JP5649800B2 - クロストリジウムヒストリチカム液体培養物由来のコラゲナーゼの改良された精製 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質生化学の分野に属し、精製されたＣ．ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型酵素を提供する方法に関する。本発明の技術的な特別な利点は、共存するタンパク質分解活性、特にクロストリパインというプロテアーゼからの所望の酵素の急速な分離の向上である。本発明にしたがった精製に関しては、コラゲナーゼが特に組織分離のためのプロテアーゼブレンドにおける成分として適している。

本発明は、クロストリジウム ヒストリチカム（Clostridium histolyticum）コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を、複合（complex）混合物から、硫酸アンモニウムによる沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および陰イオンクロマトグラフィーを順次行うことにより精製するための方法を提供する。安定化された部分精製調製物、なおかつ沈殿工程を導く条件が提供される。本発明の方法は、他のタンパク質分解活性物の、素早く、効率的な除去をもたらす。本発明による調製物は、格別に純粋で完全な酵素的に活性であるコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を提供する。本発明はまた、２つの単離されたタンパク質のブレンドを提供する。本発明はさらに、インビトロにおける組織試料を処理するための精製されたコラゲナーゼタンパク質またはそれらのブレンドの使用を提供する。

細菌性コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．３）は、天然コラーゲンのらせん領域を小断片に分解するメタロプロテアーゼである。配列−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−における好ましい切断は、−Ｇｌｙである。２つのクラスに分類される６つの主要な形態が、免疫学的には交差反応性であるが、異なる配列および異なる特異性を有するクロストリジウム ヒストリチカムから単離されている。他の変異体は、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、エンペドバクター コラゲノリチカム（Empedobacter collagenolyticum）、シュードモナス マリノグルチノサ（Pseudomonas marinoglutinosa）、ならびにビブリオ属（Vibrio）およびストレプトミセス属（Streptmyces）の種から単離された。

コラゲナーゼは、クロストリジウム ヒストリチカムなどの細菌の病原性において、細胞外構造を破壊する役割を果たしている。よって、それらは外毒素であり、例えばガス壊疽の蔓延を促進することにより毒性因子として働く。コラゲナーゼは通常、筋肉細胞および他の体内器官における結合組織を標的とする。結合組織に対する潜在的加水分解活性により、コラゲナーゼ、およびサーモリシンなどの他のタンパク質分解酵素は、インビトロでの組織分離に使用される。

クロストリジウム ヒストリチカムにより産生されるコラゲナーゼは、最初に発見され、特徴付けされたコラゲナーゼであった。クロストリジウム ヒストリチカムの培養濾液は、コラゲナーゼおよび他のプロテイナーゼの混合物を含有する。６８から１３０ｋＤａにわたる分子量の６つの主要なコラゲナーゼは、同質に（homogeneity）精製され、Ｉ型およびII型コラゲナーゼとして表された（本明細書中では、両方のタンパク質クラスについて集合的に「コラゲナーゼタンパク質」とも言う）。前記クロストリジウムコラゲナーゼはタンパク質鎖あたりおよそ１つの亜鉛を含有し、よって酵素活性には亜鉛原子が必要とされるようである。

技術的規模（a technical scale）では、クロストリジウムコラゲナーゼは、クロストリジウム ヒストリチカムの培養濾液から単離された。粗調製物は、コラゲナーゼならびに茶色の色素、クロストリパイン（クロストリジオペプチダーゼ（clostridiopeptidase）Ｂ）、アミノペプチダーゼおよびいくつかの中性プロテイナーゼを含有する。粗調製物は、個々のＩ型およびII型コラゲナーゼの精製源となり得るが、その精製スキームは極めて長いものである。

混合物中にシステインプロテアーゼ、クロストリパインが存在すると、このペプチダーゼが次第にコラゲナーゼを加水分解するので、重大な技術的問題を引き起こす。この点においては、Ｉ型のコラゲナーゼは、II型コラゲナーゼよりもクロストリパインによるタンパク質分解攻撃により敏感なようである。Ｃ．ヒストリチカム培養濾液または液体培養物上清からコラゲナーゼを精製する際には、損失を最小にするためにクロストリパインを早い段階で分離することが望ましい。

Bond, M., D., Van Wart, H., E., （Biochemistry 23 (1984) 3077-3085）は、粗酵素調製物で開始するクロマトグラフィーに基づく精製スキームを開示する。第１の工程で、粗酵素はヒドロキシアパタイトを用いてクロマトグラフされた。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの機構は、「ミックスモード（mixed-mode）」イオン交換としても知られる。これは、ヒドロキシアパタイト樹脂固定相上の正に荷電したカルシウムイオンおよび負に荷電したリン酸イオンと、負に荷電したカルボキシル基および正に荷電したアミノ基を有するタンパク質との、非特異的相互反応を含む。溶出には、通常、リン酸塩濃度の増加を伴う緩衝液が使用される。Bond, M., D., Van Wart, H., E.,（同上）によると、３つの画分がリン酸カリウムの濃度勾配により溶出された。第１の画分は色素の大部分を含有し、第３の画分はコラゲナーゼ活性の９５％を含んだ。第３の画分はさらに、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ２００カラムでゲル濾過クロマトグラフィーに付され、続いてＬ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ（商標）２０２によるアフィニティークロマトグラフィーに付された。これらの工程は、組み合わされ、開示された順序で茶色い色素、ならびにカゼイン、ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステルおよびエラスチンに対して活性な汚染プロテイナーゼの大部分を除去するために使用された。Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ（商標）１２０染料リガンドクロマトグラフィーは、Ｉ型およびII型コラゲナーゼを再分割した。

国際公開第２００３／００４６２８号パンフレットでは、Ｃ．ヒストリチカム培養物上清が、続いて（１）ヒドロキシアパタイト、（２）陰イオン交換樹脂、および（３）陽イオン交換樹脂のクロマトグラフィーに付される精製スキームを開示する。ヒドロキシアパタイトカラムから溶出された三番目の画分は、コラゲナーゼＩ／II画分に相当したが、クロストリパインも含有した。陰イオン交換体は、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼIIを２つの画分に分離させるために溶出された。しかしながら、両方の画分はなおクロストリパインを含有した。コラゲナーゼは、陽イオン交換体を用いてクロストリパインと分離された。

上記の方法は、望まれないクロストリパインをコラゲナーゼから排除することを目的とする様々なクロマトグラフィーアプローチである。

国際公開第２００７／０８９８５１号パンフレットでは、クロストリパインなどの他のプロテアーゼをかなりな量含む培養濾液からの、コラゲナーゼタンパク質の一次回収工程としての、硫酸アンモニウムとの沈殿の評価を開示する。それによれば、硫酸アンモニウムは、最初１００と４００ｇ／ｌとの間の濃度で濾液に添加され、さらに４００と５２０ｇ／ｌとの間の濃度で添加された。沈殿によるコラゲナーゼの回収は、４００ｇ／ｌで有意であること、およびこの濃度を用いて生産されたペレットは再懸濁が最も容易であることが見出された。さらに、４００ｇ／ｌより高い濃度では、コラゲナーゼタンパク質についてよく似た回収率が明らかに結果として得られた。

コラゲナーゼをより大規模で生産するために、国際公開第２００７／０８９８５１号パンフレットは、（１）特別に選択されたＣ．ヒストリチカムの菌株（strain）、（２）クロストリパインの生産を減少させることを目的とする傍らコラゲナーゼの生産を最適化する生育条件での発酵工程、および（３）コラゲナーゼＩ／IIの精製スキームの組み合わせを開示する。

Ｃ．ヒストリチカム株の選択および液体発酵培地の双方の要素が、精製過程で用いられる原料中のクロストリパインの減少に寄与する。したがって、国際公開第２００７／０８９８５１号パンフレットに開示される条件は、ｍｇ（全コラゲナーゼ）あたり０．７と５．５Ｕとの間の特定のクロストリパイン活性を有する原料調製物を基準とする精製スキームであることが言及されている。その開示によると、硫酸アンモニウム沈殿の効果としてクロストリパインの著しい分離は見出されなかったので、これらの値は培養物上清中のクロストリパイン対コラゲナーゼ率をも反映している。クロストリパインが比較的低量（ｍｇ（全コラゲナーゼ）あたり０．７および５．５Ｕの間）であることは、発酵培養液（broth）においてペプトンを選択した効果であるようだ。特にブタ由来ペプトンが、この効果を与えるために使用される。

発酵産物を含むコラゲナーゼの原料調製物は、発酵培養液からの硫酸アンモニウム沈殿により得られた。

国際公開第２００７／０８９８５１号パンフレットの精製スキームは、液体発酵バッチの濾過で始まる。濾液への硫酸アンモニウムの添加および不溶性物質の除去に続いて、液相での硫酸アンモニウム存在下で、疎水的相互作用クロマトグラフィーが行われる。クロストリパインの周知の（可逆的）阻害剤であるロイペプチンおよび他のセリンおよびシステインプロテアーゼが、コラゲナーゼを含む溶出画分に添加された。このことはクロストリパインおよび／または他のプロテアーゼの完全な分離が達成されなかったことを示唆している。ロイペプチンは、精製過程の後半の工程で除去される。

最終的な精製コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼII調製物は、さらにＮ末端切断分解産物およびコラゲナーゼＩに対してはＣ末端切断分解産物をも含んでいることについても言及されている。

国際公開第２００７／０８９８５１号パンフレットの精製方法における、ロイペプチンの幅広い使用は、疎水的相互作用クロマトグラフィーの後でさえも、顕著な残余量の望ましくないタンパク質分解活性物が、コラゲナーゼを含む溶出画分に存在することを示す。こういった残余プロテアーゼは、特にそれらが所望のコラゲナーゼを素早く分解するため不利益であり、コラゲナーゼＩ型は特に敏感な標的である。

本発明の目的は、複合混合物からクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を精製する方法を提供することである。本発明の目的は、クロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を精製する方法であって、クロストリパインなどの他のタンパク質分解活性の相対量を含有する複合混合物、例えばＣ．ヒストリチカム培養用の発酵培養液が（ペプトンなどの）哺乳類由来の要素を何も含まず、特異的クロストリパイン活性が、ｍｇ（全コラゲナーゼ）あたり約１０および約２００Ｕの間、好ましくはｍｇ（全コラゲナーゼ）あたり約５０および約２００Ｕの間、より好ましくはｍｇ（全コラゲナーゼ）あたり約７５および約２００Ｕの間、さらにより好ましくはｍｇ（全コラゲナーゼ）あたり約１００および約２００Ｕの間である濾液または上清に適用可能な方法を提供することである。

