CN107192831B - 一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法 - Google Patents

一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法。其原理是以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；以磁珠为载体固定适体DNA，得DNA修饰磁珠；再将化学发光探针与DNA修饰磁珠孵育得化学发光传感器；在目标物糖化血红蛋白存在时，适体DNA与糖化血红蛋白作用，化学发光探针从磁珠表面脱落；经过磁分离后，在分离液中加入羟胺‑O‑磺酸，以LumAuNPs—羟胺‑O‑磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标糖化血红蛋白的测定。方法具有简单、灵敏度高的优势。

Description

一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法。
背景技术
血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质(Hb、HGB)。血红蛋白由四条链组成，两条α链和两条β链，每一条链有一个包含一个铁原子的环状血红素。氧气结合在铁原子上，被血液运输。血红蛋白的特性是：在氧含量高的地方，容易与氧结合；在氧含量低的地方，又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧的功能。糖化血红蛋白(HbA1c)是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反应，并与血糖浓度成正比，且保持120天左右，糖化血红蛋白测试通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情况。现阶段检测糖化血红蛋白的方法有阳离子交换色谱法、免疫分析法等。这些方法仍然有许多不足，例如所需仪器价格昂贵、操作步骤繁琐、低重现性和易受环境影响等。鉴于现有技术的不足，本发明利用适体捕获糖化血红蛋白，以LumAuNPs标记适体互补序列DNA为探针，以LumAuNPs—羟胺-O-磺酸化学发光为检测体系实现了糖化血红蛋白的测定，方法具有灵敏度高、选择性好、简单的特点。
发明内容
本发明旨在发明一种方法简单、灵敏度高的测定糖化血红蛋白的方法。
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法。
实现本发明目的技术方案是：
一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法。其原理是以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；以磁珠为载体固定适体DNA，得DNA修饰磁珠；再将化学发光探针与DNA修饰磁珠孵育得化学发光传感器；在目标物糖化血红蛋白存在时，适体DNA与糖化血红蛋白作用，化学发光探针从磁珠表面脱落；经过磁分离后，在分离液中加入羟胺-O-磺酸，以LumAuNPs—羟胺-O-磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标糖化血红蛋白的测定。
本发明是通过以下措施来实现的：一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备；
(2)适体DNA修饰磁珠的制备；
(3)适体互补序列DNA修饰LumAuNPs的制备；
(4)糖化血红蛋白的检测。
优选的，所述的鲁米诺胶体金纳米粒子的制备包括以下步骤：
实验开始前，将所用的玻璃仪器用HNO3/HCl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干。取一定量的1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热回流煮沸；待溶液沸腾后，快速加入0.01mL～5mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热，并在继续搅拌下冷却至室温，得鲁米诺胶体金纳米粒子，即LumAuNPs，将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用。
优选的，所述的适体DNA修饰磁珠的制备包括以下步骤：
取10μL～100μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用10μL～200μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到0.01mL～2mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后向离心管中加入10μL～200μL浓度为5.0×10-8M适体DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到适体DNA修饰磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mL PBS缓冲溶液中，4℃保存。
优选的，所述的适体互补序列DNA修饰LumAuNPs的制备包括以下步骤：
将1μL～20μL的TCEP加到10μL～200μL浓度为1.0×10-6M的适体互补序列DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取100μL～1000μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入10μL～200μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mM Tris-HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针；最后得到的化学发光探针分散到1000μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用。
优选的，所述的糖化血红蛋白的检测包括以下步骤：
取10μL～200μL适体DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后在此离心管中加入10μL～100μL化学发光探针溶液，37℃条件下震荡反应40min后，磁分离，将磁性分离物分散在10μL～100μL含目标物糖化血红蛋白的溶液中，37℃震荡反应40min，经过磁分离后，将磁性分离液分散在50μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺-O-磺酸溶液，产生化学发光，根据化学发光强度定量，实现糖化血红蛋白的测定。
所述的适体DNA为：5`-NH2-ACACAGCAACACACCCACC CACCAGC C C CAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTG TG-3`
所述的适体互补序列DNA为：5’-SH-CACACACGACG GATGGG CA T G ATG C TGGGGCTGGTG GG TGG G T GTGTTGCTGTGT-3’
本发明研究了不同浓度目标物糖化血红蛋白与化学发光强度之间的关系，得到了检测目标物糖化血红蛋白的标准曲线，线性范围及线性方程。
发明的优点与效果
当糖化血红蛋白的浓度在0.01ng/mL到50ng/mL之间时，随着糖化血红蛋白浓度的变化，化学发光强度有明显变化。经计算得到检测糖化血红蛋白的非线性方程为y＝1045ln(x)+4075(y：化学发光强度；x：糖化血红蛋白浓度，单位为ng/mL)，线性相关系数为0.9987，检出限为0.003ng/mL(3σ)(图2)。该测定方法的精密度通过对浓度为1.0ng/mL的糖化血红蛋白进行11次平行测定而计算得出，相对标准偏差分别为3.6％，表明本发明的测定方法有较好的重现性。
