CN106324032B - 一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生竞争检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生竞争检测方法，属于生物传感器领域，用于快速检测食品或水源样品中的农药阿特拉津残留，将S‑MIP作为识别元件填充于反应柱。将待测样品经简单前处理后在流动相下与一定量的β‑内酰胺酶标记的待测物竞争结合S‑MIP上的印迹位点。加入酶特异性底物释放的热信号与待测物含量呈反比。在优化实验条件的基础上建立标准曲线。“放大法”特异、定量检测典型农药阿特拉津的量热仿生传感方法，具有样品前处理简便、灵敏度高、特异性强、定量检测的优点。

Description

一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生竞争检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生竞争检测方法，属于生物传感器领域，用于快速检测食品或水源样品中的农药阿特拉津残留，具有样品前处理简便、灵敏度高、特异性强、定量检测的优点。

背景技术

除草剂阿特拉津(Atrazine，ATR)又名莠去津，全称为2-氯-4-乙胺-6-异丙胺-1，3，5-三嗪，分子量为215.69三嗪类除草剂作为选择性内吸传导型苗前、苗后除草剂，通过抑制光合作用达到去除杂草的目的，自上世纪50年代开发生产以来得到了大面积使用，主要用于玉米、高粱、甘蔗、果树、林地等旱田，其中以阿特拉津(ATR)使用最为广泛；ATR具有一定残留毒性，可抑制水体中多种藻类的光合作用，使鱼的生理功能发生紊乱、杀死水底节肢动物，严重时可致使小鼠的染色体受损。在低浓度长期暴露下，ATR会使人体的内分泌系统及生殖系统紊乱，具有潜在的致癌作用。鉴于此，许多国家对水体中ATR残留限量做出了明确规定：美国环境保护局规定ATR在水中的最高允许浓度为3μg/L，欧盟规定饮用水中ATR含量不得超过0.1μg/L，我国国家环保部规定地表水(1-2类)中ATR的最高允许浓度为3μg/L。ATR残留引起的环境污染及健康危害问题已引起人们的广泛关注。因此，在实践工作中迫切需要建立ATR残留的快速检测方法。

对ATR实现准确分析的常用方法有GC-MS、HPLC-MS以及传感器检测等。这些检测方法主要是通过对样品的光、电学信号的改变来实现检测，因而对样品前处理要求高，程序繁琐，消耗时间长，并且仪器设备昂贵、需要专业的操作人员，极大的限制了快速检测方法的建立。免疫学检测方法具有方法快速、简便、灵敏高、特异性强、设备便携等优点使其适合于快速检测，在检测基质成分单一的样品时具有良好的效果，但面对复杂基质样品时，检测信号常受到基质光学特性严重干扰，另外，农药残留物浓缩富集过程中应用的有机溶剂会使抗体的活性下降甚至丧失，会干扰后续抗原抗体的免疫反应，极大限制了免疫学方法快速检测小分子残留的应用。

量热传感器是对生物反应中伴随的吸热或产热信号进行检测。其共性之一就是通过固定化酶对特异性底物的催化反应中热焓的变化而实现检测。该检测技术具有良好的通用性及检测稳定性。与其它分析方法相比较具有诸多优势，如：可对大多数生物样品进行分析、固定化酶可重复使用、检测不受样品光、电学环境特性的干扰，可实现连续流动相下检测、检测过程简便、可引入参比部件等。由于热量传感元件无需与流动相直接接触，因而消除了传感器漂移现象。量热传感器最先用于对葡萄糖及尿素的检测，然后逐渐应用于临床医学、环境监测、食品卫生、工业过程监测等领域。由于检测热信号反应总的放热量，因而检测缺乏特异性是该类检测方法的不足。对于由载液与样品在pH及离子强度上的不匹配造成的非特异性信号响应可以通过对样品稀释或引入参比柱进行信号差异性检测加以克服。量热检测方法中热信号以峰的形式出现，峰高正比于放热量，峰面积及峰上升斜率与底物浓度呈线性关系。量热生物检测(TELISA)是基于酶联免疫吸附检测基本原理结合量热仪检测热信号的方法。Scheper等人利用夹心法建立了一种简单的TELISA方法用以检测各种IgG。郄志伟等利用直接竞争法原理首次建立了一种用于快速检测玉米秸秆中典型三嗪类农药-阿特拉津残留的TELISA方法，成功实现了量热法对农药残留的检测。其中，量热传感器反应柱内固相载体所填充的表面印迹材料先后使用了CPG微球、蛋白G等材料，取得了较好的效果。

