CN117887721A - 与gym-b特异性结合的适配体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与GYM‑B特异性结合的适配体及其应用，属于裸甲藻亚胺毒素检测技术领域，两条与GYM‑B特异性结合的适配体为G15和G15a，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明弥补了尚无与GYM‑B特异性结合的适配体的空白，提供的适配体能与GYM‑B特异性结合，检测灵敏度高、亲和力强、稳定性好，其中G15a与GYM‑B的亲和力最高，达到64nM，可以用于GYMs、GYM‑B的检测，进而有效防止接触、误食GYMs污染的水和水产品引起的中毒；提供的适配体制备成本低、免疫原性低、性质稳定、方便修饰，可以大幅降低GYMs的检测成本、简化检测过程、提高检测准确性和效率。
Description
技术领域
本发明涉及裸甲藻亚胺毒素检测技术领域，尤其是涉及与GYM-B特异性结合的适配体及其应用。
背景技术
受全球气候变化和海洋污染的影响，有害藻华已成为全球近岸海域常发的生态灾害问题。贝类通过滤食产毒藻，在体内积累高剂量的毒素，潜在威胁水产品食用安全和人体健康。按照化学结构，海洋生物毒素可分为聚醚类毒素、生物碱类毒素、多肽类毒素和环亚胺类毒素(Cyclicimines)。环亚胺毒素是近年来发现的一种新型“快速作用”的脂溶性毒素，已在多个国家海域及海产品中被发现，该家族的成员包括裸甲藻亚胺毒素(Gymnodimines，GYMs)、螺环内脂毒素(Spirolides，SPXs)、江瑶毒素(Pinatoxins，PnTXs)等。
其中GYMs是环亚胺毒素家族中发现最早、分子量最小、可通过阻断乙酰胆碱受体产生神经毒性的一类“快速作用毒素”，毒性很强，小鼠腹腔注射GYM后15min内即会死亡，LD50最高为80μg/kgb.w.，还有研究表明，GYMs可通过食物链、气溶胶、皮肤接触的方式进入生物体，对人类健康和水产养殖造成巨大危害。欧盟规定水产品中GYM的最高含量为200μg/kg。因此，亟需建立一种准确、灵敏的GYM检测方法，以便更好地监控水体和水产品中GYM的水平，进而保障消费者和水生生物的安全。
目前，常用的海洋生物毒素检测方法主要有生物分析法、化学分析法和免疫分析法。小鼠生物法(MBA)是检测GYM最传统的生物分析方法。然而，该方法不仅成本高、特异度低、重现性差，而且还存在伦理道德问题。化学分析法，如高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱质谱联用(LC-MS)等也逐渐完善，其中液相色谱质谱联用技术已经被欧盟确定为首要的检测方法。然而，该方法需要进行复杂的样品前处理过程，相关仪器设备昂贵，对操作人员有较高的技术要求。因此，亟需建立一种快速、灵敏的新型检测方法。
近年来，生物传感器检测法因能克服传统检测方法的众多缺点而备受研究者们的关注。生物传感器的核心部件是分子识别元件，抗体是一种发展完善且备受关注的分子识别元件，但是，抗体不仅价格昂贵，容易变性，还会出现批次间的差异。因此，需要寻找一种新的分子识别元件。
核酸适配体是一种新型的分子识别元件，被称为“化学抗体”。它是一种能与靶标特异性结合的单链寡核苷酸，通过指数富集的配体系统进化(Systematicevolutionofligands by exponential enrichment，SELEX)技术筛选，有特异性好、稳定性高、易于合成、便于修饰和免疫原性低等优点。作为一种新型分子识别元件，适配体与抗体相似，但优于抗体。例如，适配体能够识别多种靶标，如蛋白质、氨基酸以及金属离子等，甚至细胞和病毒；适配体能够与多种基团连接，修饰方便；适配体化学性质稳定，不容易变性；适配体可以直接化学合成，成本低廉。
目前，GYMs中结构被阐明的有GYM-A、12-Me GYM-A、GYM-B、12-Me GYM-B、GYM-C、GYM-D、16-desMe GYM-D和GYM-E，它们具有螺环和亚胺结构，其中亚胺结构具有生物活性。阐明结构的GYMs中GYM-A和GYM-B的毒性最强，但目前尚没有GYM-B适配体的报道。常规的适配体筛选采用固定靶标的策略，然而GYM-B是脂溶性分子，不带电荷、分子量小、化学基团数量有限，缺少固定所需基团，难以固定，筛选其适配体具有一定挑战性。
