CN103571845B - 抑制肥大细胞钙通道的适配子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组抑制肥大细胞钙通道的适配子，其具有如SEQ？ID？NO5-11所示的核苷酸序列。本发明还提供了该抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，具体包含以下步骤：1）构建随机ssDNA文库；2）设计引物制备次级ssDNA文库；3）SELEX筛选适配子-靶物质复合物；4）分离纯化适配子。本发明提供的适配子具有抑制肥大细胞钙通道的作用，为缓解或治疗I型超敏反应提供新的方法。

Description

抑制肥大细胞钙通道的适配子及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种抑制肥大细胞钙通道的适配子及其制备方法。

背景技术

2006年，Feske等人首先识别出一种新蛋白，命名为Orai1，并且提出Orai1蛋白是钙离子释放激活通道（Ca²⁺releaseactivationchannel，CRAC）的基本组成部分。随着研究的逐步深入，现在已经明确Orai1是一个广泛表达的细胞膜表面蛋白，分子大小约为33kD，具有四个跨膜区域，两个膜外区，N端和C端位于细胞内。研究发现将编码Orai1第1膜外区D110和D112位的带负电荷的天冬氨酸密码子突变为编码中性的甘氨酸密码子，突变体cDNA转染HEK293细胞，可使Orai1丧失对钙离子的通道功能。

20世纪90年代，一种制备特异性寡核苷酸分子的SELEX技术问世，寡核苷酸分子被称为适配子(aptamer)。适配子可以是ssDNA、dsDNA或RNA，是从随机的DNA或RNA寡核苷酸库中，经过多个循环的筛选和富集而获得的。它们的特点是能形成一定的立体结构，通过空间构象与靶分子高特异性、高亲和力地结合。适配子最大的优点是没有免疫原性，故在临床治疗时能重复使用。治疗人类眼部黄斑病变的适配子药物Macugen，已经在美国批准上市。目前该技术在医学及生命科学的各个领域都展现了广阔的应用前景。

I型超敏反应是指机体受到某些抗原刺激时，引起的由特异性IgE抗体介导产生的一种发生快消退亦快的免疫应答，表现为局部或全身的生理功能紊乱。具有明显个体差异和遗传倾向。而I型超敏反应的关键环节是激活肥大细胞，活化的主要标志是脱颗粒反应。无论有无IgE和IgE受体参与，Ca²⁺从细胞外经CRAC通道迅速进入细胞内是有效激活肥大细胞、产生脱颗粒反应的充分和必要条件。因此，通过抑制肥大细胞的钙离子通道以缓解和治疗I型超敏反应成为一种新的选择。但是，目前还没有能够有效的抑制肥大细胞的钙离子通道的手段。

发明内容

针对上述需要，本发明为进一步实现通过抑制肥大细胞的钙通道以缓解和治疗I型超敏反应提供了一组抑制肥大细胞钙通道的适配子。

本发明提供的抑制肥大细胞钙通道的适配子具有如SEQIDNO5-11所示的核苷酸序列，该适配子的二级结构为茎环或口袋结构并且能够与orail蛋白特异性结合。

本发明还进一步提供了该抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，具体包含以下步骤：

1）构建长度为80nt的随机ssDNA文库，其中，所述随机ssDNA文库的两端为固定序列，中间含39个随机碱基序列；

2）设计针对固定序列的上下游引物，并制备ssDNA次级文库；

3）取所述ssDNA次级文库进行多于3轮的SELEX筛选得到与orail蛋白高亲和性结合的适配子-靶物质复合物；

4）将步骤3）所述的适配子-靶物质复合物与orail蛋白分离纯化即得到纯化的适配子。

优选地，步骤1）所述随机ssDNA文库两端的固定序列为5’-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-(39N)-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3’。

优选地，步骤2）所述的上游引物P1和下游引物P2的核苷酸序列分别如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。

