CN105652009B - 可用于辅助诊断疟疾的试剂盒 - Google Patents
可用于辅助诊断疟疾的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及可用于辅助诊断疟疾的试剂盒及其诊断方法。本发明的试剂盒包括一个或多个固体载体,以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的特定多肽集合。本发明的产品可用于疟疾,特别是恶性疟原虫感染的辅助检测。
Description
技术领域
本发明主要涉及试剂盒以及诊断方法。具体而言,本发明涉及用于检测疟疾感染,特别是用于检测恶性疟原虫感染的诊断试剂盒。
背景技术
疟疾仍然是全球公共卫生的紧要问题,每年死亡人数达0.7-2.7百万,其中75%以上为非洲儿童。在过去的35年,疟疾的发病率增长了2-3倍。在1955年,世界卫生组织(WHO)开始了一项通过应用氯喹进行临床治疗和应用DDT(二氯二苯三氯乙烷)控制蚊群而根除疟疾的宏大计划。在20世纪60年代后期逐步停止,这项计划虽然在全世界许多国家引起重要且持续的疾病负担减轻。然而,在许多国家疟疾仍有复发,其主要是由于耐药寄生虫的出现和传播导致的。耐杀虫剂蚊子的出现,人口密度的增加(自1963年,世界人口已经翻了一番),全球变暖(这种带菌者扩散至以前没有到达的范围),持续贫穷,政治动荡,以及由于传染性疾病导致的生产力的损失,所有的这些因素破坏了治疗和控制疟疾的稳定的公共卫生基础的维持。
疟疾寄生虫属于疟原虫属,能后感染许多脊椎动物宿主,包括多种非人类灵长类物种。四种疟原虫属寄生于人类:恶性疟原虫(Plasmodium.fal-ciparum)、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)和间日疟原虫(P.vivax)。其中,恶性疟原虫和间日疟原虫分别与大部分疟疾的发病率和死亡率相关。
由于疟疾治疗药物的特殊性,精确快速的诊断不仅能及时发现并治疗疟疾患者,大大降低病死率,也能通过早期排除疟疾,及时挽救感染了其它传染性疾病患者的生命。以此同时,精确快速的早期诊断也是对疟疾实时流行病监测和控制的必要手段。到目前为止,对可疑病人采血制作厚薄血片经染色后显微镜检查法(简称镜检法)一直被认为是疟疾诊断的“金标准”,其优点是费用低,能鉴定疟原虫虫种,但是也存在着缺陷,即需要非常专业的检验人员,当原虫密度较低时,可出现假阴性,引起误诊或漏诊,同时还需要显微镜、染色液等一些辅助设备。随着临床机构,特别是一些现代化程度高的医院,由于检验人员更依赖仪器设备,对镜检能力的掌握明显下降;而在一些欠发达地区,由于种种原因,未能配备镜检相关的设备和试剂。这些因素限制了临床对疟疾快速有效的诊断。因此,研究新的疟疾快速诊断方法成为目前研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供新的用于辅助诊断疟疾,特别是辅助诊断恶性疟疾的试剂盒。
本发明人提供了9条多肽。令人惊奇的是,本发明人发现,虽然所述9条多肽单独诊断疟疾时的检出率均在30.7%~57.5之间,远远未达到作为检测工具的要求,但在以受试者来源的生物样本是否对所述9条多肽中的至少一条或一条以上有响应作为判定受试者是否已被疟原虫感染的指标的情况下,却可以以高达97.6%的检出率(且假阳性率低至1.7%)诊断疟疾,进而诊断疟疾。
因此,本发明包括:
1.一种试剂盒,其包括一个或多个固体载体,以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽集合1:
SEQ ID NO:1所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:2所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:3所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:4所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:5所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:6所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:7所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:8所示的多肽或其变体;和
SEQ ID NO:9所示的多肽或其变体;
其中,变体是指:
(a)在亲本多肽中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得的,且具有与亲本多肽等同的功能的多肽;或
(b)与亲本多肽具有50%以上氨基酸同源性,且具有与亲本多肽等同的功能的多肽。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其用于诊断疟疾。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其用于诊断恶性疟原虫感染。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,全部多肽独立地连接于同一固体载体上。
5.下述多肽集合1在制备用于诊断疟疾的试剂盒中的用途:
多肽集合1
