CN115047191A

CN115047191A - 一种用于检测抗oj抗体的elisa试剂盒及其检测方法及应用

Info

Publication number: CN115047191A
Application number: CN202210502964.0A
Authority: CN
Inventors: 王楷文; 赵江峰; 曹励欧; 叶霜
Original assignee: Shanghai Jiading District Central Hospital
Current assignee: Shanghai Jiading District Central Hospital
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2022-09-13

Abstract

本发明公开了一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括：纯化后的优势抗原表位OJ蛋白，所述纯化后的优势抗原表位OJ蛋白所对应的氨基酸序列SEQ NO.1所示。本发明还公开了其检测方法和应用。本发明的试剂盒，能用于抗OJ抗体检测，弥补了抗OJ抗体检测方法的空白，具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简便的特点，更加易于推广和应用。

Description

一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒及其检测方法及应用

技术领域

本发明涉及抗体检测领域，具体涉及一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒及其检测方法及应用。

背景技术

抗合成酶抗体综合征(anti-synthetase syndrome，ASS)是多发性肌炎或皮肌炎的特殊类型,在与炎症性疾病相关的自身抗体中有一类抗合成酶抗体,这类抗体阳性的患者具有较特殊的临床表现,如肌炎肺间质病变、对称性的多发性关节炎以及发热、技工手、雷诺现象等。

OJ又名为异亮氨酸-tRNA合成酶(isoleucyl-tRNA synthetase)。

抗OJ抗体可见于0.6％-3％抗合成酶抗体综合征患者，且抗OJ抗体阳性的患者中100％合并间质性肺炎。动态观察血清中抗OJ抗体水平有助于诊断疾病，预测病情演变以及指导临床治疗。

然而目前市场上还未出现市场化的抗OJ抗体检测试剂盒。

因此，鉴于检测抗OJ抗体的重要性，开发一种可以广泛应用，高效灵敏的抗OJ抗体检测试剂盒以及相应的检测方法对于预测病情演变、指导临床治疗就显得尤为紧要。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒及其检测方法及应用。

为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：

一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，包括：

纯化后的优势抗原表位OJ蛋白，所述纯化后的优势抗原表位OJ蛋白所对应的氨基酸序列SEQ NO.1所示，具体包含如下氨基酸序列：

QQVPENINFPAEEEKILEFWTEFNCFQECLKQSKHKPKFTFYDGPPFATGLPHYGHILAGTIKDIVTRYAHQSGFHVDRRFGWDCHGLPVEYEIDKTLGIRGPEDVAKMGITEYNNQCRAIVMRYSAEWKSTVSRLGRWIDFDNDYKTLYPQFMESVWWVFKQLYKGENGMEDCVMALETLFSVLLSLCRLMDKDTLSIHYLMLPRVREELIDKKTESAVSQMQSVIELGRVIRDRKTIPIKYPLKEIVVIHQDPEALKDIKSLEKYIIEELNVRKVTLSTDKNKYGIRLRAEPDHMVLGKRLKGAFKAVMTSIKQLSSEELEQFQKTGTIVVEGHELHDEDIRLMYTFDQATGGTAQFEAHSDAQALVLLDVTPDQSMVDEGMAREVINRIQKLRKKCNLVPTDEITVYYKAKSEGTYLNSVIESHTEFIFTTIKAPLKPYPVSPSDKVLIQEKTQLKGSELEITLTRGSSLPGPACAYVNLNICANGSEQGGVLLLENPKGDNRLDLLKLKSVVTSIFGVKNTELAVFHDETEIQNQTDLLSLSGKTLCVTAGSAPSLINSSSTLLCQYINLQLLNAKPQECLMGTVGTLLLENPLGQNGLTHQGLLYEAAKVFGLRSRKLKLFLNETQTQEITEDIPVKTLNMKTVYVSV。