分子印迹材料含有大量印迹孔穴的分子印迹聚合物(MIP_S)是人工合成受体，它具有类似天然抗体或酶的特异性和选择性，这种含有合成识别元件的仿生传感器可以在各种恶劣的环境中使用。MIP_S包含大量的印迹孔穴，这些孔穴能够通过形状、大小和官能团(如氢键)与靶分子进行互补，它特别适用于小分子的检测。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种量热传感器反应柱内固相载体所填充的表面印迹材料，其特征是通过表面印迹技术(s-MIT)在氨基化修饰的可控有孔玻璃珠(CPG)表面印迹的针对阿特拉津的特异性印迹层产物(s-MIP)。

本发明的第二个目的是提供一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生竞争检测方法方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明将S-MIP作为识别元件填充于反应柱。将待测样品经简单前处理后在流动相下与一定量的β-内酰胺酶标记的待测物竞争结合S-MIP上的印迹位点。加入酶特异性底物释放的热信号与待测物含量呈反比。在优化实验条件的基础上建立标准曲线，最终建立样品前处理简便、“放大法”特异、定量检测典型农药阿特拉津的量热仿生传感方法，具体步骤如下：

1.S-MIP的制备

(1)将2.85g阿特拉津溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)乙酸缓冲液混合溶液(DMF∶乙酸缓冲液＝9∶1，v/v；乙酸缓冲液，0.2mol/L，pH5.8)。在机械搅拌的条件下使其完全溶解；

(2)依次将5.635ml甲基丙烯酸(MAA)、1.46g亚甲基双丙烯酰胺(BIS)及400mg可控有空玻璃珠(CPG)加入步骤(1)的混合溶液中，形成印迹预聚合体系；

(3)38℃水浴，搅拌子转速300rpm条件下体系预聚合12h；

(4)预聚合体系通入氮气30min，加入过硫酸铵(APS)引发接枝印迹聚合，反应10h；

(5)经砂芯漏斗通过真空抽滤将印迹产物从体系分离；

(6)用50％甲醇水溶液，pH 8～9，含1mol/L NaCl的再生液37℃条件下对产物再生24h，期间每8h更新再生液1次。制备得到的产物用乙醇冲洗后在真空干燥箱烘干备用。同时对所得产物进行扫描电镜表征(SEM)鉴定，结果如图1所示。从SEM表征图可见，CPG表面形成明显的印迹层。

方法中功能单体甲基丙烯酸(MAA)与交联剂亚甲基双丙烯酰胺(BIS)摩尔比为7∶1；功能单体对-苯乙烯磺酸钠(SSS)与模板分子阿特拉津(ATR)摩尔比为5∶1

2.MIP量热法检测阿特拉津：MIP量热检测装置如图2所示：

(1)将表面印迹产物装入反应器置于热调节器中，通入经0.22μm针式滤器过滤及超声除气的载液(0.02mol L^-1，pH 5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，含2％DMF)平衡流动体系，体系流速1000μlmin^-1；

(2)用载液为溶剂配制0-20ng mL^-1梯度浓度的阿特拉津溶液，与一定量β-内酰胺酶标记的阿特拉津混合制备成样品。

(3)经0.22μm针式滤器过滤后，加入样品溶液。待测物与酶标待测物在流动相下竞争结合S-MIP表面的印迹孔穴。多余的样品随流动相冲洗出反应柱。

(4)加入特异性底物——氨苄西林所产生的热信号变化被惠斯通电桥收集、转化后在量热工作站(N2000色谱数据工作站)上以峰信号显示；

(5)从加入样品到酶促反应热信号产生完全可在10min内完成，加上本底信号值检测、再生后基线恢复，一个样品完整的检测时间不超过30min。检测原理如图3所示：

3.量热法检测阿特拉津方法的建立

3.1实验条件的优化

本实验中选用表面印迹材料作为固相载体及识别元件，是因为：1、在量热方法中最常用到的孔性固相载体CPG表面进行印迹利于控制印迹产物的粒径及孔径控制，使印迹产物在流动相下不产生太高的背景压力；2、CPG微球上进行表面印迹可以确保印迹材料的机械稳定性，提高印迹产物耐受流动相对结构的干扰的能力；3、孔性微球上表面印迹材料的制备利于质量传递，利于印迹孔穴与目标分子的迅速识别，利于量热方法的建立；