SEQ ID NO:1所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:2所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:3所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:4所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:5所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:6所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:7所示的多肽或其变体;
SEQ ID NO:8所示的多肽或其变体;和
SEQ ID NO:9所示的多肽或其变体;
所述变体是指:
(a)在亲本多肽中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得的,且具有与亲本多肽等同的功能的多肽;或
(b)与亲本多肽具有50%以上氨基酸同源性,且具有与亲本多肽等同的功能的多肽。
6.根据权利要求5所述的用途,其中,所述诊断疟疾为诊断恶性疟原虫感染。
7.一种诊断受试者是否为疟疾患者的方法,该方法包括:
使用权利要求1~4中任一项所述的试剂盒检测SEQ ID NO:1~8所示的多肽或其变体是否对受试者来源的血液样本有响应;其中,
当检测到分别来自下述多肽组1~9中的至少一个或一个以上多肽组中的至少任意一个或一个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时,判定受试者是疟疾患者;否则,判定受试者不是疟疾患者;
多肽组1:SEQ ID NO:1所示的多肽或其变体;
多肽组2:SEQ ID NO:2所示的多肽或其变体;
多肽组3:SEQ ID NO:3所示的多肽或其变体;
多肽组4:SEQ ID NO:4所示的多肽或其变体;
多肽组5:SEQ ID NO:5所示的多肽或其变体;
多肽组6:SEQ ID NO:6所示的多肽或其变体;
多肽组7:SEQ ID NO:7所示的多肽或其变体;
多肽组8:SEQ ID NO:8所示的多肽或其变体;和
多肽组9:SEQ ID NO:9所示的多肽或其变体;
所述变体是指:
(a)在亲本多肽中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得的,且具有与亲本多肽等同的功能的多肽;或
(b)与亲本多肽具有50%以上氨基酸同源性,且具有与亲本多肽等同的功能的多肽。
8根据权利要求7所述的方法,其中,所述血液样本为全血、血浆或血清。
9.根据权利要求1~4中任一项所述的试剂盒、根据权利要求5或6的用途、或根据权利要求7或8任一项所述的方法,其中,所述的多肽和变体来源于恶性疟原虫。
发明的具体实施方式
多肽集合和多肽组
本说明书中,多肽集合1是下述多肽组1~9的全部:
多肽组1:SEQ ID NO:1所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:1所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的谷氨酸富含蛋白的406位~435位;
多肽组2:SEQ ID NO:2所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:2所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的红细胞结合蛋白-175的1486位~1502位;
多肽组3:SEQ ID NO:3所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:3所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的成熟带虫红细胞表面蛋白的223位~252位;
多肽组4:SEQ ID NO:4所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:4所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的裂殖子成帽蛋白1的346位~375位;
多肽组5:SEQ ID NO:5所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:5所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的谷氨酸富含蛋白的601位~630位;
多肽组6:SEQ ID NO:6所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:6所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的成熟带虫红细胞表面蛋白的631位~660位;
多肽组7:SEQ ID NO:7所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:7所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的顶尖体膜抗原-1的601位~622位;
多肽组8:SEQ ID NO:8所示的多肽或其变体,其中,SEQ ID NO:8所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的细胞粘附相关无性蛋白9的91位~120位;
多肽组9:SEQ ID NO::9所示的多肽或其变体;其中,SEQ ID NO:9所示的多肽相当于恶性疟疾原虫的成熟带虫红细胞表面蛋白的496位~525位;
其中,变体是指:
