CN105675878A - 可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法 - Google Patents
可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105675878A CN105675878A CN201410741955.2A CN201410741955A CN105675878A CN 105675878 A CN105675878 A CN 105675878A CN 201410741955 A CN201410741955 A CN 201410741955A CN 105675878 A CN105675878 A CN 105675878A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kit
- seq
- polypeptides
- polypeptide
- subject
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001529459 Enterovirus A71 Species 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 136
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 131
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 131
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 46
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 22
- 208000020061 Hand, Foot and Mouth Disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000025713 Hand-foot-and-mouth disease Diseases 0.000 claims description 8
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 6
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 25
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 9
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001207270 Human enterovirus Species 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- -1 carboxyl-protected amino Chemical group 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 3
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 108010025899 gelatin film Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 description 1
- WGLQHUKCXBXUDV-UHFFFAOYSA-N 3-aminophthalic acid Chemical compound NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1C(O)=O WGLQHUKCXBXUDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001429382 Coxsackievirus A16 Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 206010014612 Encephalitis viral Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 201000006219 Herpangina Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010037394 Pulmonary haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000002862 amidating effect Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- UQEAIHBTYFGYIE-UHFFFAOYSA-N hexamethyldisiloxane Polymers C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C UQEAIHBTYFGYIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001451 organic peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 201000002498 viral encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法，试剂盒包括一个或多个固体载体，所述固体载体包括彼此分离的I区和II区；所述I区包括独立地连接于所述固体载体上的多肽集合I，所述多肽集合1包含独立的下述多肽：SEQ？ID？NO：1所示的多肽；和SEQ？ID？NO：2所示的多肽；所述II区包括独立地连接于所述固体载体上的多肽集合II，所述多肽集合II包含独立的SEQ？ID？NO：1所示的多肽。本发明用于检测人血清中肠道病毒71型抗体(IgM和IgG)具有良好的准确率，灵敏度和特异性，适用于肠道病毒71型的病原学实验室辅助诊断，且操作简单，适合各级医疗和疾控部门使用。