附图说明
图1检测糖化血红蛋白的原理示意图。
图2糖化血红蛋白的浓度与化学发光强度关系图。
图3LumAuNPs—羟胺-O-磺酸化学发光检测体系(a)和LumAuNPs-H2O2化学发光检测体系(b)的化学发光强度比较。
具体实施方式
下面的实例将进一步说明本发明的操作方法，但不构成对发明的进一步限制。
实例1：一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法
1.实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器设备
DHG鼓风干燥箱(善志仪器设备有限公司，上海)；AR224CN型奥豪斯分析天平(青岛中和恒信电子有限公司，青岛)；THZ型恒温振荡箱(佳源兴业科技有限公司，北京)；RFL-1型超微弱化学发光检测仪(瑞迈分析仪器有限公司，西安)；Anke-TGL-16C飞翁牌高速离心机(安亭科学仪器厂，上海)。
1.1.2试剂
糖化血红蛋白购自于Sigma-Aldrich Co.LLC。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、氯金酸(HAuCl4)从Sigma公司购买；粒径为0.5μm，浓度为10mg/mL的羧基磁珠从天津倍思乐色谱技术开发中心购买；鲁米诺(Luminol)、羟胺-O-磺酸(HOSA)和TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)购买于Aladdin公司；0.01M的鲁米诺用0.1M NaOH溶解，在棕色瓶中保存在4℃冰箱中；取1g氯金酸加100mL水配成1％的氯金酸溶液，用棕色瓶保存，使用前用二次蒸馏水稀释。
PBS缓冲溶液是0.10M，pH 7.4，其配制方法是称取0.2g KH2PO4、8.0g NaCl、2.9gNa2HPO4·12H2O及0.2g KCl溶解于1L水中，即得。
所用到的DNA由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：
所述的适体DNA为：5`-NH2-ACACAGCAACACACCCACC CACCAGC C C CAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTG TG-3`
所述的适体互补序列DNA为：5’-SH-CACACACGACG GATGGG CA T G ATG C TGGGGCTGGTG GG TGG G T GTGTTGCTGTGT-3’
1.2 LumAuNPs的合成
实验开始前，所用的玻璃仪器均用HNO3/HCl(3:1,v/v)的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干。取100μL 1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成50mL 0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在三口烧瓶中加磁子，并将其放入磁力搅拌器中，磁力搅拌下加热回流煮沸。待溶液沸腾后，快速加入1mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸40min，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热并在继续搅拌下冷却至室温。将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用。
1.3适体DNA修饰磁珠的制备
取50μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用100μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到1mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后在离心管中加入100μL浓度为5.0×10-8M适体DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到适体DNA修饰的磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mLPBS缓冲溶液中，4℃保存。
1.4适体互补序列DNA修饰LumAuNPs的制备
将5μL的TCEP加到100μL浓度为1.0×10-6M的适体互补序列DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取600μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入50μL含0.3M NaCl pH 8.2的10mM Tris-HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针。最后得到的化学发光探针分散到1000μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用。
1.5糖化血红蛋白的检测
取50μL适体DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后在此离心管中加入50μL适体互补序列DNA修饰LumAuNPs溶液，37℃条件下震荡反应40min，磁分离，将磁性分离物分散在50μL含糖化血红蛋白的溶液中，37℃震荡反应40min，通过适体互补序列DNA与适体DNA的作用以及糖化血红蛋白与适体DNA的作用，经过磁分离，化学发光探针从磁珠表面剥落，将磁性分离液分散在50μL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺-O-磺酸溶液，产生化学发光。根据标准溶液浓度和化学发光强度关系作图得标准曲线。
实例2：样品分析
将含糖化血红蛋白的样品溶液按步骤1.5方法进行实验，根据化学发光强度和步骤1.5所得标准曲线可以获取糖化血红蛋白含量。
根据发明的方法对糖化血红蛋白含量进行了测定，并采用标准加入法对方法进行了评价，样品测定回收率为97.0-103.2％，测定结果见表1，本发明的方法在糖化血红蛋白检测中具有精密度高的特点。
表1.样品分析测定结果
a 7次测量结果
b单位：mg/mL
实例3：方法灵敏度比较
利用LumAuNPs-H2O2为检测体系，在其他步骤相同时，按本发明的方法对糖化血红蛋白进行检测，测定的检出限为0.8ng/mL。表明本发明提出的一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法具有高的灵敏度。当糖化血红蛋白的浓度为1.0ng/mL时，以LumAuNPs-羟胺-O-磺酸为化学发光检测体系，进行化学发光测定，所产生的化学发光强度是LumAuNPs-H2O2为化学发光检测体系的4倍(图3)。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛科技大学
<120> 一种化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ACACAGCAAC ACACCCACCC ACCAGCCCCA GCATCATGCC CATCCGTCGT GTGTG 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工系列
<400> 2
CACACACGAC GGATGGGCAT GATGCTGGGG CTGGTGGGTG GGTGTGTTGC TGTGT 55