(a)在亲本多肽中缺失、取代、插入和/或添加1个或多个氨基酸而得的、且具有与亲本多肽等同的功能的多肽;或
(b)与亲本多肽具有50%以上、优选60%以上、更优选70%以上、更优选80%以上、更优选90%以上、更优选95%以上、更优选97%以上、更优选98%以上、更优选99%以上的氨基酸同源性,且具有与亲本多肽等同的功能的多肽。
优选地,所述变体多肽来源于恶性疟原虫。
本说明书中,亲本多肽相对于变体多肽而言,是指作为该变体多肽的亲本的SEQID NO:1~9中的多肽。例如,当变体多肽为SEQ ID NO:1的多肽的变体时,SEQ ID NO:1的多肽即为该变体多肽的亲本。
本说明书中,“与亲本多肽等同的功能”是指:对于疟疾感染者的血清以及非疟疾感染者的血清,所述变体多肽与相应的亲本多肽具有基本相同的响应模式,即,分别对恶性疟原虫感染者有基本相同(±10%)的检出率及基本相同(±5%)的假阳性率。这里,检出率是指:用“金标准”方法确认的阳性样本中,被其他方法测定为阳性样本的比例。假阳性率是指:用“金标准”方法确认的阴性样本中,被其他方法测定为阳性样本的比例。本技术领域检测恶性疟原虫感染的“金标准”方法是镜检法。
本说明书中,“疟疾”是指恶性疟和并有恶性疟的混合感染。恶性疟是指因恶性疟原虫感染而引起的疟疾,并有恶性疟的混合感染是并有恶性疟原虫感染同时伴有其他类型疟原虫感染而引起的混合感染。
所述变体多肽中,氨基酸取代可以是保守取代,即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团氨基酸残基之间的取代(例如Ile、Val、Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。在本说明书中,“一个或多个氨基酸”指通过人工合成方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸,例如1~20个氨基酸、优选1~15个氨基酸、更优选1~10个氨基酸、更优选1~8个氨基酸、更优选1~2个氨基酸、更优选1个氨基酸。
两个氨基酸序列的同源性%可通过目测和数学计算来确定。或者两个多肽序列的同源性百分比可以通过使用以Needleman,S.B.及Wunsch,C.D.(J.Mol.Bol.,48:443-453,1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来决定。GAP程序优选的默认参数包括:(1)Henikoff,S.以及Henikoff,J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,1992)所记载的得分/矩阵、blosum62;(2)一个空位扣12分;(3)连续空位加扣4分;以及(4)末端空位不扣分。也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同源性百分比,例如:Altschul等(Nucl.Acids.Res.,25,p.3389-3402,1997)中记载的可用BLAST程序对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bank of Japan(DDBJ)网站使用。在相同站点,对利用BLAST程序进行同源性检索的各种条件(参数)进行了详细记载,可对部分设定进行适当变更,但检索通常用默认值进行。此外,两个氨基酸序列的同源性%也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时,也可用默认值检索。
所述变体多肽是否具有与亲本多肽等同的功能可以这样来确定:测定变体多肽与相应的亲本多肽分别对于恶性疟原虫感染者和伴有恶性疟原虫感染的混合感染者的血清的检出率和假阳性率,并进行比较。
如实施例所示,所述多肽集合1对恶性疟原虫感染者的血清呈阳性反应,而对健康正常人或非恶性日疟原虫感染者的血清呈阴性反应,因此,所述多肽集合1作为疟原虫感染的检测工具是有用的。
本说明书中,阳性反应是指:满足下述“诊断方法”部分中所列的判据;否则为阴性反应。
所述多肽可以适宜采用(1)化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得,其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下,通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法,可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本技术领域公知的。
此外,在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下,可以采用例如国际公开小册子WO2004/011653号所述的方法。即,可以这样来生产:将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应,生成的二肽或三肽。作为肽合成酶,可以列举出:具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
特别是多肽的化学合成已经实现了商业化,可以容易地委托专业的多肽合成公司来合成所述多肽。
试剂盒
本发明提供一种试剂盒(本发明的试剂盒),其包括
其包括一个或多个固体载体,以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的上述多肽集合1。
因此,所述多肽集合1可以用于制备用于诊断疟疾的试剂盒。该试剂盒中的固体载体可以是一个,也可以是多个,但优选为一个,即全部多肽独立地连接于同一固体载体上。