本発明者らは、驚くべきことに、疎水的相互作用クロマトグラフィーに先立つ硫酸アンモニウム（（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）での沈殿工程により、所望のＩ型およびII型コラゲナーゼを含む安定した中間産物が得られることを見出した。沈殿を回収および再溶解のうえ、疎水性相互作用クロマトグラフィーを、得られたコラゲナーゼを含有するプールされた溶出液におけるクロストリパインの活性を約１００倍〜約１５０倍、トリプシンの活性を１００倍〜４００倍低減するために行うことができ、該再溶解された沈殿物に存在する量と比較して、混合コラゲナーゼＩおよびIIの８０〜９５％がプールされた溶出液に存在する。結果として、疎水的相互作用クロマトグラフィー後、コラゲナーゼＩおよびIIの混合物は、プロテアーゼ阻害剤（たとえばロイペプチン）が存在しなくても実質的に安定である。つまり、本発明の条件下では、コラゲナーゼＩまたはIIのタンパク質分解が全く検出されないか、最小限しか検出されない。重要なことに、調製物中の共存する非コラゲナーゼプロテアーゼの除去は非常に効果的で、さらなるコラゲナーゼＩおよびIIの精製により、Ｎ末端分解さえも欠く異例の純度の産物がもたらされる。

本発明の第１の側面は、複合混合物からクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を部分的に精製する方法であって、（ａ）水性液相に溶解した複合混合物を提供する工程、（ｂ）硫酸アンモニウムを工程（ａ）の液相に溶解することにより、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の沈殿を形成する工程、（ｃ）工程（ｂ）の沈殿を液相から分離する工程、（ｄ）工程（ｃ）の沈殿を、Ｃａ²⁺イオンを含有し、６．０および８．０の間のｐＨの水性緩衝液に溶解し、かつ溶解した沈殿物を含む緩衝液の導電率を５０および３００ｍＳ／ｃｍの間の値に調整し、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を含む複合緩衝溶液を形成する工程；（ｅ）工程（ｄ）の複合緩衝溶液を疎水性固定相と接触させることにより抽出し、かつコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を該固定相に吸着させる工程；（ｆ）抽出溶液から、工程（ｅ）の吸着されたコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質と共に該疎水性固定相を分離する工程；（ｇ）コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を工程（ｆ）の該固定相から溶出する工程；を含み、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を精製する方法である。本発明の第２の側面は、本発明による方法で得ることが可能な、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を含む調製物である。本発明の第３の側面は、本発明による方法で得ることが可能な、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物である。本発明の第４の側面は、本発明による方法で得ることが可能な、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物である。本発明の第５の側面は、本発明による精製調製物の第１の測定量が、本発明による精製調製物の第２の測定量と混合されることを特徴とする、クロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型を含む混合物である。本発明の第６の側面は、本発明による酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物、本発明による酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物、または本発明による混合物の組織試料を加工するための使用であって、それにより試料中に存在するコラーゲンが消化される使用である。

本発明の方法は、他のタンパク質分解活性物の、迅速で効率的な除去をもたらす。本発明による調製物は、格別に純粋で完全な酵素的に活性であるコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を提供する。本発明はまた、２つの単離されたタンパク質のブレンドを提供する。本発明はさらに、インビトロにおける組織試料を処理するための精製されたコラゲナーゼタンパク質またはそれらのブレンドの使用を提供する。

疎水性相互作用クロマトグラフィー後の、コラゲナーゼII型およびＩ型タンパク質の安定性。ＭＯＮＯ−Ｑ（商標）分析が、実施例５にしたがって実施された。４つのクロマトグラムの重ね合わせが示されている。「II」および「Ｉ」と表されているピークは、それぞれ、コラゲナーゼII型およびＩ型タンパク質を参照している。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」および「ｄ」と付けられた矢印は、精製された混合物の４℃での、０日間（「ａ」）、２日間（「ｂ」）、３日間（「ｃ」）および６日間（「ｄ」）のインキュベーションの後の、コラゲナーゼＩ型タンパク質に相当する主たるピークの高さを示している。 疎水性相互作用クロマトグラフィー後の、コラゲナーゼII型およびＩ型タンパク質のＭＯＮＯ−Ｑ（商標）クロマトグラム（方法については実施例５を参照）。ピークの表記は図１と同様である。 Ｒｅｄ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＡＳＴ ＦＬＯＷクロマトグラフィー後の、コラゲナーゼII型およびＩ型タンパク質のＭＯＮＯ−Ｑ（商標）クロマトグラム（方法については実施例５を参照）。ピークの表記は図１と同様である。 精製されたコラゲナーゼＩ型のＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ結果例。縦座標：ｍＡＵ、横座標：時間。グループＩのピーク（「Ｉ」として示されている）のピークの高さは、約１１８０ユニットおよび約４７２０ユニットの間であった。相対的に、グループIIの主たるピーク（「II」として示されている）の高さは、約２０７５２７ユニットであった。 精製されたコラゲナーゼII型のＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ結果例。縦座標：ｍＡＵ、横座標：時間。グループＩのピーク（「Ｉ」として示されている）のピークの高さは、約８４０ユニットおよび約３８４０ユニットの間であった。相対的に、グループIIの主たるピーク（「II」として示されている）の高さは、約２２６３８８ユニットであった。

いくつかの用語は、特定の意味で使用されるか、または本発明のこの説明において初めて定義される。本発明の目的のために、使用する用語は技術分野で受け入れられている定義が存在する場合、それらの定義が以下に示す定義と対立または部分的に対立する場合を例外として、その定義により定義される。定義において対立する場合は、用語の意味はまず以下に示す任意の定義により定義される。

本発明は、Bond, M., D., van Wart, H., E., Biochemistry 23 (1984) 3077-3085およびBond, M., D., van Wart, H., E., Biochemistry 23 (1984) 3085-3091においてすでに既知のＩ型およびII型Ｃ．ヒストリチカムコラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．３）を参照する。

用語「含む（comprising）」は、本発明の説明および特許請求の範囲において、「含むが、必ずしもこれに限定されない」という意味で使用される。

冠詞「ある（a）」および「ある（an）」は、本明細書中では、１つまたは１つ以上（すなわち少なくとも１つ）のその冠詞の文法的目的物をいうために使用される。一例として、「ある化合物（a compound）」は、１つの化合物または１つ以上の化合物を意味する。

濃度範囲などの数値範囲を指定する場合、その範囲は単語「間（between）」によって示され、第１の値ｎ１および第２の値ｎ２がその後に続く。指定された範囲の下の境界は、第１の値と同じまたはより高い値であると理解される。指定された範囲の上の境界は、第２の値と同じまたはより低い値であると理解される。よって、値ｘの指定された範囲はｎ１≦ｘ≦ｎ２と示される。

別途記載されていなければ、数値ｎと組み合わされた用語「約」は、その値の±５％の数値間隔の値、すなわちｎ−０．０５×ｎ≦ｘ≦ｎ＋０．０５×ｎの値ｘを示す。数値ｎと組み合わされた用語「約」が、発明の好ましい実施態様を説明する場合には、もし別に示されていなければ、ｎの値が最も好ましい。

アミノ酸識別には、３文字の省略形とアミノ酸の１文字アルファベット、すなわちＡｓｐ Ｄ アスパラギン酸、Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン、Ｔｈｒ Ｔ スレオニン、Ｌｅｕ Ｌ ロイシン、Ｓｅｒ Ｓ セリン、Ｔｙｒ Ｙ チロシン、Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸、Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン、Ｐｒｏ Ｐ プロリン、Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン、Ｇｌｙ Ｇ グリシン、Ｌｙｓ Ｋ リジン、Ａｌａ Ａ アラニン、Ａｒｇ Ｒ アルギニン、Ｃｙｓ Ｃ システイン、Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン、Ｖａｌ Ｖ バリン、Ｇｌｎ Ｑ グルタミン、Ｍｅｔ Ｍ メチオニン、Ａｓｎ Ｎ アスパラギンが使用される。

コラゲナーゼタンパク質がそこから精製される「複合混合物」は、本明細書中では目的のタンパク質および１以上の不純物を含む。その組成物は、「部分的に精製されて」いてもよく（すなわち１以上の精製工程に付されている）、またはタンパク質を産生するＣ．ヒストリチカム培養物から直接得てもよい（たとえば、複合混合物は採取した培養液を含み得る）。

「不純物」とは、任意の所望のタンパク質とは異なる物質である。不純物には、Ｃ．ヒストリチカムタンパク質、任意の標的タンパク質以外のポリペプチド、核酸、内毒素、外毒素、ファージ成分などが含まれるが、これに限定されない。本明細書中で使用されるように、一般的に「タンパク質」は約１０より多くアミノ酸を有するポリペプチドをいう。コラゲナーゼ酵素活性により特徴付けられるタンパク質という条件下において、それぞれのアイソフォームを含むコラゲナーゼＩ（「コラゲナーゼＩ型」）およびコラゲナーゼII（「コラゲナーゼII型」）タンパク質は、「所望のタンパク質」、「標的タンパク質」、「目的のタンパク質」ともよばれる。よって一例としては、Bond, M., D., van Wart, H., E., Biochemistry 23 (1984) 3085-3091に記載のコラゲナーゼタンパク質の任意のひとつである。用語「所望のタンパク質」、「標的タンパク質」、「目的のタンパク質」、「コラゲナーゼ酵素」、「コラゲナーゼタンパク質」のいずれかひとつの複数形は、もし別に明確に言及されていなければ、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質全体をいう。タンパク質および１以上の不純物を含む組成物からそのタンパク質を「精製する」ことにより、該組成物から少なくともひとつの不純物を（完全にまたは部分的に）除去することにより、該組成物中のタンパク質の純度の程度を増加させることが意味される。本発明により、コラゲナーゼタンパク質の精製は、硫酸アンモニウム沈殿、疎水的相互作用クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーを含むプロセスであって、それらの精製工程がこの特定の順序でなされるプロセスにより行われる。「精製工程」とは、Ｃ．ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の「均質的な（homogenous）」組成物を最終的に生じる精製プロセス全体の部分である。したがって、均質的な組成物中にある場合、タンパク質は「均質的に精製され」ている。コラゲナーゼＩ型とII型のタンパク質は、付加的かつその後の陰イオン交換クロマトグラフィー工程によって均質的に精製される。

用語「クロマトグラフィー」は、混合物の個々の溶質の移動相の影響下で固定培地中を移動する率または結合および溶出過程の差異の結果として、混合物中の目的の溶質が混合物中の他の溶質と分離される過程をいう。「塩」とは、酸および塩基の相互作用により形成される化合物をいう。本発明において有用な塩には、塩化物（たとえば塩化ナトリウム、塩化カルシウム）および硫酸塩（たとえば硫酸アンモニウム）が含まれるが、これに限定されない。本明細書中で使用されるように、「溶媒」とは、１以上の他の物質を溶解または分散し、溶液を提供することができる液体物質をいう。

用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」とは、混合物中の溶質不純物または汚染物質より大きくまたは小さく、目的の溶質が荷電した化合物と非特異的に相互作用するように、混合物中の（タンパク質などの）目的の溶質が、固相イオン交換物質に（共有結合などにより）結合した荷電化合物と相互作用するクロマトグラフィープロセスをいう。混合物中の１以上の汚染溶質（不純物）は、目的の溶質より早くまたは遅く、イオン交換物質のカラムから溶出するか、または目的の溶質と比較して樹脂に結合されるかもしくは樹脂から排除される。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的には陽イオン交換、陰イオン交換およびミックスモードクロマトグラフィーを含む。「イオン交換物質」とは、負に荷電した（すなわち陽イオン交換樹脂）、または正に荷電した（すなわち陰イオン交換樹脂）固相をいう。電荷は、１以上の荷電したリガンドを、たとえば共有結合により固相に結合することで提供され得る。代わりに、または加えて、電荷は固相の固有の性質であってもよい（たとえば全体に負の電荷を有するシリカの場合のように）。

「固相」または「固定相」は、１以上の荷電したリガンドが付着できる非水性マトリックスを意味する。固相または固定相は、精製カラム、個々の粒子の不連続相、膜またはフィルターなどであってもよい。固相を形成するための物質の例には、（アガロースおよびセルロースなどの）多糖類；ならびにシリカ（たとえば調節細孔ガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子および任意の上記の誘導体などの、他の機械的に安定したマトリックスが含まれる。

「陽イオン交換樹脂」とは、負に荷電した固相をいい、よって該固相上または中を通過する水溶液中の陽イオンと交換するための遊離陽イオンを有する。陽イオン交換樹脂を形成するために固相に結合される負に荷電したリガンドは、たとえばカルボン酸塩または硫酸塩であってもよい。商業的に入手可能な陽イオン交換樹脂としては、カルボキシ−メチル−セルロース、スルホプロピル（ＳＰ）固定アガロース（たとえば、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＡＳＴ ＦＬＯＷまたはＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＨＩＧＨ ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ）およびスルホニル固定アガロース（たとえばＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ）がある。「ミックスモードイオン交換樹脂」とは、陽イオン部分、陰イオン部分および疎水性部分により共有結合で（covalently）修飾された固相をいう。

本明細書中で使用される「陰イオン交換樹脂」とは、正に荷電した固相をいい、たとえば、そこに結合する四級アミノ基などの１以上の正に荷電したリガンドを有する。商業的に入手可能な陰イオン交換樹脂には、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ ＦＬＯＷ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）がある。

「緩衝液」とは、その酸−塩基共役構成要素の作用によりｐＨの変化を抑える溶液である。たとえば緩衝液の望ましいｐＨによって採用される多様な緩衝液が、緩衝液（Buffers）、生物系における緩衝液の調製と使用の手引き（A Guide for Preparation and Use of Buffers in Biological Systems）, Gueffroy, D.,編、Calbiochem Corporation (1975)に記載される。ある実施態様では、緩衝液は約２から約９の範囲、あるいは約３から約８の範囲、あるいは約４から約７の範囲、あるいは約５から約７の範囲のｐＨを有する。この範囲にｐＨを調節するだろう緩衝液の非限定的な例には、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、トリス（Tris）、ＨＥＰＥＳ、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸およびアンモニウム緩衝液ならびにこれらの組み合わせが含まれる。

「ローディング（loading）緩衝液」とは、目的のポリペプチド分子および１以上の不純物を含む組成物をイオン交換樹脂にロードするために使用される。ローディング緩衝液は、目的のポリペプチド分子（および一般的には１以上の不純物）がイオン交換樹脂に結合されるような、または目的のタンパク質がカラムを貫流する一方不純物が樹脂に結合するような導電率および／またはｐＨを有する。本明細書中で使用される用語「洗浄緩衝液」とは、目的のポリペプチド分子を溶出する前に、イオン交換樹脂を洗浄または再均衡化するために使用される緩衝液をいう。好都合なことに、洗浄緩衝液とローディング緩衝液とは同じであってもよいが、同じであることが必要とされてはいない。「溶出緩衝液」は、目的のポリペプチドを固相から溶出するために使用される。溶出緩衝液の導電率および／またはｐＨは、目的のポリペプチドがイオン交換樹脂から溶出されるようになっている。「再生緩衝液」は、再利用可能なようにイオン交換樹脂を再生するために使用され得る。再生緩衝液は、実質的にすべての不純物および目的のポリペプチドをイオン交換樹脂から除去するために必要とされる導電率および／またはｐＨを有する。

用語「導電率」とは、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力をいう。溶液において、電流はイオン輸送により流れる。よって、溶液は、水溶液中に存在するイオン量が増加するにつれて、より高い導電率を有するだろう。導電率の測定の単位はセンチメーターあたりミリシーメンス（ｍＳ）（ｍＳ／ｃｍ）であり、導電率メーターを使用し測定できる。溶液の導電率は、溶液中のイオンの濃度を変化させることで変えられる。たとえば、溶液中の緩衝剤の濃度および／または塩（たとえば、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＮａＣｌまたはＣａＣｌ₂）の濃度は、望ましい導電率を達成するために変えてもよい。好ましくは、多様な緩衝液の塩濃度は、かなり後の実施例の欄中に記載されるような望ましい導電率を達成するために改変される。

分子を（疎水性相互作用物質またはイオン交換物質などの）固定相に「結合する」とは、分子が固定相中または固定相上に「吸着」または可逆的に固定化されるのに適切な条件（ｐＨ／導電率）下で、分子を固定相にさらすことを意味する。これは、分子と固定相の官能基との疎水性相互作用またはイオン性相互作用により影響され得る。固定相を「洗浄する」とは、適切な緩衝液を固定相中または固定相上を通過させることを意味する。本発明の好ましい実施態様では、洗浄過程の間、標的タンパク質は固定相にまたは固定相上に吸着されたままである。固定相から分子（たとえば、所望のポリペプチドまたは不純物）を「溶出する」ことは、固定相の官能基から分子が放出されるように、固定相を囲む緩衝液の組成、導電率、イオン強度およびｐＨからなる群より選択されるパラメーターを変えることによって、分子をそこから除去することを意味する。

本発明は、Ｃ．ヒストリチカム培養物上清または濾液など、すなわちコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を溶解物として含む複合溶液から、酵素的に活性なコラゲナーゼタンパク質を精製する方法を提供する。標的タンパク質のタンパク質分解を制限するために、複合溶液は２℃から１０℃の間の温度に冷却される。続く精製工程は、別段の指示がなければこの範囲の温度において実施される。

目的のタンパク質を含有する溶液が一旦得られると、溶液中の望ましくない構成要素からのそれらの分離は、普通異なるクロマトグラフィー技術の組み合わせを用いて試みられる。望ましくない構成要素には、（タンパク質、ペプトン、炭水化物および他の化合物などの）培養培地の残留成分、または細胞により産生される他のタンパク質（すなわち非コラゲナーゼタンパク質）が含まれる。

本発明の第１の実施態様においては、クロマトグラフィー精製は、硫化アンモニウム沈殿工程により先行される。沈殿により、望ましくない構成要素の大部分がコラゲナーゼタンパク質から分離される。液体培養物上清または濾液など（集合的に「透明な培養物上清」ともいう）において、２．６Ｍおよび２．８Ｍの間の濃度（（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の標的濃度）の硫化アンモニウムの存在下で、コラゲナーゼタンパク質を含む沈殿が形成される。

硫化アンモニウム沈殿は、タンパク質の溶解性を変化させることによるタンパク質精製方法である。これは、塩析として知られるより一般的な技術の特定の事例である。硫化アンモニウムは、高いイオン強度の塩溶液を可能にするほどその溶解性が高いので、一般的に使用される。タンパク質の溶解性は、溶液のイオン強度により変化し、それ故に塩濃度により変化する。２つの別個の効果が観察され；低塩濃度では、タンパク質の溶解性は塩濃度が増加する（すなわちイオン強度が増加する）につれて増加し、その効果は塩溶と称される。塩濃度（イオン強度）がさらに増加すると、タンパク質の溶解性は減少し始める。充分に高いイオン強度では、タンパク質はほぼ完全に溶液から沈殿するだろう（塩析）。高イオン強度でのタンパク質の溶解性は著しく異なるので、塩析は所定のタンパク質の精製を補佐するのに非常に有用な手順である。一般的に使用される塩は硫化アンモニウムであり、それは硫化アンモニウムが非常に水に可溶性であり、酵素活性に悪影響がないためである。液相を持続的に撹拌しながら、硫化アンモニウムは乾燥物として添加できる。あるいは、硫化アンモニウムは濃縮溶液として、たとえば飽和水溶液として添加できる。好ましくは、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の標的濃度に達するために、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄は、液体培養物上清または濾液などに約３０分間以上持続的に添加され、そこに溶解される。

２．６Ｍおよび２．８Ｍの間の硫化アンモニウム濃度に調整した後、沈殿は約１０分および約３０分の間形成させられる。沈殿したタンパク質は、その後遠心分離により除去され、その後硫化アンモニウム濃度は、目的のタンパク質のほとんどが沈殿し、一方溶液中になお存在するタンパク質汚染物の最大量を残す値にまで増加される。沈殿した目的のタンパク質は、遠心分離により回収され、精製の次の段階用の新鮮な緩衝液中に溶解される。

この技術は、本発明の精製スキームにおける第１工程として、迅速に大量の汚染タンパク質を除去するのに有用である。精製の後半の段階において、ゲル濾過および他のクロマトグラフィー分離技術などの手順後に、希薄溶液からタンパク質を濃縮するためにも、この技術は用いられる。

クロマトグラフィー技術は、その電荷、疎水性の程度、または大きさに基づき、タンパク質の混合物を分離する。いくつかの異なるクロマトグラフィー樹脂が、これらの技術のそれぞれに利用でき、含有される特定のタンパク質に的確に精製スキームを調整することが可能となる。これらの各分離方法の本質は、タンパク質が、長いカラムを異なる速度で下方へ移動させられ、カラムのさらに下方へ通過するにつれ物理的分離が達成され得るか、または分離媒体に選択的に付着させられ、その後異なる溶媒により溶出され得ることである。いくつかの場合においては、不純物が特異的にカラムに付着し、目的のタンパク質は付着しない、つまり目的のタンパク質は「フロースルー（flow-through）」中に存在する場合に、所望のタンパク質は不純物から分離される。

交換可能な対イオンに由来して命名されたイオン交換クロマトグラフィーは、イオン性分子の精製に適用可能な手順である。イオン性分子は、それらの荷電した基の、固相支持マトリックスに結合した反対に荷電した分子との非特異的静電的相互作用に基づき分離され、それによって固相とより強く相互作用するそれらのイオン性分子を遅延させる。イオン性分子の各タイプの正味電荷およびマトリックスへの親和力は、荷電した基の数、各基の電荷、および荷電した固相マトリックスとの相互作用を競合する分子の性質により変化する。これらの差異が、イオン交換クロマトグラフィーにより、結果として多様な分子タイプを分離する。イオン交換クロマトグラフィーを用いる典型的なタンパク質精製において、哺乳類細胞培養物におけるような宿主細胞由来の多くのタンパク質の混合物が、イオン交換カラムに適用される。非結合分子が洗い流された後、段階または勾配法でｐＨまたは対イオン濃度などを変化させることなどにより条件を調整し、非特異的に残留または遅延する目的のイオン性タンパク質を固相から放出させ、異なる荷電特性を有するタンパク質から分離する。陰イオン交換クロマトグラフィーは、目的の陰イオン分子と負の対イオンとが、特別な分離過程のｐＨおよび条件下で、固相マトリックスに結合する正に荷電した分子との相互作用を競合することを含む。対照的に、陽イオン交換クロマトグラフィーは、目的の陽イオン分子と正の対イオンとが、特別な分離過程のｐＨおよび条件下で、負に荷電した固相マトリックスに結合した分子を競合することを含む。ミックスモードイオン交換クロマトグラフィーは、陽イオンおよび陰イオンの交換クロマトグラフィー媒体を、同じ工程中に組み合わせて使用することを含む。特に「ミックスモード」とは、陽イオン交換、陰イオン交換、および疎水性相互作用部分の混合物がそこに共有結合している固相支持マトリックスをいう。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」ともいう）は、タンパク質を互いに分離するために疎水性の特性を利用する分離技術である。この型のクロマトグラフィーでは、フェニル、オクチルまたはブチルなどの疎水基が固定相に結合されている。表面に疎水性アミノ酸側鎖を有する、カラムを通り抜けるタンパク質は、カラム上の疎水基と相互作用および結合することができる。概して、ＨＩＣ分離において、高イオン強度の緩衝液、通常は硫化アンモニウムが最初カラムに適用される。緩衝液中の塩は、遊離試料の溶解を減じ、よって溶解が減少し露出するようになった疎水性領域は媒体により吸着される。疎水性標的分子が吸着されるにつれて、塩は結合を促進する必要が減少する。固相から吸着したタンパク質を溶出するために、塩濃度は疎水性の増加にしたがって減少する。緩やかな減少は勾配の形をとって適用できる。さらに、溶出は、特定の有機修飾物質の使用または界面活性剤の使用によって達成できる。

ＨＩＣのために、固定相は他の分子との疎水性相互作用を形成することができる。これらの相互作用は、水中では弱すぎる。しかしながら、緩衝液への塩の添加は、結果として疎水性相互作用をもたらす。疎水性相互作用を増加させる塩には：（相互作用を増強する能力順に）Ｎａ₂ＳＯ₄、Ｋ₂ＳＯ₄、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＮａＣｌ、ＮＨ₄Ｃｌ、ＮａＢｒ、およびＮａＳＣＮが含まれる。

逆相クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーは非常に類似しているが、概して、逆相クロマトグラフィーにおけるリガンドは疎水性相互作用クロマトグラフィーにおけるリガンドより疎水性が強い。これにより疎水性相互作用クロマトグラフィーでは、試料をほとんど崩壊させないより穏やかな溶出条件を用いることが可能になる。ＨＩＣを実施するのに好ましい固定相には、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＣＬ−４Ｂ、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＨＩＧＨ ＳＵＢ）およびＰｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＬＯＷ ＳＵＢ）が含まれる。

本発明により提供される重要な利点としては、特にクロストリパイン活性をコラゲナーゼタンパク質から分離する最適化部分精製がある。したがって、続く精製工程におけるコラゲナーゼタンパク質の分解が最小化される。さらに詳しくは、本発明は以下の側面および好ましい実施態様を含む：

１．複合混合物からクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を精製する方法であって、
（ａ）水性液相に溶解した複合混合物を提供する工程、
（ｂ）硫酸アンモニウムを工程（ａ）の液相に溶解することにより、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の沈殿を形成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の沈殿を液相から分離する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の沈殿を、Ｃａ²⁺イオンを含有し、６．０および８．０の間のｐＨの水性緩衝液に溶解し、かつ溶解した沈殿物を含む緩衝液の導電率を５０および３００ｍＳ／ｃｍの間の値に調整し、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を含む複合緩衝溶液を形成する工程；
（ｅ）工程（ｄ）の複合緩衝溶液を疎水性固定相と接触させることにより抽出し、かつコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を該固定相に吸着させる工程；
（ｆ）抽出溶液から、工程（ｅ）の吸着されたコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質と共に該疎水性固定相を分離する工程；
（ｇ）コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を工程（ｆ）の該固定相から溶出する工程；
を含む、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を精製する方法。

２．工程（ｂ）が、液相に硫酸アンモニウムを約２．６Ｍおよび約３．２Ｍの間、より好ましくは約２．６Ｍおよび約２．８Ｍの間の濃度で溶解することにより実施され、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の沈殿を形成することを特徴とする第１項記載の方法。

３．１Ｌの液相に約４１７ｇおよび約４５８ｇの間の硫酸アンモニウムが溶解されることを特徴とする第２項記載の方法。

４．工程（ｃ）の後、沈殿の溶解性について、工程（ａ）の溶解した複合混合物における各タンパク質分解活性と相対的に、クロストリパインのタンパク質分解活性が９０倍および１５０倍の間減少し、かつトリプシンの活性が１００倍および約４００倍の間減少することを特徴とする第２または３項記載の方法。

５．クロストリパインのタンパク質分解活性が１００倍および１５０倍の間減少し、かつトリプシンの活性が約２００倍および約４００倍の間減少することを特徴とする第４項記載の方法。

６．クロストリパインのタンパク質分解活性が１５０倍まで減少し、かつトリプシンの活性が約４００倍まで減少することを特徴とする第５項記載の方法。

７．工程（ｃ）にさらに、１０℃以下の温度で沈殿を貯蔵することを含む工程（ｃ’）が続くことを特徴とする第１〜６項のいずれかに記載の方法。

８．貯蔵の温度が１０℃および−２０℃の間であることを特徴とする第７項記載の方法。

９．貯蔵の温度が−２０℃であることを特徴とする第８項記載の方法。

１０．工程（ｄ）において、水性緩衝液が５ｍＭの濃度のＣａ²⁺イオンを含むことを特徴とする第１〜９項のいずれかに記載の方法。

１１．工程（ｄ）において、水性緩衝液がｐＨ６〜８．５の範囲で緩衝できる緩衝化合物を含むことを特徴とする第１〜１０項のいずれかに記載の方法。

１２．緩衝化合物が２０ｍＭの濃度で存在することを特徴とする第１１項記載の方法。

１３．工程（ｄ）において、水性緩衝液が、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル)−２−アミノエタンスルホン酸）、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール）、ビストリス（ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン）、ビストリスプロパン（１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）およびトリシン（Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン）からなる群より選択される緩衝化合物を含むことを特徴とする第１〜１２項のいずれかに記載の方法。

１４．工程（ｄ）において、水性緩衝液がＴＥＳまたはＨＥＰＥＳを含むことを特徴とする第１３項記載の方法。

１５．工程（ｄ）において、水性緩衝液のｐＨが中性であることを特徴とする第１〜１４項のいずれかに記載の方法。

１６．工程（ｄ）において、複合緩衝溶液のｐＨが中性であることを特徴とする第１〜１５項のいずれかに記載の方法。

１７．工程（ｄ）において、複合緩衝溶液の導電率が５０ｍＳ／ｃｍおよび２９０ｍＳ／ｃｍの間であることを特徴とする第１〜１６項のいずれかに記載の方法。

１８．工程（ｄ）において、複合緩衝溶液の導電率が５０ｍＳ／ｃｍおよび２００ｍＳ／ｃｍの間であることを特徴とする第１７項記載の方法。

１９．工程（ｄ）において、複合緩衝溶液の導電率が５０ｍＳ／ｃｍおよび１５０ｍＳ／ｃｍの間であることを特徴とする第１８項記載の方法。

２０．工程（ｄ）において、複合緩衝溶液の導電率が９０ｍＳ／ｃｍおよび１００ｍＳ／ｃｍの間であることを特徴とする第１９項記載の方法。

２１．工程（ｄ）において、複合緩衝溶液の導電率が約９５ｍＳ／ｃｍであることを特徴とする第２０項記載の方法。

２２．複合緩衝溶液における硫酸アンモニウムの濃度が０．３Ｍおよび１Ｍの間であることを特徴とする第１７〜２１項のいずれかに記載の方法。

２３．複合緩衝溶液における硫酸アンモニウムの濃度が約０．６Ｍ、より好ましくは０．６Ｍであることを特徴とする第２２項記載の方法。

２４．工程（ｆ）の固定相が、疎水性有機残基と共に誘導された固相マトリックスであることを特徴とする第１〜２３項のいずれかに記載の方法。

２５．工程（ｆ）の固定相が、へキシル、ブチル、オクチルおよびフェニルからなる群より選択される有機基と共に誘導された固相マトリックスであることを特徴とする第２４項記載の方法。

２６．固相マトリックスがアガロース、メタクリレート誘導体、アクリルアミドの重合体、アクリルアミドを含む共重合体、ビニルモノマー類に由来するポリマー（ビニルポリマー）ならびにスチレンおよびジビニルベンゼンを含む共重合体からなる群より選択されることを特徴とする第２４または２５項記載の方法。

２７．工程（ｆ）の固定相が、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＣＬ−４Ｂ、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＨＩＧＨ ＳＵＢ）およびＰｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＬＯＷ ＳＵＢ）からなる群より選択されることを特徴とする第２４〜２６項のいずれかに記載の方法。

２８．工程（ｆ）の固定相が、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＬＯＷ ＳＵＢ）であることを特徴とする第２７項記載の方法。

２９．工程（ｆ）にさらに、工程（ｆ）の固定相を、Ｃａ²⁺イオンを含みｐＨが中性で導電率が５０ｍＳ／ｃｍおよび３００ｍＳ／ｃｍの間である水性洗浄緩衝液で洗浄し、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が固定相に吸着されたままとなることを含む工程（ｆ’）が続くことを特徴とする第１〜２８項のいずれかに記載の方法。

３０．洗浄緩衝液の導電率が、工程（ｄ）の複合緩衝溶液の導電率と同じであることを特徴とする第２９項記載の方法。

３１．Ｃａ²⁺イオンの濃度および／または硫酸アンモニウムの濃度および／または洗浄緩衝液のｐＨが、工程（ｄ）の複合緩衝溶液と同じであることを特徴とする第２９または３０項記載の方法。

３２．工程（ｇ）が、工程（ｆ’）の固定相からコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を溶出することにより実施されることを特徴とする第２９〜３１項のいずれかに記載の方法。

３３．工程（ｇ）が、複合緩衝溶液におけるよりも低い濃度および低い導電率で塩を含有する溶出緩衝液と共に実施されることを特徴とする第１〜３２項のいずれかに記載の方法。

３４．工程（ｇ）が、固定相に塩濃度勾配を適用することにより実施されることを特徴とする第３３項記載の方法。

３５．工程（ｇ）が、１以上の溶出緩衝液を適用し、定組成溶離を実施することで実施されることを特徴とする第３３項記載の方法。

３６．工程（ｇ）において、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が固定相に溶出緩衝液を適用することにより溶出され、溶出緩衝液の導電率が複合緩衝溶液の導電率よりも約２０％低いことを特徴とする第３３項記載の方法。

３７．溶出緩衝液の導電率が、約７６ｍＳ／ｃｍであることを特徴とする第３６項記載の方法。

３８．複合混合物がさらに、タンパク質分解活性を有する酵素を含むことを特徴とする第１〜３７項のいずれかに記載の方法。

３９．複合混合物が、クロストリパイン（エンドプロテアーゼ Ａｒｇ−Ｃ、ＥＣ３．４．２２．８）、天然プロテアーゼおよびトリプシン活性を有する酵素からなる群より選択されるタンパク質分解活性を有する酵素を含むことを特徴とする第３８項記載の方法。

４０．複合混合物が、液体クロストリジウム ヒストリチカム培養物の上清または濾液であることを特徴とする第３８または３９項記載の方法。

４１．工程（ｇ）、および任意には続く硫酸アンモニウムの除去工程で得ることが可能なコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、酵素として活性であることを特徴とする第１〜４０項のいずれかに記載の方法。

４２．工程（ｇ）にさらに次の工程が続き、次の工程において硫酸アンモニウムがコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質から分離されることを特徴とする第１〜４１項のいずれかに記載の方法。

４３．工程（ｇ）の溶出後のコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製され、それによりさらなる残りのタンパク質分解活性がコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質からさらに分離されることを特徴とする第１〜４２記載の方法。

４４．陽イオン交換クロマトグラフィーが、約５ｍＭの濃度のＣａ²⁺イオン、緩衝化合物、および中性ｐＨの存在下で実施されることを特徴とする第４３項記載の方法。

４５．緩衝化合物の濃度が２０ｍＭであることを特徴とする第４３または４４項記載の方法。

４６．緩衝化合物が、ＢＥＳ、トリス、ビストリス、ビストリスプロパン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、ＴＥＡおよびトリシンからなる群より選択されることを特徴とする第４５項記載の方法。

４７．緩衝化合物がＴＥＳまたはＨＥＰＥＳであることを特徴とする第４６項記載の方法。

４８．陽イオン交換クロマトグラフィーが、約５ｍＭの濃度のＣａＣｌ₂の存在下で実施されることを特徴とする第４４項記載の方法。

４９．陽イオン交換クロマトグラフィー固定相が、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）であることを特徴とする第４３〜４８項のいずれかに記載の方法。

５０．コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、
（Ａ）さらに精製されたコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を陰イオン交換固定相と接触させ、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を該固定相に吸着する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の固定相からコラゲナーゼＩ型およびコラゲナーゼII型タンパク質を、別々の画分に溶出する工程；
を行うことにより分離され、それによりコラゲナーゼＩ型およびコラゲナーゼII型タンパク質が別々に精製されることを特徴とする第４３〜４９項のいずれかに記載の方法。

５１．工程（Ａ）が、約５ｍＭの濃度のＣａ²⁺イオン、緩衝化合物、および中性または弱アルカリ性ｐＨの存在下で実施されることを特徴とする第５０項記載の方法。

５２．工程（Ｂ）が、１×の濃度で約３５ｍＭの濃度のＣａ²⁺イオン、緩衝化合物、および中性または弱アルカリ性ｐＨを含む溶出緩衝液の１×〜２５×濃度勾配を適用する勾配溶離を用いて実施され、１×が勾配の開始濃度であり２５×が勾配の最終濃度であることを特徴とする第５０または５１項記載の方法。

５３．弱アルカリ性ｐＨが７．５であることを特徴とする第５１または５２項記載の方法。

５４．緩衝化合物の濃度が５ｍＭであることを特徴とする第５１または５２項記載の方法。

５５．緩衝化合物が、ＢＥＳ、トリス、ビストリス、ビストリスプロパン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＴＡＰＳ、ＴＥＳ、ＴＥＡおよびトリシンからなる群より選択されることを特徴とする第５４項記載の方法。

５６．緩衝化合物がＴＥＳまたはＨＥＰＥＳであることを特徴とする第５５項記載の方法。

５７．工程（Ａ）が、約５ｍＭの濃度のＣａＣｌ₂の存在下で実施されることを特徴とする第５１項記載の方法。

５８．工程（Ｂ）において、溶出緩衝液が、１×の濃度で約３５ｍＭの濃度のＣａＣｌ₂を含むことを特徴とする第５２項記載の方法。

５９．陰イオン交換固定相が、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）であることを特徴とする第５０〜５８項のいずれかに記載の方法。

６０．工程（Ｂ）で得ることが可能なコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、酵素として活性であることを特徴とする第４３〜５９項のいずれかに記載の方法。

６１．コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、別々の画分において得られることを特徴とする第５０〜６０項のいずれかに記載の方法。

６２．第１〜４２項のいずれかに記載の方法によって得ることが可能な、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を含む調製物。

６３．前記調製物において、トリプシンタンパク質分解活性が、液体クロストリジウム ヒストリチカム培養物の上清または濾液の複合混合物と比較して、約１００倍および約４００倍の間減少することを特徴とする第６２項記載の調製物。

６４．第６１項記載の方法で得ることが可能な、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物。

６５．調製物中の約８２％のコラゲナーゼＩ型タンパク質が、ＬＣ ＥＳＩ−ＭＳにより測定された１１３，９２０Ｄａの分子量を有することを特徴とする、第６４項記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物。

６６．約８２％のコラゲナーゼＩ型タンパク質のＮ末端が完全であることを特徴とする、第６５項記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物。

６７．コラゲナーゼＩ型タンパク質のＮ末端がアミノ酸配列ＩＡＮＴＮＳを有することを特徴とする、第６６項記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物。

６８．第６１項記載の方法で得ることが可能な、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物。

６９．調製物中の約９３％のコラゲナーゼII型タンパク質が、ＬＣ ＥＳＩ−ＭＳにより測定された１１２，０００Ｄａの分子量を有することを特徴とする、第６８項記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物。

７０．約９３％のコラゲナーゼII型タンパク質のＮ末端が完全であることを特徴とする、第６９項記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物。

７１．コラゲナーゼII型タンパク質のＮ末端がアミノ酸配列ＶＱＮＥＳＫを有することを特徴とする、第７０項記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物。

７２．調製物におけるクロストリパイン活性が、約０．０４Ｕ／ｍｇタンパク質未満、より好ましくは約０．０１Ｕ／ｍｇタンパク質および約０．０３Ｕ／ｍｇタンパク質の間であることを特徴とする、第６４〜６７項のいずれかに記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物。

７３．調製物におけるクロストリパイン活性が、約０．０７Ｕ／ｍｇタンパク質未満、より好ましくは約０．０４Ｕ／ｍｇタンパク質および約０．０６Ｕ／ｍｇタンパク質の間であることを特徴とする、第６８〜７１項のいずれかに記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物。

７４．調製物におけるトリプシン活性が、約０．０００３Ｕ／ｍｇタンパク質未満、より好ましくは約０．０００１Ｕ／ｍｇタンパク質および約０．０００３Ｕ／ｍｇタンパク質の間であることを特徴とする、第６４〜６７項のいずれかに記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物。

７５．調製物におけるトリプシン活性が、約０．００１Ｕ／ｍｇタンパク質未満、より好ましくは約０．０００３Ｕ／ｍｇタンパク質および約０．００１Ｕ／ｍｇタンパク質の間であることを特徴とする、第６８〜７１項のいずれかに記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物。

７６．第６４〜６７項のいずれかに記載の精製調製物の第１の測定量が、第６８〜７１項のいずれかに記載の精製調製物の第２の測定量と混合されることを特徴とする、クロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型およびクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型を含むブレンド。

７７．混合物が、さらなるタンパク質分解酵素の調製物の第３の測定量をさらに含むことを特徴とする第７６項記載のブレンド。

７８．第６４〜６７項のいずれか、または第７２もしくは７４項に記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼＩ型の精製調製物の、組織試料を加工するための使用であって、それにより試料中に存在するコラーゲンが消化される使用。

７９．第６８〜７１項のいずれか、または第７３もしくは７５項に記載の酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼII型の精製調製物の、組織試料を加工するための使用であって、それにより試料中に存在するコラーゲンが消化される使用。

８０．第７６または７７項に記載のブレンドの組織試料を加工するための使用であって、それにより試料中に存在するコラーゲンが消化される使用。

以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲で示される。本発明の精神を逸脱することなく、示された手順を改変できることは理解される。

実施例１
Ｃ．ヒストリチカムのコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を含む原材料
好ましい原材料は、Ｃ．ヒストリチカムの液体培養物の透明な上清である。培養液中でのＣ．ヒストリチカムの増殖を支持する液体培地は、当該技術分野において公知である。このような培地に関する最近の文献は、国際公開第２００７／０８９８５１号パンフレットを含む。不必要なタンパク質分解活性の除去およびコラゲナーゼタンパク質の最終的な調製物の純度に関して、下記に記載されるように本発明の精製スキームを使用する場合には、異なる増殖培地で有意差は見られなかった。

段階的に規模を増大する工程において、Ｃ．ヒストリチカムは、窒素雰囲気下、液体培養液中で嫌気的に増殖された。初めの種培養は、典型的には約１００ｍＬの容量で開始した。その後の前培養は、例えば、１Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌなどと増加された容量で、段階的に行われた。大規模な発酵は、約１００Ｌから約２５００Ｌまでの範囲の培養物容量で行われた。増殖温度は３０℃であり、そして、発酵培地のｐＨは、約７．３の値で維持された。一定の間隔で、培養物の試料が取り出され、そして、実施例２に記載されているように、上清をコラゲナーゼのタンパク質分解活性に関して試験した。典型的には、大規模な発酵槽は、前培養物の添加の後、約１５時間および約１８時間の間に収集された。

発酵の終了時点で、培養物は、約２℃および８℃の間の温度まで冷却された。細胞性物質、残渣粒子およびその他の粒子状物質が、遠心分離または濾過のどちらかにより、液体培地から分離され、結果として両方の方法から透明な培養物上清が生じた。濾過の場合、濾液は、孔径が約０．３μｍから約１μｍの間であるフィルター材を通された。良好な結果が、ＡＣＲＯＰＡＫ（商標） ５００材（孔径０．４５〜０．８μｍ）を用いた場合に得られた。

その後の精製工程の前に、いくつかのタンパク質分解活性が、透明な培養物上清において分析された。これらは、コラゲナーゼ（実施例２参照）、クロストリパイン（実施例３参照）およびトリプシン（実施例４参照）のタンパク質分解活性を含んだ。タンパク質含有量は、従来の方法によって、典型的には、ＵＶ分光法、ブラッドフォード法− ローリー法−もしくはビウレット法タンパク質アッセイ、または、ビシンコニン酸アッセイを用いて測定された。典型的な透明な培養物上清は、約１．５ｇ／Ｌのタンパク質含有量および約４ｋＵ／Ｌのコラゲナーゼ活性を有していた。

あるいは、培養物上清の凍結乾燥物（Bond, M., D., van Ward, H., E., Biochemistry 23 (1984) 3077-3085）などの原料調製物が出発材料とされ得る。この場合、凍結乾燥物の水溶液が、さらに下記で記載されるように、本発明にしたがって処理される。

実施例２
コラゲナーゼＩ型およびII型のタンパク質分解活性を測定するためのアッセイ
コラゲナーゼのタンパク質分解活性は、合成ペプチド基質を用いた、ブンシュユニット（Wuensch units）（Wuensch, E., Heidrich, H., Z., Physiol. Chem. 333 (1963) 149-159）における標準的な方法によって測定された。コラゲナーゼのタンパク質分解活性は、修飾された基質（「ブンシュ」）ペプチド、４−フェニルアゾ−ベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（バッケム（Bachem）、Ｍ１７１５）のＬｅｕおよびＧｌｙ残基の間の加水分解を触媒する。活性の１ユニット（Ｕ）は、２５℃、ｐＨ７．１での、１分あたりの１μＭのペプチドの加水分解によって定義される。

基質ペプチド（「基質」とも言う）は、溶液で、そして、１ｍｇ／ｍＬの濃度で準備した。１０ｍｇの基質ペプチドを初めに、０．２ｍＬのメタノールに溶解した。溶液の容量を、ｐＨ７．１の０．１ＭのトリスＨＣｌを添加することによって、１０ｍＬに増量した。さらなる試薬は、水中０．１ＭのＣａＣｌ₂溶液ならびに５容量部の酢酸エチルおよび１容量部の水中０．０２５Ｍのクエン酸からなる抽出混合物である。０．３５〜０．４ｇのＮａ₂ＳＯ₄を含む試験管として、乾燥管が準備された。使用を前に、それぞれの乾燥管はパラフィルムで密封された。

対照および試料の反応は、次の分注手順および工程の流れにしたがって、試験管中において設定された：

コラゲナーゼＩ型およびII型酵素の両方を含む混合物において、ブンシュペプチドを基質として使用して活性のアッセイが実施される場合、測定されるコラゲナーゼIIの活性は、常にコラゲナーゼＩの活性よりも高かった。本発明の完全な精製スキームにしたがって精製され、そして、実施例１４に記載されるように最終生成物として得られた、コラゲナーゼII型は、タンパク質のｍｇあたり約１０および約１４Ｕの間の特異的活性を有していた；同じように精製されたコラゲナーゼＩ型の特異的活性は、タンパク質のｍｇあたり約０．１および約０．３Ｕの間であった。

実施例３
クロストリパインのタンパク質分解活性を測定するためのアッセイ
クロストリパインのタンパク質分解活性は、合成基質を用いた方法によって測定された。クロストリパインのタンパク質分解活性は、ベンゾイル−Ｌ−アルギニン エチルエステル（「ＢＡＥＥ」とも参照される）の加水分解を触媒し、それによって、ベンゾイル−Ｌ−アルギニンおよびエタノールを生成する。反応は、クロストリパインに特異的であり、そして、基質は、コラゲナーゼのタンパク質分解活性によっては、非常に限られた量しか転換されない。

合成基質（「基質」とも参照される）は、溶液で、そして、ｐＨ７．６の０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（「ＰＰＢ」）中に溶解された３８ｍＭの濃度で準備された。さらなる試薬は、ＰＰＢ、ＰＰＢに溶解された１９４ｍＭのジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）および０．０１ＭのＣａＣｌ₂溶液である。

対照および試料の反応は、次の分注手順および工程の流れにしたがって、試験管中において設定された：

反応速度は、基質ＢＡＥＥの加水分解に起因する、２５５ｎｍにおける吸光度の増大として測定される。１Ｕのクロストリパインのタンパク質分解活性は、上記で明示された条件下、２５℃かつｐＨ７．６で、１分あたり１μＭのＢＡＥＥを加水分解する。

実施例４
トリプシンのタンパク質分解活性を測定するためのアッセイ
トリプシンは、ＬｙｓまたはＡｒｇによって寄与されているカルボキシル基の結合を優先的に加水分解する。トリプシンのタンパク質分解活性は、合成基質を用いた方法によって測定された。トリプシンのタンパク質分解活性は、Ｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−４−ニトロアニリンとも参照される、ＣＲＯＭＯＺＹＭ（商標） ＴＲＹの加水分解を触媒し、それによって、Ｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇおよび４−ニトロアニリン（「４−ＮＡ」）を生成する。

合成基質（「基質」とも参照される）は、溶液で、そして、超純水中に溶解された１０ｍＭの濃度で準備された。さらなる試薬は、０．０２ＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ８、０．１ＭのトリスＨＣｌである。

対照および試料の反応は、次の分注手順および工程の流れにしたがって、試験管において設定された：

反応速度は、基質の加水分解に起因する４０５ｎｍにおける吸光度の増大として測定される。１Ｕのトリプシンのタンパク質分解活性は、上記で明示された条件下、２５℃かつｐＨ８で、１分あたり１μＭのＣＲＯＭＯＺＹＭ（商標） ＴＲＹを加水分解する。

実施例５
ＭＯＮＯ−Ｑ（商標） ＨＰＬＣ分析アッセイ
サンプリングされた、分取用のクロマトグラフの画分のアリコートを、ＭＯＮＯ−Ｑ（商標）カラムを用いたＨＰＬＣによって分析した。コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の両方が存在している場合、ＭＯＮＯ−Ｑ（商標）クロマトグラフィーは、タンパク質を分離することができる。タンパク質の量および純度は、例えばＵＶ分光計を用いて記録されたＭＯＮＯ−Ｑ（商標）クロマトグラムに基づいて、評価することができる。

ＨＰＬＣ分析は、ＭＯＮＯ−Ｑ（商標） ５／５０カラム（ＧＥ、コード番号１７−５１６６−０１）を用いて実施された。試料を適用する前に、カラムを、１ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ７．５、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（「緩衝液Ａ」、カラム容量の１０倍量）で平衡化した。コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を通常含む試料を適用し、そしてイオン交換材に結合させ、続いて、カラム容量の３倍量の緩衝液Ａで洗浄した。溶出は、緩衝液Ａで開始され、そして、１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ₂、ｐＨ７．５、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（緩衝液Ｂ）の１５％濃度で終了する、直線の濃度勾配を成している、カラム容量の３０倍量の溶出緩衝液を用いて実施された。さらなる望ましくない（異質の）タンパク質を、１５％より多くそして１００％までの間の濃度の緩衝液Ｂで溶出した。その後、カラムを、カラム容量の８倍量の緩衝液Ａをカラムに通すことによって再調整した。

検出には、ＵＶ−分光器が使用された。吸収は、２８０ｎｍの波長において観測された。

実施例６
コラゲナーゼタンパク質の質量スペクトル分析
精製されたタンパク質の分析は、ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳによって実施された：タンパク質は、アライアンス ＨＴ（Alliance HT）（ウォータース）機器または類似の装置を用いた逆相ＨＰＬＣによって分離された。好ましいカラムは、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８、Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｐｅｐｔｉｄｅ、２５０×２．１ｍｍ ２１８ ＴＰ ５２（マッハライ アンド ナーゲル（Macherey & Nagel）、ドイツ）であった。タンパク質は、ＵＶ検知器を用いて、２２６ｎｍの波長でオンラインで検出された。スキャンモードでは、タンパク質は、ＱＴＯＦ II（ウォータース）機器を用いた、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって検出された。

試料は、水中で１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整された。個々の試行において、１０μＬのタンパク質溶液が、注入され、そして、分析された。２回の分析のランの間には、交差汚染を避けるために、ただの水からなるモック試料（１０μＬ）が２回注入された。

図４は、コラゲナーゼＩ型調製物の結果を示している。２つの群のピークが、図４に示されているように得られた。グループIIは、総ピーク面積の約９０％を表していた。グループII内の主たるピークは、１１３,９３０Ｄａの分子量に相当し、総ピーク面積の８２％を占めていた。グループII内の小さいピークは、１１３,４１０Ｄａの分子量に相当し、総ピーク面積の８％を占めていた。

図５は、コラゲナーゼII型調製物の結果を示している。２つの群のピークが、図５に示されているように得られた。グループIIは、ただ１つの主たるピークからなり、総ピーク面積の約９３％を表していた。そのピークは、１１２,０００Ｄａの分子量に相当していた。

実施例７
Ｒｅｄ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーおよびＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーを用いた、Ｃ．ヒストリチカムのコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の調製
以下に記載されている全ての工程は、別段の指示のない限り、約２℃および約８℃の間の温度で実施した。透明な培養物上清を、実施例１に記載されているように得た。第１の工程では、硫酸アンモニウムを、上清中に約１．６５Ｍの濃度で溶解した。１つの例としては、２４５．６５ｇの硫酸アンモニウムを、上清１Ｌに対して溶解し、そして、約８時間および約２４時間の間インキュベートした。沈殿を、遠心分離または濾過によって、液相から分離した。透明な液相を、その後、ｐＨ７の、０．０２ＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ₂（以下、「緩衝液Ｒ１」とも参照される）に対して、透析濾過した；透析濾過に続いて、液相の導電率を、２ｍＳ／ｃｍより低い値に調整し、液相を、必要とあれば、追加の緩衝液Ｒ１で希釈した。液相のｐＨを、トリス／ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて、６．８および７．０の間の値に調整した。

タンパク質含量は、液相の１：２０の希釈液の、２８０ｎｍでの消光を測定することによって求められた。加えて、液相を、実施例５に記載されているように、ＭＯＮＯ−Ｑ（商標） ＨＰＬＣを用いて分析した。

以下のクロマトグラフィー工程の間、全ての移動相のｐＨは、他に示されていない限り、ｐＨ７±０．２に維持した。緩衝液Ｒ１で平衡化された、分取用のＲｅｄ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＡＳＴ ＦＬＯＷカラムは、液相をロードされ、そして、その後、カラムからの流出液の２８０ｎｍでの光学密度がベースラインに到達し、顕著に変化しなくなるまで、２倍またはそれ以上のカラム容量の緩衝液Ｒ１で洗浄された。したがって、ベースラインは、最終的には、洗浄緩衝液中の少量のタンパク質のみを反映した。その後、カラムは、ｐＨ９の、０．０２ＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ₂、１ＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液（以下、「緩衝液Ｒ２」とも参照される）にて溶出された。溶出液を集め、そして、ｐＨ７の、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＣａＣｌ₂（以下、「緩衝液Ｓ１」とも参照される）に対して、透析濾過した；液相のタンパク質含有量は、５ｍｇ／ｍＬに調整され、そして、導電率が、２ｍＳ／ｃｍより小さい値に調整され、液相は、必要とあれば、追加の緩衝液Ｓ１で希釈された。

以下の工程において、分取用のＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーが実施された。カラム材を調整するために、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラムを初めに水で洗浄した；その後、カラム容量の半分の０．５ＭのＣａＣｌ₂および２．５倍のカラム容量のｐＨ７の、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＣａＣｌ₂を、カラムに通した。その後、カラムを、緩衝液Ｓ１で洗浄した；カラムを、Ｒｅｄ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーの後に得られた、透析濾過され、そして、調整された液相のｐＨ（±０．２）を流出液が有するようになるまで、緩衝液Ｓ１で平衡化した。ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラムは、その後、コラゲナーゼタンパク質およびさらなる不純物を含む、前記液相をロードされた。ローディング工程に続いて、カラムを、緩衝液Ｓ１で洗浄し、そして、タンパク質の溶出を観察した。クロストリパインおよびコラゲナーゼタンパク質が、別々の画分に集められた。コラゲナーゼタンパク質の画分が、ｐＨ７．５の、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ₂（以下、「緩衝液Ｑ１」とも参照される）に対する透析濾過によって濃縮された。

コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質は、その後の分取用Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー工程において分離された。Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標） ｆｆカラムを、初めに水で洗浄した；その後、カラム容量の半分の４Ｍのグアニジン塩酸塩をカラムに通し、続いて水でさらに洗浄し、０．５ＭのＮａＯＨおよび０．５ＭのＨＣｌをそれぞれ１回通し、水でさらに洗浄し、そして、最終的に、緩衝液Ｑ１でカラムを平衡化した。ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーの後で得られた、コラゲナーゼタンパク質を含む液相を、カラムに適用した。約１〜２倍のカラム容量の緩衝液Ｑ１を、カラムに適用し、そして、フロースルーを廃棄した。コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を、２５倍のカラム容量を含み、９５％の緩衝液Ｑ１、５％の緩衝液Ｑ２（ｐＨ７．５の、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、３５ｍＭのＣａＣｌ₂）の比で開始され、そして、５％の緩衝液Ｑ１および９５％の緩衝液Ｑ２の比で終了する、濃度勾配を適用することによって、別々に溶出した。タンパク質の溶出が観察された。コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を、別々の画分に集め、そして、ＨＰＬＣ分析（実施例５参照）を用いて確認した。

実施例８
Ｒｅｄ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標） ＦＡＳＴ ＦＬＯＷを用いた精製後の、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の割合の定量的測定
コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質は、実施例７の方法にしたがって精製された。ＭＯＮＯ−Ｑ（商標）分析は実施例５に説明されているように実施された。コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質に相当する、ピーク下の積分値が定量された。この点について、図３が、クロマトグラムの１例を示している。示されているようなピーク下の面積の定量が、表１に記載されている。

コラゲナーゼII型タンパク質の総ピーク面積は、７．２９分および９．７５分の間の間隔から得られ、そして、総ピーク面積の２８．１％を占めている。

総ピーク面積の１０．３％を占めている、９．７５分および１２．３５分の間の間隔にあるピークは、考慮から外された。質量スペクトル分析は、このピーク面積が、種々のコラゲナーゼＩ型分解生成物の混合物およびいくつかの非コラゲナーゼタンパク質を反映していることを示していた。

完全（intact）なコラゲナーゼＩ型タンパク質の総ピーク面積は、１４．３６分および１５．８７分の間の間隔から得られ、そして、総ピーク面積の１０．２％を占めている。分解生成物は、１５．８７分および１７．５４分の間（２９．７％）、ならびに１７．５４分および１９．６１分の間（１２．１％）で検出される。全てまとめると、コラゲナーゼＩ型に関するピーク面積は、総ピーク面積の５２％を占めている。

したがって、コラゲナーゼタンパク質のＩ型／II型の比は、５２／２８．１に相当しており、１．８５の値と概算される。

以下において、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の精製のための、その他のタンパク質分解活性による標的タンパク質の分解の影響を特に克服する新規な方法および工程の流れが示される。

実施例９
透明な培養物上清からの、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の沈殿
下記に記載される全ての工程は、他に示されていない限り、約２℃および約８℃の間の範囲の温度で実施された。Ｃ．ヒストリチカムの液体培養物のＡＣＲＯＰＡＫ（商標） ５００フィルター材を用いた限外濾過法（実施例１参照）によって得られた、透明な培養物上清に、秤量された量の固体の硫酸アンモニウムが添加された。硫酸アンモニウムは、徐々に、約２０分および約３０分の間の時間にわたって上清に添加され、そして、最終的な濃度である３．２Ｍに到達するまで、撹拌によって溶解された。硫酸アンモニウムが完全に溶解した後、沈殿が約１０分および約２０分の間に形成させられた。その後、沈殿物質が、残りの液相から遠心分離によって単離された。単離された沈殿は、さらなる精製工程のために直接的に再溶解される（実施例１０参照）か、または、約２℃および約８℃の間で２週間まで、もしくは、−２０℃で２週間以上、貯蔵された。

実施例１０
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
実施例９の処置によって得られた、単離された沈殿は、ｐＨ７の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む水溶性緩衝液に溶解され、そして、溶液の導電率が、硫酸アンモニウムを用いて、約９５ｍＳ／ｃｍの値に調整された。溶液は、Ｐｈｅｎｙｌ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＬＯＷ ＳＵＢ）（ジェネラル エレクトリック、ＧＥ １７−０９６５−０４）を固定相とする、クロマトグラフィーカラムに適用された。その前に、カラムは、ｐＨ７の、０．６Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む緩衝液で平衡化された。

コラゲナーゼタンパク質を含む混合物をカラム上にロードしている間、フロースルーは廃棄された。その後、結合されたコラゲナーゼタンパク質を含む固定相が、ｐＨ７の、０．６Ｍの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む水溶性の洗浄緩衝液を用いて洗浄され、洗浄緩衝液の導電率は、約９５ｍＳ／ｃｍであった。典型的には、１０および１５倍の間のカラム容量の洗浄緩衝液が、洗浄工程のためにカラムを通された。洗浄緩衝液のフロースルーは廃棄された。

コラゲナーゼタンパク質は、ｐＨ７の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳで構成されている溶出緩衝液を用いて定組成溶離を実施することによって、固定相より除去され、緩衝液の導電率は、硫酸アンモニウムを用いて７６ｍＳ／ｃｍの値に調整された。このために、１５および２０倍の間のカラム容量の溶出用緩衝液が、カラムを通された。

もう１つの方法として、ｐＨ７の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳから開始される勾配溶離が実施され、溶液の導電率は、硫酸アンモニウムを用いて約９５ｍＳ／ｃｍの値に調整された（「緩衝液１」）。勾配の最終の濃度は、ｐＨ７の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（「緩衝液２」）で硫酸アンモニウムは含まない。勾配の総容量は、典型的には、１０倍のカラム容量であった。勾配溶離の後、カラムは、追加の、１０倍のカラム容量の緩衝液２を用いて溶出された。

コラゲナーゼタンパク質を含む、溶出液または溶出液の集められた画分は、その後、濃縮、および、ｐＨ７の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳに対する透析濾過に付された。

実施例１１
疎水性相互作用クロマトグラフィー後の、コラゲナーゼタンパク質の安定性
実施例１０の処置によって得られた、透析濾過された溶出液のアリコートが、安定性試験のために用いられた。表２は、クロストリパインおよびトリプシンのタンパク質分解活性の減少の効果を示している。比較結果が、疎水性相互作用クロマトグラフィーの後、かつ、定組成溶離を用いた、３回の独立した調製ロットで得られた。Ｃ．ヒストリチカム培養物上清と比較して、トリプシンの（「Ｔｒｙｐ．」）タンパク質分解活性は、約１００倍および約４００倍の間減少し、そして、クロストリパイン（「Ｃｌｏｓ．」）のタンパク質分解活性は、約１００倍および約１５０倍の間減少した。

この項目での調製物におけるコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の安定性は、すでに、著しく高かった。ＭＯＮＯ−Ｑ（商標）分析が、実施例５に記載されているように、溶出液を特徴づけるために実施された。図１は、４つのクロマトグラムの重ね合わせを示している。疎水性相互作用クロマトグラフィー後に直接分析された試料、ならびに、引き続いて２日、３日および６日間４℃でインキュベーションされた試料が比較された。図１から明らかなように、コラゲナーゼII型タンパク質に相当する主たるピークは、その高さにおいて明確には変化せず、そして、ピーク下の積分値は検出できるほどには変化しなかった。０日目のコラゲナーゼＩ型タンパク質に対応する主たるピーク下の積分値を対照（１００％）とすると、２日後（約９９％）、３日後（約９８％）および６日後（約８５％）の緩やかな減少しか見られない。それでもなお、６日後でさえも、コラゲナーゼＩ型タンパク質の総計のほぼ大部分が、ピーク下の積分値によって明らかなように、インタクトなまま残存していた。

このような予期せぬ結果は、所望のタンパク質の損失または減少を導く、不必要なタンパク質分解活性の大部分は、既に、精製工程の流れにおけるこの段階で除去されていたことを示している。不必要なタンパク質分解活性の早期の除去が、コラゲナーゼＩ型タンパク質の回収のさらなる最適化のためには決定的であることが見出された。

実施例１２
疎水性相互作用クロマトグラフィー後の、コラゲナーゼII型およびＩ型タンパク質の比の定量的測定
実施例１０で記載されている疎水性相互作用クロマトグラフィー後に続いて、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の比が測定された。ＭＯＮＯ−Ｑ（商標）分析が、実施例５に記載されているように実施された。コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質に相当する、ピーク下の積分値が定量された。この点について、図２が、クロマトグラムの１例を示している。示されているようなピーク下の面積の定量が、表３に記載されている。

コラゲナーゼII型タンパク質の総ピーク面積は、７．９０分および９．２１分の間の間隔から得られ、そして、総ピーク面積の３０．４％を占めている。

完全なコラゲナーゼＩ型タンパク質の総ピーク面積は、１４．７９分および１６．５０分の間の間隔から得られ、そして、総ピーク面積の４６．１％を占めている。タンパク質分解作用のため、さらにＣ−末端が切断された形のコラゲナーゼＩ型タンパク質が、１６．５０分および１９．００分の間の間隔に存在し、総ピーク面積の１６．３％を占めている。したがって、コラゲナーゼＩ型タンパク質の総計のピーク面積は、６２．４％である。

コラゲナーゼタンパク質のＩ型／II型の比は、６２．４／３０．４に相当しており、２の値と概算される。

実施例１３
陽イオン交換クロマトグラフィー
残留のクロストリパインおよびその他の不必要なタンパク質分解活性は、実施例１０に記載されている処置によって得られた、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の混合物から、陽イオン交換クロマトグラフィーの方法によって除去された。陽イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ樹脂、アマルシャム バイオサイエンス）が、ｐＨ７の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む水溶性の緩衝液で平衡化された。実施例１０で得られた透析濾過された溶出液は、クロマトグラフィーカラムに適用され、そして、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、平衡化緩衝液を移動相として用いて、固定相を通じてクロマトグラフされた。カラムからの流出液が、画分に集められた。コラゲナーゼ活性を含む画分（アッセイについては実施例２を参照）が集められた。

実施例１４
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した、コラゲナーゼタンパク質のＩ型およびII型の分離
実施例１３の処置によって得られた、精製されたコラゲナーゼタンパク質は、コラゲナーゼタンパク質のＩ型およびII型に分離された。Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ 陰イオン交換クロマトグラフィーカラムが、ｐＨ７．５の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む水溶性緩衝液を用いて平衡化された。実施例１３の精製工程の後に得られた、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を含む混合物が、カラム上にロードされ、そして、固定相に吸着された。その後、洗浄工程が、３倍のカラム容量の平衡化緩衝液をカラムに通すことによって実施された。溶出は、２５倍のカラム容量の、直線のＣａ²⁺イオン濃度勾配を適用することによって実施された。溶出は、ｐＨ７．５の、５ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（「緩衝液Ｉ」）で開始され、そして、ｐＨ７．５の、３５ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（「緩衝液II」）で終了した。コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質は、別々の画分に得られた。コラゲナーゼＩ型は、緩衝液Ｉ／緩衝液IIの比が約４４％／５６％および約６％／９４％の間で溶出した；コラゲナーゼII型は、緩衝液Ｉ／緩衝液IIの比が約７６％／２４％および約６７％／３３％の間で溶出した。

実施例１５
精製されたコラゲナーゼタンパク質のＩ型およびII型のＮ−末端アミノ酸の決定
別々に得られたコラゲナーゼタンパク質のＩ型およびII型（実施例１４参照）が、エドマン分解法による、アミノ酸のＮ−末端配列分析およびＰＲＯＣＩＳＥ（登録商標）シーケンサー（アプライド バイオシステムズ）を用いた分析に付された。

コラゲナーゼＩ型の調製物において、最も多いコラゲナーゼＩ型タンパク質種に相当するタンパク質のアイソフォームに関して、Ｎ−末端配列、Ｉ−Ａ−Ｎ−Ｔ−Ｎ−Ｓが検出された。

コラゲナーゼII型の調製物において、最も多いコラゲナーゼII型タンパク質種に相当するタンパク質のアイソフォームに関して、Ｎ−末端配列、Ｖ−Ｑ−Ｎ−Ｅ−Ｓ−Ｋが検出された。

実施例１６
クロストリパインの減少に関する、精製スキームの比較
クロストリパインの活性は、実施例３に示されているように検出された。コラゲナーゼＩ型およびII型は、培養物上清のいくつかのバッチから、実施例９から実施例１４の処置（「Ａ」調製物）および実施例７に基づいた処置（「Ｂ」調製物）を用いて、別々に単離された。調製物は、調製物中の残留クロストリパイン活性に関して比較された。結果は表４にまとめられている。

データは、さらに、「Ａ」調製物における、クロストリパイン活性の効果的な除去を明らかにしている。結果として、それぞれの所望のコラゲナーゼ酵素の分解が顕著に減少され、そして、酵素調製物における高度な品質のための根拠を提供している。

実施例１７
コラゲナーゼＩ型およびII型の調製物におけるトリプシン活性の決定
トリプシンの活性は、実施例４に記載されているように検出された。コラゲナーゼＩ型およびII型は、培養物上清のいくつかのバッチから、実施例９から実施例１４の処置（「Ａ」調製物）を用いて、別々に単離された。調製物は、調製物中の残留トリプシン活性に関して分析された。結果は表５にまとめられている。

データは、さらに、「Ａ」調製物における、トリプシンの活性の効果的な除去を明らかにしている。結果として、それぞれの所望のコラゲナーゼ酵素の分解が顕著に減少され、そして、酵素調製物における高度な品質のための根拠を提供している。

本発明の方法は、他のタンパク質分解活性物の、迅速で効率的な除去をもたらす。本発明による調製物は、格別に純粋で完全な酵素的に活性であるコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を提供する。本発明はまた、２つの単離されたタンパク質のブレンドを提供する。本発明はさらに、インビトロにおける組織試料を処理するための精製されたコラゲナーゼタンパク質またはそれらのブレンドの使用を提供する。

配列番号１：コラゲナーゼＩ型のＮ末端配列。
配列番号２：コラゲナーゼII型のＮ末端配列。
配列番号３：コラゲナーゼのタンパク質分解活性を測定する「ブンシュ」アッセイ用の修飾された基質ペプチド（バッケム、Ｍ１７１５）。４−フェニルアゾ−ベンジルオキシカルボニル−残基により１位で修飾されたペプチド。

Claims (14)

1. 複合混合物からクロストリジウム ヒストリチカム（Clostridium histolyticum）コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を精製する方法であって、
   （ａ）水性液相に溶解した複合混合物を提供する工程、
   （ｂ）硫酸アンモニウムを工程（ａ）の液相に溶解することにより、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質の沈殿を形成する工程、
   （ｃ）工程（ｂ）の沈殿を液相から分離する工程、
   （ｄ）工程（ｃ）の沈殿を、Ｃａ²⁺イオンを含有し、６．０および８．０の間のｐＨの水性緩衝液に溶解し、かつ溶解した沈殿物を含む緩衝液の導電率を５０および３００ｍＳ／ｃｍの間の値に調整し、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を含む複合緩衝溶液を形成する工程；
   （ｅ）工程（ｄ）の複合緩衝溶液を疎水性固定相と接触させることにより抽出し、かつコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を該固定相に吸着させる工程；
   （ｆ）抽出溶液から、工程（ｅ）の吸着されたコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質と共に該疎水性固定相を分離する工程；
   （ｇ）コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を工程（ｆ）の該固定相から溶出する工程；
   を含み、それによりコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を精製する方法。
2. 工程（ｃ）後、沈殿の溶解性について、工程（ａ）の溶解した複合混合物における各タンパク質分解活性と相対的に、クロストリパインタンパク質分解活性が９０倍と１５０倍の間減少し、かつトリプシン活性が１００倍と４００倍の間減少することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 工程（ｇ）の溶出後のコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製されることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
4. 陽イオン交換クロマトグラフィー後に得られたコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質が、
   （Ａ）さらに精製されたコラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を陰イオン交換固定相と接触させ、コラゲナーゼＩ型およびII型タンパク質を該固定相に吸着する工程；
   （Ｂ）工程（Ａ）の固定相からコラゲナーゼＩ型およびコラゲナーゼII型タンパク質を、別々の画分に溶出する工程；
   を行うことにより分離され、それによりコラゲナーゼＩ型およびコラゲナーゼII型タンパク質が別々に精製されることを特徴とする請求項３記載の方法。
5. 工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼＩ型画分中の、約８２％のコラゲナーゼＩ型タンパク質が、約１１４ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼＩ型画分中の、約８２％のコラゲナーゼＩ型タンパク質のＮ末端が完全であることを特徴とする請求項４または５記載の方法。
7. 工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼＩ型画分におけるクロストリパイン活性が、０．０４Ｕ／ｍｇタンパク質未満であることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
8. 工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼII型画分中の、約９３％のコラゲナーゼII型タンパク質が、約１１２ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項４記載の方法。
9. 工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼII型画分中の、約９３％のコラゲナーゼII型タンパク質のＮ末端が完全であることを特徴とする請求項４または８記載の方法。
10. 工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼII型画分におけるクロストリパイン活性が、０．０７Ｕ／ｍｇタンパク質未満であることを特徴とする請求項４、８および９のいずれかに記載の方法。
11. 工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼＩ型画分における第１の測定量のコラゲナーゼＩ型タンパク質と、工程（Ｂ）で得られたコラゲナーゼII型画分における第２の測定量のコラゲナーゼII型タンパク質とを続く工程においてブレンドすることを特徴とする請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
12. 請求項１１記載の方法により得られた、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼ酵素の精製調製物の、さらなるタンパク質分解酵素とのブレンドを製造するための使用。
13. 請求項１１記載の方法により得られた、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼ酵素の精製調製物の、凍結乾燥物を製造するための使用。
14. 請求項１１記載の方法により得られた、酵素として活性なクロストリジウム ヒストリチカムコラゲナーゼ酵素の精製調製物の、組織試料を加工するための使用であって、それにより試料中に存在するコラーゲンが消化される使用。

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