载液流速不仅决定检测通量，同时影响单位时间内热信号产生强度及信号稳定性。随着流速的提升，相同样品信号响应强度逐渐上升。到流速为1000μl min^-1时信号最强。根据实验观测，流速继续升高很容易出现流动相不稳及漏液，因而选定1000μl min^-1为最佳体系流速。相同操作方式下在检测体系温度25、30、37℃下进行相同样品信号测定，观测到信号在30℃条件下信号最强，且再生效果最好，因而选定30℃为检测体系温度。

载液选用0.02molL^-1pH 5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液。优化了其中添加剂DMF含量，从2％提升到8％。观察到DMF为4％时竞争抑制幅度明显减小，为8％时竞争抑制现象消失。但是必须保证对ATZ足够的溶解度。因此选定DMF含量为2％。含有按照1∶100稀释的ATZ-β(0.8mg ml^-1)样品加入后随着底物加入次数的增加，信号强度有逐渐升高的趋势，提示此条件下ATZ-β可能过量。该条件下，相对高浓度的ATZ-β存在空间位阻，影响对酶特异性底物催化反应的进行。因而对ATZ-β进行梯度稀释，根据信号响应优化使用稀释比。

结果发现1∶200与1∶400组信号相比1∶100组信号强度略有降低，但是在1∶800时信号显著下降，提示此时ATZ-β不能充分结合印迹孔穴，因而选择1∶400组为最佳稀释比。在此条件下进行再生条件的优化，发现1000μl min^-1条件下1molL^-1NaCl的50％甲醇水溶液再生2min可以获得满意的再生效果。在此优化的基础上测量量热信号。上样后重复加入底物，随着底物加入次数的增加信号强度呈现较快下降，说明ATZ-β浓度已经至最佳浓度。如图4所示。同时也可以观察到，从加入样品到酶促反应热信号产生完全可在10min内完成，加上本底信号值检测、再生后基线恢复，一个样品完整的检测时间不超过30min。

在ATZ-β稀释的基础上，进一步优化底物使用浓度。图5中可见，Amp浓度在1、2、4mmol L-1升高时信号强度成倍增加。在6mmol L^-1时信号增加幅度显著下降，说明此浓度接近饱和催化浓度。因而Amp4mmol L^-1认为是对酶活性变化最为敏感的浓度，选定该浓度进行方法建立。

3.2检测方法标准曲线建立

在实验条件优化的基础上，绘制标准曲线(见图6)。数据点均3次重复。

经计算该竞争抑制曲线线性检测范围(IC₂₀-IC₈₀)为0.6-4.1ng ml^-1，检出限IC₁₀为0.4ng ml^-1。

3.3检测方法特异性

选用了与ATR结构类似的西玛津、三聚氰胺、间苯三酚测定方法的特异性。三者在较低浓度(5μg L^-1)均未观测到竞争抑制现象，直到浓度提高到50μg L^-1。通过计算该浓度下产生的竞争抑制信号相当于ATZ的产生相同竞争抑制强度的浓度比值计算交叉反应性。S-MIP对结构高度类似的三嗪类除草剂交叉反应性仅为5.7％，说明印迹效果很好。对三聚氰胺交叉反应性为3.7％，可能为三聚氰胺氮原子质子与印迹孔穴有静电吸附作用，形成一定程度的识别。间苯三酚未观测到交叉反应性，说明印迹孔穴对于空间构象的高度选择性。综合上述分析可知，该印迹孔穴具有良好的识别能力。

3.4加标回收实验

表1 自来水中ATR加标回收实验及方法学比对结果(n＝3)

1均数；2标准差

由于本方法检测灵敏度为ng ml^-1级，因而选定用UPLC-MS/MS进行方法学比对。实验结果见表1。

由表中可知，基于S-MIP与量热传感检测技术相结合建立的竞争法量热仿生检测方法与UPLC-MS/MS具有较好的可比性。本文也实现了以S-MIP为识别元件的流动相下量热检测技术的建立。将MIP所具备的制备简便、识别特异性强及环境稳定性与量热传感技术的样品前处理简便、易于实现连续自动化检测相结合，首次实现了对农药残留的快速特异检测。

同时，由于该方法识别元件在制备原理具有一定的通用性，且方法可以实现对目标物的高特异性快速检测，可在30min内可完成一个样品的检测，非常适宜于在实践中推广。该方法作为检测农药残留的样品前处理简便、快速特异检测方法，具有良好的应用前景。

附图说明

图1 S-MIP经SEM表征图(左图为CPG裸球；右图为S-MIP)

图2基于竞争法的MIP量热仿生检测装置示意图

图3基于竞争法的MIP量热仿生检测原理示意图

图4ATZ-β浓度优化前(上图)后(下图)量热信号对比①为本底信号峰；②③④为催化信号峰

图5ATZ-β 1∶400条件下底物浓度优化

图6量热仿生检测法检测ATZ标准曲线

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。

本发明的技术方案：一种己烯雌酚阳离子完全抗原的制备方法：

实施例1

按照步骤1制备S-MIP。

(1)将表面印迹产物装入反应器置于热调节器中，通入经0.22μm针式滤器过滤及超声除气的载液(0.02mol L^-1，pH 5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，含2％DMF)平衡流动体系，体系流速1000μl min^-1；

(2)用载液为溶剂配制0-20ng mL-1梯度浓度的阿特拉津溶液，与一定量β-内酰胺酶标记的阿特拉津混合制备成样品。

(3)经0.22μm针式滤器过滤后，加入样品溶液。待测物与酶标待测物在流动相下竞争结合S-MIP表面的印迹孔穴。多余的样品随流动相冲洗出反应柱。

(4)加入特异性底物-氨苄西林所产生的热信号变化被惠斯通电桥收集、转化后在量热工作站(N2000色谱数据工作站)上以峰信号显示；

(5)从加入样品到酶促反应热信号产生完全可在10min内完成，加上本底信号值检测、再生后基线恢复，一个样品完整的检测时间不超过30min。

Claims (2)

1.一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生竞争检测方法，其特征是量热传感器反应柱内固相载体所填充的表面印迹材料为通过以甲基丙烯酸为功能单体的表面印迹技术在氨基化修饰的可控有孔玻璃珠表面印迹的针对阿特拉津的特异性印迹层产物；

该检测方法包括以下步骤：

步骤1：S-MIP的制备

(1-1)将2.85g阿特拉津溶于100ml N,N-二甲基甲酰胺乙酸缓冲液混合溶液,在机械搅拌的条件下使其完全溶解；其中，N,N-二甲基甲酰胺∶乙酸缓冲液＝9∶1，v/v；乙酸缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH为5.8；

(1-2)依次将5.635ml甲基丙烯酸、1.46g亚甲基双丙烯酰胺及400mg可控有孔玻璃珠加入步骤(1)的混合溶液中，形成印迹预聚合体系；

(1-3)38℃水浴，搅拌子转速300rpm条件下体系预聚合12h；

(1-4)预聚合体系通入氮气30min，加入过硫酸铵引发接枝印迹聚合，反应10h；

(1-5)经砂芯漏斗通过真空抽滤将产物从体系分离；

(1-6)用50％甲醇水溶液，pH 8～9，含1mol/L NaCl的再生液37℃条件下对产物再生24h，期间每8h更新再生液1次；制备得到的表面印迹产物用乙醇冲洗后在真空干燥箱烘干备用；

步骤2：MIP量热法检测阿特拉津

(2-1)将表面印迹产物装入反应器置于热调节器中，通入经0.22μm针式滤器过滤及超声除气的载液平衡流动体系，体系流速为1000μl min^-1；载液为0.02mol L^-1pH 5.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，其添加剂DMF含量为2％；

(2-2)用载液为溶剂配制0-20ng mL^-1梯度浓度的阿特拉津溶液，与一定量β-内酰胺酶标记的阿特拉津混合制备成样品溶液；β-内酰胺酶标记的阿特拉津的稀释比为1:400；

(2-3)经0.22μm针式滤器过滤后，加入样品溶液，阿特拉津与β-内酰胺酶标记的阿特拉津在流动相下竞争结合S-MIP表面的印迹孔穴，多余的样品随流动相冲洗出反应柱；检测体系温度为30℃；

(2-4)加入4mmol L^-1特异性底物氨苄西林，所产生的热信号变化被惠斯通电桥收集、转化后在量热工作站上以峰信号显示；

(2-5)检测结束后，通入1mol/L NaCl的50％甲醇水溶液，2min，进行再生。

2.根据权利要求1所述的一种检测农药阿特拉津残留的量热仿生竞争检测方法，其中，所述检测方法的线性检测范围IC₂₀-IC₈₀为0.6-4.1ng ml^-1，检出限IC₁₀为0.4ng ml^-1。