Description
技术领域
本发明主要涉及诊断试剂盒及诊断方法。具体而言，本发明涉及可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法。
背景技术
肠道病毒EV71型感染是由人肠道病毒71型(EV71)引起的疾病的总称，临床上主要表现为手足口病，手足口病多在婴幼儿中爆发流行，部分EV71感染患儿表现为疱疹性咽峡炎，重症患者出现病毒性脑炎、病毒性脑脊髓膜炎、肺水肿、肺出血等。引起手足口病的病原，最常见的是柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型；由肠道病毒71型感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高，重症病例病死率可达10％-25％，因此病原学诊断意义重大。
肠道病毒71型(EV71)基因组为含有大约7.5Kb的单股正链RNA，包括5'端非编码区、3'端非编码区和由Pl，P2，P3所组成的多蛋白，共编码11种蛋白，其中4个结构蛋白VPl,VP2,VP3,VP4,7个非结构蛋白2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D。其中VP1,VP2,VP3暴露于病毒外壳的表面，为EV71主要的抗原变异位置；VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部的RNA结合，其功能类似病毒外壳的锚，用以稳定病毒蛋白的结构。非结构蛋白2A为分裂初期先驱蛋白质，也与终止宿主细胞合成其本身所需蛋白有关；3C则参与大部分的蛋白裂解反应；3D为RNA聚合酶，在病毒RNA复制时主导转录及复制反应；2B,2C,3A,3B等四种蛋白则与病毒RNA的复制有关。
肠道病毒EV71的临床诊断主要依据三个方面:一是临床表现，二是血清学证据，三是病原学证据。由于肠道病毒EV71型感染临床表现多，因此肠道病毒EV71的血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。EV71感染产生免疫保护，感染后可检出IgM和IgG抗体。
肠道病毒71型抗体(IgM)的检测已有相关文献报道，基本上是以肠道病毒71型的病毒培养物作为包被抗原的间接ELISA，试剂盒在特异性、灵敏度和稳定性方面尚存诸多不足之处；并且，由于病毒培养成本高，效率低，无法大量供应市场。中国发明专利CN102243232A，公开日2011年11月16公开了一种肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒(酶联免疫法)，技术方案是首先将血清加入到微孔板中，其中的IgM抗体被预包被在微孔板上的抗μ链捕获，然后，加入酶标记物，被捕获的IgM中的EV71-IgM会与HRP标记的EV71重组抗原特异性结合，洗涤后，HRP会和后续加入的底物反应，最终达到检测EV71-IgM抗体的目的，但是这种方法所需(如血清的体积)大、消耗的试剂等耗材量也大，且该方法仅限用于IgM检测，对检测病人体内IgG则不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供新的可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法。
本发明人令人惊奇地发现，当以SEQIDNO：1所示的多肽和SEQIDNO：2所示的多肽对受试者来源的血液样本中的IgM有响应、和/或SEQIDNO：1所示的多肽对受试者来源的血液样本中的IgG有响应作为判定受试者是否已被人肠道病毒71型感染的指标的情况下，可以以90％以上的灵敏度诊断人肠道病毒71型感染，这是目前我们知道的任何仅使用2个以下的诊断分子的诊断试剂盒均未达到的高灵敏度。
因此，本发明包括：
1.一种诊断试剂盒，其包括一个或多个固体载体，所述固体载体包括彼此分离的I区和II区；
所述I区包括独立地连接于所述固体载体上的多肽集合I，所述多肽集合1包含独立的下述多肽：
SEQIDNO：1所示的多肽；和
SEQIDNO：2所示的多肽；
所述II区包括独立地连接于所述固体载体上的多肽集合II，所述多肽集合II包含独立的SEQIDNO：1所示的多肽。
2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合I中的全部多肽独立地连接于同一固体载体上。
3.根据项1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合II中的全部多肽独立地连接于同一固体载体上。
4.根据项1所述的试剂盒，其中，所述I区和II区位于不同固体载体上。
5.根据项1所述的试剂盒，其用于诊断人肠道病毒71型感染。
6.根据项1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合I还包含独立的下述多肽：
SEQIDNO：3所示的多肽。
7.根据项1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合II还包含独立的下述多肽：
SEQIDNO：3所示的多肽；和/或
SEQIDNO：4所示的多肽；和/或
SEQIDNO：5所示的多肽。
8.一种诊断受试者是否为人肠道病毒71型感染的方法，该方法包括：
使用项1～7中任一项所述的试剂盒检测所述多肽集合I中的多肽对受试者来源的血液样本中的IgM是否有响应、以及所述多肽集合II中的多肽对受试者来源的血液样本中的IgG是否有响应；
当检测到所述多肽集合I中的任一个或一个以上多肽对受试者来源的血液样本中的IgM有响应、和/或所述多肽集合II中的任一个或一个以上多肽对受试者来源的血液样本中的IgG有响应时，判定该受试者为人肠道病毒71型感染。
9.根据项8所述的方法，其中，所述血液样本为全血、血浆或血清。
10.根据项8所述的方法，其中，所述受试者为具有手足口病临床症状的受试者。
发明的具体实施方式
多肽集合
本说明书中，多肽集合I是指位于I区的全部多肽，该多肽集合I包含SEQIDNO：1所示的多肽和/或SEQIDNO：2所示的多肽。在优选的实施方案中，该多肽集合I还可以包含SEQIDNO：3所示的多肽。