发明内容
本发明的目的是提供与GYM-B特异性结合的适配体及其应用，以提供一种用于GYM检测、成本低、稳定性好的适配体，以使采用生物传感器检测法检测GYM成为可能，大幅提高GYM检测的灵敏性、准确性，降低检测成本，以为更好地保护消费者生命安全贡献力量。
为实现上述目的，本发明提供两条与GYM-B特异性结合的适配体，所述适配体为G15和G15a，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
如上所述的两条适配体在制备GYM-B检测试剂、试剂盒和传感器中的应用，所述适配体可以为未经过修饰的适配体还可以为经过修饰的适配体。
优选的，所述修饰包括于适配体3′端、5′端或中间序列进行生物素、FITC、巯基、荧光集团修饰。
如上所述的两条适配体在制备GYMs检测试剂、分离富集试剂、检测/分离富集试剂盒和传感器中的应用，所述适配体可以为未经过修饰的适配体还可以为经过修饰的适配体。
如上所述的两条适配体在水体、水产品中GYMs、GYM-B检测、分离富集中的应用。
因此，本发明提供的与GYM-B特异性结合的适配体及其应用，具有如下
有益效果：
(1)本发明弥补了尚无与GYM-B特异性结合的适配体的空白，提供的适配体能与GYM-B特异性结合，检测灵敏度高、亲和力强、稳定性好，其中G15a与GYM-B的亲和力最高，达到64nM，可以用于GYMs、GYM-B的检测，进而有效防止接触、误食GYMs污染的水和水产品引起的中毒；
(2)本发明提供的适配体制备成本低、免疫原性低、性质稳定、方便修饰，可以大幅降低GYMs的检测成本、简化检测过程、提高检测准确性和效率。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例二中筛选GYM-B的适配体的流程图；
图2是本发明实施例二中适配体G15(A部分)和G15a(B部分)的二级结构预测图；
图3是本发明实施例四中适配体G15a与不同毒素相互作用测试结果。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例中所用的仪器设备、试剂材料均通过商业途径获得。
实施例一
构建ssDNA文库：
文库由69个碱基组成，两端分别为含有20和22个碱基的固定区域，中间为含有30个碱基的随机区域，如序列SEQ ID NO.3所示，其中N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一种，30代表随机碱基的数量。
实施例二
筛选GYM-B的适配体，采用磁珠法进行筛选，具体步骤如下：
S2.1、文库杂交孵育：每一轮筛选中，将各级文库和捕获序列(序列如SEQ ID NO.4所示)以1:3进行混匀。随后对混匀的混合物进行变复性处理，处理条件为：95℃加热10min，以每秒0.1℃的速率缓慢降温至60℃，保持1min，然后以每秒0.1℃的速率缓慢降温至25℃，25℃保持20min。整个变复性过程在PCR仪上通过设定降温程序进行，最终得到文库和捕获序列形成的杂交体。
第一轮取3nmol ssDNA文库，第二轮到第五轮文库量为200pmol，第六轮到第十轮文库量为100pmol。
S2.2、SA磁珠与文库偶联：将变复性好的文库加入无水乙醇洗好的SA磁珠中，在四维旋转混合器上室温孵育过夜。磁性分离后，用1000μL筛选缓冲液清洗磁珠1次，磁性分离2min。
将偶联好的磁珠与200pmol的GYM-AB混合至体积为1000μL的筛选缓冲液中，于四维旋转仪上室温孵育2h，记为实验组。同时设置对照组，对照组中不添加GYM-A，其它条件与实验组相同。孵育好后，磁性分离，用核酸定量荧光计Qubit定量分析实验组和对照组中洗脱的ssDNA，计算回收率，监测筛选的进程。每轮GYM-A的投入量均为200pmol。