在本发明中,对固体载体没有特殊限制,只要是作为固体或不溶性材料(例如是可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。
构成固体载体的材料包括但不限于:硅胶(聚二甲基硅氧烷,PDMS)、纤维素、特氟隆TM、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、铂、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组合等。
固体载体的形状包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样,薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
磁珠可以具有约25nm~约1mm范围的球体直径。在优选的实施方式中,磁珠具有约50nm~约10μm范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24μm~约165μm范围的直径。优选地,高交联球形琼脂糖珠具有约24μm~约44μm范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences,Warrington,PA或Spherotech,Liberville,IL购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
二氧化硅(SiO2)-处理或二氧化硅(SiO2)基的固体载体的例子包括可从Polysciences,Warrington,PA购买的超常磁性二氧化硅珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA)。或者,还可以使用可从Dynal Biotech购买的M-280等。
具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子,可以列举出Polysciences,Warrington,PA销售的珠子(名称:Biomag(注册商标)羧基)、或者Bangs Laboratory,Inc.,Fishers,IN的名称为MC02N/2928的珠子。或者,可以使用Dynal Biotech销售的M-270等。
在一个优选实施方式中,所述固体载体是SJ改性硅胶,其是苏州偲聚生物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(iPDMS薄膜,参见中国专利CN101265329A)。这种材料是以生物学研究常用的PDMS为基础,在其中加入特定的引发剂成分(使该材料可通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面功能化修饰),再经过聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly(oligo(ethylene glycol)methacrylate),pOEGMA)表面修饰获得的。SJ改性硅胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(Nonspecific protein adsorption,NPA)能力,可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对0”水平(接近或低于仪器的检测极限),不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦,还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。苏州偲聚公司已经成功地将SJ改性硅胶应用于11个肿瘤标志物组成的多指标联检微阵列ELISA试剂盒,实现了高通量和高灵敏的检测,证明了这种材料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时,这种材料还具有表面性质可调的特性,可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。
多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。例如,对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言,可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[1-ethyl-3-(3-dimethyl ami-nopropyl)carbodiimide,EDC]和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)的反应将改性硅胶表面高分子链上的羧基(-COOH)基团改为活化基团,该活化基团可与蛋白/多肽上所带的氨基(-NH2)反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面。
对于点样时使用的点样液中多肽的浓度没有特殊限制,本领域技术人员可以依常规选择,优选为1μg~1000μg/mL,更优选10μg~500μg/mL。此外,对于多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制,本领域技术人员可以依常规选择,优选为1~100点/10mm2,更优选5~50点/10mm2。
该试剂盒还可以包括:
