓冲溶液中硫酸铵的浓度为大约0.6M,更优选的为0.6M。
24.第1到23项中任意一项的方法,其特征在于步骤(f)的固定相是用疏水性有机残基衍生化的固相基质。
25.第24项的方法,其特征在于步骤(f)的固定相是用有机残基衍生化的固相基质,所述有机残基选自己基、丁基、辛基和苯基。
26.第24和25项中任意一项的方法,其特征在于固相基质选自琼脂糖,异丁烯酸衍生物,丙烯酰胺聚合物,包含丙烯酰胺的共聚物,源自乙烯单体的聚合物(乙烯基聚合物)以及包含苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
27.第24到26项中任意一项的方法,其特征在于步骤(f)的固定相选自TOYOPEARLTM Phenyl-650,Phenyl SEPHAROSETM CL-4B,PhenylSEPHAROSETM 6 FAST FLOW(HIGH SUB)和Phenyl SEPHAROSETM 6FAST FLOW(LOW SUB)。
28.第27项的方法,其特征在于步骤(f)的固定相是PhenylSEPHAROSETM 6 FAST FLOW(LOW SUB)。
29.第1到28项中任意一项的方法,其特征在于步骤(f)后是另一步骤(f),其包括利用包含Ca2+离子的水性洗涤缓冲液洗涤步骤(f)的固定相,所述水性洗涤缓冲液具有中性pH及50mS/cm到300mS/cm的电导率,由此I型和II型胶原酶蛋白仍吸附在固定相上。
30.第29项的方法,其特征在于洗涤缓冲液的电导率与步骤(d)的复杂缓冲溶液的电导率相同。
31.第29和30项中任意一项的方法,其特征在于洗涤缓冲液的Ca2+离子浓度和/或硫酸铵浓度和/或pH与步骤(d)的复杂缓冲溶液相同。
32.第29到31项中任意一项的方法,其特征在于通过从步骤(f)的固定相洗脱I型和II型胶原酶蛋白来实施步骤(g)。
33.第1到32项中任意一项的方法,其特征在于利用洗脱缓冲液实施步骤(g),因此洗脱缓冲液包含比复杂缓冲溶液更低浓度和更低电导率的盐。
34.第33项的方法,其特征在于通过在固定相上使用盐浓度梯度实施步骤(g)。
35.第33项的方法,其特征在于通过使用一种或者更多种洗脱缓冲液并进行等度洗脱来实施步骤(g)。
36.第33项的方法,其特征在于步骤(g)中通过在固定相上使用洗脱缓冲液来洗脱I型和II型胶原酶蛋白,因此洗脱缓冲液的电导率比复杂缓冲溶液的电导率低大约20%。
37.第36项的方法,其特征在于洗脱缓冲液的电导率为大约76mS/cm。
38.第1到37项中任意一项的方法,其特征在于所述复杂混合物还包含具有蛋白水解活性的酶。
39.第38项的方法,其特征在于所述复杂混合物包含具有蛋白水解活性的酶,所述酶选自梭菌蛋白酶(胞内蛋白酶Arg-C,EC 3.4.22.8)、中性蛋白酶和具有胰蛋白酶活性的酶。
40.第38和39项中任意一项的方法,其特征在于所述复杂混合物是液态溶组织梭菌培养物的上清或滤液。
41.第1到40项中任意一项的方法,其特征在于步骤(g)及任选的后续去除硫酸铵的步骤中可获得的I型和II型胶原酶蛋白具有酶活性。
42.第1到41项中任意一项的方法,其特征在于步骤(g)后接着一个后续步骤,由此在所述后续步骤中硫酸铵与I型和II型胶原酶蛋白分离。
43.第1到42项中任意一项的方法,其特征在于通过阳离子交换层析进一步纯化步骤(g)的I型和II型胶原酶蛋白,由此更多的残留蛋白水解活性被进一步与I型和II型胶原酶蛋白分离。
44.第43项的方法,其特征在于在浓度约5mM的Ca2+离子、缓冲化合物和中性pH存在条件下进行阳离子交换层析。
45.第43和44项中任意一项的方法,其特征在于所述缓冲化合物的浓度为20mM。
46.第45项的方法,其特征在于所述缓冲化合物选自BES,Tris,BisTris,BisTris propane,HEPES,MES,MOPS,MOPSO,PIPES,TAPS,TES,TEA和Tricine。
47.第46项的方法,其特征在于所述缓冲化合物是TES或HEPES。
48.第44项的方法,其特征在于在浓度约5mM的CaCl2存在条件下进行阳离子交换层析。
49.第43到48项中任意一项的方法,其特征在于阳离子交换固定相是SP SEPHAROSETM
50.第43到49项中任意一项的方法,其特征在于通过进行以下步骤分离I型和II型蛋白
(A)将进一步纯化的I型和II型胶原酶蛋白与阴离子交换固定相接触,并且让I型和II型胶原酶蛋白吸附到所述固定相;
(B)从步骤(A)的固定相洗脱I型胶原酶和II型胶原酶蛋白到不同的部分;
由此I型胶原酶和II型胶原酶蛋白被分别纯化。
51.第50项的方法,其特征在于在浓度约5mM的Ca2+离子、缓冲化合物及中性或弱碱性pH存在条件下进行步骤(A)。
52.第50和51项中任意一项的方法,其特征在于利用1×-25×浓度梯度的洗脱缓冲液的梯度洗脱进行步骤(B),所述洗脱缓冲液在1×浓度时包含浓度约35mM的Ca2+离子、缓冲化合物及中性或弱碱性pH,由此1×是梯度的起始浓度而25×是梯度的终浓度。