优选地，步骤2）所述制备ssDNA次级文库的方法为直接不对称PCR法，其中，所述上游引物P1和下游引物P2的比例关系为1：50或1：100。

优选地，步骤3）所述SELEX筛选的轮次数为12轮。

优选地，步骤4）中将所述适配子从所述适配子-靶物质复合物中分离纯化的方法为聚苯乙烯微孔板法。

本发明还进一步提供了该抑制肥大细胞钙通道的适配子在缓解或治疗I型超敏反应中的应用。

过敏反应的关键环节是激活肥大细胞，活化的主要标志是脱颗粒反应。无论有无IgE和IgE受体参与，Ca²⁺从细胞外经CRAC通道迅速进入细胞内是有效激活肥大细胞、产生脱颗粒反应的充分和必要条件。人的Orai1蛋白分子共有5个带负电荷的氨基酸，2个为谷氨酸残基分别位于第1和第3跨膜区，3个天冬氨酸残基均位于第1膜外区。研究发现分别构建编码这几个氨基酸残基的突变cDNA转染入HEK293细胞，给予钙池激动剂，钙内流和膜电流受到明显抑制，说明这几个带负电荷的氨基酸对钙离子的入胞具有决定性的作用。

本发明针对Orai1分子第1膜外区蛋白进行了SELEX筛选。其基本原理是，首先人工合成大容量的随机ssDNA文库，然后将靶蛋白与ssDNA次级文库一起孵育，并通过反向筛选使未结合的序列被洗掉弃去，而能与靶蛋白特异性结合的序列得以保留，再从蛋白核酸复合物中抽提纯化出其中的核酸片段，PCR扩增后就得到了次级文库，继而投入下一轮的筛选。如此反复筛选扩增之后，与靶蛋白特异性结合的核酸序列就得到了富集，最终得到高亲和力、高特异性的适配子。

根据筛选物质的不同，发明人创造了多种分离寡核苷酸和靶物质的方法：目前常用的有聚苯乙烯微孔板法，硝酸纤维素法、磁性介质分离、亲和柱层析、抗体法、凝胶阻滞法,及毛细管电泳、微流控芯片电泳法等方法。本发明优选地采用了聚苯乙烯微孔板法，操作相对简单，成本低，可重复性好，适合于少量制备适配子。

对于次级ssDNA文库的合成，目前多采用不对称PCR法，然而不对称PCR又可分为直接不对称PCR和间接不对称PCR。前者是直接以ssDNA为模板，合适的引物比，进行PCR扩增获得ssDNA；后者首先以ssDNA为模板，通过对称PCR扩增得到dsDNA，再以获得的dsDNA为模板，通过不对称PCR扩增得到ssDNA。理论上，两者都可以获得ssDNA。本发明发现经过优化的直接不对称PCR可以满足实验参数的设计要求，可比间接法可节约一半的时间。

本发明优选地利用将下游引物标记生物素，经不对称PCR扩增后，其回收产物利用生物素一链霉亲和素一辣根过氧化物酶系统检测每轮ssDNA次级文库与靶蛋白的亲和力，并用紫外分光光度测量其吸光度A值，直至A值的上升达到平台期。将亲和力最高一轮筛选产物连接PMD19-T质粒，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选、摇菌克隆、质粒抽提验证连接效果，将菌液送公司测序，并用DNAMAN软件进行二级结构分析。

从人静脉血或脐血中分离纯化诱导生成的肥大细胞PBMC或CBMC，其诱导周期一般为7-8周，生长过程中所需要的因子除重组人干细胞因子外，还需要白介素3和白介素6，培养成本高及周期长限制了其应用。

脱颗粒是肥大细胞激活的标志，组胺是肥大细胞脱颗粒的主要炎性介质。由于组胺分子量小，无免疫原性，在血浆中半衰期较短，在临床检测中存在一定难度。目前实验室检测组胺常用的方法有酶联免疫分析法、荧光分光光度法、放射免疫分析法。郭永超等采用荧光分光光度法，利用组胺样本与邻二甲苯（OPT）共孵育后进行检测，该方法结果不够稳定。放射免疫法虽然灵敏性高，但是复杂耗时，特别是每个实验室均需自行分离甲基转移酶。本发明应用的酶联免疫法，将组胺样本酰基化后，添加组胺碱性酶联物共孵育进行检测，检测结果稳定可靠，组胺释放水平随着Biotin-IgE浓度的升高而逐渐升高，可以应用于IgE介导的肥大细胞脱颗粒检测。

组胺、β-氨基己糖苷酶是肥大细胞脱颗粒的主要标志，检测肥大细胞脱颗粒还可以用类胰蛋白酶、前列腺素、白介素、TNF等，本发明利用组胺和β-氨基己糖苷酶等指标成功检测了肥大细胞的脱颗粒模型，其中β-氨基己糖苷酶检测更方便灵敏，成本更低，应用核酸适配子后，β-氨基己糖苷酶的释放受到明显抑制，为进一步研究IgE介导的I型超敏反应奠定了基础。

总而言之，本发明以orail分子第1膜外区蛋白为靶分子，采用SELEX技术筛选获得适配子，利用LAD2细胞脱颗粒模型，研究适配子对肥大细胞钙通道的抑制效应，为缓解或治疗IgE介导的I型超敏反应提供了新的手段。

附图说明

图1是退火温度和引物浓度比的优化示意图；

图2是对称PCR条件的优化示意图；

图3是各轮筛选产物条带电泳图；

图4ELISA检测亲和力条形图；

图5是质粒PCR后检测的目的片段电泳图；

图6是Y1与Y14的结构模拟图；结构的最小自由能是-7.90kcal/mol；

图7是Y2的结构模拟图；结构的最小自由能是-10.50kcal/mol；

图8是Y6的结构模拟图；结构的最小自由能是-2.40kcal/mol；

图9是Y8的结构模拟图；结构的最小自由能是-15.40kcal/mol；

图10是Y11的结构模拟图；结构的最小自由能是-16.90kcal/mol；

图11是Y14的结构模拟图；结构的最小自由能是-7.90kcal/mol；

图12是Y22的结构模拟图；结构的最小自由能是2.50kcal/mol；

图13是适配体对IgE介导的LAD2细胞脱颗粒的干预；

图14是激光共聚焦观察核酸适配体对LAD2细胞钙离子内流的影响；图14A为钙荧光；图14B为单细胞钙成像；图14C为钙电流。

具体实施方式

为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实验试剂和材料

构建长度为80nt的随机ssDNA文库，两端为固定序列，中间含39个随机碱基序列，5-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-(39N)-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3；上游引物P1为SEQIDNO1:CTTCTGCCCGCCTCCTTCC，下游引物为P2为SEQIDNO2:AGTGTCCGCCTATCTCGTCTCC，生物素标下游引物(biotin-P2)为SEQIDNO3:AGTGTCCGCCTATCTCGTCTCC。上述随机ssDNA文库和引物由上海英骏合成。目的蛋白为Orai1膜外区11个氨基酸残基的合成肽（氨基酸顺序为SEQIDNO4:DADHDYPPGLL），2xTaqMix（北京博迈德）PMD19-Tsimplevector（Takara），琼脂糖（invitrogen），凝胶回收试剂盒（OMEGA），BSA(sigma)，HRP-1abeledStreptavidin、TMB显色液、TE（PH8.0）。

实验仪器

PCR仪T100、电泳仪PAC300、凝胶成像系统GelDoc2000、紫外分光光度计SmartSpec3000均为BIO-RAD产品。

实施例1LAD2细胞的培养

细胞培养于50ml的培养瓶中，每瓶5ml完全培养基。完全培养基包含StemPro-34NutrientSupplement、100IU/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、100ng/ml重组人干细胞因子。

实施例2直接不对称PCR法制备ssDNA的优化

单链DNA文库1ul（100pmol），2×TaqMix15ul，具有比例关系的P1：P2（1:50,1:100），加去离子水至总体积为30ul。PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30sec，55-65℃退火30sec，72℃延伸30sec，30-35个循环；最后72℃延伸5min。由此得到ssDNA次级文库。

直接不对称PCR扩增条件的优化对于ssDNA次级文库的生成、筛选的成功至关重要。本发明对退火温度和非对称PCR反应的上下游引物比进行了优化。琼脂糖凝胶电泳如图1所示。通过对比发现：1)退火温度在64.3℃时目的片段较为明显且杂带及拖尾少。2)上下游引物浓度为1:50时目的条带较为明显。以上两个因素的优化已基本能够满足筛选的需要，循环次数本发明选择较为常用的35次进行。

实施例3ssDNA次级文库合成dsDNA的优化

单链DNA文库4ul（20pmol），2×TaqMix15ul，P12ul：P22ul，2×TaqMix10ul，加去离子水至总体积为20ul。PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，25-35个循环；最后72℃延伸5min。由此得到dsDNA文库。

PCR扩增dsDNA优化：通过25至35个循环次数的优化，发现25个循环时，反应体系能够生成比较明显的目的条带。能够满足后续连接反应用量。

实施例4SELEX筛选

用包被缓冲液将目的蛋白包被到微孔板中，37℃3h或4℃过夜，同时设置未包被蛋白的空白孔。拍干包被孔和空白孔，用1％BSA37℃封闭1h。取不对称PCR后的ssDNA电泳，按每轮实验参数用结合缓冲液混匀后加入到空白孔中，37℃孵育40min，反向筛选去除与BSA和微孔结合的序列，然后转移到包被孔中继续孵育，孵育时间根据实验参数减少。弃去结合缓冲液，用冲洗缓冲液冲洗包被孔，冲洗次数根据实验参数增加。甩干后加入洗脱缓冲液80℃作用10min。向洗脱液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液进行抽提，氯仿/异戊醇再抽提，经乙醇沉淀后，TE缓冲液重溶获得筛选产物。用于下一轮筛选及亲和实验使用。

为了能够进行有效的筛选，并增加实验的严谨性，在筛选过程中，对每一轮所需的目的蛋白浓度量、ssDNA文库量、孵育时间、冲洗次数进行了设定(表1)。在开始的3轮筛选中，选用高浓度的靶蛋白和ssDNA文库，较长的孵育的时间，较少的冲洗次数以尽可能地把初始文库中与靶物质结合的寡核苷酸筛选出来；在随后的筛选中，通过叠加式降低两者的浓度增加筛选压力，提高筛选的效率，以便于从大容量的寡核苷酸库中获得与靶物质高亲和性结合的适配子。

表1selex筛选过程中各轮参数设定

实施例5筛选轮数的确定

为了确定筛选轮数，避免无效筛选，本发明将第1、3、5、7、9、11、12轮筛选获得的ssDNA，利用生物素标记的下游引物扩增ssDNA，酶联免疫法进行亲和力测定。由图2可看出，通过12轮的筛选，11轮后A值不再升高。这说明经过12轮筛选后获得的ssDNA文库与orail蛋白的亲和力基本达到平衡（如图4所示）。从电泳结果上来看，经过12轮筛选后，获得了单一的、且比初始文库更为致密的产物条带（图3）。由此可见，经过12轮的筛选足可以获得orail蛋白的ssDNA适配子库。

实施例6酶联免疫法测定亲和性

用上游引物P1和生物素标记的下游引物biotin-P2对筛选产物进行PCR扩增，电泳观察目的条带，切胶回收。

实施例7适配子的连接、转化、克隆、测序及结构分析

采用第11轮筛选产物扩增出dsDNA，切胶回收80bp条带后与pMD19-T连接，转化DH5α（购自Takara公司）感受态细胞。蓝白斑筛选后，随机挑取23个白色菌落摇菌培养，随机取其中6瓶菌落进行质粒PCR法鉴定确定片段。图5显示目的片段连接克隆成功。

测序结果

将23个克隆子送测序，分别标记为Y1-Y23.结果显示，成功筛选到7条序列。其中随机序列的一级结构如表2所示。通过序列对比发现Y1与Y14相似度为100%，Y2与Y22只有一个碱基不同，Y6与Y11也只差一个碱基。因此有六条序列，4条40个碱基，2条51个碱基。采用DNAMAN软件分析其二级结构，表明茎环和口袋结构为主要的结构形式，提示其可能是适配子与人蛋白蛋白特异性结合的基础。列举两条结构图如图6和图7。

经12轮筛选得到的ssDNA，经PCR扩增成dsDNA，琼脂糖凝胶电泳，DNA回收试剂盒纯化回收产物，将其与pMD19-T连接，转化DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选，挑取白色菌落摇菌培养，随机挑选6瓶菌液，质粒PCR法鉴定阳性克隆，随机挑取20个单克隆子菌液送上海英俊公司测序。用DNAMAN软件分析其空间结构。其中Y1与Y14结构图如图6所示；Y2的结构模拟图如图7所示；Y6的结构模拟图如图8所示；Y8的结构模拟图如图9所示；Y11的结构模拟图如图10所示；Y14的结构模拟图如图11所示；Y22的结构模拟图如图12所示。

表2适配子一级结构

实施例8适配子干预IgE介导的LAD2细胞脱颗粒模型

取3x10⁶个细胞，1000rpmX3min离心后去培养基，用3ml台式液重悬。取6个EP管，每管0.5ml细胞悬液。标记总酶组，正常释放组，Y1，Y6，Y22，色甘酸钠组，并设置色甘酸钠空白、总酶组空白、台式液空白调零组。每管加0.5ml细胞悬液，离心后吸弃200ul上清，除总酶组外其余加IgE，使其浓度为500ng/ml，重悬后放孵箱孵育2小时，总酶组离心后加500ul的Trition放孵箱。参见图13。

实施例9激光共聚焦观察核酸适配子对LAD2细胞钙离子内流的影响

将三组细胞样本（刺激组、干预组、静息组）制备好后，转移入专用培养皿中（明确培养基的量）。在每组样本观察前加入SA（100ng/ml）激活。参见图14，实验结果显示：刺激组细胞钙信号最强，刺激组和干预组细胞内钙离子浓度明显减低。

实施例10统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据用表示，2组间比较采用两样本均数t检验。P＜0.01提示差异具有显著性。P>0.05提示无明显统计学意义。实验显示，刺激组与干预组有明显统计学差异，干预组和静息组差异不明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (7)

1.抑制I型超敏反应的肥大细胞钙通道的适配子，其特征在于，该适配子的核苷酸序列如SEQIDNO5所示，该适配子的二级结构为茎环结构并且能够与orail蛋白特异性结合。

2.一种权利要求1所述的抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）构建长度为80nt的随机ssDNA文库，其中，所述随机ssDNA文库的两端为固定序列，中间含39个随机碱基序列；

2）设计针对固定序列的上下游引物，并制备ssDNA次级文库；

3）取所述ssDNA次级文库进行7-12轮的SELEX筛选得到与orail蛋白高亲和性结合的适配子-靶物质复合物；所述orail蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO4:所示；

4）将步骤3）所述的适配子-靶物质复合物与orail蛋白分离纯化即得到纯化的适配子。

3.如权利要求2所述的抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，其特征在于，步骤1）所述随机ssDNA文库两端的固定序列为5’-CTTCTGCCCGCCTCCTTCC-(39N)-GGAGACGAGATAGGCGGACACT-3’。

4.如权利要求2所述的抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的上游引物P1和下游引物P2的核苷酸序列分别如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示。

5.如权利要求2所述的抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，其特征在于，步骤2）所述制备ssDNA次级文库的方法为直接不对称PCR法，其中，所述上游引物P1和下游引物P2的比例关系为1：50或1：100。

6.如权利要求2所述的抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，其特征在于，步骤4）中将所述适配子从所述适配子-靶物质复合物中分离纯化的方法为聚苯乙烯微孔板法。

7.权利要求1所述的抑制肥大细胞钙通道的适配子在制备缓解或治疗I型超敏反应的制剂中的应用。