1.配好的血清稀释液或血清稀释液组分溶液:血清稀释液,例如有北京赛驰生物科技有限公司的样本稀释液(产品编号070021-S2)、郑州博威嘉生物科技有限公司的加样变色样本稀释液(产品编号bwj010103)等。该血清稀释液用来稀释血清,试剂盒检测的血清要稀释适当倍数,例如2~200倍,优选10~100倍。
该试剂盒还可以包括:
2.浓缩洗液:固体载体表面孵育血清及酶标二抗后,需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是1%的吐温20水溶液,使用时需稀释2~40倍、优选5~20倍。
该试剂盒还可以包括:
3.酶标二抗溶液:疟原虫感染(例如疟疾)病人血清中的疟原虫自身抗体可与固体载体(例如SJ改性硅胶)上的本发明的多肽结合,酶标二抗可与抗体结合,而酶标二抗上的标记物可与发光底物反应,从而发出可检测的光。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。作为酶标二抗溶液,可以列举出北京中杉金桥生物技术有限公司生产的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(H+L),产品编号ZB-2304。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制,可以是例如1ng~1000ng/mL。
该试剂盒还可以包括:
4.发光液组分溶液:发光液可与酶标二抗上标记的辣根过氧化物酶反应,使得反应发出仪器可检测到的化学光。发光液由两种溶液混合而成,分别是A液—过氧化氢溶液,及B液—发光氨溶液。发光氨(鲁米诺)只有用氧化剂处理过才会发光。通常使用双氧水和一种氢氧化物碱的混合水溶液作为激发剂。在辣根过氧化物酶催化下,双氧水分解为氧气和水:
2 H2O2→O2+2 H2O
鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子,它可被过氧化氢分解出的氧气氧化,产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定,立即分解出氮气,生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中,释放的能量以光子的形式存在,波长位于可见光的蓝光部分。发光液组分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的ELISAFemto Maximum Sensitivity Substrate,货号37074。
该试剂盒还可以包括:
5.一个或两个以上的反应腔体(例如中国专利授权公告CN202054829U)。
该试剂盒还可以包括:
6.其他用于定性或恶性疟原虫感染的检测分子(例如多肽、蛋白质、核酸等)。
该试剂盒还可以包括:
7.使用说明书。
该试剂盒还可以包括:
8.连接于所述一个或多个固体载体、或其他独立的固体载体上的阳性质控点(例如人血桨丙种球蛋白(H-IgG),简称H-IgG)和/或阴性质控点(例如磷酸缓冲液,简称PB)。
诊断方法
本发明还提供一种诊断受试者是否为疟疾患者的方法,该方法包括:
使用上述本发明的试剂盒检测SEQ ID NO:1~9所示的多肽或其变体是否对受试者来源的血液样本有响应;其中,
当检测到分别来自下述多肽组1~9中的至少一个或一个以上多肽组中的至少任意一个或一个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时(判据1),判定受试者是疟疾患者;否则,判定受试者不是疟疾患者。
在本说明书中,“响应”是指:信噪比(SNR)大于或等于2,其中,信噪比=(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。
需要说明的是,在上述本发明的检测方法中,所述血液样本可以是全血、血浆或血清,优选为血浆或血清,更优选为血清。
实施例
1.多肽的制备与确认
实施例中使用的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成,并通过质谱对其进行了确认。其中,
SEQ ID NO:1:(SEIILPENVETEEIIDDVPSPKHSNHETFE);分子量为3449。
SEQ ID NO:2:(NDFSEYHEDINDINFKK);分子量为2128。
SEQ ID NO:3:(GESKETGESKETGESKETGESKETGESKET);分子量为3176。
SEQ ID NO:4:(AGKKIDKKKEQANKKNNNNKNKNKNKNLSK);分子量为(3468)。
SEQ ID NO:5:(IVPEQNDEESGESGLVDNEEGDFEEPNHEE);分子量为3373。
SEQ ID NO:6:(EIKKQVEEGIKENDTEGNDKVKGPEIITEE);分子量为(3400)。
SEQ ID NO:7:(SFWGEEKRASHTTPVLMEKPYY);分子量为2657。
SEQ ID NO:8:(AEKPYIIPTSNCSANDIVKYEHTLKTQITL);分子量为3392。
SEQ ID NO:9:(KNDEQKDKVLGEGDKEDVKEKNDEQKDKVL);分子量为3502。
2.检测试剂盒的制备
检测试剂盒是以SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)为固体支撑材料,在其上通过点样固定多肽溶液制备而成。改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂,并通过热交联(硅氢键键合)固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中,得到一种新的材料即SJ改性硅胶。其制作过程参见国际专利公开WO2014/044184。