在本发明的一个优选实施例中，所述纯化后的优势抗原表位OJ蛋白对应的全长蛋白结构如SEQ NO.2所示，具体包含如下氨基酸序列：

MLQQVPENINFPAEEEKILEFWTEFNCFQECLKQSKHKPKFTFYDGPPFATGLPHYGHILAGTIKDIVTRYAHQSGFHVDRRFGWDCHGLPVEYEIDKTLGIRGPEDVAKMGITEYNNQCRAIVMRYSAEWKSTVSRLGRWIDFDNDYKTLYPQFMESVWWVFKQLYDKGLVYRGVKVMPFSTACNTPLSNFESHQNYKDVQDPSVFVTFPLEEDETVSLVAWTTTPWTLPSNLAVCVNPEMQYVKIKDVARGRLLILMEARLSALYKLESDYEILERFPGAYLKGKKYRPLFDYFLKCKENGAFTVLVDNYVKEEEGTGVVHQAPYFGAEDYRVCMDFNIIRKDSLPVCPVDASGCFTTEVTDFAGQYVKDADKSIIRTLKEQGRLLVATTFTHSYPFCWRSDTPLIYKAVPSWFVRVENMVDQLLRNNDLCYWVPELVREKRFGNWLKDARDWTISRNRYWGTPIPLWVSDDFEEVVCIGSVAELEELSGAKISDLHRESVDHLTIPSRCGKGSLHRISEVFDCWFESGSMPYAQVHYPFENKREFEDAFPADFIAEGIDQTRGWFYTLLVLATALFGQPPFKNVIVNGLVLASDGQKMSKRKKNYPDPVSIIQKYGADALRLYLINSPVVRAENLRFKEEGVRDVLKDVLLPWYNAYRFLIQNVLRLQKEEEIEFLYNENTVRESPNITDRWILSFMQSLIGFFETEMAAYRLYTVVPRLVKFVDILTNWYVRMNRRRLKGENGMEDCVMALETLFSVLLSLCRLMDKDTLSIHYLMLPRVREELIDKKTESAVSQMQSVIELGRVIRDRKTIPIKYPLKEIVVIHQDPEALKDIKSLEKYIIEELNVRKVTLSTDKNKYGIRLRAEPDHMVLGKRLKGAFKAVMTSIKQLSSEELEQFQKTGTIVVEGHELHDEDIRLMYTFDQATGGTAQFEAHSDAQALVLLDVTPDQSMVDEGMAREVINRIQKLRKKCNLVPTDEITVYYKAKSEGTYLNSVIESHTEFIFTTIKAPLKPYPVSPSDKVLIQEKTQLKGSELEITLTRGSSLPGPACAYVNLNICANGSEQGGVLLLENPKGDNRLDLLKLKSVVTSIFGVKNTELAVFHDETEIQNQTDLLSLSGKTLCVTAGSAPSLINSSSTLLCQYINLQLLNAKPQECLMGTVGTLLLENPLGQNGLTHQGLLYEAAKVFGLRSRKLKLFLNETQTQEITEDIPVKTLNMKTVYVSVLPTTADF。