53.第51和52项中任意一项的方法,其特征在于所述弱碱性pH是7.5。
54.第51和52项中任意一项的方法,其特征在于所述缓冲化合物的浓度为5mM。
55.第54项的方法,其特征在于所述缓冲化合物选自BES,Tris,BisTris,BisTris propane,HEPES,MES,MOPS,MOPSO,PIPES,TAPS,TES,TEA和Tricine。
56.第55项的方法,其特征在于所述缓冲化合物是TES或HEPES。
57.第51项的方法,其特征在于在浓度约5mM的CaCl2存在条件下进行步骤(A)。
58.第52项的方法,其特征在于步骤(B)中1×浓度的洗脱缓冲液包含浓度约35mM的CaCl2
59.第50到58项中任意一项的方法,其特征在于阴离子交换固定相是Q-SEPHAROSETM
60.第43到59项中任意一项的方法,其特征在于步骤(B)中获得的I型和II型胶原酶蛋白具有酶活性。
61.第50到60项中任意一项的方法,其特征在于所述I型和II型胶原酶蛋白在不同的部分获得。
62.可通过第1到42项中任意一项的方法获得的制剂,其包含具有酶活性的溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白。
63.第62项的制剂,其特征在于与液态溶组织梭菌培养物的上清或滤液的复杂混合物相比,所述制剂中胰蛋白酶的蛋白水解活性降低至约1/100到约1/400。
64.可通过第61项的方法获得的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂。
65.第64项的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂,其特征在于通过LC ESI-MS测定,所述制剂中约82%的I型胶原酶蛋白具有113,920Da的分子量。
66.第65项的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂,其特征在于约82%的I型胶原酶蛋白是N末端完整的。
67.第66项的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂,其特征在于所述I型胶原酶蛋白的N末端具有氨基酸序列IANTNS。
68.可通过第61项的方法获得的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂。
69.第68项的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂,其特征在于通过LC ESI-MS测定,所述制剂中约93%的II型胶原酶蛋白具有112,000Da的分子量。
70.第69项的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂,其特征在于约93%的II型胶原酶蛋白是N末端完整的。
71.第70项的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂,其特征在于所述II型胶原酶蛋白的N末端具有氨基酸序列VQNESK。
72.第64到67项中任意一项的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂,其特征在于所述制剂中梭菌蛋白酶的活性低于约0.04U/mg蛋白,更优选的为约0.01U/mg蛋白到约0.03U/mg蛋白。
73.第68到71项中任意一项的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂,其特征在于所述制剂中梭菌蛋白酶的活性低于约0.07U/mg蛋白,更优选的为约0.04U/mg蛋白到约0.06U/mg蛋白。
74.第64到67项中任意一项的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂,其特征在于所述制剂中胰蛋白酶的活性低于约0.0003U/mg蛋白,更优选的为约0.0001U/mg蛋白到约0.0003U/mg蛋白。
75.第68到71项中任意一项的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂,其特征在于所述制剂中胰蛋白酶的活性低于约0.001U/mg蛋白,更优选的为约0.0003U/mg蛋白到约0.001U/mg蛋白。
76.包含溶组织梭菌I型胶原酶和溶组织梭菌II型胶原酶的混合物,其特征在于第一已测定量的第64到67项中任意一项的纯化制剂与第二已测定量的第68到71项中任意一项的纯化制剂混合。
77.第76项的混合物,其特征在于所述混合物还包含第三已测定量的另外的蛋白水解酶的制剂。