制好的SJ改性硅胶薄膜可保存在4℃冰箱中。
采用晶芯16个人点样仪在改性硅胶上制备多肽微阵列,过程为:
1)预处理
将SJ改性硅胶薄片(15×15mm2)浸泡在活化液中,30min后取出用去离子水淋洗3次,用氮气吹干,马上用于点样。
2)点样
将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中,将带样本的384孔板置于点样仪基台上,同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上,马上进行点样。点样环境条件为室温(25℃),湿度设定为50%。所述9条多肽在SJ改性硅胶薄片上点成微阵列,每条多肽点样一个点,另外点样一个H-IgG点作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0.6nL,样点半径为200μm。
3)化学固定
刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱(26℃,60%湿度)中固定至少6h。化学固定过程参见国际专利公开WO2014/044184。
首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上,接着缓冲液开始蒸发,捕获多肽分子与SJ改性硅胶表面亲密接触并相互作用,通过化学结合,改性硅胶表面的ploy(OEGMA)高分子的末端-COOH与多肽分子的-—NH2形成稳定共价键,进而将有化学活性的多肽分子固定在SJ改性硅胶表面。
4)装配
固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将SJ改性硅胶薄片贴在专门的反应柱上,盖上反应腔体。一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成。
5)保存
装配好的多肽微阵列,需要抽真空密封,保存在4℃的冰箱中,备用。
3.用检测试剂盒进行检测
检验步骤
(1)开始检测前,将浓缩清洗液按1:10的比例加入纯化水或蒸馏水进行稀释,稀释完成后直接使用。使用移液枪将2mL清洗液加到芯片表面,浸泡芯片3分钟,保证芯片表面被完全浸润。
(2)将待测血清样本用样本稀释液按照1:200稀释混匀。
(3)弃去浸泡芯片的清洗液,在芯片表面完全湿润的状态下,每个血清样本吸取200μL稀释后的血清加入到芯片反应器内。
(4)将芯片反应器放入芯片固定座,放到摇床上,开启摇床,频率150转/分钟,室温孵育30分钟。
(5)弃去芯片反应器内的血清样本,用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
(6)清洗完成后,每个芯片反应器分别加入200μL酶标抗体溶液,将芯片反应器放入芯片固定座,放到摇床上,开启摇床,频率150转/分钟,室温孵育30分钟。
(7)弃去芯片反应器内的酶标抗体溶液,用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
(8)清洗完成后,取下反应腔体,每个芯片表面分别加入15μL发光底物液,使发光液能均匀的铺于芯片表面。
(9)将加入了发光液的芯片置于凝胶成像仪中化学发光成像并判定结果,作为凝胶成像仪,使用例如天能5500型微阵列成像仪、偲捷牌TN5500型或偲捷牌CLEAR4000型等均可。
(10)结果判定:对于每一份血清,分别统计试剂盒1中的每一条多肽是否有响应(即,信噪比(SNR)大于等于1),并根据上述“诊断方法”部分中所描述的判决进行判定,即:
当检测到分别来自下述多肽组1~9中的至少一个或一个以上多肽组中的至少任意一个或一个以上的多肽对所述受试者来源的血液样本有响应时(判据1),判定受试者是疟疾患者;否则,判定受试者不是疟疾患者。
对于285份血清样本,分别采用上述2中制备的检测试剂盒(按上述3的步骤)以及传统的镜检法进行检测,检测结果如表1所示。
表1
正确率=(161+118)/285×100%=97.9%
检出率=161/165×100%=97.6%
特异性=118/120×100%=98.3%
假阳性率=2/120×100%=1.7%
由此可知,上述检测器件的检测数据与临床镜检数据基本一致,其完全符合作为检测试剂盒的要求。
作为对比,对于上述9条多肽中的任一条,按照国际专利公开WO2014/044184实施例部分标题2的描述制备了检测器件,使用上述285份血清样本,按照国际专利公开WO2014/044184实施例部分标题3的描述进行了检测,结果显示上述9条多肽单独检测恶性疟时的检出率均在30.7%~57.5%之间(见表2),不能满足作为检测试剂盒的要求。
表2 9条多肽在285份血清中的检出率结果 单位:%
序列号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
检出率 | 37.4 | 57.5 | 56.4 | 50.3 | 48.0 | 45.3 | 42.5 | 31.3 | 30.7 |
以下,通过实施例对本发明进行更具体的说明,但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载,本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变,这些包含在本发明的技术范围内。
序列表
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 可用于辅助诊断疟疾的试剂盒
<130> 20141111-2