本说明书中，多肽集合II是指位于II区的全部多肽，该多肽集合II包含SEQIDNO：1所示的多肽。在优选的实施方案中，该多肽集合II还可以包含SEQIDNO：3所示的多肽；和/或SEQIDNO：4所示的多肽；和/或SEQIDNO：5所示的多肽。
其中，SEQIDNO：1所示的多肽序列为APTGQNTQVSSHRLDTGKVP；
SEQIDNO：2所示的多肽序列SHRLDTGKVPALQAAEIGAS；
SEQIDNO：3所示的多肽序列为DKFANPVKDIFTEMAAPLKS；
SEQIDNO：4所示的多肽序列为AAAQKNFTMKLCKDASDILQ；
SEQIDNO：5所示的多肽序列为LDLPYSTYVKDELRSIDKIK。
所述多肽可以适宜采用(1)化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。
此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子WO2004/011653号所述的方法。即，可以这样来生产：将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出：具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
特别是多肽的化学合成已经实现了商业化，可以通过委托专业的多肽合成公司来合成所述多肽。
试剂盒
本发明提供一种诊断试剂盒(本发明的试剂盒)，其包括一个或多个固体载体，所述固体载体包括彼此分离的I区和II区；
所述I区包括连接于所述固体载体上的多肽集合I，所述多肽集合I包含独立的SEQIDNO：1所示的多肽和SEQIDNO：2所示的多肽；在优选的实施方案中，该多肽集合I还可以包含SEQIDNO：3所示的多肽。
所述II区包括独立地连接于所述固体载体上的多肽集合II，所述多肽集合II包含独立的SEQIDNO：1所示的多肽。在优选的实施方案中，该多肽集合II还可以包含SEQIDNO：3所示的多肽；和/或SEQIDNO：4所示的多肽；和/或SEQIDNO：5所示的多肽。
令人惊奇的是，本发明的试剂盒能够以92％以上的灵敏度诊断人肠道病毒71型感染。特别是，在本发明的试剂盒包含上述全部多肽的情况下，本发明的试剂盒能够以高98％以上的灵敏度诊断人肠道病毒71型感染。本说明书中，灵敏度是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。假阳性率是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。本技术领域检测人肠道病毒71型感染的“金标准”方法是核酸检测法、即PCR法。本说明书中，“诊断”可以是确诊，也可以是为确诊提供参考信息。
在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料(例如是可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。
构成固体载体的材料包括但不限于：硅胶(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纤维素、特氟隆TM、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组合等。
固体载体的形状包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
磁珠可以具有约25nm～约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中，磁珠具有约50nm～约10μm范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24μm～约165μm范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24μm～约44μm范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA或Spherotech，Liberville，IL购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
二氧化硅(SiO2)-处理或二氧化硅(SiO2)基的固体载体的例子包括可从Polysciences，Warrington，PA购买的超常磁性二氧化硅珠等，其可以用于捕捉核酸(例如DNA)。或者，还可以使用可从DynalBiotech购买的M-280等。
具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子，可以列举出Polysciences，Warrington，PA销售的珠子(名称：Biomag(注册商标)羧基)、或者BangsLaboratory，Inc.，Fishers，IN的名称为MC02N/2928的珠子。或者，可以使用DynalBiotech销售的M-270等。
在一个优选实施方式中，所述固体载体是SJ改性硅胶，其是苏州偲聚生物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(iPDMS薄膜，参见中国专利CN101265329A)。这种材料是以生物学研究常用的PDMS为基础，在其中加入特定的引发剂成分(使该材料可通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面功能化修饰)，再经过聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(oligo(ethyleneglycol)methacrylate),pOEGMA)表面修饰获得的。SJ改性硅胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(Nonspecificproteinadsorption，NPA)能力，可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对0”水平(接近或低于仪器的检测极限)，不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦，还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。苏州偲聚公司已经成功地将SJ改性硅胶应用于11个肿瘤标志物组成的多指标联检微阵列ELISA试剂盒，实现了高通量和高灵敏的检测，证明了这种材料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时，这种材料还具有表面性质可调的特性，可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。