在本发明的一个优选实施例中，所述纯化后的优势抗原表位OJ蛋白由如SEQNO.3、4所示的引物对扩增得来，所述引物对所对应的序列如下：

F:ccaccgccttgctgaca；

R:ccctgctcctagtagtaaaccttagaatc。

在本发明的一个优选实施例中，所述ELISA试剂盒中还包括：

包被所述优势抗原表位OJ蛋白的96孔酶标板。

在本发明的一个优选实施例中，所述ELISA试剂盒中还包括：

阴性对照血清、阳性对照血清、血清稀释液、酶标二抗、洗涤液、底物显色液、终止液；

所述阴性对照血清为抗合成酶综合征患者免疫印迹法检测抗OJ抗体阴性血清；

所述阳性对照血清为抗合成酶综合征患者免疫印迹法检测抗OJ抗体阳性血清；

所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。

在本发明的一个优选实施例中，所述血清稀释液为含BSA的PBS溶液；

所述洗涤液为PBST，浓度为1％；

底物显色液为四甲基联苯胺(TMB)；

终止液为0.5％的稀硫酸溶液。

一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

利用所述96孔酶标板包被所述优势抗原表位OJ蛋白后在4℃的环境温度下包被过夜；

采用所述PBST洗涤液对多余的包被液进行去除，重复3-5次洗涤步骤；

在96孔酶标板的单孔中加入300ul，1％浓度的BSA溶液，在37℃下温育2小时后采用所述PBST进行洗涤，重复3-5次；

在96孔酶标板的单孔中加入100ul的所述阴性、阳性对照血清作为标准品和100ul的待测血清，常温温育1小时；

将温育后的残余溶液采用PBST洗涤液进行洗涤，重复3-5次洗涤步骤；

以1：60000的比例加入所述酶标二抗后常温温育30分钟；

加入所述底物显色液(TMB)进行显色，显示完成后采用终止液终止反应；

在450/630nm酶标仪下读数。

在本发明的一个优选实施例中，所述阳性对照血清作为标准品的稀释及空白对照标准如下：

稀释梯度为：1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560；

空白对照采用100ul，pH＝7.2的PBS缓冲液

在本发明的一个优选实施例中，所述优势抗原表位OJ蛋白的浓度为5ug/ml，每个反应孔中加100ul。

一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒的应用，所述应用为用于抗OJ抗体检测。

本发明的有益效果在于：

由于OJ蛋白全长表达困难，表达技术要求高，购买成品化的OJ全长蛋白价格更是昂贵。

本发明在寻找OJ优势抗原表位的基础上，表达合成抗原，大大的缩减了成本。

本发明的试剂盒，能用于抗OJ抗体检测，弥补了抗OJ抗体检测方法的空白，具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简便的特点，更加易于推广和应用。

附图说明

图1为OJ蛋白的全长蛋白结构图。

图2为优势抗原表位OJ蛋白结构图。

图3为蛋白重组后获得的优势抗原表位OJ蛋白Western-Blot结果示意图。

图4为Anti-OJ抗体检测在各组人群中的比较示意图。

图5为Anti-OJ抗体检测在治疗后变化示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下结构中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要的混淆本发明的概念。

本发明所称的常温，为本领域通常理解的常温，范围在20-25摄氏度。

1.由于OJ蛋白结构大，空间结构为复合物，氨基酸序列多，发明人先将其全长结构通过蛋白动力学分析，得出其优势的抗原结构表位：

所涉及的全长氨基酸序列如下：

SEQ NO.1：

全长蛋白结构如图1所示。

本发明的发明人通过大量的蛋白组动力学分析后，得到的优势抗原表位氨基酸序列如下所示：

SEQ NO.2：

优势抗原结构如图2所示。

在得到优势抗原表位氨基酸序列后，通过蛋白重组的方式得到对应优势抗原表位氨基酸序列的优势抗原表位蛋白，具体的蛋白重组包括如下步骤：

2.1基因克隆；

2.1.1获得目的基因

PCR方法：

以含目的基因的人cDNA为模板，按目的基因序列设计引物如下：

F:ccaccgccttgctgaca；

R:ccctgctcctagtagtaaaccttagaatc。

PCR反应条件如下：

95℃2min；

94℃30s,60℃30s,65℃Xm in(3min/kb)；重复35个循环；

65℃10min；

4℃1min；

利用目的片段回收试剂盒(QIAGEN QIAqu ickGe l Extract ion Kit)，针对扩增产物进行电泳跑胶回收，得到纯化的扩增产物。

2.1.2构建目的克隆质粒

2.1.2.1扩增产物的连接

构建连接体系为：

加双蒸水至10ul；

16℃连接过夜，得到连接产物。

2.1.2.2

利用感受态细胞将连接产物进行热转化，然后转接入带有相应抗生素的LB培养平板进行过夜培养，转化得到菌落筛选板；挑取单菌落再次转接到含有相应抗生素的LB培养基中进行培养出，然后取2μL进行PCR鉴定；通过鉴定后，将含有目的片段的样品接入LB培养基过夜旋转培养。

2.1.2.3

培养得到的菌液利用Axygen小抽试剂盒，按照试剂盒的标准步骤进质粒抽提，并将得到的质粒通过测序鉴定是否为目的克隆质粒。

2.2细胞转染

得到的目的克隆质粒转染至HEK293细胞中，将转染后含有目的克隆质粒的细胞接入相应的培养基中培养48-72h，然后收集培养得到的细胞。

2.3蛋白纯化。

将收集后的细胞通过超声破碎方式进行裂解，然后高速离心收集裂解上请，通过亲和纯化的方法将裂解上清液进行纯化得到纯化蛋白。

2.4SDS-Page电泳鉴定结果参见图3。截短表达的蛋白经过SDS-Page验证后的分子量为70KD左右。

3.得到大量纯化后的优势抗原蛋白，以其作为抗原进行ELISA试验，包括如下步骤：

3.1抗原浓度为10ug/ml OJ ul包被96孔板，每个反应孔中加100ul，4℃过夜；

3.2洗涤：包被结束后弃去包被液，用PBST进行洗涤，重复3-5次；

3.3封闭：1％BSA，300ul/孔，37℃温育2h后洗涤，同3.2；

3.4加入标准品和待测血清，每孔100ul，常温下温育1h；

3.5按如下标准来稀释标准品(已知阳性血清)：

标准品稀释：空白，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560；空白：100ulPBS，待测血清1：100稀释，分别加入100ul；

3.6洗涤，同3.2；

3.7以1：60000的比例加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG)，常温下温育30分钟，洗涤，同3.2；

3.8加底物液显色15min；

3.9终止反应，450/630nm酶标仪读数。

4.实验数据：

本发明中的Anti-OJ抗体检测试剂盒的敏感性和特异性统计，参见表1。

表1：

由表1可知，本检测系统针对抗合成酶抗体综合征(n＝105)的临床灵敏度为3.24％。检测其他自身免疫性疾病患者(n＝701)和健康献血者(n＝400)血清的结果显示其特异性为100％。

由表2可知，本发明中检测方法(ELISA)与免疫印迹法的相关性分析，105份抗合成酶抗体综合征患者血清，600例对照组血清进行比对，本发明检测法的的敏感度为31.43％，特异性为100％。

本发明中的Anti-OJ抗体检测试剂盒与传统检测方法的比较统计，参见表2。

表2：

Anti-OJ抗体检测在各组人群中的比较，参见图4。

本发明证实，抗OJ抗体在正常人群、类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、系统性硬化症(SSc)以及非OJ抗体阳性类型的皮肌炎(DM)患者血清中均无阳性出现，说明本检测发明的特异性较高。

Anti-OJ抗体检测在治疗后变化示意图，参见图5。

本发明检测了抗OJ抗体阳性的抗合成酶综合征患者治疗前后数值的变化，证实经治疗后抗OJ抗体的数值有所下降，且相应的临床症状有所减轻。本发明针对抗OJ抗体的检测结果可以有效的进行疗效的监测。

以上显示和描述了发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 上海市嘉定区中心医院(上海健康医学院附属嘉定区中心医院、上海交通大学医学院附属仁济医院嘉定分院)

<120> 一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒及其检测方法及应用

<130> 20220509

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 653

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 1

Gln Gln Val Pro Glu Asn Ile Asn Phe Pro Ala Glu Glu Glu Lys Ile

1 5 10 15

Leu Glu Phe Trp Thr Glu Phe Asn Cys Phe Gln Glu Cys Leu Lys Gln

20 25 30

Ser Lys His Lys Pro Lys Phe Thr Phe Tyr Asp Gly Pro Pro Phe Ala

35 40 45

Thr Gly Leu Pro His Tyr Gly His Ile Leu Ala Gly Thr Ile Lys Asp

50 55 60

Ile Val Thr Arg Tyr Ala His Gln Ser Gly Phe His Val Asp Arg Arg

65 70 75 80

Phe Gly Trp Asp Cys His Gly Leu Pro Val Glu Tyr Glu Ile Asp Lys

85 90 95

Thr Leu Gly Ile Arg Gly Pro Glu Asp Val Ala Lys Met Gly Ile Thr

100 105 110

Glu Tyr Asn Asn Gln Cys Arg Ala Ile Val Met Arg Tyr Ser Ala Glu

115 120 125

Trp Lys Ser Thr Val Ser Arg Leu Gly Arg Trp Ile Asp Phe Asp Asn

130 135 140

Asp Tyr Lys Thr Leu Tyr Pro Gln Phe Met Glu Ser Val Trp Trp Val

145 150 155 160

Phe Lys Gln Leu Tyr Lys Gly Glu Asn Gly Met Glu Asp Cys Val Met

165 170 175

Ala Leu Glu Thr Leu Phe Ser Val Leu Leu Ser Leu Cys Arg Leu Met

180 185 190

Asp Lys Asp Thr Leu Ser Ile His Tyr Leu Met Leu Pro Arg Val Arg

195 200 205

Glu Glu Leu Ile Asp Lys Lys Thr Glu Ser Ala Val Ser Gln Met Gln

210 215 220

Ser Val Ile Glu Leu Gly Arg Val Ile Arg Asp Arg Lys Thr Ile Pro

225 230 235 240

Ile Lys Tyr Pro Leu Lys Glu Ile Val Val Ile His Gln Asp Pro Glu

245 250 255

Ala Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Glu Lys Tyr Ile Ile Glu Glu Leu