78.第64到67项中任意一项及第72和74项中任意一项的具有酶活性的溶组织梭菌I型胶原酶的纯化制剂用于处理组织样品的用途,由此所述样品中存在的胶原蛋白被消化。
79.第68到71项中任意一项及第73和75项中任意一项的具有酶活性的溶组织梭菌II型胶原酶的纯化制剂用于处理组织样品的用途,由此所述样品中存在的胶原蛋白被消化。
80.第76和77项中任意一项的混合物用于处理组织样品的用途,由此所述样品中存在的胶原蛋白被消化。
提供下列实施例和附图以帮助理解本发明,而本发明的真正范围在所附权利要求中阐述。应当理解在不脱离本发明精神的条件下可以对阐明的步骤进行修改。
附图简述
图1疏水性相互作用层析后II型和I型胶原酶蛋白的稳定性。根据实施例5进行MONO-QTM分析。显示4张层析图的重叠。标记“II”和“I”的峰分别是指II型和I型胶原酶蛋白。标记“a”、“b”、“c”和“d”的箭头指示在4℃孵育纯化的混合物0天(“a”)、2天(“b”)、3天(“c”)和6天(“d”)后对应于I型胶原酶蛋白的主峰的高度。
图2疏水性相互作用层析后II型和I型胶原酶蛋白的MONO-QTM层析图(方法参见实施例5)。峰标记如图1所示。
图3Red SEPHAROSETM FAST FLOW层析后II型和I型胶原酶蛋白的MONO-QTM层析图(方法参见实施例5)。峰标记如图1所示。
图4纯化的I型胶原酶的示例性HPLC/ESI-MS结果。纵坐标:mAU,横坐标:时间。I组峰(标记为“I”)的峰高为约1180单位到约4720单位。比较起来,II组主峰(标记为“II”)的高度为约207527单位。
图5纯化的II型胶原酶的示例性HPLC/ESI-MS结果。纵坐标:mAU,横坐标:时间。I组峰(标记为“I”)的峰高为约840单位到约3840单位。比较起来,II组主峰(标记为“II”)的高度为约226388单位。
实施例1
包含溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白的原料
优选的原料是溶组织梭菌液体培养物的澄清上清。在培养中支持溶组织梭菌生长的液体培养基是本领域公知的。关于这类培养基的最近文献包括WO 2007/089851。当利用下文所述的本发明的纯化方案时,在不想要的蛋白水解活性的去除及胶原酶蛋白最终制剂的纯度方面,对于不同的生长培养基没有观察到显著差异。
在逐步扩大的过程中,溶组织梭菌在氮气条件下在液体培养物中厌氧生长。第一种子培养通常开始于约100ml的体积。逐步利用增加的体积(诸如1升,10升,50升)制备后续的预培养物。利用范围为约100升到约2,500升的培养体积实施大规模发酵。生长温度是30℃,发酵培养基的pH值保持在约7.3。定期提取培养物的样品,并按照实施例2所述检测上清的胶原酶蛋白水解活性。通常,在添加预培养物约15小时到约18小时后收集大规模的发酵罐。
当发酵终止时,将培养物冷却到约2℃到8℃。通过离心或过滤(这两者均产生澄清的培养物上清)从液体培养基分离细胞物质、碎片颗粒及其他颗粒物。就过滤而言,滤液穿过孔径为约0.3μm到约1μm的过滤材料。利用ACROPAKTM 500材料(孔径0.45-0.8μm)获得满意结果。
在后续纯化步骤前,对澄清培养物上清中的数种蛋白水解活性进行测定。这些包括胶原酶(参见实施例2)、梭菌蛋白酶(参见实施例3)和胰蛋白酶(参见实施例4)的蛋白水解活性。通过常规方法确定蛋白含量,通常利用UV分光术,Bradford-Lowry-或双缩脲蛋白测定法,或双金鸡宁酸(bicinchoninic acid)测定法。典型的澄清培养物上清具有约1.5g/l的蛋白含量和约4kU/l的胶原酶活性。
可选择地,粗品诸如培养物上清的冻干物(Bond,M.,D.,van Ward,H.,E.,Biochemistry 23(1984)3077-3085)可以作为起始材料。在这种情况下,按照本发明下文的描述处理冻干物的水溶液。
实施例2
确定胶原酶I和II蛋白水解活性的测定法
利用合成的肽底物,通过标准方法测量采用Wünsch单位(Wuensch,E.,Heidrich,H.,Z.,Physiol.Chem.333(1963)149-159)的胶原酶蛋白水解活性。胶原酶蛋白水解活性催化修饰的底物(“Wuensch”)肽4-苯偶氮基-苄氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg(Bachem M1715)在Leu和Gly残基间的水解。1活性单位(U)被定义为在25℃、pH 7.1每分钟水解1μM肽。
在溶液中提供浓度为1mg/ml的底物肽(也被称作“底物”)。首先将10mg底物肽溶于0.2ml甲醇。通过添加0.1M TrisHCl,pH 7.1将所述溶液的体积增加到10ml。其他试剂是溶于水的0.1M CaCl2溶液和提取混合物(由水中的5体积份醋酸乙酯和1体积份0.025M柠檬酸组成)。提供干燥管作为包含0.35-0.4g Na2SO4的试管。在使用前用石蜡膜(parafilm)密封每个干燥管。