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 疟疾抗原性多肽
<400> 1
Ser Glu Ile Ile Leu Pro Glu Asn Val Glu Thr Glu Glu Ile Ile Asp
1 5 10 15
Asp Val Pro Ser Pro Lys His Ser Asn His Glu Thr Phe Glu
20 25 30
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asn Asp Phe Ser Glu Tyr His Glu Asp Ile Asn Asp Ile Asn Phe Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 疟疾抗原性多肽
<400> 3
Gly Glu Ser Lys Glu Thr Gly Glu Ser Lys Glu Thr Gly Glu Ser Lys
1 5 10 15
Glu Thr Gly Glu Ser Lys Glu Thr Gly Glu Ser Lys Glu Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Ala Gly Lys Lys Ile Asp Lys Lys Lys Glu Gln Ala Asn Lys Lys Asn
1 5 10 15
Asn Asn Asn Lys Asn Lys Asn Lys Asn Lys Asn Leu Ser Lys
20 25 30
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 疟疾抗原性多肽
<400> 5
Ile Val Pro Glu Gln Asn Asp Glu Glu Ser Gly Glu Ser Gly Leu Val
1 5 10 15
Asp Asn Glu Glu Gly Asp Phe Glu Glu Pro Asn His Glu Glu
20 25 30
<210> 6
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 疟疾抗原性多肽
<400> 6
Glu Ile Lys Lys Gln Val Glu Glu Gly Ile Lys Glu Asn Asp Thr Glu
1 5 10 15
Gly Asn Asp Lys Val Lys Gly Pro Glu Ile Ile Thr Glu Glu
20 25 30
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 疟疾抗原性多肽
<400> 7
Ser Phe Trp Gly Glu Glu Lys Arg Ala Ser His Thr Thr Pro Val Leu
1 5 10 15
Met Glu Lys Pro Tyr Tyr
20
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 疟疾抗原性多肽
<400> 8
Ala Glu Lys Pro Tyr Ile Ile Pro Thr Ser Asn Cys Ser Ala Asn Asp
1 5 10 15
Ile Val Lys Tyr Glu His Thr Leu Lys Thr Gln Ile Thr Leu
20 25 30
<210> 9
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 疟疾抗原性多肽
<400> 9
Lys Asn Asp Glu Gln Lys Asp Lys Val Leu Gly Glu Gly Asp Lys Glu
1 5 10 15
Asp Val Lys Glu Lys Asn Asp Glu Gln Lys Asp Lys Val Leu
20 25 30
Claims (6)
1.一种试剂盒,其包括一个或多个固体载体,以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽集合1:
SEQIDNO:1所示的多肽;
SEQIDNO:2所示的多肽;
SEQIDNO:3所示的多肽;
SEQIDNO:4所示的多肽;
SEQIDNO:5所示的多肽;
SEQIDNO:6所示的多肽;
SEQIDNO:7所示的多肽;
SEQIDNO:8所示的多肽;和
SEQIDNO:9所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其用于诊断疟疾。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其用于诊断恶性疟原虫感染。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,全部多肽独立地连接于同一固体载体上。
5.下述多肽集合1在制备用于诊断疟疾的试剂盒中的用途:
多肽集合1
SEQIDNO:1所示的多肽;
SEQIDNO:2所示的多肽;
SEQIDNO:3所示的多肽;
SEQIDNO:4所示的多肽;
SEQIDNO:5所示的多肽;
SEQIDNO:6所示的多肽;
SEQIDNO:7所示的多肽;
SEQIDNO:8所示的多肽;和
SEQIDNO:9所示的多肽。
6.根据权利要求5所述的用途,其中,所述诊断疟疾为诊断恶性疟原虫感染。
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-
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