多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。例如，对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言，可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethylami-nopropyl)carbodiimide,EDC]和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)的反应将改性硅胶表面高分子链上的羧基(-COOH)基团改为活化基团，该活化基团可与蛋白/多肽上所带的氨基(-NH2)反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面。
对于点样时使用的点样液中多肽的浓度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1μg～1000μg/mL，更优选10μg～500μg/mL。此外，对于多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1～100点/10mm2，更优选5～50点/10mm2。
在本说明书中，“独立的”是指：该多肽在所述固体载体上形成一个点，该点中不包含对检测有影响的量的其他多肽，优选仅包含该多肽。
本发明的试剂盒中的固体载体可以是一个，也可以是多个，优选为两个以上。
在本说明书中，“彼此分离”是指所述I区和II区在物理上彼此分开，使得能够在用血液样品对它们进行处理后，分别对它们施用不同的酶标二抗而不互相干扰，例如像实施例所示的那样。使所述I区和II区“彼此分离”的方式是本领域技术人员的常规选择，例如可以列举出：将所述I区和II区设置在同一固体载体上，并在所述I区和II区之间设置挡板等，使得液体不能相互流通；将所述I区和II区设置在不同固体载体上。
本发明的试剂盒中可以满足以下条件中的任意一项、任意两项或全部：
(1)所述多肽集合I中的全部多肽独立地连接于同一固体载体上；
(2)所述多肽集合II中的全部多肽独立地连接于同一固体载体上；和/或
(3)所述I区和II区位于不同固体载体上。
该试剂盒还可以包括：
1.配好的血清稀释液或血清稀释液组分溶液：血清稀释液，例如有北京赛驰生物科技有限公司的样本稀释液(产品编号070021-S2)、郑州博威嘉生物科技有限公司的加样变色样本稀释液(产品编号bwj010103)等。该血清稀释液用来稀释血清，试剂盒检测的血清要稀释适当倍数，例如2～200倍，优选10～100倍。
该试剂盒还可以包括：
2.浓缩洗液：固体载体表面孵育血清及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是1％的吐温20水溶液，使用时需稀释2～40倍、优选5～20倍。
该试剂盒还可以包括：
3.酶标二抗溶液：人肠道病毒71型感染者血清中的IgM与固体载体(例如SJ改性硅胶)上的多肽集合I中的多肽结合，人肠道病毒71型感染者血清中的IgG与固体载体(例如SJ改性硅胶)上的多肽集合II中的多肽结合，酶标二抗可与IgM或IgG结合，而酶标二抗上的标记物可与发光底物液反应，从而发出可检测的光。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM或辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制，可以是例如1ng～1000ng/mL。
该试剂盒还可以包括：
4.发光底物液组分溶液：发光底物液可与酶标二抗上标记的辣根过氧化物酶反应，使得反应发出仪器可检测到的化学光。发光底物液由两种溶液混合而成，分别是A液—过氧化氢溶液，及B液—发光氨溶液。发光氨(鲁米诺)只有用氧化剂处理过才会发光。通常使用双氧水和一种氢氧化物碱的混合水溶液作为激发剂。在辣根过氧化物酶催化下，双氧水分解为氧气和水：
2H2O2→O2+2H2O
鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。发光液组分溶液的例子例如ThermoSeientific公司的ELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate，货号37074。
该试剂盒还可以包括：
5.一个或两个以上的反应腔体。
例如可以是一个或者两个以上的生物孵育反应器，根据需求可以采用例如双面的生物孵育反应器，中国专利ZL201120177686.3或者ZL201110142518.5；或者单面的生物孵育反应器ZL201220430886.x。
该试剂盒还可以包括：
6.其他用于检测人肠道病毒71型感染的检测分子(例如多肽、蛋白质、核酸等)。
该试剂盒还可以包括：
7.使用说明书。
该试剂盒还可以包括：
8.连接于所述一个或多个固体载体、或其他独立的固体载体上的阳性质控点(对于I区，可采用例如是人IgM作为阳性质控点；对于II区，可采用例如是人IgG作为阳性质控点)和/或阴性质控点(例如磷酸缓冲液，简称PB)。
诊断方法
在另一个方面中，本发明提供一种诊断受试者是否为人肠道病毒71型感染的方法(本发明的诊断方法)，该方法包括：
使用上述本发明的试剂盒检测所述多肽集合I中的多肽对受试者来源的血液样本中的IgM是否有响应、以及所述多肽集合II中的多肽对受试者来源的血液样本中的IgG是否有响应；