根据下列移液方案和工艺流程在试管中开始对照和样品反应:
步骤        溶液        对照试管        样品试管
1           底物肽      1ml             1ml
            CaCl2       0.2ml           0.2ml
     混合,加热到25℃
2    样品材料§              -             0.05ml
     0.1M TrisHCl,pH 7.1    0.05ml        -
     混合,在25℃孵育15分钟;孵育后,将孵育溶液的等分试样转移到一
     定体积的提取混合物中
3    步骤2的孵育溶液         0.5ml         0.5ml
     提取混合物              6ml           6ml
     通过涡旋20s立即混合,将约3ml醋酸乙酯相转移到干燥管中,通过
     涡旋混合并将上清转移到比色杯中;在320nm测量消光(A),比色杯光
     程=1cm。
4    计算体积活性[U/ml]=ΔA*d*0.794
     A:测量的消光值
     d:稀释因子
     ΔA=A样品-A对照
§包含胶原酶I型和II型酶两者的溶液,或者分别包含其中一种酶的溶液。通常通过稀释包含I型和/或II型胶原酶的溶液来制备测定中使用的样品材料。利用0.1M TrisHCl,pH 7.1进行稀释;对于每次测量来说,调节和选择相应的稀释系数(d)以便最终产生0.3到1.0的消光值。含有I型胶原酶但不含有II型胶原酶的溶液进行1∶100稀释;含有II型胶原酶的溶液进行1∶1,000稀释。此外,检测含有已知量I型和/或II型胶原酶的标准品作为参考。
当利用Wuensch肽作为底物进行活性测定时,在包含胶原酶I型和II型酶的混合物中,测量到的胶原酶II活性总是大于胶原酶I的活性。按照本发明的完整纯化方案纯化并作为实施例14所述终产物获得的II型胶原酶具有约10到约14U每毫克蛋白的特异活性;同样纯化的I型胶原酶的特异活性为约0.1到约0.3U每毫克蛋白。
实施例3
确定梭菌蛋白酶的蛋白水解活性的测定法
通过利用合成底物的方法测量梭菌蛋白酶的蛋白水解活性。梭菌蛋白酶的蛋白水解活性催化苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(也被称为“BAEE”)的水解,从而形成苯甲酰基-L-精氨酸和乙醇。该反应对梭菌蛋白酶是特异的,底物只被胶原酶的蛋白水解活性转化非常有限的程度。
在溶液中提供合成底物(也被称为“底物”),其浓度为38mM,溶于0.1M磷酸钾缓冲液pH 7.6(“PPB”)。其他试剂是PPB,溶于PPB的194mM二硫苏糖醇(“DTT”)和0.01M CaCl2溶液。
根据下列移液方案和工艺流程在试管中开始对照和样品反应:
步骤
1    缓冲液/底物溶液:0.73mM BAEE,7.8mM DTT,0.4mM
     CaCl2
     将0.5ml BAEE溶液,1ml DTT溶液,1ml CaCl2溶液转
     移入25ml烧瓶;将PPB添加到25ml标记;混合溶液。
2    提供冻干固体干物质(“样品”)形式的样品材料和标准品。
     临测量前将1mg的每种样品溶于1ml重提纯的(HPLC级)
     水,并通过向1体积份的溶解样品添加49体积份的PPB进
     行稀释。
     溶液               对照试管        样品试管
3    PPB                0.05ml          -
     缓冲液/底物溶液    3ml             3ml
     混合,孵育并加热到25℃
4    通过添加以下物质开始酶促反应
     样品               -               0.05ml
     混合,确定255nm的消光(A),比色杯光程=1cm;监测消
     光的变化并基于曲线的线性范围确定ΔA/min
5    计算体积活性[U/ml]=3.05/(ε255*0.05*1)*ΔA/min
     样品溶液的体积活性
     当计算体积活性时将考虑的任何稀释系数
     A:测量的消光值
     ΔA=A样品-A对照
     ε255=0.81[1*mM-1*cm-1]
     测量255nm处吸光度的增加(由底物BAEE的水解产生)作为反应速度。在上面指定的条件下,1U梭菌蛋白酶的蛋白水解活性在25℃和pH 7.6每分钟水解1μM BAEE。
实施例4
确定胰蛋白酶的蛋白水解活性的测定法