S2.3、扩增：以步骤S2.2实验组中洗脱的ssDNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)为：模板2.5μL；PCRmix(2×)25μL；上游引物(10μM)2.5μL；下游引物A(10μM)2.5μL；无酶水17.5μL。PCR扩增程序为：98℃，5min；95℃，30s、57℃，40s、72℃，30s，共26个循环；72℃，5min。
上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物A序列如SEQ ID NO.6所示。
为了提高筛选的效率，从第六轮开始进行反向筛选。与正向筛选的不同之处在于：在用GYM-B磁珠与ssDNA文库进行孵育以前，先将ssDNA文库与阴性磁珠在室温下旋转孵育，孵育结束以后，用磁力架分离溶液中的ssDNA和结合在空白磁珠上的ssDNA，回收得到的溶液中的ssDNA即为正向筛选的ssDNA文库。筛选方案见表1。
表1
S2.4、电泳胶回收：步骤S2.3中PCR扩增得到的DNA是dsDNA，而适配体则是ssDNA。为了获得ssDNA次级文库，特意设计了含有20个鸟嘌呤的下游引物A(序列如SEQ ID NO.6所示)，使PCR后的两条链相差20个碱基，然后通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对两条链进行分离，再对目标链进行切胶回收。
将回收的凝胶离心破碎后，加入1mL的缓冲液，并在50℃水浴锅中孵育20min(重复2次)。孵育结束后，对样品进行离心(12000rpm，5min)，收集上清。采用凝胶提取试剂盒对回收得到的ssDNA进行纯化。纯化完成后，用核酸定量荧光计Qubit进行定量分析，至此，次级文库制备完毕。
S2.5、克隆测序与分析：当筛选到第12轮的时候，ssDNA的回收率不再上升，预示达到了筛选终点。于是，利用上游引物(序列如SEQ ID NO.5所示)和下游引物B(序列如SEQ IDNO.7所示)对第12轮洗脱下来的ssDNA进行PCR扩增，并用核酸回收试剂盒对经聚丙烯酰胺凝胶电泳回收的dsDNA进行纯化以后，委托上海生工生物工程股份有限公司进行克隆测序，总共测得了50条序列。
在用Clustal X 2.1软件对所有序列进行比对分析以后，从中挑选了8条测序结果频率最高的、具有代表性的序列进行亲和力测定(生物膜干涉技术)，其中G15亲和力最高，用于进行后续优化，G15的序列如SEQ ID NO.1所示，其中划线部分为非引物区，没有划线的部分为引物区。
实施例三
适配体G15的优化，具体步骤如下：
适配体G15与GYM-B之间亲和力常数(KD)为0.43μM。为了得到适配体G15的核心结构并对该适配体加以优化，根据在线工具the mfold web server对G15二级结构的预测，对该适配体进行了截短处理。图2为在线工具the mfold web server对适配体G15截短产物的二级结构预测图。
将适配体G15两端引物区域截短以后(命名为G15a，序列如SEQ ID NO.2所示，其中划线部分为非引物区)，二级结构的自由能一定程度升高，结构稳定性有所下降，但是生物膜干涉分析结果显示该适配体(G15a)依然能够与GYM-B结合，且KD值变化不大，为0.46μM。因此，可以推断适配体G15引物区域不参与GYM-B之间的结合，对适配体结构稳定性有支撑作用，适配体G15a中的茎环结构在结合时具有重要意义，极有可能为其核心结构。
实施例四
利用生物膜干涉技术分析分子间的相互作用，步骤如下：
生物膜干涉技术是一种免标记的技术，可以提供实时、高通量的生物分子相互作用信息。生物膜干涉技术的基本原理是仪器发射白光到传感器表面，同时收集光学膜层两个表面的反射光。因为不同频率的反射光受到光学膜层厚度和质量密度的影响有差异，一些频率的反射光形成了相长干涉(蓝色)，另一些则形成了相消干涉(红色)。光谱仪检测到这些干涉光后形成了干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度(Δλ)显示。
因此，当结合到传感器表面的分子在数量上发生变化的时候，这种干涉光谱的位移就会被光谱仪检测到。而这种位移能够直接地反映出传感器表面生物膜厚度和质量密度的变化，从而对待测分子间的相互作用过程进行精确的定量测定。作为一种新型的免标记技术，生物膜干涉技术已经在生物分子间的相互作用研究中占据着重要地位。
将核酸适配体的5′端用生物素进行修饰，通过生物素和链霉亲合素相互作用将适配体固定在超级链霉亲和素(SSA)传感器表面。固定前，首先要对适配体进行变复性处理(95℃水浴10min，冰浴骤冷5min，室温放置10min)，以帮助适配体重新折叠成稳定的空间结构。
在用生物膜干涉仪OctetRED 96进行检测前，依次将缓冲液、生物素标记的适配体溶液、缓冲液以及GYM-B溶液加入96孔板的不同列中，加样体积为200μL。Octet RED 96系统的程序设定为：传感器平衡；适配体耦合；传感器再平衡；GYM-B结合；GYM-B解离。所有的步骤均在室温下完成。
检测完成后，利用Octet数据分析软件CFR Part 11Version 6.x，将实验组传感器的响应值中扣除对照组传感器的响应值，得到校正后的实际响应值。通过对响应数据进行拟合，可以计算出亲和常数KD值。
利用上述方法，对适配体G15a和GYM-A、GYM-B、PnTX、OA、STX、DTX、PTX之间，以及随机序列(Random sequence)和GYM-B之间的相互作用的特异性进行测试，结果如图3所示。G15a能够和GYM-B特异性结合(响应值为0.35±0.02nm)，显著高于其他毒素产生的响应值，因此，G15和G15a在GYM-B检测方面具有巨大的实际应用价值。
因此，本发明弥补了尚无与GYM-B特异性结合的适配体的空白，提供的适配体能与GYM-B特异性结合，检测灵敏度高、亲和力强、稳定性好，其中G15a与GYM-B的亲和力最高，达到64nM，可以用于GYMs、GYM-B的检测，进而有效防止接触、误食GYMs污染的水和水产品引起的中毒；提供的适配体制备成本低、免疫原性低、性质稳定、方便修饰，可以大幅降低GYMs的检测成本、简化检测过程、提高检测准确性和效率。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.两条与GYM-B特异性结合的适配体，其特征在于：所述适配体为G15和G15a，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的两条适配体在制备GYM-B检测试剂、试剂盒和传感器中的应用，其特征在于：所述适配体可以为未经过修饰的适配体还可以为经过修饰的适配体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述修饰包括于适配体3′端、5′端或中间序列进行生物素、FITC、巯基、荧光集团修饰。
4.如权利要求1所述的两条适配体在制备GYMs检测试剂、分离富集试剂、检测/分离富集试剂盒和传感器中的应用，其特征在于：所述适配体可以为未经过修饰的适配体还可以为经过修饰的适配体。
5.如权利要求1所述的两条适配体在水体、水产品中GYMs、GYM-B检测、分离富集中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| XIAOJUAN ZHANG 等: "Selection, Characterization, and Optimization ofDNA Aptamers against Challenging Marine BiotoxinGymnodimine-A for Biosensing Application", TOXINS, vol. 14, no. 3, 5 March 2022 (2022-03-05), pages 195 * |
| 张小娟: "裸甲藻亚胺毒素A核酸适配体的筛选、结合机制及初步应用", 中国博士学位论文全文数据库工程科技I辑, 15 February 2023 (2023-02-15), pages 027 - 309 * |
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