当检测到所述多肽集合I中的多肽中的任一个或一个以上对受试者来源的血液样本中的IgM有响应、或者所述多肽集合II中的多肽中的任一个或一个以上对受试者来源的血液样本中的IgG有响应时(判据1)，判定该受试者为人肠道病毒71型感染。
在本说明书中，“响应”是指：信噪比(SNR)大于或等于2，其中，信噪比＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。
本说明书中，对本发明的试剂盒的阳性反应是指：受试者来源的血液样本满足上述判据1；否则为阴性反应。
所述血液样本可以为全血、血浆或血清。
在一个优选的实施方式中，所述受试者可以为具有手足口病临床症状的受试者。在本发明中，手足口病临床症状具体表现为发热和手、足、口腔等部位有皮疹或疱疹。
实施例
1.多肽的制备与确认
实施例中使用的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
SEQIDNO：1(APTGQNTQVSSHRLDTGKVP)，分子量为2093。
SEQIDNO：2(SHRLDTGKVPALQAAEIGAS)，分子量为2020。
SEQIDNO：3(DKFANPVKDIFTEMAAPLKS)，分子量为2222。
SEQIDNO：4(AAAQKNFTMKLCKDASDILQ)，分子量为2196。
SEQIDNO：5(LDLPYSTYVKDELRSIDKIK)，分子量为2397。
2.试剂盒的制备
检测芯片是以SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)为固体支撑材料，在其上通过点样固定多肽溶液制备而成。SJ改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂，并通过热交联(硅氢键键合)固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到一种新的材料即SJ改性硅胶。其制作过程参见国际专利公开WO2014/044184。
制好的SJ改性硅胶薄膜可保存在4℃冰箱中。
采用晶芯PersonalArrayerTM16个人点样仪在改性硅胶上制备多肽微阵列(即检测芯片)，过程为：
1)预处理
将SJ改性硅胶薄片(15×15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去离子水淋洗3次，用氮气吹干，马上用于点样。
2)点样
将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中，将带样本的384孔板置于点样仪基台上，同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上，马上进行点样。点样环境条件为室温(25℃)，湿度设定为50％。将下述多肽在SJ改性硅胶薄片上点成微阵列，在I区，多肽集合I中每个多肽点样一个点，另外点样一个人IgM点作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点，在II区，多肽集合II中每个多肽点样一个点，另外点样一个人-IgG点作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0.6nL，样点半径为200μm。所述I区和II区分别位于两块SJ改性硅胶薄片上。
这里，各试剂盒的改性硅胶薄片上点样的多肽具体如下：
试剂盒1：I区的多肽集合I为独立的SEQIDNO：1所示的多肽和SEQIDNO：2所示的多肽；II区的多肽集合II为独立的SEQIDNO：1所示的多肽。
试剂盒2：I区的多肽集合I为独立的SEQIDNO：1所示的多肽、SEQIDNO：2所示的多肽和SEQIDNO：3所示的多肽；II区的多肽集合II为独立的SEQIDNO：1所示的多肽、SEQIDNO：3所示的多肽、SEQIDNO：4所示的多肽和SEQIDNO：5所示的多肽。
3)化学固定
刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱(26℃,60％湿度)中固定至少6h。化学固定过程参见国际专利公开WO2014/044184。
首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上，接着缓冲液开始蒸发，捕获多肽分子与SJ改性硅胶表面亲密接触并相互作用，通过化学结合，改性硅胶表面的ploy(OEGMA)高分子的末端-COOH与多肽分子的-—NH2形成稳定共价键，进而将有化学活性的多肽分子固定在SJ改性硅胶表面。
4)装配
固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将SJ改性硅胶薄片贴在专门的反应柱上，盖上反应腔体。生物孵育反应器可以根据需求采用双面生物孵育反应器，即，一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成，或者单面生物孵育反应器，即，一个反应器由一个反应柱和一个反应腔体组成。
5)保存
装配好的多肽微阵列，需要抽真空密封，保存在4℃的冰箱中，备用。
3.用试剂盒进行检测
检验步骤
I区检测步骤(IgM检测芯片)：
1)平衡试剂温度：将所有试剂平衡至室温。
2)洗液的配制：将浓缩洗液用纯化水或蒸馏水按1:9稀释，例如：450mL纯化水或蒸馏水中加入50mL浓缩洗液，充分混匀。未使用完的洗液放在2～8℃保存,可保存3个月。
3)样品的稀释：将待测样品用血清稀释液按1:100稀释(如：2μL血清加入到198μL血清稀释液，充分混匀)。一次样品检测需要稀释后的样品200μL。
4)润湿芯片：取出检测所需的生物芯片孵育反应器。加入1mL洗液，浸润芯片表面3分钟。弃去浸泡芯片的洗液。
5)加样：在本实施例中，以单面生物孵育反应器加样，使用移液枪将稀释好的待测样品通过加液通气孔(两个中任意一个)加入单面生物孵育反应器中，每个单面生物孵育反应器加200μL，用密封贴封闭加液通气孔(两个)。
6)样品孵育：将加完样的单面生物孵育反应器置于水平摇床上150rpm，室温孵育30分钟。
7)清洗：将反应柱从单面生物孵育反应器的反应腔体中取出，弃去反应器内液体，反复冲洗反应柱顶部芯片表面和反应腔体内部3次(每次约用12mL洗液，冲洗1-2分钟)。