260 265 270

Asn Val Arg Lys Val Thr Leu Ser Thr Asp Lys Asn Lys Tyr Gly Ile

275 280 285

Arg Leu Arg Ala Glu Pro Asp His Met Val Leu Gly Lys Arg Leu Lys

290 295 300

Gly Ala Phe Lys Ala Val Met Thr Ser Ile Lys Gln Leu Ser Ser Glu

305 310 315 320

Glu Leu Glu Gln Phe Gln Lys Thr Gly Thr Ile Val Val Glu Gly His

325 330 335

Glu Leu His Asp Glu Asp Ile Arg Leu Met Tyr Thr Phe Asp Gln Ala

340 345 350

Thr Gly Gly Thr Ala Gln Phe Glu Ala His Ser Asp Ala Gln Ala Leu

355 360 365

Val Leu Leu Asp Val Thr Pro Asp Gln Ser Met Val Asp Glu Gly Met

370 375 380

Ala Arg Glu Val Ile Asn Arg Ile Gln Lys Leu Arg Lys Lys Cys Asn

385 390 395 400

Leu Val Pro Thr Asp Glu Ile Thr Val Tyr Tyr Lys Ala Lys Ser Glu

405 410 415

Gly Thr Tyr Leu Asn Ser Val Ile Glu Ser His Thr Glu Phe Ile Phe

420 425 430

Thr Thr Ile Lys Ala Pro Leu Lys Pro Tyr Pro Val Ser Pro Ser Asp

435 440 445

Lys Val Leu Ile Gln Glu Lys Thr Gln Leu Lys Gly Ser Glu Leu Glu

450 455 460

Ile Thr Leu Thr Arg Gly Ser Ser Leu Pro Gly Pro Ala Cys Ala Tyr

465 470 475 480

Val Asn Leu Asn Ile Cys Ala Asn Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val Leu

485 490 495

Leu Leu Glu Asn Pro Lys Gly Asp Asn Arg Leu Asp Leu Leu Lys Leu

500 505 510

Lys Ser Val Val Thr Ser Ile Phe Gly Val Lys Asn Thr Glu Leu Ala

515 520 525

Val Phe His Asp Glu Thr Glu Ile Gln Asn Gln Thr Asp Leu Leu Ser

530 535 540

Leu Ser Gly Lys Thr Leu Cys Val Thr Ala Gly Ser Ala Pro Ser Leu

545 550 555 560

Ile Asn Ser Ser Ser Thr Leu Leu Cys Gln Tyr Ile Asn Leu Gln Leu

565 570 575

Leu Asn Ala Lys Pro Gln Glu Cys Leu Met Gly Thr Val Gly Thr Leu

580 585 590

Leu Leu Glu Asn Pro Leu Gly Gln Asn Gly Leu Thr His Gln Gly Leu

595 600 605

Leu Tyr Glu Ala Ala Lys Val Phe Gly Leu Arg Ser Arg Lys Leu Lys

610 615 620

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<210> 2

<211> 1237

<212> PRT

<213> 智人(homo sapiens)

<400> 2

Met Leu Gln Gln Val Pro Glu Asn Ile Asn Phe Pro Ala Glu Glu Glu

1 5 10 15

Lys Ile Leu Glu Phe Trp Thr Glu Phe Asn Cys Phe Gln Glu Cys Leu

20 25 30

Lys Gln Ser Lys His Lys Pro Lys Phe Thr Phe Tyr Asp Gly Pro Pro

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Arg Arg Phe Gly Trp Asp Cys His Gly Leu Pro Val Glu Tyr Glu Ile