Claims (1)

1.一种非诊断目的的化学发光技术检测糖化血红蛋白的方法，其特征在于以鲁米诺还原氯金酸，得到鲁米诺胶体金纳米粒子LumAuNPs，以适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，得化学发光探针；以磁珠为载体固定适体DNA，得适体DNA修饰磁珠；再将化学发光探针与适体DNA修饰磁珠孵育得化学发光传感器；在目标物糖化血红蛋白存在时，适体DNA与糖化血红蛋白作用，化学发光探针从磁珠表面脱落；经过磁分离后，在分离液中加入羟胺-O-磺酸，以LumAuNPs—羟胺-O-磺酸为化学发光体系，进行化学发光测定，根据产生的化学发光实现目标糖化血红蛋白的测定，具体步骤：
(1)鲁米诺胶体金纳米粒子的制备：实验开始前，将所用的玻璃仪器用HNO3/HCl体积比为3:1的王水浸泡24h后，用二次蒸馏水冲洗，放入烘箱烘干；取一定量的1％的氯金酸溶液加去离子水稀释成0.02％的氯金酸溶液并置于三口烧瓶中，在磁力搅拌下加热回流煮沸；待溶液沸腾后，快速加入0.01mL～5mL 0.01M的鲁米诺溶液，继续加热煮沸，溶液的颜色由浅黄色变为黑色，最后变成酒红色，40min后停止加热，并在继续搅拌下冷却至室温，得鲁米诺胶体金纳米粒子，即LumAuNPs，将制得的LumAuNPs转移到棕色广口瓶中，4℃下保存备用；
(2)适体DNA修饰磁珠的制备：取10μL～100μL羧基化磁珠溶液放入1.5mL离心管中，用10μL～200μL浓度为0.1M咪唑缓冲液洗涤三次，然后分散到0.01mL～2mL含有0.1M EDC和0.05M NHS的0.1M咪唑缓冲液中，在37℃条件下，振荡反应30min；然后向离心管中加入10μL～200μL浓度为5.0×10-8M适体DNA，在37℃条件下振荡过夜，得到适体DNA修饰磁珠，然后再用2.0mL 0.1M PBS缓冲溶液清洗三次，最后分散到2.0mL PBS缓冲溶液中，4℃保存；
(3)适体互补序列DNA修饰LumAuNPs的制备：将1μL～20μL的TCEP加到10μL～200μL浓度为1.0×10-6M的适体互补序列DNA溶液中，37℃振荡活化1小时，再取100μL～1000μL合成好的LumAuNPs加入到该溶液中，在37℃条件下震荡过夜，然后再加入10μL～200μL含0.3MNaCl pH 8.2的10mM Tris-HCl缓冲液；继续震荡48h后，在12000rpm的条件下离心30min后，将红色沉淀用1mL pH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液清洗，再次离心，如此重复三次，得适体互补序列DNA修饰LumAuNPs，即化学发光探针；最后得到的化学发光探针分散到1000μLpH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，4℃保存备用；
(4)糖化血红蛋白的检测：取10μL～200μL适体DNA修饰磁珠溶液置于离心管中，然后在此离心管中加入10μL～100μL化学发光探针溶液，37℃条件下震荡反应40min后，磁分离，将磁性分离物分散在10μL～100μL含目标物糖化血红蛋白的溶液中，37℃震荡反应40min，经过磁分离后，将磁性分离液分散在50μLpH 7.4的0.1M PBS缓冲溶液中，然后再加入羟胺-O-磺酸溶液，产生化学发光，根据化学发光强度定量，实现糖化血红蛋白的测定；
所述的DNA序列如下：
适体DNA为：5`-NH2-ACACAGCAACACACCCACCCACCAGCCCCAGCATCATGCCCATCCGTCGTGTGTG-3`；
适体互补序列DNA为：5’-SH-CACACACGACGGATGGGCATGATGCTGGGGCTGGTGGGTGGGTGTGTTGCTGTGT-3’。
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