8)酶标抗体孵育：将反应柱与反应腔体重新组合，卡紧。揭去密封贴，每个单面生物孵育反应器加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM溶液200μL。重新用密封贴封闭加液通气孔。置于摇床上150rpm，室温孵育30分钟。
9)再清洗：弃去反应腔体，用洗液仔细清洗芯片表面3次。
10)加入发光底物液：每个芯片表面分别加入30μL发光底物液，使发光液能均匀的铺于芯片表面
11)芯片成像：将加入了发光底物液的芯片用化学发光图像分析系统对芯片进行曝光1分钟成像。作为化学发光图像分析系统时，没有特殊限制，使用例如天能5500型微阵列成像仪、偲捷牌TN5500型微阵列成像仪或偲捷牌CLEAR4000型微阵列成像仪等均可。
II区检测步骤(IgG检测芯片)：
1)平衡试剂温度：将所有试剂平衡至室温。
2)洗液的配制：将浓缩洗液用纯化水或蒸馏水按1:9稀释，例如：450mL纯化水或蒸馏水中加入50mL浓缩洗液，充分混匀。未使用完的洗液放在2～8℃保存,可保存3个月。
3)样品的稀释：将待测样品用血清稀释液按1:100稀释(如：2μL血清加入到198μL血清稀释液，充分混匀)。一次样品检测需要稀释后的样品200μL。
4)润湿芯片：取出检测所需的生物芯片孵育反应器。加入1mL洗液，浸润芯片表面3分钟。弃去浸泡芯片的洗液。
5)加样：在本实施例中，以单面生物孵育反应器加样，使用移液枪将稀释好的待测样品通过加液通气孔(两个中任意一个)加入单面生物孵育反应器中，每个单面生物孵育反应器加200μL，用密封贴封闭加液通气孔(两个)。
6)样品孵育：将加完样的生物芯片孵遇反应器置于水平摇床上150rpm，室温孵育30分钟。
7)清洗：将反应柱从单面生物孵育反应器的反应腔体中取出，弃去反应器内液体，反复冲洗反应柱顶部芯片表面和反应腔体内部3次(每次约用12mL洗液，冲洗1-2分钟)。
8)酶标抗体孵育：将反应柱与反应腔体重新组合，卡紧。揭去密封贴，每个单面生物孵育反应器加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG溶液200μL。重新用密封贴封闭加液通气孔。置于摇床上150rpm，室温孵育30分钟。
9)再清洗：弃去反应腔体，用洗液仔细清洗芯片表面3次。
10)加入发光底物液：每个芯片表面分别加入30μL发光底物液，使发光液能均匀的铺于芯片表面
11)芯片成像：将加入了发光底物液液的芯片用化学发光图像分析系统对芯片进行曝光1分钟成像。作为化学发光图像分析系统时，没有特殊限制，使用例如天能5500型微阵列成像仪、偲捷牌TN5500型微阵列成像仪或偲捷牌CLEAR4000型微阵列成像仪等均可。
结果判定：对于每一份血清，分别统计试剂盒1、2中的每一条多肽是否有响应(即，信噪比(SNR)大于等于2)，并根据上述“诊断方法”部分中所描述的判据1进行判定。即，
当检测到所述多肽集合I中的多肽中的任一个或一个以上对受试者来源的血液样本中的IgM有响应、和/或所述多肽集合II中的多肽中的任一个或一个以上对受试者来源的血液样本中的IgG有响应时(判据1)，判定该受试者为人肠道病毒71型感染。
其中，信噪比＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。多肽点信号值是指成像仪配套软件读取的多肽点的化学发光强度值，阴性对照点信号值是指成像仪配套软件读取的阴性对照点的化学发光强度值。
对收集到临床血清406份，采用本发明的试剂盒1检测结果与采用传统的金标准法-核酸检测法(采用Takara的荧光定量PCR检测试剂盒)的检测结果进行比较，结果如表1所示。上述临床血清406份的提供者均具有手足口病的临床症状。
表1本发明的试剂盒1与Takara的荧光定量PCR检测试剂盒的比较
准确率＝(280+95)/406＝92.4％
灵敏度＝280/304＝92.1％
特异性＝95/102＝93.1％
假阳性率＝7/102＝6.9％
对于收集到临床血清406份，将采用本发明的试剂盒2的检测结果与采用传统金标准法-核酸检测法(Takara的荧光定量PCR检测试剂盒)的检测结果进行比较，如表2所示。上述临床血清406份的提供者均具有手足口病的临床症状。
表2本发明的试剂盒2与Takara的荧光定量PCR检测试剂盒的比较
准确率＝(300+101)/406＝98.8％
灵敏度＝300/304＝98.7％
特异性＝101/102＝99.0％
假阳性率＝1/102＝1.0％
以上结果表明，本发明用于检测人血清中肠道病毒71型抗体(IgM和IgG)具有良好的准确率，灵敏度和特异性，适用于肠道病毒71型的病原学实验室辅助诊断，且操作简单，适合各级医疗和疾控部门使用。
以上，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。
序列表
<110>苏州偲聚生物材料有限公司
<120>可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法
<130>SJ-EV-1202-1
<160>5
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>人肠道病毒EV71型抗原性多肽
<400>1
AlaProThrGlyGlnAsnThrGlnValSerSerHisArgLeuAspThr
151015
GlyLysValPro
20
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>人肠道病毒EV71型抗原性多肽
<400>2
SerHisArgLeuAspThrGlyLysValProAlaLeuGlnAlaAlaGlu
151015
IleGlyAlaSer
20
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>人肠道病毒EV71型抗原性多肽
<400>3
AspLysPheAlaAsnProValLysAspIlePheThrGluMetAlaAla
151015
ProLeuLysSer
20
<210>4
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>人肠道病毒EV71型抗原性多肽
<400>4