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100 105 110

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130 135 140

Asp Asn Asp Tyr Lys Thr Leu Tyr Pro Gln Phe Met Glu Ser Val Trp

145 150 155 160

Trp Val Phe Lys Gln Leu Tyr Asp Lys Gly Leu Val Tyr Arg Gly Val

165 170 175

Lys Val Met Pro Phe Ser Thr Ala Cys Asn Thr Pro Leu Ser Asn Phe

180 185 190

Glu Ser His Gln Asn Tyr Lys Asp Val Gln Asp Pro Ser Val Phe Val

195 200 205

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210 215 220

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Glu Met Gln Tyr Val Lys Ile Lys Asp Val Ala Arg Gly Arg Leu Leu

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Glu Ile Thr Leu Thr Arg Gly Ser Ser Leu Pro Gly Pro Ala Cys Ala

1045 1050 1055

Tyr Val Asn Leu Asn Ile Cys Ala Asn Gly Ser Glu Gln Gly Gly Val

1060 1065 1070

Leu Leu Leu Glu Asn Pro Lys Gly Asp Asn Arg Leu Asp Leu Leu Lys

1075 1080 1085

Leu Lys Ser Val Val Thr Ser Ile Phe Gly Val Lys Asn Thr Glu Leu

1090 1095 1100

Ala Val Phe His Asp Glu Thr Glu Ile Gln Asn Gln Thr Asp Leu Leu

1105 1110 1115 1120

Ser Leu Ser Gly Lys Thr Leu Cys Val Thr Ala Gly Ser Ala Pro Ser

1125 1130 1135

Leu Ile Asn Ser Ser Ser Thr Leu Leu Cys Gln Tyr Ile Asn Leu Gln

1140 1145 1150

Leu Leu Asn Ala Lys Pro Gln Glu Cys Leu Met Gly Thr Val Gly Thr

1155 1160 1165

Leu Leu Leu Glu Asn Pro Leu Gly Gln Asn Gly Leu Thr His Gln Gly

1170 1175 1180

Leu Leu Tyr Glu Ala Ala Lys Val Phe Gly Leu Arg Ser Arg Lys Leu

1185 1190 1195 1200

Lys Leu Phe Leu Asn Glu Thr Gln Thr Gln Glu Ile Thr Glu Asp Ile

1205 1210 1215

Pro Val Lys Thr Leu Asn Met Lys Thr Val Tyr Val Ser Val Leu Pro

1220 1225 1230

Thr Thr Ala Asp Phe

1235

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccaccgcctt gctgaca 17

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccctgctcct agtagtaaac cttagaatc 29

Claims

1.一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括：

纯化后的优势抗原表位OJ蛋白，所述纯化后的优势抗原表位OJ蛋白所对应的氨基酸序列SEQ NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述纯化后的优势抗原表位OJ蛋白对应的全长蛋白结构如SEQ NO.2所示。

3.如权利要求1所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述纯化后的优势抗原表位OJ蛋白由如SEQ NO.3、4所示的引物对扩增得来，所述引物对所对应的序列如下：

F:ccaccgccttgctgaca；

R:ccctgctcctagtagtaaaccttagaatc。

4.如权利要求1所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒中还包括：

至少一包被所述优势抗原表位OJ蛋白的96孔酶标板。

5.如权利要求1或4中任一项所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒中还包括：

所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。

6.如权利要求5所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述血清稀释液为含0.5％BSA的PBS溶液。涤液为PBST，浓度为1％。底物显色液为四甲基联苯胺(TMB)；终止液为0.5％的稀硫酸溶液。

7.如权利要求1-6当中任一项所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

在96孔酶标板的单孔中加入100ul的所述阴性/阳性对照血清作为标准品和100ul的待测血清，常温温育1小时；

以1：60000的比例加入所述酶标二抗后常温温育30分钟；

加入所述底物显色液四甲基联苯胺(TMB)进行显色，显示完成后采用终止液终止反应；

在450/630nm酶标仪下读数。

8.如权利要求7所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于，所述阳性对照血清作为标准品的稀释及空白对照标准如下：

空白对照采用100ul PH＝7.2的PBS缓冲液。

9.如权利要求7所述的一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒的检测方法，其特征在于，所述优势抗原表位OJ蛋白的浓度为5ug/ml，每个反应孔中加100ul。

10.如权利要求1-6当中任一项所述一种用于检测抗OJ抗体的ELISA试剂盒的应用，其特征在于，所述应用为用于抗OJ抗体检测。