胰蛋白酶优先水解由Lys或Arg提供羧基的键。通过利用合成底物的方法测量胰蛋白酶的蛋白水解活性。胰蛋白酶的蛋白水解活性催化CROMOZYMTM TRY(也被称为Z-Val-Gly-Arg-4-硝基苯胺)的水解,从而形成Z-Val-Gly-Arg和4-硝基苯胺(“4-NA”)。
在溶液中提供合成底物(也被称作“底物”),其浓度为10mM,溶于超纯水。其他试剂是0.02M CaCl2,0.1M TrisHCl,pH 8。
根据下列移液方案和工艺流程在试管中开始对照和样品反应:
1    工作溶液:混合12.88体积份的0.02M CaCl2,0.1M TrisHCl,pH 8和1.4
     体积份的10mM底物溶液;将1.02ml等分试样分配到比色杯;加热到
     25℃。
2    通过添加以下物质开始酶促反应
     溶液            对照试管            样品试管
     样品§或对照    0.1ml(工作溶液)     0.1ml(样液)
3    混合,确定405nm的消光(A),比色杯光程=1cm;监测消光的变化至
     少5min,并基于曲线的线性范围确定ΔA/min
4    计算体积活性[U/ml]=1.12/(ε405*0.1*1)*ΔA/min
     ΔA=A样品-A对照
     酶溶液的总酶活性:用ΔA/min乘以稀释系数
    ε405=10.4[1*mM-1*cm-1]
§样品通常由未稀释的样液(诸如培养物上清和层析柱流过液部分的等分试样)组成。
测量405nm处吸光度的增加(由底物的水解产生)作为反应速度。在上面指定的条件下,1U胰蛋白酶的蛋白水解活性在25℃和pH 8每分钟水解1μM CROMOZYMTM TRY。
实施例5
分析型MONO-Q TM  HPLC测定
利用MONO-QTM柱通过HPLC分析制备型层析部分的等分试样。在I型和II型胶原酶蛋白都存在的情况下,MONO-QTM层析能够分离所述蛋白。基于诸如UV分光计记录的MONO-QTM层析图评价蛋白数量及完整性。
利用MONO-QTM 5/50柱(GE,编号17-5166-01)进行HPLC分析。在上样前,柱用1mM CaCl2,20mM TrisHCl,pH 7.5(“缓冲液A”,10个柱体积)平衡。通常包括I型和II型胶原酶蛋白的样品被加到离子交换物质上并与其结合,然后用3个柱体积洗涤。用30个柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱,所述洗脱缓冲液包含线性浓度梯度,所述线性梯度浓度开始于缓冲液A,结束于15%浓度的1M NaCl,1mM CaCl2,20mM TrisHCl,pH 7.5(“缓冲液B”)。其他不想要的(外源)蛋白在超过15%并直至100%缓冲液B的浓度区间洗脱。然后,通过将8个柱体积的缓冲液A流过柱重新调节柱。
使用UV分光计进行检测。监测280nm波长处的吸收。
实施例6
胶原酶蛋白的质谱分析
纯化蛋白的分析通过HPLC/ESI-MS进行:利用Alliance HT(Waters)装置或类似设备通过反相HPLC分离蛋白。优选的柱是Vydac C18,Protein& Peptide,250*2.1mm 218 TP 52(Macherey & Nagel,Germany)。利用UV检测器在226nm处联机检测蛋白。利用QTOF II(Waters)装置通过电喷射质谱法(ESI-MS)以扫描方式检测蛋白。
在水中将样品调节为1mg/ml的蛋白浓度。对于每次运行,注射并分析10μl的蛋白溶液。在两次分析运行之间,注射仅仅由水组成的两个模拟样品(10μl),以避免交叉污染。
图4显示I型胶原酶制剂的结果。如图4所示,获得两组峰。II组占总峰面积的约90%。II组内的主峰对应于113,930Da的分子量,占总峰面积的82%。II组内的次峰对应于113,410Da的分子量,占总峰面积的8%。
图5显示II型胶原酶制剂的结果。如图5所示,获得两组峰。II组占总峰面积的约93%,由单一主峰组成。该峰对应于112,000Da的分子量。
实施例7
利用Red SEPHAROSE TM 、SP SEPHAROSE TM 层析和Q SEPHAROSE TM 层析制备溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白
如果不另外指示,所有下面描述的步骤都在约2℃到约8℃的温度下进行。按照实施例1所述获得澄清的培养物上清。第一步,在上清中溶解硫酸铵到约1.65M的浓度。在示例性的例子中,在每升上清中溶解245.65g硫酸铵,并孵育约8小时到约24小时。通过离心或过滤从液相分离沉淀。随后用0.02M HEPES,1mM CaCl2,pH 7(在下文中也被称为“缓冲液R1”)透析过滤澄清的液相;透析过滤后将该液相的电导率值调节至2mS/cm以下,由此如果需要的话该液相再用另外的缓冲液R1稀释。利用Tris/HEPES缓冲液将该液相的pH值调节至6.8到7.0。
通过测量280nm处1∶20稀释的液相的消光来确定蛋白含量。此外还按照实施例5所述利用MONO-QTM HPLC分析该液相。
如果不另外指示,在下列层析步骤期间任意流动相的pH维持在pH7±0.2。将所述液相上样到用缓冲液R1平衡的制备型Red SEPHAROSETMFAST FLOW柱上,随后用2个或更多个柱体积的缓冲液R1洗涤,直到柱流出液在280nm处的光密度达到基线并且不再显著变化。因此基线最终只反映洗涤缓冲液中的少量蛋白。随后,用包含0.02M TrisHCl,1mMCaCl2,1M NaCl,pH 9的洗脱缓冲液(在下文中也称为“缓冲液R2”)对柱进行洗脱。收集洗脱液,用20mM HEPES,5mM CaCl2,pH 7(在下文中也被称为“缓冲液S1”)透析过滤;将该液相的蛋白含量调节至5mg/ml,电导率值调节至2mS/cm以下,由此如果需要的话该液相用另外的缓冲液S1稀释。
在下一步骤中,进行制备型SP SEPHAROSETM层析。为了使柱材料适应,首先用水洗涤SP SEPHAROSETM柱;然后将半个柱体积的0.5MCaCl2和2.5个柱体积的100mM HEPES,5mM CaCl2,pH 7流过柱。随后,用缓冲液S1洗涤柱;再用缓冲液S1平衡柱,直至流出液具有RedSEPHAROSETM层析后获得的经透析过滤和调节的液相的pH(±0.2)。随后将含有胶原酶蛋白和其他杂质的所述液相上样到SP SEPHAROSETM柱。在上样步骤后,用缓冲液S1洗涤柱,并监测蛋白的洗脱。在不同的部分收集到梭菌蛋白酶和胶原酶蛋白。通过用5mM HEPES,1mM CaCl2,pH7.5(在下文中也称为“缓冲液Q1”)透析过滤来浓缩胶原酶蛋白部分。
在后续的制备型Q SEPHAROSETM层析步骤中分离I型和II型胶原酶蛋白。首先用水洗涤Q SEPHAROSETM ff柱;然后将半个柱体积的4M盐酸胍流过柱,再用水洗涤,0.5M NaOH和0.5M HCL中每种流过一次,再用水洗涤,最后用缓冲液Q1平衡柱。将SP SEPHAROSETM层析后获得的含有胶原酶蛋白的液相上样到柱上。将约1-2个柱体积的缓冲液Q1上样到柱上,弃去流过液。利用含有25个柱体积的浓度梯度(开始于95%缓冲液Q1和5%缓冲液Q2(5mM HEPES,35mM CaCl2,pH 7.5)的比例,结束于5%缓冲液Q1和95%缓冲液Q2的比例)分别洗脱I型和II型胶原酶蛋白。监测蛋白的洗脱。在不同的部分收集到I型和II型胶原酶蛋白,并利用HPLC分析进行验证(参见实施例5)。
实施例8
Red SEPHAROSE TM  FAST FLOW纯化后II型和I型胶原酶蛋白比例的 定量测定
根据实施例7的方法纯化I型和II型胶原酶蛋白。按实施例5所述进行MONO-QTM分析。定量对应于I型和II型胶原酶蛋白的峰下的积分。为此,图3显示示例性的层析图。表1给出所示峰下面积的定量。
表1:I型和II型胶原酶峰面积的定量
II型胶原酶蛋白的总峰面积获自7.29分钟到9.75分钟的区间,占总峰面积的28.1%。
9.75分钟到12.35分钟区间内的峰(占总峰面积的10.3%)被排除。质谱分析显示该峰面积反映不同的I型胶原酶降解产物和数种非胶原酶蛋白的混合物。
完整的I型胶原酶蛋白的总峰面积获自14.36分钟到15.87分钟的区间,占总峰面积的10.2%。在15.87分钟到17.54分钟(29.7%)及17.54分钟到19.61分钟(12.1%)的区间检测到降解产物。总的来说,与I型胶原酶有关的峰面积占总峰面积的52%。
因此I型/II型胶原酶蛋白的比例对应于52/28.1,其约等于1.85。
在下文中,提供用于纯化I型和II型胶原酶蛋白的新方法和工艺流程,其特别克服了其他蛋白水解活性对靶蛋白的降解作用。
实施例9
从澄清的培养物上清沉淀I型和II型胶原酶蛋白
如果不另外指示,所有下面描述的步骤都在约2℃到约8℃的温度范围内进行。将已测定量的固体硫酸铵添加到澄清的培养物上清中,所述上清通过用ACROPAKTM 500过滤材料超滤溶组织梭菌液体培养物获得(参见实施例1)。在约20分钟到约30分钟内逐步向所述上清中添加硫酸铵,并通过搅拌进行溶解直至达到3.2M的终浓度。在硫酸铵完全溶解后,约10分钟到约20分钟内沉淀形成。随后,通过离心将沉淀物与剩余液相分离。分离的沉淀被直接再溶解用于进一步的纯化步骤(参见实施例9),或在约2到约8℃保存直至2周或在-20℃保存超过2周。
实施例10
疏水性相互作用层析(HIC)
将通过实施例9的步骤获得的分离的沉淀溶于包含5mM CaCl2,20mM HEPES,pH 7的水性缓冲液,并用硫酸铵将该溶液的电导率值调节至约95mS/cm。将该溶液上样到用Phenyl SEPHAROSETM 6 FAST FLOW(LOW SUB)(General Electric,GE 17-0965-04)作为固定相的层析柱。在此之前,该柱用包含0.6M(NH4)2SO4,5mM CaCl2,20mM HEPES,pH 7的缓冲液平衡。
将含有胶原酶蛋白的混合物上样到柱上时,弃流过液。随后,利用包含0.6M(NH4)2SO4,5mM CaCl2,20mM HEPES,pH 7的水性洗涤缓冲液洗涤含有结合的胶原酶蛋白的固定相,由此该洗涤缓冲液的电导率为大约95mS/cm。通常,对于洗涤步骤来说10到15个柱体积的洗涤缓冲液流过柱。丢弃洗涤缓冲液的流过液。
随后,利用由5mM CaCl2,20mM HEPES,pH 7组成的洗脱缓冲液进行等度洗脱将胶原酶蛋白从固定相上移除,由此利用硫酸铵将清洗缓冲液的电导率值调节为大约76mS/cm。为这个目的,15到20个柱体积的洗脱缓冲液流过柱。
可选择地,从5mM CaCl2,20mM HEPES,pH 7开始进行梯度洗脱,由此用硫酸铵将溶液的电导率值调节为约95mS/cm(“缓冲液1”)。该梯度的终浓度是5mM CaCl2,20mM HEPES,pH 7(“缓冲液2”)。该梯度的总体积通常是10个柱体积。梯度洗脱后,再用10个柱体积的缓冲液2洗脱柱。
随后将包含胶原酶蛋白的洗脱物或洗脱物的合并部分进行浓缩,并用5mM CaCl2,20mM HEPES,pH7透析过滤。
实施例11
疏水性相互作用层析后胶原酶蛋白的稳定性
通过实施例10的步骤所获透析过滤的洗脱物的等分试样用于稳定性试验。表2显示梭菌蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白水解活性的降低效果。在按照疏水性相互作用层析和利用等度洗脱的3个独立制备批次中获得类似的结果。与溶组织梭菌培养物上清相比,胰蛋白酶的(“tryp.”)蛋白水解活性降低至约1/100到约1/400,梭菌蛋白酶(“clos.”)的蛋白水解活性降低至约1/100到约1/150。
表2:不想要的蛋白水解活性的降低
在这一项的制剂中I型和II型胶原酶蛋白的稳定性已经非常高。按照实施例5所述进行MONO-QTM分析来表征洗脱物。图1显示4张层析图的重叠。对疏水性相互作用层析后直接分析的样品及在4℃孵育2天、3天和6天后分析的样品进行比较。如图1所示,对应于II型胶原酶蛋白的主峰在高度上没有显著变化,该峰下的积分也没有可检测的改变。利用对应于第0天I型胶原酶蛋白的主峰下的积分作为参照(100%),2天(约99%)、3天(约98%)和6天(约85%)后只有轻微的逐步降低。然而,即使在6天后,如峰下的积分所示,所有I型胶原酶蛋白的近乎绝大部分仍然是完整的。
这个出人意料的结果证明在所述纯化工艺流程的这个阶段已经去除大部分不想要的导致所需蛋白的损失或缩短的蛋白水解活性。还发现在早期去除不想要的蛋白水解活性对进一步优化I型胶原酶蛋白的回收非常重要。
实施例12
疏水性相互作用层析后II型与I型胶原酶蛋白比例的定量测定
在实施例10描述的疏水性相互作用层析后,测定I型和II型胶原酶蛋白的比例。按实施例5所述进行MONO-QTM分析。定量对应于I型和II型胶原酶蛋白的峰下的积分。为此,图2显示示例性的层析图。表3给出所示峰下面积的定量。
表3:I型和II型胶原酶峰面积的定量
II型胶原酶蛋白的总峰面积获自7.90分钟到9.21分钟的区间,占总峰面积的30.4%。
完整的I型胶原酶蛋白的总峰面积获自14.79分钟到16.50分钟的区间,占总峰面积的46.1%。由于蛋白水解的攻击,在16.50分钟到19.00分钟的区间存在I型胶原酶蛋白的其他C末端缩短形式,占总峰面积的16.3%,因此,I型胶原酶蛋白的总计峰面积是62.4%。
因此I型/II型胶原酶蛋白的比例对应于62.4/30.4,其约等于2。
实施例13
阳离子交换层析
从利用阳离子交换层析的方法通过实施例10所述步骤获得的从I型和II型胶原酶蛋白的混合物中去除残留的梭菌蛋白酶及其他不想要的蛋白水解活性。阳离子交换层析柱(SP SEPHAROSETM FAST FLOW树脂,Amersham Biosciences)用包含5mM CaCl2,20mM HEPES,pH7的水性缓冲液平衡。将实施例10所获透析过滤的洗脱物上样于层析柱,并利用平衡缓冲液作为流动相使I型和II型胶原酶蛋白层析通过固定相。将柱的流出液分成各个部分收集。合并包含胶原酶活性的部分(测定法参见实施例2)。
实施例14
利用阴离子交换层析分离I型和II型胶原酶蛋白
将通过实施例13的步骤获得的纯化胶原酶蛋白分离为I型和II型胶原酶蛋白。Q SEPHAROSETM FAST FLOW阴离子交换层析层析柱用包含5mM CaCl2,5mM HEPES,pH7.5的水性缓冲液平衡。将包含I型和II型胶原酶蛋白的混合物(实施例13的纯化步骤后获得)上样到柱上,使其与固定相吸附。随后,通过将3个柱体积的平衡缓冲液流过柱来实施洗涤步骤。通过使用25个柱体积的线性Ca2+离子浓度梯度进行洗脱。洗脱开始于5mM CaCl2,5mM HEPES,pH7.5(“缓冲液I”),结束于35mM CaCl2,5mM HEPES,pH7.5(“缓冲液II”)。在不同的部分获得I型和II型胶原酶蛋白。I型胶原酶在约44%/56%到约6%/94%的缓冲液I/缓冲液II比例处被洗脱;II型胶原酶在约76%/24%到约67%/33%的缓冲液I/缓冲液II比例处被洗脱。
实施例15
纯化的I型和II型胶原酶蛋白的N末端氨基酸的测定
通过Edman降解法并利用测序仪(Applied Biosystems)进行分析,对分别获得的I型和II型胶原酶蛋白(参见实施例14)进行氨基酸的N末端测序。
对于对应于I型胶原酶制剂中丰度最高的I型胶原酶蛋白种类的蛋白同工型,检测到N末端序列I-A-N-T-N-S。
对于对应于II型胶原酶制剂中丰度最高的II型胶原酶蛋白种类的蛋白同工型,检测到N末端序列V-Q-N-E-S-K。
实施例16
根据梭菌蛋白酶的减少比较纯化方案
如实施例3所述检测梭菌蛋白酶的活性。利用实施例9到实施例14(“A”制剂)以及根据实施例7(“B”制剂)的步骤从数批培养物上清中分别分离I型和II型胶原酶。根据制剂中残留的梭菌蛋白酶活性对所述制剂进行比较。结果概述于表4。
表4:梭菌蛋白酶的活性,U/mg蛋白
Coll.=胶原酶
该数据进一步显示“A”制剂中梭菌蛋白酶活性的有效去除。因此,各种所需胶原酶的降解显著减少,从而为提高酶制剂的质量奠定基础。
实施例17
I型和II型胶原酶制剂的制备中胰蛋白酶活性的测定
如实施例4所述检测胰蛋白酶的活性。利用实施例9到实施例14的步骤从数批培养物上清中分别分离I型和II型胶原酶(“A”制剂)。根据制剂中残留的胰蛋白酶活性对所述制剂进行分析。结果概述于表5。
表5:胰蛋白酶的活性,U/mg蛋白
Coll.=胶原酶
该数据进一步显示“A”制剂中胰蛋白酶活性的有效去除。因此,各种所需胶原酶的降解显著减少,从而为提高酶制剂的质量奠定基础。

Claims (12)

1.一种从复杂混合物纯化溶组织梭菌I型和II型胶原酶蛋白的方法,包括以下步骤:
(a)提供溶于水性液相的复杂混合物;
(b)通过在步骤(a)的液相中溶解硫酸铵形成I型和II型胶原酶蛋白的沉淀;
(c)从所述液相分离步骤(b)的沉淀;
(d)在包含Ca2+离子并且pH为6.0到8.0的水性缓冲液中溶解步骤(c)的沉淀,调节含有溶解的沉淀的缓冲液的电导率值为50到300mS/cm,从而形成包含I型和II型胶原酶蛋白的复杂缓冲溶液;
(e)通过将步骤(d)的复杂缓冲溶液与疏水性固定相接触并使I型和II型胶原酶蛋白吸附到所述固定相上,以此来提取所述步骤(d)的复杂缓冲溶液;
(f)将步骤(e)的含有吸附的I型和II型胶原酶蛋白的疏水性固定相与提取的溶液分离;
(g)从步骤(f)的固定相洗脱I型和II型胶原酶蛋白;
从而纯化I型和II型胶原酶蛋白。
2.权利要求1的方法,其特征在于相对步骤(a)的溶解的复杂混合物中相应的蛋白水解活性,步骤(c)后沉淀的可溶物中梭菌蛋白酶的蛋白水解活性降低1/90到1/150,胰蛋白酶活性降低至1/100到1/400。
3.权利要求1和2中任意一项的方法,其特征在于通过阳离子交换层析进一步纯化步骤(g)的I型和II型胶原酶蛋白,由此更多的残留蛋白水解活性被进一步与I型和II型胶原酶蛋白分离。
4.权利要求3的方法,其特征在于通过进行以下步骤分离阳离子交换层析后获得的I型和II型蛋白:
(A)将进一步纯化的I型和II型胶原酶蛋白与阴离子交换固定相接触,并且使I型和II型胶原酶蛋白吸附到所述固定相;
(B)从步骤(A)的固定相洗脱I型胶原酶和II型胶原酶蛋白到不同的部分;
由此I型胶原酶和II型胶原酶蛋白被分别纯化。
5.权利要求4的方法,其特征在于步骤(B)获得的I型胶原酶部分中82%的I型胶原酶蛋白具有114kDa的分子量。
6.权利要求4和5中任意一项的方法,其特征在于步骤(B)获得的I型胶原酶部分中82%的I型胶原酶蛋白是N末端完整的。
7.权利要求4到5中任意一项的方法,其特征在于步骤(B)获得的I型胶原酶部分中梭菌蛋白酶活性低于0.04U/mg蛋白。
8.权利要求4的方法,其特征在于步骤(B)获得的II型胶原酶部分中93%的II型胶原酶蛋白具有112kDa的分子量。
9.权利要求4和8中任意一项的方法,其特征在于步骤(B)获得的II型胶原酶部分中93%的II型胶原酶蛋白是N末端完整的。
10.权利要求4和8中任意一项的方法,其特征在于步骤(B)获得的II型胶原酶部分中梭菌蛋白酶活性低于0.07U/mg蛋白。
11.权利要求4到5中任意一项的方法,其特征在于步骤(B)获得的I型胶原酶部分中第一已测定量的I型胶原酶蛋白在后续步骤中与第二已测定量的II型胶原酶蛋白混合。
12.权利要求4和8中任意一项的方法,其特征在于步骤(B)获得的II型胶原酶部分中第一已测定量的II型胶原酶蛋白在后续步骤中与第二已测定量的I型胶原酶蛋白混合。
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