AlaAlaAlaGlnLysAsnPheThrMetLysLeuCysLysAspAlaSer
151015
AspIleLeuGln
20
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>人肠道病毒EV71型抗原性多肽
<400>5
LeuAspLeuProTyrSerThrTyrValLysAspGluLeuArgSerIle
151015
AspLysIleLys
20
Claims (10)
1.一种诊断试剂盒，其包括一个或多个固体载体，所述固体载体包括彼此分离的I区和II区；
所述I区包括独立地连接于所述固体载体上的多肽集合I，所述多肽集合1包含独立的下述多肽：
SEQIDNO：1所示的多肽；和
SEQIDNO：2所示的多肽；
所述II区包括独立地连接于所述固体载体上的多肽集合II，所述多肽集合II包含独立的SEQIDNO：1所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合I中的全部多肽独立地连接于同一固体载体上。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合II中的全部多肽独立地连接于同一固体载体上。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述I区和II区位于不同固体载体上。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其用于诊断人肠道病毒71型感染。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合I还包含独立的下述多肽：
SEQIDNO：3所示的多肽。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述多肽集合II还包含独立的下述多肽：
SEQIDNO：3所示的多肽；和/或
SEQIDNO：4所示的多肽；和/或
SEQIDNO：5所示的多肽。
8.一种诊断受试者是否为人肠道病毒71型感染的方法，该方法包括：
使用权利要求1~7中任一项所述的试剂盒检测所述多肽集合I中的多肽对受试者来源的血液样本中的IgM是否有响应、以及所述多肽集合II中的多肽对受试者来源的血液样本中的IgG是否有响应；
当检测到所述多肽集合I中的任一个或一个以上多肽对受试者来源的血液样本中的IgM有响应、和/或所述多肽集合II中的任一个或一个以上多肽对受试者来源的血液样本中的IgG有响应时，判定该受试者为人肠道病毒71型感染。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述血液样本为全血、血浆或血清。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述受试者为具有手足口病临床症状的受试者。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410741955.2A CN105675878B (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410741955.2A CN105675878B (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105675878A true CN105675878A (zh) | 2016-06-15 |
| CN105675878B CN105675878B (zh) | 2017-09-29 |
Family
ID=56958274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410741955.2A Expired - Fee Related CN105675878B (zh) | 2014-12-08 | 2014-12-08 | 可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105675878B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107255713A (zh) * | 2017-03-31 | 2017-10-17 | 深圳市儿童医院 | 可用于诊断人肠道病毒感染的试剂盒 |
| CN113125720A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-07-16 | 深圳国际旅行卫生保健中心(深圳海关口岸门诊部) | 一种ev71病毒检测芯片及其制备方法和检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101891805A (zh) * | 2010-05-18 | 2010-11-24 | 北京凯悦宁科技有限公司 | 一种人肠病毒71型特异性多肽及其应用 |
| CN101936994A (zh) * | 2010-08-30 | 2011-01-05 | 山东省医学科学院基础医学研究所 | 检测手足口病患者ev71-vp1抗体在预测病情转归中的应用 |
| CN102351947A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-15 | 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 | Ev71早期诊断方法及试剂盒 |
| CN102558313A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-07-11 | 东南大学 | 肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用 |
| WO2013142809A1 (en) * | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Baculovirus-based enterovirus 71 vlp as a vaccine |
-
2014
- 2014-12-08 CN CN201410741955.2A patent/CN105675878B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101891805A (zh) * | 2010-05-18 | 2010-11-24 | 北京凯悦宁科技有限公司 | 一种人肠病毒71型特异性多肽及其应用 |
| CN101936994A (zh) * | 2010-08-30 | 2011-01-05 | 山东省医学科学院基础医学研究所 | 检测手足口病患者ev71-vp1抗体在预测病情转归中的应用 |
| CN102351947A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-02-15 | 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 | Ev71早期诊断方法及试剂盒 |
| CN102558313A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-07-11 | 东南大学 | 肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用 |
| WO2013142809A1 (en) * | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Baculovirus-based enterovirus 71 vlp as a vaccine |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107255713A (zh) * | 2017-03-31 | 2017-10-17 | 深圳市儿童医院 | 可用于诊断人肠道病毒感染的试剂盒 |
| CN113125720A (zh) * | 2021-05-07 | 2021-07-16 | 深圳国际旅行卫生保健中心(深圳海关口岸门诊部) | 一种ev71病毒检测芯片及其制备方法和检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105675878B (zh) | 2017-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105785026B (zh) | 用于检测肠道病毒71型IgM抗体的试剂盒及检测方法 | |
| CN1217194C (zh) | 蛋白芯片及其制备方法和使用方法 | |
| WO2014044184A1 (zh) | 可用于检测1型糖尿病的蛋白质及该蛋白质的部分肽 | |
| CN1313622C (zh) | 高通量细胞生物芯片检测技术及试剂盒 | |
| CN102435730B (zh) | 基于核酸地址编码的高通量检测方法及生物芯片 | |
| CN107255713B (zh) | 可用于诊断人肠道病毒感染的试剂盒 | |
| CN105675878B (zh) | 可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒及诊断方法 | |
| CN105784997B (zh) | 用于检测肠道病毒71型IgM抗体的试剂盒及检测方法 | |
| CN108663523A (zh) | 可用于诊断人肠道病毒71型感染的试剂盒 | |
| CN108663517A (zh) | 可用于诊断人肠道病毒感染的试剂盒 | |
| WO2004038413A1 (fr) | Systeme de detection de cristaux de proteine pouvant detecter simultanement plusieurs cibles | |
| CN114720700A (zh) | 检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤试剂盒的应用 | |
| CN105732772A (zh) | 多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒 | |
| CN105753943A (zh) | 可用于诊断系统性红斑狼疮的检测器件、检测试剂盒及诊断方法 | |
| CN107090024A (zh) | 可用于诊断系统性红斑狼疮的检测器件、检测试剂盒及诊断方法 | |
| CN105652009B (zh) | 可用于辅助诊断疟疾的试剂盒 | |
| CN105572379B (zh) | 可用于诊断间日疟和/或恶性疟的试剂盒 | |
| CN105628925B (zh) | 可用于诊断间日疟和/或恶性疟的试剂盒 | |
| CN104098649B (zh) | 多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒 | |
| JP3938627B2 (ja) | リジン親和性物質の測定方法 | |
| CN104098672B (zh) | 多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒 | |
| CN104098669B (zh) | 多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒 | |
| CN105732774A (zh) | 多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒 | |
| CN104945476A (zh) | 多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒 | |
| CN105732770A (zh) | 多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170929 Termination date: 20181208 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |